1. Introducción
Es un hecho conocido que los estudios preventivos no han tenido el mismo alcance que las investigaciones dirigidas a la detección y tratamiento del cáncer. Esto plantea un problema de salud pública, puesto que el diagnóstico se da muchas veces en un estadio ya avanzado de la patología, cuando es poco lo que la medicina puede hacer por el paciente.
acetilénicos u olefínicos que, al combinarse con substituyentes oxidantes, se convierten en especies positivas, o sea electrofílicas. Estos aceptores del tipo michaeliano poseen estructuras como: CH2=CH-Z, Z'-CH=CH-Z (como las
quinonas), o bien estructuras del tipo acetilénico: R-C≡C-Z. Muchas de esas moléculas son al mismo tiempo inductores de enzimas quimioprotectoras y substratos para las glutatión-S- transferasas (Spencer et al., 1991).
Los antiinflamatorios no esteroideos son medicamentos, muchos de origen sintético, que bloquean la acción de las ciclooxigenasas 1 y 2. Mientras la COX-1 es considerada producto de un gen constitutivo, la isoenzima COX-2 es altamente inducible mediante estímulos inflamatorios (O´Banion et al., 1992). Estas enzimas catalizan la síntesis de prostaglandinas, que desencadenan muchos de los síntomas de la respuesta inflamatoria. El reconocimiento, durante las últimas dos décadas, de que el cáncer es una enfermedad asociada a procesos inflamatorios, ha abierto la puerta a la experimentación con antiinflamatorios no esteroideos para evaluar su posible papel en la prevención o tratamiento de distintos tipos de cáncer. Muchos estudios epidemiológicos demuestran que AINEs tales como sulindaco y aspirina reducen la incidencia y la tasa de mortalidad en varios tipos de cáncer, entre ellos el carcinoma colorectal (Thun et al., 1991; Schreinemachers et al., 1994; Taketo, 1998).
1.1. Epidemiología del cáncer en Costa Rica
cáncer a nivel global alcanzó los 7.5 millones de casos nuevos por año y calcula que, para 2020, la misma podría aumentar hasta en un 50% (Fuente: Organización
Mundial de la Salud, 2005). La distribución geográfica y tasa de incidencia para los distintos tipos de cáncer no son homogéneas. No obstante las asimetrías, el cáncer de pulmón, seno, próstata, cérvix, hígado, colon y piel, están entre las causas de muerte por neoplasia más comunes (Muir, 1987). Se calcula que en el mundo surgen, anualmente, 7.6 millones de casos nuevos de cáncer, de los cuales un 52% tienen lugar en los países en desarrollo (Kidwai Institute, 2005).
Costa Rica no es la excepción. La segunda causa de muerte en el país son los tumores, superados sólo por las enfermedades cardiovasculares. Se espera que para 2010 se diagnostiquen unos 10 954 nuevos casos (Fuente: Registro Nacional de Tumores, 2005). Para 1990, la tasa fue de 7.5 muertes por cada 10.000 habitantes, 8.1 en 1994 y 8.4 en 1995. En el año 1994 el primer lugar era ocupado, en ambos sexos, por el cáncer gástrico, seguido por el de próstata en varones y los de mama y cuello uterino, como segundo y tercero respectivamente, en mujeres (Organización Panamericana de la Salud, 2009).
en conjunto (comparado a los datos del periodo 1995-2003, para ambos sexos), la tasa de mortalidad para ambos sexos se ha mantenido, hasta 2005, sin variaciones importantes en un 79.04 por 100 000 habitantes. Para el caso de las mujeres, la tasa de incidencia hasta 2003 está ocupada por el cáncer de piel (44.46), seguido por el de mama (40.07) y el cáncer de cérvix y estómago en un reñido tercer lugar (16.94 y 17.42, respectivamente). La tasa de mortalidad para este grupo, con los datos actualizados al 2006, fue liderada por el cáncer de mama (13.14), seguida por el cáncer de estómago (8.7) y el de colon en tercer lugar (5.49).
Para la población masculina, el cáncer de próstata ocupa el primer lugar en incidencia, pues ha aumentado en un 60% desde 1995, llegando a una tasa de 58.81 por cada 100 000 habitantes en 2003. El segundo lugar en incidencia lo tiene el cáncer de piel (51.31) seguido por el de estómago (31.87). Las tasas de mortalidad en el caso de los hombres hasta 2006 son de 18.55 para el cáncer de estómago (que ha disminuido en un 45% desde 1995), 14.81 para el cáncer de próstata (que se ha estabilizado luego de un periodo de incremento en el segundo quinquenio de la década de 1990) y de un 8.59 para el cáncer de pulmón, que se encuentra en tercer lugar.
por edad por cada 100 000 habitantes, método directo) fue de 48.48 en hombres y de 41.66 en mujeres. En ese mismo año, la tasa de incidencia de tumor maligno tipo melanoma fue 2.83 y 2.80 para hombres y mujeres, respectivamente. La tasa de mortalidad por tumores malignos de piel en 2003 fue de 2.32 (hombres) y 1.68 (mujeres); para 2005, los datos accesibles indican una mortalidad de 1.29 para los varones y 0.97 para las mujeres.
De éste modo las estadísticas indican que el cáncer de piel, pese a ser uno de los de menor tasa de mortalidad, se ubica entre de los de más elevada incidencia. Según las fuentes anteriores el cáncer de piel tiene una distribución similar por sexo, con la mayor incidencia de casos en el Valle Central, en especial en los sectores de Heredia y Alajuela. Aunque los cánceres de piel más detectados son de tipo carcinoma (epidermoide y basal), el 50% de las defunciones anuales debidas a tumores en la piel son debidas a melanoma maligno. Por lo tanto este tumor es sujeto justificado de investigación tendiente a prevención y tratamiento.
1.2. Naproxeno: características y estudios previos
1.2.1. Naproxeno
El naproxeno o ácido S-6-metoxi-α-metil-2-naftaleneacético (figura 1), cuya fórmula molecular es C14H14O3, es un fármaco perteneciente a la clase de antiinflamatorios no
intraperitoneal y 534 por vía oral (The Merck Index, 1996). Funciona disminuyendo el nivel de las prostaglandinas, que provocan inflamación y dolor corporal (Drug Information Online, 2010). Este fármaco es comúnmente empleado para combatir el dolor, la inflamación y la rigidez que se presentan en los cuadros de espondilitis, tendinitis, artritis reumatoide, osteoartritis, bursitis, cólicos abdominales producto de la menstruación y en dolores causados por heridas en general.
Figura 1. Estructura molecular del ácido S-6-metoxi-α-metil-2-naftaleneacético o naproxeno Arriba: estructura química. Abajo: modelo molecular (fuente: ChemView).
1.2.2. Estudios previos in vivo
Buenos Aires (UBA), se convierte en el antecedente científico de la presente investigación.
