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Papel de los monocitos frente a infección sistémica por Candida albicans

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Jorge Domínguez Andrés Madrid,2017

FRENTE A LA INFECCIÓN POR CANDIDA ALBICANS

TESIS DOCTORAL

FACULTAD DE CIENCIAS

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Papel de los monocitos frente a infección por Candida albicans

Tesis doctoral

Jorge Domínguez Andrés, graduado en Farmacia Director: Prof. Dr. Carlos Ardavín

Madrid, 2017

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El Prof. Dr. D. Carlos Ardavín Castro

CERTIFICA:

Que D. Jorge Domínguez Andrés ha realizado bajo su dirección el presente trabajo titulado “Papel de los monocitos frente a infección por Candida albicans” con el objetivo de obtener el Grado de Doctor.

Y para que conste a todos los efectos, firma el presente certificado.

Fdo.: Prof. Dr. D. Carlos Ardavín Castro

Madrid, abril de 2017

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Este trabajo ha sido llevado a cabo en el Departamento de Inmunología y

Oncología del Centro Nacional de Biotecnología, CSIC (Madrid)

bajo la dirección del Prof. Dr. Carlos Ardavín.

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AGRADECIMIENTOS...5

SUMMARY...11

01 INTRODUCCIÓN...15

El reino Fungi...16

El género Candida...17

Relevancia de las infecciones causadas por Candida...17

Modelos animales de candidiasis...18

Modelo múrido de infección sistémica por Candida albicans...19

Los hongos y el sistema inmune...19

Reconocimiento e inicio de la respuesta inmune...20

Respuesta adaptativa a la infección por Candida albicans...26

Respuesta innata contra Candida albicans...27

Sistema fagocítico mononuclear y Candida albicans...29

Neutrófilos y Candida albicans...32

Células natural killer y Candida albicans...33

02 OBJETIVOS... 37

03 MATERIAL Y MÉTODOS... 41

MATERIALES BIOLÓGICOS...42

Ratones...42

Candida albicans...42

ÍNDICE

(7)

REACTIVOS...42

Medios de cultivo...42

Anticuerpos monoclonales...42

Primers para qRT-PCR...43

Estímulos...43

METODOLOGÍA...43

Preparaciones celulares...43

Aislamiento de poblaciones celulares...45

Citometría de flujo...45

Cultivos celulares...46

Histología...49

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real...49

Cuantificación de proteínas...49

Ensayos in vivo...49

04 RESULTADOS...55

CARACTERIZACIÓN DE LAS POBLACIONES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS, MONOCITOS Y MACRÓFAGOS DURANTE CANDIDIASIS SISTÉMICA EN BAZO Y RIÑÓN...56

Definición de las principales poblaciones del sistema inmune innato en riñón durante infección sistémica por C. albicans ...56

Definición de las principales poblaciones del sistema inmune innato en bazo durante infección sistémica por C. albicans ...60

IMPACTO DE LA DEFICIENCIA DE CCR2 EN LA RESPUESTA A LA INFECCIÓN SISTÉMICA POR C. ALBICANS...63

(8)

Estudio del efecto de la deficiencia de CCR2 en la evolución de las poblaciones del sistema

inmune innato de riñón en la infección sistémica por C. albicans...63

Estudio del efecto de la deficiencia de CCR2 en la evolución de las poblaciones del sistema inmune innato de bazo en la infección sistémica por C. albicans...65

Impacto de la deficiencia de CCR2 en la susceptibilidad a candidiasis sistémica...65

Efecto de la deficiencia de CCR2 en la activación del eje célula NK-neutrófilo en respuesta a candidiasis sistémica...66

PAPEL DE LOS MONOCITOS EN LA ACTIVACIÓN DEL EJE CÉLULA NK/NEUTRÓFILO EN LA DEFENSA FRENTE A CANDIDIASIS SISTÉMICA...72

Los monocitos inflamatorios Ly6Chi actúan como fuente de IL-15 durante la infección con C. albicans...72

Papel de la IL-15 producida por monocitos Ly6Chi en la activación de células NK durante infección por C. albicans...76

La producción de IL-15 durante la infección por C. albicans está controlada por interferón de tipo I...83

COOPERACIÓN ENTRE BAZO Y RIÑÓN EN LA DEFENSA FRENTE A CANDIDIASIS SISTÉMICA...89

05 DISCUSIÓN...93

Papel de los monocitos Ly6Chi en la respuesta inmune frente a C. albicans...94

Función de la IL-15 producida por monocitos Ly6Chi en la respuesta frente a candidiasis sistémica...97

Dependencia de IFNAR para la producción de IL-15 en candidiasis sistémica...102

Cooperación entre bazo y riñón en la respuesta frente a candidiasis sistémica...103

Modelo propuesto...106

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06 CONCLUSIONES...109

07 BIBLIOGRAFÍA...113

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ABREVIATURAS APC: Aloficocianina

BMDCs: DCs derivadas de médula ósea CCL: Ligando de quimioquinas

CCR: Receptor de quimioquinas CD: Cluster de diferenciación cDC: Célula dendrítica convencional CLR: Receptores de lectina de tipo C DC: Célula dendrítica

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético ELISA: Ensayo colorimétrico

FCS: Suero fetal de ternera

FITC: Isotiocianato de fluoresceína

GM-CSF: Factor estimulante de colonias de gra- nulocitos-macrófagos

HKC: heat-killed C. albicans

i-moDC: célula dendrítica derivada de monocito inmadura

i.p.: Intraperitoneal i.v.: Intravenoso IFN: Interferón

IFN-I: Interferón de tipo I IFNγ: Interferón gamma

IFNAR: Cadena α del receptor de IFN-I Ig: Inmunoglobulina

IL: Interleucina

iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible LPS: Lipopolisacárido bacteriano mAbs: anticuerpos monoclonales

MACS: Seperación celular magnética

MHC: Complejo principal de histocompatibili- dad

MHCII: Complejo principal de histocompatibili- dad de tipo II

MΦ: Macrófago

moDC: Célula dendrítica derivada de monocito MR: Receptor de manosa

mRNA: Ácido ribonucleico mensajero NK: Célula natural killer

NLR: Receptores para dominios de oligomeriza- ción para la unión a nucleótidos

PAMP: Patrón molecular asociado a patógenos PB: Pacific Blue®

PBS: Tampón fosfato salino PE: Ficoeritrina

PE-Cy7: Ficoeritrina-Cianina 7 PerCP: Peridina de clorofila A

PRR: Receptor de reconocimiento de patrones ROS: Especies reactivas de oxígeno

RT-PCR: Transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa

Th: Células T colaboradoras Th1: Células Th de tipo 1 Th17: Células T de tipo 17 Th2: Células T de tipo 2

Tip-DCs: Células dendríticas productoras de TNFα e iNOS

TLR: Receptores toll-like

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AGRADECIMIENTOS

“El orgullo y los halagos con frecuencia nublan nuestra razón.”

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AGRADECIMIENTOS

A pesar de tener muchas cosas que agrade- cer y sin que sirva de precedente, he pro- metido no extenderme demasiado en estas líneas. Espero que los recuerdos de los mo- mentos compartidos compensen lo que las palabras no pueden reflejar.

A Carlos, por su guía, su paciencia y su cer- canía. Por su disposición a discutir extensa- mente conmigo todas las decisiones rela- tivas a este trabajo. Gracias a ti me siento preparado para afrontar todos los desafíos de una carrera científica.

A la Fundación “La Caixa”, por confiar en mí y sostenerme durante el desarrollo de este trabajo. Por ser mis mecenas particulares durante tanto tiempo. Nada de esto hubiera sido posible sin su contribución.

A las miembros del laboratorio 412, por su ayuda y su apoyo. A María López, por el tiempo que ha dedicado a enseñarme todo lo que pude aprender. A Leti, por toda su alegría y su buena disposición. Seguro que aquellos adolescentes aún se preguntan cómo se quema un billete. A María Mingui-

to, por toda la ayuda que me prestó cuando

empezaba a luchar contra la ciencia. Me ale- gro de que hayas encontrado tu camino. A

Lidia, por estar dispuesta siempre a ayudar

en cualquier momento. Pase lo que pase no

te rindas. A Laura, por su energía y su entre- ga constantes. Tienes todo lo que hace falta para triunfar en este mundo. A Adrián, por el soplo de aire fresco que ha supuesto su lle- gada. No olvido a los integrantes del tercer pasillo, nuestra ONU en miniatura. Gracias a Rahman, por su entrega y su entereza, a

Gorjana, por no rendirse nunca, a Katy por

la dulzura con la que vive día a día, y a Pa-

rinaz, por su fuerza, su entusiasmo y su va-

lentía.

A la familia del DIO. A aquellos que se mar- charon hace un tiempo, como Javi, Vicen,

Pedro, Laura, Gema, Miriam y Daya, os de-

seo lo mejor a todos. Mención especial para

Dimitri, con el que cualquier excusa valía, y

vale, para pasar un buen rato, en un país u otro. También a Araceli, que nunca deja pa- sar la ocasión para que sigamos disfrutando de su compañía.

A la familia del DIO. A aquellos con los que he compartido momentos inolvidables a ambos lados de la valla verde. A Amaia, siempre trabajadora, y siempre encantado- ra y que se merece siempre lo mejor. A Car-

men, que con su personalidad y su despar-

pajo llegará donde quiera que se proponga.

A Jesús, trabajador multidisciplinar y plu-

riempleado. Camarero, freelance, maestro

y niño de las kinasas, por todos los buenos

momentos que hemos compartido duran-

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te estos años, que no son pocos. A Manu, gracias por todas esas horas vividas juntos en los últimos tiempos, que he disfrutado enormemente y que estoy seguro no cesa- rán en la distancia. Quidquid latine dictum sit,

altum videtur. A María Tello, a la que se ha

visto vagando por lejanas calles y que sigue valiendo montones de centavos. A Gonzalo, presidente emérito, por haber sido piedra angular del grupo que tantos buenos mo- mentos me ha dado. Al omnipresente Javi, con el que he disfrutado mucho de nuestros recurrentes encuentros a lo largo y ancho de los pasillos y recovecos del DIO. A Diego, por el corazón que le pone al día a día, sigue lu- chando. A Sheila, que pase lo que pase y pise donde pise, siempre te dedica una sonrisa. A

Lorena, que fue la primera persona que me

habló en el departamento y a la que estaré siempre agradecido por ello. A Javi Santos, por su eterna sonrisa y entusiasmo cons- tantes, sin importar las horas que lleve tra- bajando. A Ana, por su sonrisa constante. A

Jesús Ogando, Supermán amateur y futuro

empresario de éxito, por lo interesantes que son siempre los encuentros contigo y por la motivación que transmites. A sus órdenes. A

Graciela, por su capacidad de alegrarme el

día cada vez que la veía. Mazo agradecido, ya sabes. A Eva, que siempre ha está conti- go cuando le necesitas, por haber sido otro de los pilares de todo lo bueno vivido estos

años. Don Pelayo estará orgulloso de ti. A

Sara, por su espontaneidad, por todo lo que

nos hemos reído juntos. Nunca dejes de en- trar partiendo la pana, invitando a la peña, invitando a cañas. A Violeta, por todos los momentos vividos rondando por los andenes de estaciones y por aquellos que te cambian el carbón de la pipa sin pedírselo. Invócame cuando sientas que te ataquen las palomas.

A Laura, por sus ya legendarias amabilidad y ternura. A Alfonso, que pone buena cara tanto al buen como al mal tiempo. A Alejan-

dra, por demostrarme que la perseverancia

al final conlleva resultados. A Miguel, por la sinergia que compartimos y a la que todo el mundo teme pero solamente deja buenos momentos. A Ruth, con la que siempre es un placer encontrarme aunque tuviera que emigrar al otro extremo del pasillo. A Merce, que siempre encuentra un momento para pararse a hablar aunque las PCRs la desbor- den. A Mohi, proveedor ocasional y músico habitual, que siga adelante con toda la ener- gía que ha mostrado estos años.

A la familia del DIO. A las incorporaciones de

los últimos tiempos. A Christian, a Nico, a

Cris-CR, a Carmen, a Pablo, a Sofía, Jose, Diego, Pilar, Ester, Maria José y Alfon, que

aportan novedad y frescura y garantizan que

la esencia del departamento seguirá viva

mucho más tiempo.

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A la familia del CNB. A Carmen, Jas y Su-

resh, las primeras personas a las que cono-

cí en aquella entrevista, a los que considero buenos amigos y son una muestra más de las grandes personas con las que he tenido suer- te de compartir mi tiempo en el CNB. A C. G.

Briz. Un tipo enorme en lo científico y en lo

personal. Cuando seas rico publicaré nuestra correspondencia privada para que me aso- cien contigo.

A esas personas de los distintos servicios del CNB que han aportado su granito de arena a este trabajo y lo han facilitado enormemen- te. A Nunci, a Ana y a Enrique de cocina.

A Óscar y Soledad del Servicio de Histolo- gía. A Cristina, Rocío y Javi de microscopía electrónica. A Sylvia y Ana de microscopía confocal. A Mª Carmen, Sara y Carol de ci- tometría. A Marcos y Abdul de seguridad. A

Carol, Santa, Paloma y Miguel de cafetería.

A Raquel, a Antonio y a Iván del animalario.

Muchas gracias por todo lo que habéis hecho por m í y por este trabajo. Especial mención merece este último, Iván, que cuida de los ratones como si fueran sus hijos y al que no se le escapa una. Gracias por tu buen hacer y por amenizar esas todas las horas de trabajo que pasamos bajo tierra.

Todo mi agradecimiento a Mihai Netea por darme la oportunidad de sentirme uno más de su grupo desde el día en que llegué. Tam-

bién a Rob Arts y al resto de miembros del laboratorio AIG de Nijmegen por hacerme sentir como en casa y demostrarme que la organización eficiente del trabajo se refleja en buenos resultados.

Todo mi agradecimiento también a Carlos

del Fresno, David Sancho, James di Santo, Sara Colpitts, Lynn Puddington, Andrés Hidalgo, Gordon Brown y a Irina Udalova,

por sus contribuciones a este trabajo, sin las cuales no hubiera sido posible.

A Ana María, a Julia, a Azucena y a José, a los que nunca logré explicar exactamente a qué me dedico. Siempre he sentido vuestro apoyo en todas mis decisiones, a pesar de la distancia. Espero haberos hecho sentir orgu- llosos durante todo este tiempo.

A Andrea. Jefa de edición de esta tesis. La que ha tenido que aguantar repentinos hora- rios flexibles, jornadas maratonianas y des- pertadores en fines de semana. Gracias por tu incansable apoyo, tu permanente alegría y tu capacidad de hacer de todo una aventu- ra que merece la pena vivir. Esta tesis tam- bién es tuya.

Ars longa, vita brevis.

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SUMMARY

“La ciencia es una forma de pensar, mucho más que un cuerpo de conocimientos.”

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SUMMARY

Neutrophils play a crucial role in defense against systemic candidiasis, a disease associa- ted with a high mortality rate in patients recei- ving immunosuppressive therapy, although the early immune mechanisms that boost the can- didacidal activity of neutrophils remain to be defined in-depth. In this work, we have explored the role of inflammatory Ly6Chi monocytes in natural killer cell-mediated neutrophil activa- tion during the innate immune response against C. albicans, using a murine model of systemic candidiasis. Our data support that efficient an- ti-Candida immunity required a collaborative response between the spleen and kidney, relying on type I interferon-dependent IL-15 production by spleen inflammatory Ly6Chi monocytes, dri- ving an efficient activation and GM-CSF release by spleen natural killer cells, that was needed to boost the Candida killing potential of kidney neutrophils. Our data thus unveil an unknown function of IL-15 as a critical mediator in defense against systemic candidiasis, and hold promise for the design of novel IL-15-based antifungal immunotherapies.

RESUMEN

Los neutrófilos juegan un papel crucial en la defensa frente a candidiasis sistémica, una en- fermedad asociada con elevadas tasas de mor- talidad en pacientes inmunodeprimidos, si bien los mecanismos que el sistema immune emplea para disparar las actividades fungicidas de los neutrófilos aún no se encuentran bien definidos.