Utilizando machos y hembras de la cepa murina SKH-1-hr-BR, el grupo de la UBA analizo la respuesta inflamatoria y el desarrollo de tumores cutáneos en individuos expuestos a radiación ultravioleta (UVB), de manera aguda (200 mJ cm -2) de forma crónica (50 mJ cm-2 tres veces por semana hasta la aparición de al menos un tumor en la piel) y los comparó con individuos control no irradiados. Los animales se subdividieron en grupos tratados con naproxeno 10% en solución tópica (desarrollada por Laboratorios Stein de Costa Rica) inmediatamente después de ser irradiados, y en grupos control (a los cuales se les aplicó solamente el excipiente de la loción). Se procedió a estudiar en esos grupos la expresión de prostaglandina E2
(PGE2), sintasa del óxido nítrico (iNOS), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y
la aparición de lesiones cancerosas.
Entre los hallazgos principales, el equipo determino que el naproxeno en formulación de uso tópico disminuye los niveles de PGE2 y aumenta los niveles de TNF-α
(después de 24 y 96 horas de la irradiación aguda), y que el aumento en la producción de TNF-α in vivo en presencia del naproxeno corresponde a 5.78 veces el nivel de la citoquina producida en ratones irradiados pero sin tratamiento con el AINE.
al suspender el programa de irradiación crónica al cuarto mes (cuando aparecen los tumores) y someter a los individuos a irradiación aguda en el quinto mes, los niveles de PGE2 no se alteran en los ratones tratados con naproxeno tópico (respecto de los
controles), pero que los niveles de iNOS y TNF-α aumentan considerablemente. Se determinó también que la aplicación de naproxeno vía dérmica reduce la incidencia de los tumores de piel en animales irradiados crónicamente y que el AINE así aplicado mejora la estructura del tejido dérmico de los animales irradiados (después de un mínimo de 3 aplicaciones), devolviendo los valores del grosor de la piel a niveles casi normales 96 horas después de un evento de irradiación aguda. Finalmente, el excipiente de la loción tópica del naproxeno no afectó la estructura de la piel, la eliminación de queratinocitos muertos ni ocasionó daño tumorigénico alguno, por lo que tal excipiente resulto inocuo in vivo bajo las condiciones experimentales empleadas.
La actividad encontrada en el naproxeno como inductor del TNF-α y como preventor de la aparición de tumores en la piel (aparte de su conocida actividad como antiinflamatorio no esteroideo), fundamentó el interés en investigar qué tipo de efectos podría tener dicho fármaco sobre células de tumores humanos.
El estudio in vivo argentino concuerda con los resultados in vitro obtenidos en varios tipos de líneas de melanoma humano, reportados por Denkert et al. (2001). Entre los hallazgos de dicho estudio están la confirmación de que las células de melanoma presentan alta expresión de COX-2 y producción de PGE2, la posible implicación de
mediante inhibidores de la ciclooxigenasa 2, se suprime la producción de PGE2 en
todas las líneas de SK-MEL usadas en un 50-90%.
En su estudio de un modelo de carcinogénesis cutánea en ratones sin pelo de la cepa SKH-HR1, Squiquera et al. (2001) encontraron que incluso dosis mínimas, suberitematógenas, de UVB, fueron capaces de provocar daño evidente a sólo 30 minutos posteriores a la exposición. La exposición reiterada a dosis mínimas de UVB resultó, en todos los casos, cancerígena. Esto implica la necesidad de revisar los estándares aceptados de protección frente al daño solar, ya que dosis inferiores a 1 DEM podrían provocar la aparición de tumores agresivos.
Figura 2. Efectos del naproxeno sobre la estructura histológica y la respuesta inflamatoria en piel de ratones desnudos irradiados con luz ultravioleta. Izquierda arriba: producción de PGE2 y TNF-α en los homogenizados epidérmicos 24 horas después de irradiación aguda.
Izquierda abajo: cuantificación del grosor epidérmico 96 horas después de la irradiación
Figura 3. Efecto protector del naproxeno contra lesiones cutáneas causadas por irradiación crónica de ratones SKH-1 con UVB (50 mJ/cm2). Izquierda arriba: incidencia de lesiones tumorales. Izquierda abajo: fotomicrografía de un corte histológico de un tumor de un animal irradiado sin tratamiento con naproxeno. Derecha: estado de los animales al quinto mes; grupo 1: especímenes irradiados sin tratamiento, grupo 2: animales irradiados y tratados con naproxeno al 10% vía tópica luego de cada irradiación, grupo 3: controles sin irradiación crónica a los que se les aplicó solamente el solvente de la loción dérmica. Reproducido con permiso de la Dra. Juliana Leoni, Universidad de Buenos Aires.
Los estudios citados antes han demostrado en conjunto la importancia de los mediadores pro-inflamatorios en el desarrollo del cáncer, pero no han podido probar que en presencia de PGE2 se revierta el efecto de los AINEs, lo cual puede implicar
1.3. Justificación
La investigación se realizó con la intención de analizar si existen efectos del naproxeno que pudiesen asociarse con actividad quimioprotectora, usando células tumorales humanas cultivadas in vitro. Se utilizó naproxeno disuelto en un solvente de uso común (dimetil-sulfóxido o DMSO) y, con propósitos comparativos, solubilizado en el vehículo acuoso D desarrollado por Stein, mismo que se había utilizado en los estudios in vivo previos.
El enfoque fue la experimentación con células tumorales epiteliales humanas (melanoma maligno de la línea SK-MEL 2), debido a la alta incidencia de los melanomas en Costa Rica. A manera de comparación y con el objetivo de obtener datos adicionales de los efectos en células tumorales de un cáncer sistémico, se realizaron algunos ensayos con la línea K562 (leucemia mieloidea crónica humana), puesto que el naproxeno puede administrarse por otras vías (por ejemplo la oral) y alcanzar, así, órganos internos.
2. Objetivos
2.1. Objetivo General
Investigar si existen propiedades en el naproxeno como posible quimioprotector, utilizando células de melanoma maligno humano cultivadas in vitro.
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1. Determinar si se produce inducción de la actividad de la enzima NAD(P)H:quinona oxidoreductasa, producto de la exposición al naproxeno, en células de melanoma humano.
2.2.2. Observar si la exposición a naproxeno induce cambios ultraestructurales en las células tumorales humanas empleadas.
2.2.3. Analizar los posibles efectos que sobre la proliferación de células de melanoma humano pueda ejercer el naproxeno.
2.2.4. Evaluar si existe un efecto sensibilizador a la muerte celular in vitro causado por la exposición de células malignas al naproxeno.
3.1. Cáncer y quimioprevención
La definición del cáncer y la procura de su prevención y son complejas per se. Las teorías presentadas y defendidas en los medios de comunicación científica para explicar su origen y naturaleza, están en su mayoría bien articuladas y cuentan con apoyo evidencial importante, en muchos aspectos. No obstante, ninguna puede erigirse como un modelo unificador que dé una satisfactoria y completa explicación a todos los hechos trascendentales y que responda a todas las interrogantes. Es decir, ninguna de estas teorías es capaz de explicar los distintos tipos de cáncer como casos particulares de una fenomenología causal uniforme y común a todos ellos.
Los eventos moleculares y celulares que llevan a un escape desde la normalidad fisiológica de las células hasta el ominoso desorden nuclear, característico de una célula transformada, son desencadenados por factores de muy variada naturaleza. La causa más aceptada para tales cambios ha sido la mutación a nivel génico, producida por agresiones ambientales a consecuencia de la dieta, fármacos, radiación y otros. La postura clásica ha estimado que el daño que dispara el desarrollo de la malignidad es provocado por mutaciones en los llamados ‘genes del cáncer’ (genes supresores de tumores y oncogenes). Nuevas teorías implican que la mutación se da a nivel
(Gibbs, 2003). Finalmente, hay quienes defienden que es la condición de aneuploidía, sin necesaria mediación previa de mutación génica, la causa real del cáncer (Duesberg et al., 2000).
Independientemente de la discusión actual, acerca de en qué genes en particular (o en qué regiones cromosómicas) ocurren las mutaciones importantes para la transformación y de la cantidad de mutaciones requeridas para la cancerogénesis, es evidente que las alteraciones a nivel del ADN juegan un rol central en la etiología del cáncer. Por tanto, prevenir la ocurrencia de tales agresiones es un enfoque trascendental en la lucha contra esta mortal enfermedad.
De hecho, pese a que el interés en el desarrollo de métodos de protección para prevenir el cáncer está creciendo, la mayoría de esfuerzos han sido históricamente dirigidos hacia el diagnóstico y el tratamiento. Siendo el cáncer una enfermedad sidrómica, compleja y de múltiples fases, sería más efectivo el prevenirle que el tratarle. Los estudios recientes están siendo dirigidos a la prevención del cáncer por inducción de enzimas que atacan y neutralizan a las substancias carcinógenas. Así, la quimioprotección busca prevenir, detener o incluso revertir la fase de iniciación de la carcinogénesis, o bien la progresión de las células neoplásicas hacia el cáncer (Greenwald, 2002). La protección química reconoce el hecho, ya puesto de manifiesto por los estudios en biología molecular, que el cáncer es un proceso de
son, en el mejor de los casos, también tenues. Un buen ejemplo de ello lo constituye el hecho de que muchos de los agentes preventivos que se estudian, provenientes de la dieta, actúan, al menos parcialmente, como estimulantes de la apoptosis, tanto en células cuyo ADN ha sido dañado como en tumores consolidados (Conney, 2003). Entre tales substancias tenemos, por ejemplo, cafeína, curcumina y algunos metabolitos presentes en el té (en la variedad verde, entre otras). Un fármaco evaluado como agente protector contra el cáncer podría, de esta manera, ser promisorio como agente terapéutico.
La bioquímica de la activación y la neutralización de los carcinógenos están bajo el control de las llamadas enzimas de fase I (para las reacciones de oxidación y reducción) y las enzimas de fase II (para las reacciones de conjugación). Muchas de estas enzimas, en especial las de fase II, actúan como defensa contra el ataque genotóxico al metabolizar las especies moleculares dañinas para el ADN. Los genes que codifican para estos biocatalizadores están regulados por el denominado elemento de respuesta al estrés oxidativo o ARE (del inglés Antioxidant-Response Element). Ejemplos de tales enzimas son la NAD(P)H:quinona oxido-reductasa I, glutatión S-transferasa, la γ-glutamil-cisteín ligasa y otras (Lee, 2005). El factor molecular que regula positivamente la transcripción de los genes de respuesta al estrés oxidativo es denominado Nrf2, un factor de transcripción eritroide, relacionado al factor nuclear E2, NF-E2 (Lee y Surth, 2005; Zhang y Gordon, 2004).
de dicho factor de transcripción y estimular la apoptosis. Diversos estudios han demostrado una relación entre niveles altos del NFκB y la resistencia a la apoptosis inducida por el TNF-α (Shukla y Gupta, 2004).
También se ha reconocido que la prostaglandina E2 (PGE2), derivada de la
ciclooxigenasa 2 (COX-2), es capaz de promover la proliferación tumoral al unirse a sus receptores y activar vías de señalización que modulan la proliferación celular (asociada a la familia de proteínas Ras), apoptosis, angiogénesis y migración (Wang y DuBois, 2007).
Por tanto, un quimioprotector podría actuar a través de la vía del Nrf2, al inducir las enzimas de fase II, o bien inhibir procesos pro-cancerígenos inducidos por substancias promotoras de la proliferación celular (como el NFκB y la PGE2); para el
caso del NFkB esto implicaría impedir su translocación al núcleo o su unión al ADN, previniendo la transcripción de los genes pro-inflamatorios regulados por éste.
3.2. Melanoma y línea SK-MEL2
3.2.1. Melanoma
Siendo Costa Rica un país con alta incidencia de melanoma (Fuente: Registro Nacional de Tumores, Ministerio de Salud) y tomando en cuenta que el riesgo de padecerlo aumenta con la edad, particularmente después de los cincuenta años (Ries et al., 2003), es imperiosa la necesidad de estimular la quimioprevención, detección temprana y tratamiento expedito de las etapas tempranas de la malignidad, para así disminuir la probabilidad de aparición y/o promoción de las células tumorales.
El melanoma es considerado un excelente modelo para el estudio de los mecanismos moleculares de la progresión tumoral (Nambiar et al., 2005), así como para el seguimiento de sus cambios morfológicos (Losina et al., 2007). Esto debido a que atraviesa por estadios reconocibles fenotípicamente: nevus (lunar) benigno, nevus displásico, melanoma de crecimiento radial y melanoma de crecimiento vertical, para culminar con la forma agresiva y metastásica (ídem).
Los estudios a la fecha indican que los tratamientos anti Ras/Raf deberían ser efectivos para tratar el melanoma maligno, por el papel de esta familia de proteínas en la regulación de p53, la proteína del retinoblastoma (RB) y del protooncogen B-raf, que se ven alterados en las metástasis melanómicas cutáneas (Bardeseey et al., 2001; Gorden et al., 2003).
El diagnóstico y tratamiento molecular irán ganando terreno y factibilidad conforme se avance en la era post-genómica. No obstante, el status quo de la tecnología en este campo recuerda y reafirma la importancia que debe reconocerse a los estudios de quimioprevención.
3.2.2. Melanoma de la línea SK-MEL2
Aislado de un hombre caucásico de 60 años, esta línea celular proviene de una región metastásica de la piel del muslo. La línea SK-Mel 2 es tumorigénica en ratones desnudos, a los cuales provoca melanoma maligno (fuente: CLS). Las células presentan cariotipo con hipodiploidismo o hipertetraploidismo, con anormalidades que incluyen cromosomas dicéntricos con constricciones secundarias, así como un marcador telocéntrico largo.
petrotetraindiol A extraído de la esponja Petrosia sp. (Hye et al., 2006) y la cantaxantina (Palozza et al., 1998).