En este trabajo hemos explorado el papel de los monocitos inflamatorios Ly6Chi en la activación de neutrófilos mediada por células natural killer durante las primeras fases de la respuesta im- mune innata a la infección por C. albicans, uti- lizando un modelo múrido de candidiasis sisté- mica. Nuestros datos sostienen que la defensa eficaz frente a la infección por Candida requirió una respuesta coordinada entre el riñón y el bazo, dependiente de la producción de IL-15 por los monocitos Ly6Chi de bazo, a través de un me- canismo mediado por interferon de tipo I, la cual permitió una eficiente activación y liberación de GM-CSF por las células natural killer de bazo, ne- cesaria para disparar el potencial fungicida de los neutrófilos de riñón. De esta forma, nuestros datos revelan una función hasta ahora descono- cida de la IL-15 en la defensa frente a candidiasis sistémica y permite abrir nuevos frentes para el desarrollo de terapias frente a esta enfermedad.

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01 INTRODUCCIÓN

“La ignorancia afirma o niega rotundamente; la ciencia duda.”

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La historia del ser humano está marcada por las enfermedades infecciosas. La Peste Antoni- na mató a 5 millones de personas en el Imperio Romano, incluyendo a un emperador. La Plaga de Justiniano diezmó la población de Bizancio en una cuarta parte. La Peste Negra sesgó la vida de unos 100 millones de personas en el siglo XIV. La Gripe Española acabó con 1 millón de personas a la semana a principios del siglo XX. Hoy, unos 35 millones de personas son portadoras del VIH.

Las infecciones contribuyeron a la expansión del ser humano más allá de África, han cambiado el curso de guerras y ejercido una enorme influen- cia en la evolución de nuestra sociedad a lo largo de los siglos. Hoy en día, se estima que las en- fermedades infecciosas causan la muerte de más 15 millones de personas cada año. Neumonía, SIDA, tuberculosis o malaria son palabras que si- guen formando parte del día a día de millones de individuos en todo el mundo. Los agentes cau- santes de enfermedades infecciosas presentan una enorme heterogeneidad. Virus, bacterias, hongos, protozoos y helmintos son capaces de colonizar la superficie o el interior de un organis- mo generando una respuesta defensiva. La di- versidad de elementos causantes de infecciones es tan elevada como la propia variedad de fami- lias, géneros y especies.

El número total de especies eucariotas en la Tierra ha sido estimado en unos 8,7 millones. De todos ellos, los hongos suponen aproximada- mente el 7% (Mora et al., 2011). Dentro de estas

600.000 especies de hongos, solamente 600 son patogénicas para la especie humana (Brown et al., 2012). Este relativamente reducido grupo de especies comprende hongos que causan en- fermedades cutáneas leves (por ejemplo, hon- gos dermatofitos como Trychophyton rubrum), hongos que provocan enfermedades cutáneas severas (como la esporotricosis, causada por Sporotrix schenkii) y hongos que generan enfer- medades sistémicas que pueden llegar a com- prometer la vida del paciente (Aspergillus fumi- gatus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum y Candida albicans).

El reino Fungi

Un hongo es un ser vivo heterótrofo, carente de clorofila, hojas y raíces, que se reproduce por esporas y vive parásito, en simbiosis o sobre mate- rias orgánicas en descomposición (Real Academia Española. (2014). Diccionario de la lengua espa- ñola, 23.ª ed.). Los hongos son organismos de tipo eucariota capaces de existir en forma unice- lular (levaduras) o bien de formar hifas. Estas hi- fas son una serie de estructuras filamentosas for- madas por una sucesión de células comunicadas entre sí, de manera que en su conjunto constitui- rán un micelio. En general, las hifas conforman la forma invasiva de los hongos patógenos, obser- vándose en los diversos tejidos colonizados por el agente infeccioso. Además, algunos hongos miceliares son capaces de formar esporas que facilitan su diseminación. El reino Fungi se divide

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en cuatro grupos o filos: Ascomycota, Basidiomy- cota, Chytridiomycota y Zygomycota. Las micosis más importantes provocadas por los hongos de estos grupos son las candidiasis, dermatofitosis, aspergilosis, blastomicosis, histoplasmosis, es- porotricosis, hialohifomicosis, feohifomicosis y criptococosis.

El género Candida

Dentro del reino de los hongos y del grupo de los ascomicetos, el género Candida fue descrito por primera vez en el año 1923 por la micóloga holandesa Christine Marie Berkhout como parte de su tesis doctoral en la Universidad de Utrecht (Berkhout, 1923). Los hongos del género Candida son levaduriformes, entendiendo como levadura a un hongo eucariota microscópico unicelular capaz de descomponer cuerpos orgánicos me- diante fermentación. Crecidas en condiciones de laboratorio, las especies del género Candida aparecen como colonias grandes, redondas, de color blanco o cremoso (albicans en latín signi- fica ‘blancuzco´). Candida albicans es capaz de fermentar glucosa y maltosa produciendo ácido y gas, y sacarosa produciendo solamente ácido.

Sin embargo, no es capaz de fermentar lactosa, hecho que permite distinguirla de otras especies del género Candida (Gunasekaran and Hughes, 1980).

Relevancia de las infecciones causadas por Candida

La incidencia de infecciones causadas por es- pecies del género Candida ha aumentado en los últimos años debido al uso de terapias inmuno- supresoras y al empleo de antibióticos de amplio espectro (Low and Rotstein, 2011). En total, hay más de 200 especies comprendidas dentro del género Candida, pero hay muy pocas que ten- gan una relevancia clínica real. Los agentes cau- santes de candidiasis aislados de humanos per- tenecen principalmente a las especies Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida glabra- ta, Candida tropicalis, Candida krusei y Candida dublinensis (Scanlan et al., 2008). En individuos sanos, las especies del género Candida actúan como comensales que colonizan distintas áreas de la piel, del tracto gastrointestinal y del tracto genitourinario (Brown et al., 2012). Sin embar- go, cuando se producen eventos que provocan un desequilibrio en las condiciones normales de estas regiones tales como tratamientos con an- tibióticos que modifican la composición habitual de la flora comensal o desequilibrios electrolíti- cos que alteran el pH de las mucosas, Candida es capaz de provocar infecciones oportunistas superficiales como candidiasis oral, candidiasis vaginal o candidiasis esofágica, que en general se resuelven por si mismas o tras un tratamien- to sencillo con medicamentos antifúngicos (flu- conazol, clotrimazol, ketoconazol). De manera aproximada, el 75% de las mujeres sufren de

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candidiasis vaginal al menos una vez en su vida siendo Candida albicans la especie causante de la infección en el 90% de las ocasiones (Fidel, 2007).

En pacientes con una capacidad homeostáti- ca comprometida (por ejemplo en pacientes con neutropenia, insuficiencia renal o pancreatitis), en individuos en tratamiento con fármacos como glucocorticoides y antibióticos, en pacientes con cateterismos, bajo condiciones de nutrición pa- renteral o tras cirugía abdominal, Candida es ca- paz de alcanzar el torrente sanguíneo y coloni- zar diferentes órganos causando enfermedades sistémicas (candidiasis sistémica) que pueden llegar a comprometer la vida del paciente (Gud- laugsson et al., 2003; Wisplinghoff et al., 2014).

Uno de los mayores problemas de las infeccio- nes sistémicas provocadas por Candida reside en las dificultades que presenta el correcto diag- nóstico de la infección, cuyos signos y síntomas a menudo se confunden con los de una infección bacteriana. Esto puede generar retrasos en el inicio de la terapia farmacológica antifúngica, ya que estos medicamentos a menudo no son administrados hasta que se demuestra que el tratamiento con compuestos antibacterianos es inútil. Estos retrasos en el correcto diagnóstico y tratamiento de la enfermedad contribuyen a que las infecciones por Candida puedan alcanzar tasas de mortalidad por encima del 40% (Pfaller and Diekema, 2007, 2010). Además, la terapia

antifúngica existente ha mostrado una eficacia bastante limitada en estos casos de candidiasis sistémica lo que hace de las infecciones por Can- dida un problema de primer orden en el ámbito clínico (Sanglard and Odds, 2002).

Modelos animales de candidiasis

Debido a los problemas en el diagnóstico y en el pronóstico de las infecciones por Candida en seres humanos, los modelos animales de can- didiasis sistémica son una herramienta esencial para adquirir comprensión de los eventos que tienen lugar en las fases de inicio y progresión de la enfermedad, así como para la búsqueda de métodos de diagnóstico más rápidos y de tera- pias más eficaces que las actuales. En los últimos años se han empleado modelos de candidiasis en insectos como Caenorhabtidis elegans, Droso- phila melanogaster o Galleria mellonella (Chami- los et al., 2007) para estudiar diferentes aspectos particulares de la infección sistémica por Can- dida. Sin embargo, debido a las limitaciones de estos modelos, solamente se puede estudiar la evolución completa de la infección en modelos de mamíferos. Aunque hay ejemplos de estudios en conejos, cobayas y ratas, la inmensa mayo- ría de ensayos de candidiasis sistémica en ani- males se han llevado a cabo en ratones. Existen dos sistemas principales de modelos múridos de candidiasis sistémica: el modelo de infección intravenosa y el modelo de colonización gas- trointestinal y posterior propagación sistémica.

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En esta tesis doctoral, nos hemos centrado en el primero de ellos, en el que está basado todo el trabajo aquí expuesto.

Modelo múrido de infección sistémica por Candida albicans

El modelo múrido de infección intravenosa por Candida albicans es un modelo bien carac- terizado y extensamente utilizado (MacCallum and Odds, 2005). En este modelo, las células del hongo son introducidas de forma intravenosa a través de la vena lateral de la cola del ratón, permitiendo una diseminación rápida por todo el organismo. Una vez inoculadas, las blastoco- nidias de Candida se diseminan rápidamente a través del torrente sanguíneo estableciéndose en diversos tejidos. En el modelo múrido de can- didiasis invasiva, la carga fúngica observada en los distintos órganos del animal varía en función del tiempo transcurrido desde la inoculación in- travenosa del patógeno y de la propia evolución del proceso infeccioso de manera específica en cada uno de los órganos invadidos. Así, en órga- nos como el cerebro, el bazo y el hígado, se ob- serva un control espontáneo de la infección con un descenso de la carga fúngica proporcional al tiempo transcurrido y una disminución progresi- va de los infiltrados leucocitarios generados tras la invasión del tejido (Lionakis et al., 2011). Sin embargo, en el caso del riñón, las blastoconidias son capaces de establecerse y evolucionar a una morfología de tipo hifa, provocando un aumento

de la carga fúngica y una infiltración leucocitaria creciente con el tiempo, causando una pérdida progresiva de la función renal que potencial- mente llevará al animal a la muerte (MacCallum and Odds, 2005). La susceptibilidad a la candi- diasis sistémica se evalúa a través de distintos indicadores, como la capacidad de supervivencia de los animales a la infección, el recuento de uni- dades formadoras de colonias en los diversos ór- ganos o la evaluación histológica de la severidad de las lesiones observadas en los tejidos.

Los hongos y el sistema inmune

Los mecanismos de defensa contra los hon- gos en mamíferos son muy numerosos, abarcan- do desde mecanismos protectores conservados a lo largo de los diferentes estadios evolutivos de los seres vivos (inmunidad innata), hasta so- fisticados mecanismos adaptativos inducidos de forma específica durante procesos infecciosos (inmunidad adaptativa). Durante muchos años los mecanismos de defensa relacionados con la inmunidad innata fueron vistos como una simple barrera física de defensa primaria. Sin embargo, en las últimas dos décadas este punto de vista ha cambiado drásticamente, ya que, a pesar de cierta falta de especificidad, los mecanismos in- natos son capaces de diferenciar entre antígenos propios y extraños permitiendo la activación de mecanismos de respuesta adaptativa al propor- cionar señales específicas a células T (Medzhitov and Janeway, 1997; Romani et al., 1997). El pri-

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mero de los mecanismos innatos defensivos que las especies invasoras se encuentran al colonizar un organismo son las barreras físicas que sepa- ran el organismo del entorno tales como la piel y las membranas mucosas de los tractos respira- torio, gastrointestinal y genitourinario. La piel y las membranas mucosas son barreras físicas que presentan sustancias antimicrobianas en su su- perficie, algunas de ellas sintetizadas por las pro- pias células epiteliales y endoteliales de la zona en cuestión. Del mismo modo, estas superficies presentan una rica flora comensal de microorga- nismos saprófitos que dificultan la colonización por agentes externos (Romani, 2004).

Si los hongos son capaces de superar las ba- rreras físicas, se encontrarán con una serie de factores defensivos, incluyendo membranas, receptores celulares y una variedad de factores humorales solubles. En los tejidos, los fagocitos como neutrófilos, monocitos, macrófagos y célu- las dendríticas (DCs), son las células encargadas de captar y eliminar esos organismos invasores.

Las células innatas no fagocíticas, como las célu- las natural killer (NK), células T γδ y las células de naturaleza no hematopoyética de tipo epitelial y endotelial también ejercen un importante papel defensivo secretando quimioquinas, citoquinas proinflamatorias y factores antimicrobianos que dificultarán el establecimiento y la dispersión de la infección. En el caso de infecciones causadas por Candida albicans o Aspergillus fumigatus, los neutrófilos ejercen el papel efector fundamental

(Murdock et al., 2011).

Reconocimiento e inicio de la respuesta inmune

El primer objetivo fundamental del sistema inmune de un individuo es distinguir lo propio de lo ajeno. Desde que Medzhitov y Janeway propusieron el concepto de reconocimiento de patrones (Medzhitov and Janeway, 1997), se ha identificado una enorme cantidad de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs), que re- conocen patrones moleculares asociados a pa- tógenos (PAMPs). Estos PRRs son expresados en la superficie, en endosomas o en el citoplasma de las células del huésped y están presentes en diferentes células del organismo, principalmen- te monocitos, macrófagos, DCs, células B, célu- las T y células endoteliales. La activación de los PRRs por PAMPs lleva al desencadenamiento de rutas de señalización intracelular, ligadas a la transcripción de multitud de genes involucrados en la respuesta inmune, llevando a la producción de citoquinas, quimioquinas y péptidos antimi- crobianos (Janeway and Medzhitov, 2002).Hoy en día distinguimos entre tres tipos principales de sistemas de reconocimiento específico de patrones: Receptores de tipo Toll (Toll-Like Re- ceptors o TLRs), receptores de lectina de tipo C (C-type Lectin Receptors o CLRs) y receptores para dominios de oligomerización para la unión a nucleótidos (Nucleotide-binding domain, Leuci-

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ne-rich Repeat containing o NLRs) (Takeuchi et al., 2010). La pared celular de Candida albicans está principalmente formada por quitina, β-glu- canos, mananos y fosfolipomananos expresan- do así gran cantidad de ligandos de PRRs, lo que permitirá su reconocimiento por los receptores específicos expresados en las células del siste- ma inmune del individuo (Hardison and Brown, 2012). En los próximos párrafos revisamos bre-

vemente la señalización mediada por cada una de las principales familias de PRRs.

Receptores de lectina de tipo C. Los recep- tores de lectina de tipo C son la familia de recep- tores más importante involucrada en el recono- cimiento de antígenos expresados en la pared celular de Candida, tanto en ratones como en se- res humanos (Netea et al., 2015). Estos recepto- res son capaces de reconocer polisacáridos que

Figura 1. Estructura de la pared celular de Candida albicans.

La pared celular es un órgano esencial para mantener viables las células del hongo. La pared celular de Candida albicans com- bina una parte esquelética y una parte matricial. El componente esquelético de la pared celular de este hongo se basa en una estructura de β-(1,3)-glucano unido de forma covalente a β-(1,6)-glucano y a quitina (un polímero de β-(1,4)-N-acetilglu- cosamina). Estos polímeros forman puentes de hidrógeno entre cadenas de polisacáridos adyacentes para formar una red tridimensional de microfibrillas. Además, la pared celular de Candida albicans contiene una matriz que comprende proteínas glicosiladas. En esta especie, la mayoría de las proteínas de la pared celular son dependientes de anclaje a glicosilfosfatidili- nositol (GPI-CWPs), lo que quiere decir que se encuentran ancladas a una molécula de GPI unida a β-(1,3)-glucano o a quitina a través de una rama β-(1,6)-glucano que actúa de enlace. Esta estructura tan compleja y altamente intrincada dota al hongo de una gran resistencia y plasticidad, permitiendo su adaptación a los entornos locales que ofrecen los diferentes órganos del cuerpo y el enmascaramiento de sus moléculas más antigénicas para evitar la activación de las células del sistema inmune del hospedador. De Netea et al. Nature Rev. Microbiol (2008).