3.3. Enzimas de Fase I y II
Es un hecho conocido en bioquímica que las enzimas capaces de metabolizar los compuestos xenobióticos, muchos de ellos cancerígenos, pertenecen a una de dos grandes categorías, que se han denominado Fase I y Fase II. Las enzimas de fase I incluyen, en general, a los biocatalizadores especializados en las reacciones de oxidación y reducción, en tanto las de fase II catalizan las biotransformaciones ‘‘neutralizantes’’, que implican conjugación de especies moleculares agresoras para la célula (Lee y Surth., 2005). Así, mientras las enzimas de fase I (por ejemplo la aril-hidrocarburo hidrolasa), actúan como activadores de los carcinógenos al convertirlos a sus formas reactivas, las enzimas de fase II metabolizan o neutralizan dichas moléculas. Entre estas últimas enzimas tenemos la UDP-glucorunosil transferasa, las glutatión transferasas o GHS y la NAD(P)H:quinona reductasa o QR (Talalay et al., 1988).
estrés oxidativo es una vía por la cual los agentes supresores y bloqueadores de tumores pueden actuar para proveer de quimioprotección a las células. Esta función enzimática formaría parte de un conjunto de estrategias que podrían ser estimuladas por algunos de esos agentes, tales como la inhibición de la angiogénesis, la supresión de oncogenes, la activación de los genes supresores de tumores y la estimulación de la apoptosis (Manson et al., 2000).
Según lo anterior, los inductores monofuncionales se perfilan como especies idóneas en los estudios de inducción enzimática anticarcinogénica (Prochaska et al., 1992). En las investigaciones realizadas desde hace 20 años hasta la fecha, se ha demostrado que la inducción de las enzimas de fase II es capaz de proteger a las células contra los carcinógenos y de prevenir la formación de tumores inducidos por los mismos, en distintos modelos animales y celulares (Brooks et al., 2001). Es más, se ha encontrado que en muchos tipos de tumores, las células han perdido o disminuido su capacidad de síntesis de algunas de las enzimas de fase II. Un ejemplo claro lo constituyen las células de cáncer prostático, que prácticamente pierden toda la expresión del gen de la glutatión-S-transferasa п (Brooks et al., 2001 y 2002). Cabe la posibilidad de que la inducción de estos genes pueda servir no sólo como prevención, sino además como una herramienta de ataque en los estados tempranos del desarrollo del cáncer.
3.4. El elemento ARE y la vía Nrf2
mecanismo molecular por el cual los inductores señalizan, o promueven, la expresión de los genes de las enzimas protectoras. Un primer paso fue el descubrimiento de que estos genes poseen en su extremo 5´ un elemento regulatorio en su secuencia promotora, denominado ARE (por sus siglas en inglés Antioxidant Response Element), es decir, un elemento de respuesta al estrés oxidativo. La secuencia de consenso del ARE, que funciona en cis, es 5´-TGA-CnnnGC-3´ (donde n representa cualquier nucleótido), siendo reportada por vez primera por Rushmore, Morton et al. en 1991, en el gen de la glutatión transferasa A2 de la rata. Este elemento guarda mucha semejanza secuencial en los distintos genes y entre diversas especies. Por ejemplo, la secuencia para el gen de la glutatión transferasa de rata es TGATTCAGC y para el gen de la NADPH quinona reductasa humana es TGACTCAGC (Zhang, 2004). Aunque se ha descubierto que las secuencias que flanquean al elemento ARE son necesarias para la expresión del gen bajo su control, parece que no todos los ARE son funcionales. Ejemplo de esto es el caso del gen GSTP1 humano, que no responde a los inductores comunes del ARE (Zhang et al., 2002).
P450-ciclooxigenasas (Zhang y González, 2002; Anzenbacher, 2001), la disminución de la electrofilicidad de las moléculas agresoras o destoxificación, podría estimularse por la inducción de los genes regulados por el elemento ARE y el Nrf2. El cuadro molecular se ha venido completando paulatinamente, al descubrirse más recientemente que el factor Nrf2 está, a su vez, regulado por una proteína citoplásmica conocida como Keap1.
El factor eritroide 2p45 o Nrf2, es un factor de transcripción nuclear relacionado con el factor NF-E2. Posee un peso molecular de 66 kDa con un dominio de unión al ADN del tipo cremallera de leucina, con el que se ha comprobado puede unirse a la secuencia para el NF-E2, en los genes blanco para éste. Normalmente, el NF-E2 está implicado en la regulación de la expresión del gen de la globina en las células hematopoyéticas (Zhang y Hannik, 2003). Pese al que el Nrf2 no es necesario para la eritropoyesis, se encontró que el motivo NF-E2 contenía un elemento ARE, por lo que se sospechó que el Nrf2 tendría un papel en la regulación de los genes controlados por dicho elemento. Luego sobrevino el descubrimiento de que el Nrf2 se une para formar heterodímeros con la proteína Maf, una proteína del fibrosarcoma muscular aponeurótico. Estos heterodímeros se unen con fuerza a las secuencias ARE (Zhang y Hannik, 2003).
respuesta frente a la inducción con moléculas como el oltipraz y otras, que son conocidas por actuar mediante la regulación de genes controlados por el elemento ARE (Itoh et al., 1997). Los ratones deficientes para la transcripción del gene nrf2 aumentan su sensibilidad a la carcinogénesis y pierden la respuesta de inducción de enzimas protectoras frente a inductores conocidos (Ramos et al., 2001). Por el contrario, los agentes quimioprotectores elevan la transcripción de la proteína Nrf2. Luego de la exposición celular a los inductores químicos, los niveles totales y nucleares de Nrf2 aumentan de manera constante y se ha comprobado que el gene nrf2 posee también un elemento ARE en su secuencia, que es estimulado por los inductores quimioprotectores (Kwak et al., 2002). Es decir, que el nrf2 posee una autorregulación positiva que magnifica o amplifica el efecto de los inductores de las enzimas de fase II.
7, respectivamente), reaccionan como aceptores de Michael con los inductores de las enzimas de respuesta al estrés oxidativo.
Al menos en la Keap1, los residuos cisteínicos en las posiciones 257, 273, 288 y 297, son muy reactivos frente a inductores como el sulforafano (contenido en las plantas crucíferas como el brócoli) y el mesilato de dexametasona, entre otros (Zhang y Gordon, 2004). Se ha descubierto, además, que la Keap1 posee una función activa en la señalización o marcaje por ubiquitinización de la Nrf2 para degradación en el proteasoma y que esta ubiquitinización, dependiente de Keap1, precisa de los residuos de cisterna C273 y C288 de esa proteína (Zhang y Hannink, 2003). Como conclusión a estos hallazgos, se ha propuesto que la Keap1 podría ser parte de un complejo ubiquitín-ligasa, el cual es inhibido por los inductores o agentes quimioprotectores, así como por el estrés oxidativo en la célula (Zhang y Hannink, 2003). El homólogo molecular humano para Keap1 se denomina KIAA0132 y se ha demostrado que diversos inductores, entre ellos el resveratrol y los antiinflamatorios no esteroideos como la indometacina y el ibuprofeno, son capaces de liberar la Nrf2 y permitir su translocación al núcleo, donde se estimula la síntesis de enzimas de fase II, como en el caso de la γ-glutamilcisteín-sintetasa, estimulando el metabolismo del glutatión (Sekhar et al., 2002).
producción parece inhibir la expresión génica regulada por ARE. Además, se sabe que Nrf2 también dimeriza con factores proteicos de la familia AP-1 y que existen otros factores nucleares relacionados al factor eritroide 2, llamados Nrf1 y 3, que pueden actuar de manera similar al Nrf2 (Zhang, 2004). Se ha encontrado que la proteínquinasa C (PKC) es capaz de promover la disociación del complejo Keap1-Nrf2, mediante la fosforilación de la serina 40 en Keap1-Nrf2, aunque esto no necesariamente se requiera para la translocación al núcleo y para la estimulación de la transcripción del gen de la NQO1 (Bloom, 2003).