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se encuentran en la pared celular del hongo. Uno de los CTLs más estudiados hasta la fecha es Dectin-1, un receptor principalmente expresado en monocitos, macrófagos y DCs que reconoce β-glucanos e induce la producción de citoquinas y la internalización del hongo por fagocitosis (Goodridge et al., 2011). El reconocimiento por Dectin-1 lleva a la fosforilación de sus motivos ITAM, el cual recluta a la tirosina kinasa SYK, lle- vando a su vez a la activación de PLCγ2 (Xu et al., 2009) y al ensamblaje del complejo CARD9 a través de un mecanismo dependiente de PKCδ (Strasser et al., 2012).

La cascada de señalización iniciada por Dec- tin-1 lleva a la producción de citoquinas inflama- torias como IL-6, IL-12, TNFα e IFNβ y antiinfla- matorias como IL-10, de forma dependiente de los factores de transcripción NF-κB, NFAT, IRF1 e IRF5 (del Fresno et al., 2013; Sancho and Reis e Sousa, 2012). La ruta SYK-CARD9 también indu- ce el inflamasoma NLRP3, lo que resulta en la ac- tivación proteolítica de IL-1β e IL-18 por la acción de la caspasa-1 (Hise et al., 2009). De manera al- ternativa, dectin-1 también induce señalización a través de Raf-1 de forma SYK-dependiente, lo que se asocia con la activación de las fosfolipa- sas C y A2 y amplifica la respuesta inflamatoria a Candida (Plato et al., 2013). La importancia de estas rutas de señalización en infección por Can- dida es tal que la deficiencia de Dectin-1 como la de CARD9 están directamente asociadas con una mayor susceptibilidad a la infección por Can-

dida tanto en humanos como en ratones (Roma- ni, 2011).

La involucración de Dectin-1 es también ca- paz de amplificar las respuestas a TLR2 y TLR4 tras el reconocimiento de mananos por estos re- ceptores (Gantner et al., 2005) y favorece la for- mación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs, de sus siglas en inglés) en respuesta al re- conocimiento de formas filamentosas demasia- do grandes como para ser fagocitadas (Branzk et al., 2014). Los β-glucanos también son reco- nocidos por CR3, a través de un mecanismo im- plicado en el reconocimiento de C. albicans por neutrófilos humanos (van Bruggen et al., 2009).

Los mananos y las manoproteínas son otros importantes componentes de la pared celular de C. albicans. Estos son reconocidos por diversos CLRs, incluyendo MR, Dectin-2, DC-SIGN y MIN- CLE. El receptor de manosa reconoce los N-ma- nanos de la pared de Candida, activando una se- ñalización que llevará a la producción de diversas citoquinas proinflamatorias, especialmente IL-17 (van de Veerdonk et al., 2009). Dectin-2 recono- ce α-mananos y también ha sido asociado con la producción de ROS, IL-1β, IL-6 y TNFα durante la infección con C. albicans (Zhu et al., 2013). El res- to de receptores de esta familia, galectin-3, MIN- CLE y DC-SIGN, también han sido relacionados con la expresión de citoquinas proinflamatorias tras el reconocimiento de Candida por células mieloides (Netea et al., 2015).

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Receptores de tipo Toll. El papel de los TLRs en la defensa frente a infecciones fúngicas se comenzó a tener en cuenta cuando se puso de manifiesto que mutaciones que inducían altera- ciones en la señalización mediada por TLRs re- ducían la supervivencia a la infección por A. fu- migatus en Drosophila (Lemaitre et al., 1996). La

atención hacia el papel que podían desempeñar los TLRs en el reconocimiento frente a hongos llevó a descubrir que TLR2 está involucrado en el reconocimiento de fosfolipomananos y TLR4 en el de mananos (Oliveira et al., 2015).Aunque se sabe que los ratones deficientes en la proteí- na adaptadora Myd88 son susceptibles a la in- fección por hongos (Netea et al., 2008), el papel específico jugado por cada TLR en el marco de la infección por Candida no está aún del todo cla- ro. Algunos estudios han asociado la deficiencia de TLR2, TLR4 y TLR6 a una mayor susceptibili- dad a candidiasis sistémica (Naglik et al., 2014).

Además, cada vez cobran más importancia los receptores intracelulares que reconocen ácidos nucleicos, como TLR3, cuyas mutaciones es- tán asociadas con peor respuesta a la infección en humanos (Nahum et al., 2011). Del mismo modo, se sabe que TLR9 es capaz de reconocer ácidos nucleicos y quitina de C. albicans, aunque su función en el contexto infeccioso no está del todo clara, ya que, aunque un estudio vincula su actividad con la producción de citoquinas proin- flamatorias tras el reconocimiento de ácidos nu- cleicos de C. albicans (Miyazato et al., 2009), otro estudio demuestra que su deficiencia no influye en el pronóstico de candidiasis sistémica en ra- tones infectados (van de Veerdonk et al., 2008).

NLRs. Los NLRs son receptores citoplásmi- cos de PAMPs que entran en la célula tras en- docitosis o directamente a través de poros en la membrana. La principal función de los NLRs

Figura 2. Rutas de señalización inducidas por Dectin-1.

Tras la interacción con su ligando, Dectin-1 es fosforilado por tirosina kinasas de tipo Src, lo que proporciona lugares de unión para Syk, dando lugar al inicio de la cascada de señalización. Esta cascada es mediada por moléculas como CARD9, Bcl10 y MALT1, cyua participación lleva a la acti- vación del factor de transcripción NF-κB y a la producción de citoquinas. Dectin-1 también puede activar NFAT y la vía no canónica de NF-κB de forma independiente de CARD9, Bcl10 y MALT1. La estimulación de dectin-1 con β-gluca- nos también puede inducir una segunda ruta de señaliza- ción independiente de Syk mediada por la kinasa Raf-1. De Marakalala et al. Dectin-1 in antifungal defense, Mamm Genome (2011).

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relacionada con Candida descrita hasta ahora es la producción de IL-10 tras el reconocimiento de la quitina obtenida de la pared celular de C. al- bicans en un mecanismo dependiente de TLR9 y NOD2 (Wagener et al., 2014). Además de esta función, un estudio apuntó a la señalización de- pendiente de NLRs como vía capaz de aumentar la secreción de IL-1β a través de la activación del inflamasoma NLRC4 en un modelo de candidia- sis oral (Tomalka et al., 2011).

Diversos estudios han demostrado que los patógenos de origen fúngico pueden manipular o escapar de la acción del sistema inmune apro- vechando los sistemas de reconocimiento de pa- trones en su propio beneficio, ya sea impidiendo las funciones microbicidas o fagocíticas ciertos tipos celulares, escapando al reconocimiento del sistema inmune o induciendo la secreción de ci- toquinas de perfil antiinflamatorio, favoreciendo así la expansión del proceso infeccioso (Netea et al., 2008). Candida albicans es capaz de inducir inmunosupresión a través de la producción de IL- 10 mediada por TLR2, llevando a la generación de células T reguladoras con potencial inmuno- supresor (Netea et al., 2004). Además, Candida es capaz de evadir la actividad fagocítica a través de la formación de hifas, de mucho mayor tama- ño que las levaduras, impidiendo que las células con capacidad fagocítica puedan englobarlas (Branzk et al., 2014). La propia estructura de la pared celular de los hongos dificulta el recono- cimiento de los mismos por parte del sistema

inmune. Un ejemplo de esto es el hecho de que Dectin-1 sea capaz de reconocer a los β-glucanos expuestos en las zonas de gemación de las leva- duras, resultando inaccesibles en la pared de las hifas, donde quedan cubiertos por una capa de mananos (Gantner et al., 2005).