La enzima NAD(P)H: quinona oxidoreductasa, aceptora de quinonas, denominada QR o NQO-1, es una flavoproteína citosólica dependiente de FAD. Ésta enzima ha sido usada en sistemas in vitro e in vivo como marcador molecular de la respuesta celular frente al estrés oxidativo y de la inducción de enzimas de fase II mediada por agentes quimioprotectores (Brooks et al., 2002).
Como ya se comentó, esta enzima se induce de forma coordinada con las glutatión transferasas y múltiples estudios, muchos de los cuales se han citado ya en este trabajo, apoyan la tesis de que la inducción de estas enzimas puede impedir la formación de tumores promovidos por carcinógenos, en varias especies. Estos factores justifican que la medición de los niveles citosólicos de la quinona reductasa constituye una herramienta confiable, adecuada y versátil, para identificar las capacidades quimioprotectoras de inductores putativos, así como para analizar las vías de inducción de las enzimas de fase II.
3.6. Inducción de muerte celular: citotoxicidad
Por lo anterior, el estudio de toxicidad celular inducida por un agente de interés es un buen punto de partida para análisis más detallados, acerca de los posibles efectos en el mantenimiento de la capacidad de reproducirse rápidamente y de formar colonias en células adherentes. Esto es particularmente importante de determinar en células cancerosas, tales como el melanoma, que presentan una elevada agresividad y alta capacidad metastásica.
La prueba de proliferación es un ensayo de sobrevivencia más que uno de viabilidad. Los experimentos de sobrevivencia implican evaluar la retención de la capacidad proliferativa por parte de las células y ésta se puede medir por la eficiencia de sembrado o plaqueo celular. Las células que son capaces de sobrevivir a la exposición momentánea de un agente experimental pueden mostrar efectos en un periodo posterior, sea de horas, días o semanas, cuando las células que murieron durante la exposición a dicho agente han incluso desaparecido ya del sistema, cultivo u órgano en cuestión.
3.4. Papel biológico del factor de necrosis tumoral alfa
de caspasa 8 se inicia por transducción mediada por el factor de necrosis tumoral (TNF), la independiente se presenta como respuesta a exposición a radiación o a ciertos agentes quimioterapéuticos, que dañan a los mitocondrios de una manera aún no bien definida (Wang et al., 1999). De cualquier forma, una vez que el citocromo c es liberado del condriosoma, éste junto a la proteína Apaf 1 y ATP, reclutan y procesan la procaspasa 9. La caspasa 9 activada entonces actúa sobre otras, como la caspasa 3, que finalizan el proceso de muerte celular.
Figura 4. Panorama molecular de la inducción de la respuesta apoptótica o de pro-sobrevivencia celular, estimulada por la unión del TNF a su receptor TNFR-1. Abreviaturas: APAF-1: factor proteico de activación de la apoptosis 1; Bcl-2: linfoma 2 de células B, da nombre a familia de proteínas; Bak, Bax, Bid, Bcl-XL: proteínas mitocondriales de la familia Bcl-2; CAD: DNAsa activada por caspasa; Cdc37: co-chaperona de la HSP90; cIAP: inhibidor citoplásmico de la apoptosis; cFos/cJun: factores de transcripción; DM: dominio de muerte; EndoG: DNAsa mitocondrial; FADD: dominio de muerte asociado a Fas; HSP90 chaperona de choque térmico 90; I-CAD: inhibidor de CAD; IκB : inhibidor del NFκB; IKKα/β: quinasa de la IκB ; JNK: quinasa cJun n-terminal; MEKK1: proteína quinasa activada por mitógenos/quinasa quinasa 1 relacionada con señales extracelulares; MKK3/7: quinasa MAPK 3/7; NEMO: modulador del NFκB; NFκB: factor de transcripción nuclear kappa B; NIK: quinasa inductora del NFκB; p38MAPK: quinasa activada por mitógeno p38; RIP: proteína de interacción con receptor; SODD: silenciador del dominio de muerte; TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa; TNFR-1: receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral; TRADD: dominio de muerte asociado al receptor del TNF; TRAF-2: factor 2 asociado al receptor del TNF. (Fuente: Van Horssen et al., 2006; 11:397-408).
degradación acelerada de la IκB-α, lo que permite la entrada al núcleo celular del NFκB (Shattuck y Richmond, 1997).
La regulación de la dirección de la señalización ejercida por el TNF-α en una célula, dirigiéndola hacia la supervivencia (vía NFκB o MAPK) o hacia la apoptosis, es compleja. No sólo existe doble acción a nivel del receptor tipo I (TNFR-I), que puede transducir la señal hacia la vía pro-apoptótica o hacia la anti-apoptótica, sino que el receptor de tipo II (TNRF-II), que es principalmente anti-apoptótico por carecer de dominios de muerte, parece poder interactuar de forma sinérgica con el TNRF-I, según se ha descubierto de manera reciente. Además, parecen existir diferencias en el camino a seguir luego de estimulación por TNF-α, según el tipo celular. La interacción entre ambos tipos de receptores puede aumentar la señalización vía TNFR-I. La estimulación del TNFR-II por unión a TNF-α puede llevar a que las células incrementen su producción endógena de TNF y, consecuentemente, haya estimulación autocrina y paracrina del TNFR-I (Balkwill, 2009).
dos tipos de señalización (vía TNFR-I o TNFR-II), la proteína RIP (del inglés receptor interacting protein), parece jugar un papel regulatorio crucial. La forma truncada de RIP, denominada cRIP, impide la apoptosis al inhibir a la IκB -quinasa, en tanto la forma intacta de RIP promueve el escape a la apoptosis mediante la estimulación de la quinasa mencionada (Gupta, 2001).
El hecho de que proteínas intermediarias en la señalización mediada por TNF-α, tales como RIP y cRIP, tengan efecto estimulante o inhibitorio (respectivamente) sobre la IκB-quinasa es trascendental. Ello implica que esta quinasa juega un papel preponderante en la activación del NFκB vía IκB-α y, por consiguiente, sobre la muerte celular o el escape de la apoptosis. La interrupción de esta vía de señalización mediante substancias inhibidoras debería servir como quimioprevención e incluso tratamiento de células pre-cancerosas, si se considera que la vía del NFκB está anormalmente activa en las células cancerosas y pre-malignas. Pese a las complejidades a nivel molecular, este proceso fisiológico podría ser el blanco u objetivo de terapia preventiva y de ataque, en la segunda fase de progreso de la enfermedad, es decir, durante la promoción de las células neoplásicas. Estudios diversos han dado evidencia de la posibilidad de prevenir el cáncer, por medio de la estimulación de la apoptosis mediante inductores químicos (Gasparian et al., 2002). Esto por cuanto la oncogénesis depende de mecanismos antiapoptóticos y la resistencia frente a la apoptosis es un indicativo de la transformación celular (Shukla y Gupta, 2004).
necrosis tumoral alfa (TNF-α). Bajo tales circunstancias, la célula maligna escapa a la acción de la muerte celular programada. Es decir, bajo ciertos estímulos el NFκB permite el escape de la apoptosis y uno de esos estímulos puede ser la unión del TNF-α a sus receptores en la membrana (Batra et al., 1999).