Como hemos visto, la entrada de Candida en el organismo provoca la correspondiente reac- ción protectora por parte del sistema inmune del individuo. La respuesta principal a la candi- diasis invasiva es de tipo innato siendo mediada fundamentalmente por neutrófilos, monocitos, macrófagos, DCs y células natural killer, cuyas funciones específicas detallaremos más adelan- te. En cuanto a la respuesta adaptativa, diversos trabajos han demostrado que las células T y las células B no ejercen un papel fundamental en la defensa frente a infección por Candida. Así, se ha demostrado que las infecciones sistémicas no progresan de forma más rápida o letal en ratones que presentan deficiencias en los tipos celulares relacionados con la respuesta adaptativa (Drum- mond et al., 2014). Sin embargo, en modelos de invasión de mucosas, las respuestas de tipo Th1 y Th17 mediadas por células T son cruciales para controlar la infección (Hernández-Santos and Gaffen, 2012). Con esto en mente, en los próxi- mos párrafos revisaremos brevemente el papel de la respuesta adaptativa en la respuesta a can- didiasis para pasar después a profundizar en los mecanismos de respuesta innata involucrados en la defensa frente a este patógeno.

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Figura 3. Reconocimiento de Candida por las células del sistema inmune innato.

La unión de los ligandos de TLR a sus receptores, bien extracelulares como TLR2 y TLR4, o intracelulares como TLR3 y TLR9 lle- va a la producción de citoquinas pro y antiinflamatorias durante las infecciones por Candida. El reconocimiento de los ligandos de varios CLRs como Dectin-1, Dectin-2, Dectin-3 y FcγRs, provoca el reclutamiento de SYK, mientras que los mecanismos de señalización disparados por MR aún son desconocidos. Dectin-1 actúa a través de una cascada de señalización que puede ser de- pendiente de SYK o de RAF-1. En neutrófilos, CR3 es importante para el reconocimiento de Candida sin opsonizar mientras que los FcγRs se encargan de interactuar con la opsonizada. DC-SIGN es capaz de iniciar respuestas de tipo adaptativo en DCs tras el reconocimiento de N-mananos. Aún no se conoce la molécula de Candida que interactúa con MINCLE, mientras que los β-mana- nos de la pared del hongo son reconocidos por Galectin-3. En conjunto, todas estas vías de señalización inducen la secreción de citoquinas y quimioquinas e inician procesos fagocíticos que tienen como objetivo eliminar las infecciones por Candida. De Netea et al. Nature Rev Immunol (2015).

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Respuesta adaptativa a la infección por Candida albicans

Tanto las células T CD4+ (células T helper) como las células T CD8+ (células T citotóxicas) juegan un papel en la inmunidad antifúngica.

Aunque se ha demostrado que las células T ci- totóxicas son capaces de inhibir el crecimiento de hifas de Candida albicans in vitro (Beno et al., 1995), los principales mecanismos de la inmu- nidad adaptativa relacionados con la defensa frente a infecciones por Candida albicans están relacionados con células T helper. Esta respuesta adaptativa mediada por células T helper supone el mecanismo fundamental de respuesta adap- tativa a infecciones por Candida en superficies mucosas. La importancia de la respuesta T helper contra este tipo de infecciones queda patente por ejemplo, en la elevada prevalencia de candi- diasis orofaríngea (OPC) entre los pacientes con VIH que presentan un bajo número de células T CD4+ circulantes (Davoodi et al., 2010). Histó- ricamente, se ha considerado a las respuestas de tipo Th1 como predominantes dentro de la respuesta adaptativa asociada a las infecciones causadas por Candida albicans, participando en la resolución de la infección de la cavidad oral y del tracto gastrointestinal. En este modelo de respuesta, las DCs que fagocitan levaduras se- cretan IL-12 favoreciendo la diferenciación de las células T helper hacia el subtipo Th1. Este tipo celular es una fuente importante de citoquinas proinflamatorias como IFNγ y TNFα, favorecien-

do el reclutamiento y aumentando de la capaci- dad fungicida de los neutrófilos en este tipo de infección en superficies mucosas (Ashman et al., 2011). Aun manteniendo cierta importancia, en los últimos años el papel de la contribución de la respuesta Th1 contra la infección por Candida albicans en superficies mucosas ha sido desban- cada por la relevancia de la respuesta de tipo Th17. Los linfocitos T productores de IL-17 (célu- las Th17) secretan numerosas citoquinas, inclu- yendo IL-17A, IL-17F e IL-22, cuya importancia en la protección contra el desarrollo de infecciones por Candida albicans en superficies mucosas del cuerpo resulta de una importancia crítica. A pe- sar de ser un subtipo descrito de forma relativa- mente reciente (Langrish et al., 2005), a día de hoy la respuesta adaptativa de tipo Th17 se con- sidera la principal responsable de la respuesta antifúngica contra candidiasis oral y cutánea. En este sentido, IL-17 juega un papel fundamental en el reclutamiento de neutrófilos, mientras que IL-22 favorece la función de barrera de las célu- las epiteliales (Hernández-Santos and Gaffen, 2012). La importancia de este tipo de respuestas se pone de relieve en múltiples casos. Pacientes con trastornos hereditarios en la respuesta an- tifúngica mediada por células Th17 desarrollan candidiasis mucocutánea (CMC) con elevada fre- cuencia (Nielsen et al., 2015). En estos pacientes, la CMC se manifiesta en forma de infecciones severas en uñas, piel y tracto gastrointestinal.

Las interleucinas 12 y 23 son importantes para el

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desarrollo de respuestas Th1 y Th17 respectiva- mente. El punto de vista más extendido actual- mente es la existencia de una respuesta mixta de tipo Th1/Th17 que favorece el reclutamiento y la activación de células efectoras a través de la secreción de citoquinas proinflamatorias (IFNγ, TNFα, IL-17, IL-22). En contraste con el papel protector de la respuesta Th1 y Th17, la inducción de un fenotipo Th2, respuesta favorecida por la formación de hifas, se asocia con un incremen- to en el crecimiento y la diseminación del hongo (Romani, 2004).

Respuesta innata contra Candida albicans El primer paso para desarrollar una respues- ta efectiva contra Candida es el reconocimiento eficaz del patógeno por el sistema inmune. En los últimos años se han hecho grandes esfuerzos para desentrañar la relación que se establece entre el patógeno invasor y los distintos tipos celulares del hospedador. Los eventos de natu- raleza innata que tienen lugar durante los pri- meros días tras la infección por Candida albicans resultan fundamentales para el resultado de la misma (Romani et al., 1997). La respuesta innata del huésped a la infección producida por Candi- da albicans incluye el reclutamiento de fagocitos desde médula ósea y sangre hacia los tejidos infectados. Monocitos y neutrófilos son células circulantes que presentan una elevada actividad fagocítica extravasándose tras entrar en contac-

to con zonas donde el endotelio está activado y respondiendo a señales emitidas por los tejidos infectados (Charles A Janeway et al., 2001).

En el caso de la infección sistémica por Candi- da albicans, las células epiteliales y endoteliales forman una primera barrera física que separa al patógeno del interior de los órganos. Sin embar- go, las levaduras son capaces de invadir los te- jidos induciendo su propia endocitosis por estas células, atravesando e infectando los tejidos que se encuentran al otro lado de estas defensas.

Del mismo modo, las levaduras son capaces de quedarse adheridas a las capas externas de las células epiteliales y endoteliales y de penetrar activamente a través de ellas gracias a la forma- ción de hifas y la secreción de proteasas libera- das por el extremo apical de las mismas (Moyes et al., 2016). Una vez colonizados los tejidos, las levaduras se encuentran con las células del sis- tema inmune que residen en los mismos, prin- cipalmente macrófagos y DCs. Estas células de- tectarán a los invasores a través de su conjunto de PRRs, disparando la producción de citoquinas como IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18, IFNβ o TNFα entre otros, además de quimioquinas atrayentes de monocitos (CCL2) y neutrófilos (CXCL1, CXCL2), todo ello con la finalidad de inducir la madura- ción, activación y reclutamiento de monocitos y neutrófilos desde sus lugares de origen y de- sarrollo, principalmente la médula ósea, hasta los órganos periféricos en los que tiene lugar la infección (Netea et al., 2015). Además, según

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Figura 4. Respuesta del sistema inmune a la infección sistémica por Candida albicans.

La primera barrera que Candida se encuentra durante su invasión son las células epiteliales. Para superar esta barrera, el hongo es capaz de inducir su propia endocitosis por estas células con el objetivo de atravesarlas y colonizar los tejidos situados al otro lado de la lámina basal. Las células epiteliales son capaces de producir péptidos antimicrobianos y citoquinas proinflamatorias en respuesta a la invasión, lo que llevará al reclutamiento de diversos tipos celulares del sistema inmune innato. Una vez den- tro de los tejidos, los macrófagos residentes serán los encargados de fagocitar los primeros hongos que hayan atravesado la barrera epitelial. A su vez, estos macrófagos producirán una serie de citoquinas, como IL-1β, IL-6 y TNFα, factores capaces de promover la maduración y el reclutamiento de otros tipos celulares, como células NK, monocitos y neutrófilos, que acudirán al lugar de la infección, donde contribuirán al aclaramiento de la misma. Los neutrófilos reclutados serán capaces de eliminar Candida a través de mecanismos de fagocitosis directa dependientes de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de liberación de trampas extracelulares (NETs). De forma similar, los monocitos inflamatorios son reclutados al lugar de la infección de forma CCR2-dependiente, donde contribuirán a la eliminación del patógeno. Las DCs pueden migrar a los nódulos linfáticos locales, contribuyendo al establecimiento de respuestas T helper de naturaleza Th1 y Th17. Cuando Candida alcanza el torrente sanguíneo puede interactuar con plaquetas, que se activarán respondiendo a través de la producción de otros factores con actividad antifúngica, como CCL5 y PF4. De Netea et al. Nature Rev Immunol 2015.)

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recientes estudios, las citoquinas producidas de forma innata en las primeras fases de la infección también son capaces de producir la activación de las células NK, las cuales actuarán como fuente principal de GM-CSF durante candidiasis sisté- mica (Bär et al., 2014; Whitney et al., 2014). Este GM-CSF actuará como mediador fundamental de la activación de los neutrófilos, disparando su potencial fungicida, lo que finalmente llevará a una eliminación del patógeno en los tejidos colo- nizados por el mismo. En los próximos párrafos procederemos a describir con mayor detalle la implicación de cada uno de estos tipos celulares en la respuesta frente a candidiasis sistémica.

Sistema fagocítico mononuclear y Candida albicans

Como hemos dicho, una vez dentro de los tejidos, los hongos han de afrontar el encuen- tro con las células fagocíticas residentes de los lugares invadidos, en este caso macrófagos y DCs. Estas células del sistema inmune entran en contacto con las células fúngicas a través de sus PRRs, activando mecanismos de fagocitosis y de secreción de factores proinflamatorios. Así, tanto DCs como macrófagos serán capaces de fagocitar las levaduras de Candida albicans, for- mar un fagolisosoma y llevar a la eliminación di- recta del hongo en su citoplasma (Brown, 2011).

Sin embargo, uno de los mecanismos de evasión de la respuesta inmune de Candida albicans con- siste precisamente en el desarrollo de hifas en

respuesta a la acidificación del fagolisosoma de manera que, aunque una parte de las levaduras fagocitadas sean finalmente digeridas, otra frac- ción muy importante de los hongos será capaz de escapar del interior de estos tipos celulares gra- cias a la formación de filamentos que provocarán la lisis directa de las células fagocíticas (Lewis et al., 2012). Las DCs juegan un importante papel dentro de la capacidad de respuesta inmune in- nata a la infección fúngica gracias a su capacidad de producción de IFNβ a través de una cascada de señalización dependiente de SYK e IRF5 (del Fresno et al., 2013). Más recientemente otro es- tudio mostró que, tras entrar en contacto con las levaduras de Candida albicans, las DCs actúan como fuente de IL-23p19, que activará una serie de interacciones entre distintos tipos celulares inmunes, llevando finalmente al aumento de la capacidad fungicida de los neutrófilos (Whitney et al., 2014). Por su parte, la respuesta local me- diada por los macrófagos residentes de tejido resulta fundamental en las primeras horas de la infección, tal y como demostraron Lionakis et al.

en un modelo de candidiasis sistémica, en el que la muerte de los macrófagos residentes de riñón en las primeras horas tras el contacto con Candi- da llevaba a una menor supervivencia global a la infección (Lionakis et al., 2013).

El origen de los macrófagos en situaciones de reposo y procesos inflamatorios es muy dife- rente. En situaciones de reposo, los macrófagos residentes de tejido proceden de monocitos del

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hígado fetal, los cuales dan lugar a macrófagos primitivos, que colonizarán los diferentes tejidos del individuo durante el desarrollo embrionario.

Estas células poseen capacidad de proliferación y autorenovación, siendo capaces de mantener por si mismas, sin aporte externo, las poblacio- nes de macrófagos residentes de tejido a lo largo de toda la vida adulta del animal (Ginhoux and Jung, 2014). Estos macrófagos serán los que pri- mero se enfrentarán a las levaduras de Candida que invaden los tejidos del individuo infectado.

Sin embargo, el conjunto de señales generadas tras el reconocimiento del patógeno lleva al rá- pido reclutamiento de otros tipos celulares que pasarán a ejercer la respuesta principal frente a la infección. En este punto es donde entran en juego los monocitos, células que juegan un pa- pel clave en multitud de procesos inflamatorios.

Clásicamente el monocito ha sido considera- do como un simple precursor del macrófago, cuando en realidad los monocitos son capaces de ejercer múltiples funciones por si mismos.

En primer lugar, es importante destacar que los monocitos son células con una enorme plastici- dad funcional, con capacidad de diferenciarse a distintos tipos celulares en función del estímu- lo y de los mediadores presentes en su entor- no. Así, son capaces de diferenciarse en células dendríticas derivadas de monocitos (moDCs) o en macrófagos. Las moDCs son células con una elevada capacidad de presentación antigé- nica y con un gran potencial de producción de

citoquinas proinflamatorias, resultando claves en la iniciación de respuestas de tipo Th2 fren- te a antígenos inhalados (Plantinga et al., 2013) y en la defensa innata frente a infecciones por Leishmania o Listeria (León and Ardavín, 2008).

Del mismo modo, los monocitos que infiltran tejidos pueden dar lugar a macrófagos de tipo inflamatorio (macrófagos M1 o GM-MØ), con funciones antimicrobianas; o de tipo anti-infla- matorio (macrófagos M2 o M- MØ), con funcio- nes de reparación de tejidos dañados (Izquierdo et al., 2015). Ante esta gran variedad de tipos celulares derivados de monocitos, recientemen- te se ha acuñado el término MC, de las siglas del inglés monocyte-derived cells, “células derivadas de monocitos” (Guilliams and van de Laar, 2015), que engloba todos estos diversos subtipos ce- lulares derivados de monocitos y diferentes de los macrófagos residentes de tejido. Aunque la médula ósea sigue siendo considerado el prin- cipal reservorio de monocitos en el organismo, otros tejidos como el bazo albergan importan- tes cantidades de monocitos capaces de ejercer un papel protector fundamental, tal y como fue demostrado en un modelo de isquemia cardiaca (Swirski et al., 2009). Esto es indicativo de que los monocitos que infiltran los tejidos inflama- dos se pueden reclutar no solamente desde la médula ósea sino también desde el bazo (y pro- bablemente desde otros órganos) dependiendo de la situación fisiológica y del estímulo que in- duzca su movilización.

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Los monocitos fueron inicialmente descritos como células con una elevada expresión de las moléculas CD11b, Ly6C y CD62L, que no expre- saban ni CD11c ni MHC-II (Passlick et al., 1989).