A nivel morfológico, las células apoptóticas sufren condensación del núcleo (picnosis) y ruptura del mismo (cariorexis), formación de extrusiones a nivel de la superficie celular (los llamados blebs o cuerpos apoptóticos) y fragmentación de los remanentes celulares, que comprenden porciones del núcleo y de citoplasma y organelos degradados. Además, la apoptosis se acompaña de cambios en la permeabilidad a substancias tales como los colorantes vitales y no vitales, lo que permite la visualización de células que están sufriendo muerte celular programada. La apoptosis juega un papel importante no sólo en el desarrollo normal, sino en patologías como SIDA, desórdenes neurológicos, enfermedad cardiaca y cáncer (Hayakawa et al., 1999).
4. Materiales y métodos
La investigación se basó en técnicas de cultivo de tejidos, bioquímica y biología celular, según se aprecia en la figura 5. Todos los reactivos y cristalería fueron comprados a Sigma Aldrich Corporation mediante Laboratorios Stein; las líneas celulares fueron obtenidas por donación de la Dra. Cecilia Díaz Oreiro, del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Costa Rica. Las pruebas realizadas incluyeron ensayos de viabilidad (citotoxicidad), sobrevivencia (proliferación), análisis metabólicos (expresión de la QR), estudios ultraestructurales (microscopia electrónica) y evaluación del efecto de una citoquina de interés (actividad del factor de necrosis tumoral alfa humano).
4.1. Líneas celulares
4.1.1. Melanoma humano (línea SK-MEL 2)
Las células se subcultivaron 2-3 veces por semana y se subdividieron, en cada ocasión, en una proporción de 1:3. El tipo celular es de morfología poligonal, adherente y se aprecia en la figura 6.
Figura 6. Células de melanoma humano (SK-MEL 2) cultivadas in vitro. Las células fueron fijadas y teñidas con cristal violeta (10 X). Pueden notarse la forma poligonal y las prolongaciones dendríticas de las células.
4.1.2. Leucemia mieloide crónica humana (línea K562)
Figura 7. Células leucémicas humanas de la línea K562, en cultivo celular en suspensión en medio DMEM 10% SFB (10X).
4.2. Técnica de cultivo de células tumorales
Todos los cultivos celulares se propagaron utilizando el medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), comprado de Sigma Aldrich Corporation. Las botellas de cultivo se mantuvieron en incubadora con atmósfera de CO2 al 5% y a una
Los experimentos en los que se midió la citotoxicidad inducida por el naproxeno se realizaron con DMEM al 2% SFB. Esto para evitar el enmascaramiento de la citotoxicidad que pudiese efectuar un medio de cultivo rico en SFB. En todos los experimentos se aplicó el fármaco de manera que el volumen del solvente no excediese el 2% del volumen total de la muestra.
4.3. Inducción de la enzima de fase II NAD (P)H:quinona
oxidoreductasa (QR).
4.3.1. Cultivo y exposición a naproxeno.
La actividad de la quinona reductasa se ensayó mediante la reacción de reducción del indicador de bromuro de tetrazoilo (MTT o bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) asociada a menadiona, en presencia de los substratos específicos de la enzima, siguiendo en general la metodología de Prochaska y Santamaría (1992) y Brooks et al. (2001 y 2002). Después de 48 h de exposición al compuesto, se ensayaron las placas para determinar la actividad de la reductasa de la quinona.
4.3.2. Lisis y evaluación de la actividad de la QR.
a 595 nm en un escáner para microplacas. Con los datos obtenidos se calculó la potencia del inductor para cada concentración utilizada del fármaco.
4.4. Evaluación de alteraciones ultraestructurales mediante
microscopia electrónica de transmisión
Se procedió a preparar muestras de los cultivos tratados con el principio activo así como los controles, que se analizaron mediante microscopia electrónica de transmisión (MET). La fijación de las células se hizo siguiendo los protocolos utilizados en el Centro de Investigaciones en Estructuras Microscópicas (CIEMIC, Universidad de Costa Rica), con la asesoría de la MSc. Ethel Sánchez Chacón. Este estudio se realizó por observación de cambios en la morfología de células de las líneas SK-MEL 2 y K562. Las muestras se fijaron con la solución de Karnovsky por 30 minutos, se lavaron en buffer de fosfatos tres veces y se centrifugaron a 3000 rpm por 10 minutos entre cada lavado. Se osmificaron con osmio al 1% por 30 minutos y luego de tres lavados en buffer de fosfatos se agarizaron al 3%. Las muestras así tratadas fueron sujetas a deshidratación seriada en acetona, infiltración en resina Spurr, polimerización, microtomía y tinción con acetato de uranilo (12 minutos) y solución plomo de Sato’s (10 minutos).
4.5. Evaluación de la viabilidad celular en presencia de
naproxeno y TNF-
α
humano
análisis microscópico de las células (control y tratadas) teñidas con el colorante azul tripán, se determinó el índice de muerte celular y el porcentaje de viabilidad, calculado como promedio de las diferentes muestras.
4.6. Análisis de inducción de muerte celular y efectos sobre
la proliferación melanómica in vitro
Estas pruebas estuvieron dirigidas a determinar efectos anticelulares a corto plazo (muerte celular o citotoxicidad) y a mediano/largo plazo (proliferación), en las células tumorales expuestas a los agentes experimentales.
4.6.1. Citotoxicidad de células tumorales expuestas a
naproxeno
la acción del AINE fuese dependiente de la concentración (por cuantificación espectrofotométrica en escáner de ELISA, a 540 nm).
4.6.2. Evaluación del efecto del naproxeno en la
proliferación de células de melanoma humano
El análisis de los efectos del naproxeno sobre la capacidad y retención de la velocidad de división celular a largo plazo, luego de exposición a 1 y 24 horas, se realizó mediante la prueba de proliferación clonogénica. Por ser ésta una técnica especialmente apta para células adherentes, se experimentó con la línea SK-MEL 2. Este método en general sigue el procedimiento de Batra et al. (1999), con modificaciones según el método de Freshney (2005). Se calculó la eficacia del sembrado o plaqueo en cada caso, la fracción sobreviviente respecto del control y se construyó y analizó la gráfica de proliferación.
4.7. Análisis estadísticos y graficación de resultados.
Para los análisis estadísticos se emplearon los paquetes SPSS versión 7.5 y Excel 2010 de Microsoft Office. En todas las pruebas se utilizó un coeficiente de confianza α = 0.05. Por la cantidad de datos en los experimentos, se calcularon las medidas de
5. Resultados
5.1. El naproxeno induce la actividad de la enzima NAD(P)H:
quinona oxidoreductasa en células de melanoma maligno
humano cultivadas in vitro.
Según se desprende de la figura 8, el cambio en la absorbancia de las muestras (debido a la reducción del colorante de bromuro de tetrazoilo en presencia de la enzima), fue lineal durante los 5 minutos de seguimiento. Esto ocurrió así en todos los experimentos. La línea SK-MEL 2 mostró una inducción robusta de la QR después de los tratamientos con el fármaco. Aplicado usando DMSO como vehículo, el naproxeno alcanzó el valor de 1 CDQR (i.e. la concentración a la cual un agente
experimental es capaz de duplicar la actividad específica de la quinona oxidoreductasa, parámetro usado para establecer actividad inductora, Prestera et al., 1993), a concentraciones del 10% (figura 9). Cuando el naproxeno se aplicó diluido en el vehículo tópico de Stein, el valor de 1 CDQR se alcanzó a concentraciones
cercanas al 1% de principio activo (figura 10). Según este criterio, ni el excipiente tópico ni el DMSO elevan la actividad de la quinona oxidoreductasa de manera significativa, pues no se acercan al valor basal de 1CDQR(es decir un valor mínimo
Para todas las concentraciones y el control, las diferencias entre las medias fueron significativamente diferentes (P « 0.05), con un poder observado de prueba de 1.000. El grado de inducción de la enzima fue significativamente diferente para cada uno de los tiempos de lectura, con P = 0.018. La prueba de Levene mostró que, para todas las concentraciones o tratamientos, el error de varianza de la variable dependiente (absorbancia, que refleja actividad de la QR), es uniforme (P » 0.05). Los promedios de absorbancia para cada tratamiento son significativamente diferentes según el tiempo (P « 0.05). La prueba de Dunnett indicó que todos los tratamientos indujeron la enzima de manera significativamente diferente al control (P = 0.004). La prueba de Tukey produjo sub-grupos homogéneos de varianzas significativamente diferentes para cada concentración en cada tiempo de medida, de la siguiente forma: DMSO, 9 sub-grupos; naproxeno 0.1% en DMSO, 2 sub-grupos; naproxeno 1% en DMSO, 7 grupos y naproxeno 10% en DMSO, 6 grupos; excipiente tópico, 7 sub-grupos; naproxeno 0.1% en e.t. (excipiente tópico), 7 sub-sub-grupos; naproxeno 1% e.t., 7 sub-grupos; naproxeno 5% e.t., 8 sub-grupos; naproxeno 10% e.t., 3 sub-grupos y naproxeno 20% e.t., 6 sub-grupos. Esto implica que para α = 0.05, la mayoría de los tratamientos mostró un aumento significativamente diferente en el nivel de inducción de la quinona oxidoreductasa para cada intervalo de 30 segundos, durante 5 minutos.
significativa dependiente de la concentración en las medias de la inducción de la quinona oxidoreductasa, a los 5 minutos de preparación de los lisados (P « 0.05). La C de Dunnett evidenció, como antes, una diferencia significativa de todos los tratamientos respecto del control (P « 0.05).
5.2. El naproxeno induce alteraciones ultraestructurales en
células de leucemia mieloide crónica humana (línea K562)
cultivadas in vitro.
La exposición de células tumorales leucémicas humanas a naproxeno 10% (tanto en DMSO como en excipiente tópico), durante 1 a 24 horas, ocasionó diversos tipos de alteraciones ultraestructurales y daño celular grave. No obstante, las células control (a las que solamente se añadió un volumen de PBS igual al volumen de tratamiento) se mostraron íntegras, tanto a nivel nuclear como de superficie celular (figura 11 A y B).
Dicho núcleo ha perdido su integridad morfológica y presenta condensación y marginación de la cromatina (características similares a las de un núcleo picnótico o apoptótico). Al comparar la estructura de los nucléolos en las figuras 11 B y C, pueden advertirse cambios en la estructura nucleolar, que ocurren durante la exposición a naproxeno. El nucléolo pasa de tener integridad a ser un cuerpo ovoide, mucho menos estructurado constituido principalmente de elementos granulares, con intersticios de diferentes tamaños y sin cromatina asociada a él claramente: solo alguna cromatina electrodensa está ubicada tangencialmente. Este tipo de cambios morfológicos en la ultraestructura nucleolar después de la exposición a fármacos o por señalización de muerte celular programada, han sido asociados a un proceso denominado autoesquisis (Jamison et al., 2010).
A una hora de exposición a naproxeno tanto en DMSO como en excipiente tópico (E.T.), se observaron cuerpos desprendidos o en proceso de separación, porciones de citoplasma constreñido y con organelas atrofiadas, así como un elevado número de restos celulares menores (fig. 12 A-D). La figura 13 muestra los efectos del naproxeno a 24 de tratamiento. Es notoria la presencia de remanentes celulares mucho menos reconocibles estructuralmente, típicos de los procesos de necrosis y necrosis secundaria.
fragmentada electrodensa, separación de membrana nuclear y degradación de membrana celular. Estos detalles se muestran en la figura 14.
A B
C
A
B C
D
Figura 12. Cambios morfológicos inducidos por naproxeno 434 mM, en células de leucemia mieloidea crónica humana expuestas por una hora. A. Acercamiento de una porción de un núcleo en fragmentación pero aún reconocible (se observa la envoltura, barra = 0.33 µm), de una célula expuesta a naproxeno-DMSO. B. Sección de la superficie de una célula expuesta a naproxeno 434 mM disuelto en excipiente de uso tópico (E.T.), donde se aprecia la formación de vesículas citoplásmicas en proceso de desprendimiento, barra = 0.33 µm. C. Resto de un cuerpo separado completamente de una célula expuesta a naproxeno-E.T., barra = 0.25 µm. D. Acercamiento a una sección una célula expuesta a naproxeno-E.T., donde se observa fragmentación del citosol, barra = 0.25 µm.
5.3. El naproxeno induce alteraciones ultraestructurales
en células de melanoma maligno humano (línea SK-MEL 2)
cultivadas in vitro.
Los estudios de microscopia electrónica de transmisión mostraron cambios estructurales a nivel nuclear y de superficie celular en las células de melanoma expuestas a concentraciones de naproxeno del 1% y 10%, por 24 horas. Los detalles morfológicos de las células melanómicas control (que recibieron solamente un volumen de PBS igual al volumen del tratamiento de las células que si se expusieron al fármaco), se muestran en las figuras 15 a 17.
A
B
Figura 17. Fotomicrografía electrónica de transmisión de la superficie apical de una célula de melanoma humano (control). Se observan la membrana celular íntegra, organelos celulares (secciones del retículo endoplásmico, mitocondrios y otras vesículas), además de numerosos estereocilios, característicos de muchos tipos de células epiteliales. Barra = 0.5 µm.
A
B
Figura 20. Fotomicrografías electrónicas de transmisión de células de melanoma humano expuestas a naproxeno en excipiente tópico al 1%, durante 24 horas. A. Detalles de estereocilios grandes desprendiéndose de la cara superior de la célula; barra = 0.66 µm. B. Detalle de un lóbulo de la célula en desprendimiento: obsérvese la cromatina electrodensa en su centro; barra = 0.59 µm. C. Célula en proceso de muerte, de donde provienen las muestras en A y B. La cara de adherencia mira hacia el lado izquierdo; barra = 1.66 µm.