Posteriormente, se caracterizó una segunda po- blación de monocitos que expresaba un mayor nivel de CX3CR1 y un menor nivel de Ly6C que los monocitos convencionales (Geissmann et al., 2003). Estas dos poblaciones de monocitos actualmente se denominan monocitos Ly6Chi y Ly6Clow. Existen evidencias de que los monoci- tos Ly6Clow derivan de los Ly6Chi a través de una transición que parece ocurrir tanto en la médula ósea como de forma extramedular (Gamreke- lashvili et al., 2016). En ausencia de inflamación se ha propuesto que la función de los monocitos Ly6Clow es patrullar los tejidos sanos avanzando por el endotelio, mientras que en inflamación tendrían una función de reparación de los tejidos dañados por el proceso inflamatorio (Shi and Pamer, 2011). De este modo, los monocitos Ly- 6Clow no tendrían un papel activo en la respuesta innata frente a Candida, sino que se encargarían de la reparación del tejido dañado durante la respuesta inflamatoria mediada por otros tipos celulares.

Los monocitos Ly6Chi son los principales pre- cursores de las MCs que se generan en los tejidos en situaciones de respuesta a infección. La fun- ción de este tipo de monocitos es clave para la defensa frente a infecciones de naturaleza bac- teriana, vírica y protozoaria. En este tipo de in-

fecciones, los monocitos Ly6Chi de médula ósea son reclutados a los tejidos inflamados a través de un mecanismo CCR2-dependiente (Serbina and Pamer, 2006), donde ejercen actividades an- timicrobianas directas, de presentación antigé- nica o bien actúan como fuente de mediadores proinflamatorios (Shi and Pamer, 2011). A pesar de la relevancia del papel de los monocitos Ly- 6Chi en diversos modelos de infección, los estu- dios acerca de la relevancia de su potencial papel en la defensa frente a las infecciones por Candi- da aún son escasos. En la década de los 90, se mostró cómo la depleción de monocitos y ma- crófagos inducida por liposomas de clodronato resultó en una mayor carga en tejidos infectados y una mortalidad superior a la observada en el grupo de ratones control (Qian et al., 1994). Más allá de esto, es conocido el hecho de que los mo- nocitos son capaces de infiltrar los tejidos infec- tados por Candida (Legrand et al., 2008; Lionakis et al., 2011), de matar directamente al hongo (Brown, 2011) y de secretar citoquinas que in- ducen reclutamiento y activación de granuloci- tos, tales como IL-1β, TNFα e IL-6 (Netea et al., 2010). En los últimos años, un estudio mostró que la depleción de monocitos Ly6Chi aumenta la susceptibilidad a la infección por C. albicans y cómo la transferencia de dichos monocitos a ra- tones con candidiasis sistémica es capaz de fre- nar el progreso de la infección (Ngo et al., 2014).

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Neutrófilos y Candida albicans

Como hemos visto, las células epiteliales y las residentes de tejidos infectados, sea cual sea su naturaleza, emiten una serie de señales de alerta cuyo fin último es el del reclutamiento de células fungicidas efectoras a la zona de in- fección (Netea et al., 2008). En el caso de infec- ciones por Candida albicans, las células efectoras por excelencia son los neutrófilos. La actividad fungicida de los neutrófilos es fundamental en la lucha contra la candidiasis sistémica. Así, la neutropenia es un factor de riesgo para las infec- ciones de tipo invasivo protagonizadas por este hongo tanto en ratón como en seres humanos (Fulurija et al., 1996; Uzun et al., 2001). En parti- cular, la disponibilidad rápida de neutrófilos tras la infección es fundamental, ya que la depleción de los mismos dentro de las primeras 24 horas lleva a una proliferación exacerbada de Candida y a elevadas tasas de mortalidad (Romani et al., 1997). Por otra parte, una acción excesiva de los neutrófilos puede llevar al hospedador a sufrir estados de inflamación exacerbada, pudiendo causar daño tisular en la zona de infiltración si su número es excesivo (Kruger et al., 2015). De hecho, pacientes que han sufrido de candidiasis invasiva a menudo requieren de la administra- ción de corticosteroides para recuperarse de las complicaciones derivadas de un estado de infla- mación excesiva (Legrand et al., 2008).

Para ejercer su función, los neutrófilos requie- ren contacto directo con el patógeno invasor. De

este modo, los neutrófilos han de viajar a través del torrente sanguíneo hasta las zonas invadi- das, donde ejercerán su actividad fagocítica y lítica. Es importante destacar que los neutrófilos son el único tipo celular capaz de inhibir de for- ma eficaz la diferenciación de las levaduras hacia su forma filamentosa una vez el hongo ha sido fagocitado (Brown, 2011). Los neutrófilos son capaces de utilizar mecanismos oxidativos y no oxidativos para eliminar Candida. Aunque tanto los neutrófilos humanos como de ratón deficien- tes en NADPH oxidasa o mieloperoxidasa son in- capaces de eliminar Candida in vitro de forma efi- ciente (Lehrer and Cline, 1969), la deficiencia en NADPH oxidasa en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica tiene poco impacto en la susceptibilidad a Candida. La correcta activación de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en los neutrófilos de individuos infectados también se ha mostrado como un factor fundamental en la lucha contra la infección sistémica producida por Candida albicans (Naglik et al., 2014). Además de las especies reactivas de oxígeno, los neutrófilos usan mecanismos no oxidativos para comba- tir al hongo. Son capaces de producir factores antimicrobianos como lisozima, lactoferrina, elastasa, β-defensinas, gelatinasas y catepsina G (Netea et al., 2015). La elastasa de neutrófilos y la catepsina B tienen actividad antifúngica di- recta. Además, la elastasa juega un papel en la liberación de trampas extracelulares de neutró- filos (NETs, de sus siglas en inglés), que forman

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grandes estructuras de fibras de DNA y péptidos antimicrobianos (mieloperoxidasa, lactoferrina, azurocidina y catelicidina, precursor de LL-37 (Sørensen et al., 2001) que permiten neutralizar la acción de las hifas, que resultan ser demasia- do grandes como para ser fagocitadas de forma directa (Branzk et al., 2014).

Células natural killer y Candida albicans

Las células natural killer (NK) son linfocitos de tipo innato que, en general, actúan como una primera línea de defensa contra infecciones de tipo sistémico, generalmente de naturaleza vírica (Brandstadter and Yang, 2011). Además, juegan un papel muy importante en la lucha con- tra tumores (Waldhauer and Steinle, 2008). Las funciones de las células NK están controladas por receptores de superficie que emiten señales estimuladoras e inhibidoras al interior celular (Höglund and Brodin, 2010). Este tipo celular también actúa como fuente de citoquinas proin- flamatorias como IFNγ o GM-CSF, que a su vez son capaces de ejercer efectos sobre otros tipos celulares. De manera reciente, dos estudios han subrayado el papel de las células NK como me- diadoras fundamentales de la acción del sistema inmune innato en infección sistémica por Can- dida albicans. En uno de ellos se describe a las células NK como productoras fundamentales de GM-CSF, factor clave para la correcta activación y desarrollo de la capacidad fungicida en neu-

trófilos. De este modo, en ratones incapaces de completar una maduración funcional de las célu- las NK, el hongo es capaz de proliferar en el te- jido renal de forma muy superior a la observada en ratones con células NK plenamente funciona- les (Bär et al., 2014). El segundo estudio también apunta al papel de las células NK como produc- toras de GM-CSF previa activación mediada por la acción de DCs que han estado en contacto con el hongo invasor. Estas DCs reconocerían al hongo a través de Dectin-1, produciendo el me- diador soluble IL-23p19, activando a las células NK, que liberarán GM-CSF incrementando la actividad fungicida de los neutrófilos infiltrados en el tejido renal y luchando de forma más efi- ciente contra el patógeno invasor (Whitney et al., 2014), aunque el enfoque de este estudio se encuentra limitado al microambiente generado en el riñón tras la infección.

Las células NK fueron originalmente identifi- cadas como células “naturalmente activas” que rápidamente desarrollan funciones efectoras tras el encuentro con células infectadas o trans- formadas (Cuturi et al., 1989). Sin embargo, las células NK, tanto en el caso del ratón como en el del ser humano, muestran una actividad efec- tora (citotoxicidad, producción de citoquinas) muy baja cuando son incubadas in vitro con cé- lulas tumorales o bien cuando son directamente estimuladas a través de sus receptores activado- res, lo que sugiere que las células NK en reposo

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