B
C
D
A C
5.4. El naproxeno reduce la capacidad proliferativa en
células de melanoma humano (línea SK-MEL 2) cultivadas in
vitro.
A B
C D
A B C
D E
A.Control 4X. B.DMSO 10X.
C.Naproxeno 0,1% 10X. D.Naproxeno 1% 10X E.Naproxeno 10% 10X.
Figura 25. Aspecto de las colonias generadas durante la prueba de proliferación clonogénica para células de melanoma maligno humano (SK-MEL 2). Las células fueron expuestas a las concentraciones indicadas de naproxeno por 24 horas, luego de las cuales se tripsinizaron y sembraron a densidad adecuada para clonaje (1 x 101 células/mL) y se mantuvieron en crecimiento durante tres semanas. Nótese el efecto mínimo que el solvente (DMSO) provocó, respecto de los tratamientos que incluyeron al principio activo.
El análisis estadístico de los datos muestra que hay una diferencia significativa en las medias de formación de colonias proliferativas, dependiente de la concentración de naproxeno usada (P « 0.05). La prueba de Dunnett arroja que las medias son significativamente diferentes del control, usado como referencia (P « 0.05).
Los subgrupos homogéneos están conformados, según la prueba de Tukey, de la siguiente manera: 10% - 1% - 0,1% - DMSO, control. Así, el dimetil-sulfóxido usado como excipiente, muestra una actividad baja y no significativamente distinta del control, en ambos tiempos de exposición.
No obstante, no se encontró una diferencia significativa entre el número de colonias formadas según el tiempo de exposición al fármaco (P = 0,101, según ANDEVA de dos vías evaluando la independencia colonias-concentración y colonias-tiempo de exposición), por lo que se concluye que el efecto sobre la proliferación de las células de melanoma no difirió significativamente, bajo las condiciones experimentales, entre las células tratadas por 1 o por 24 horas con el fármaco, luego de 3 semanas de mantenimiento. Pese a que ambos tiempos de exposición provocaron un efecto similar en cuanto al número de colonias formadas luego de la dilución para clonaje, en ambos casos se observó un efecto citotóxico y citostático del naproxeno sobre las células SK-MEL 2. A mayor concentración del principio activo, las colonias aparecieron más desorganizadas y el número de células en ellas se redujo.
la alta actividad citotóxica del vehículo, la cual enmascaró la acción del AINE. Solamente los controles mostraron evidente proliferación (figura 26). El vehículo tópico dejó viables solamente unas cuantas células poco proliferativas, diseminadas en la placa, las cuales solamente llegaron a la formación de colonias muy pequeñas. Después de tres semanas de observación no se produjo formación de colonias para ninguno de los tratamientos.
5.5. El naproxeno induce muerte celular in vitro en las
líneas SK-MEL 2 y K562. Esta actividad no es aumentada por
la presencia del factor de necrosis tumoral alfa humano. El
TNF-
α
humano
induce
citotoxicidad
en las
células
melanómicas cultivadas in vitro.
Se procedió a evaluar la inducción de muerte celular al exponer los cultivos en condiciones in vitro durante 1 y 24 horas al AINE, a los solventes del mismo (DMSO y vehículo tópico), a una combinación naproxeno-TNF-α humano 10 nM y a TNF-α 10 nM solo. La inducción de muerte celular se calculó como porcentaje respecto de los controles tratados solamente con PBS y los experimentos se realizaron por triplicado.
Figura 27. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica humana (línea K562) por naproxeno 434 mM, en presencia y ausencia del factor de necrosis tumoral alfa humano (TNF-α), a 1 y 24 horas de tratamiento (normalización de experimentos realizados por triplicado, N= 3 por tratamiento/hora). Barras: desviación estándar.
significativamente diferente de la inducida en presencia del AINE, según la prueba estadística realizada.
Las células K562 expuestas a naproxeno disuelto en el excipiente tópico sufrieron porcentajes de mortalidad superiores al 90% en comparación a los controles tratados con PBS pero, en este caso, el efecto de enmascaramiento de la actividad del principio activo por el solvente compuesto es, como en la prueba de proliferación clonogénica, muy alto (duplicando incluso el efecto del DMSO). El análisis estadístico mostró que el tratamiento de las células con TNF-α 10 nM únicamente, no provoca diferencias significativas en la inducción de mortalidad a lo largo del experimento (P = 0,063). De hecho los porcentajes de mortalidad se mantuvieron en valores cercanos al 10% determinado en los experimentos anteriores (figura 28). No se determinó, de nuevo, sinergia en la inducción de muerte celular al combinar el AINE y la citoquina bajo las condiciones empleadas.
Figura 28. Muerte celular inducida en células de leucemia mieloide crónica humana (línea K562) por naproxeno disuelto en excipiente de uso tópico (E.T.), en presencia y ausencia del factor de necrosis tumoral alfa humano (TNF-α), durante 24 horas de tratamiento (normalización de experimentos realizados por triplicado, N= 3 por tratamiento/hora). Barras: desviación estándar.
bajo las condiciones empleadas. Pese a que el DMSO mostró actividad anticelular elevada, ésta fue menor que para el caso de las células leucémicas y menos del doble que para las células melanómicas expuestas al naproxeno.
Figura 29. Porcentaje de inducción de muerte celular por exposición a naproxeno-DMSO 434 mM, en células de melanoma maligno humano (SK-MEL 2), expuestas al fármaco por 1 y 24 horas. Los experimentos se hicieron en presencia y ausencia de TNF-α humano 10 nM (normalización de experimentos por triplicado, N= 3 por tratamiento/hora). Barras = desviación estándar.
tópico parece ser independiente de la línea celular tumoral empleada, pues tanto para el melanoma como para la leucemia el valor se ubicó en las cercanías del 70% (comparar las figuras 28 y 30). La actividad anticelular del TNF alfa humano contra las células de melanoma maligno cultivadas in vitro, después de 24 horas de exposición, fue superior al 40% (semejante a los resultados de las pruebas anteriores). No se observa sinergia en la actividad anticelular entre el AINE y la citoquina, confirmando resultados anteriores.
6. Discusión
Inducción de la enzima quinona oxidoreductasa como marcadora de las enzimas
de fase II en células de melanoma humano. La exposición a radiación ultravioleta
es el factor de riesgo ambiental cuyo papel es mejor entendido en el desarrollo del cáncer de piel. La luz UV causa daño al ADN, induce la supresión de la respuesta inmune y genera altas concentraciones de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células epiteliales (Thompson et al., 2005). Estos radicales son un factor de riesgo bioquímico, capaz de iniciar las células normales en su camino a la transformación maligna, dado el daño genotóxico que son capaces de infringir. La quimioprevención incluye desde la prevención de la generación de tales especies ROS hasta la inducción in situ de las enzimas capaces de neutralizarlas. Estas enzimas, denominadas de fase II, son controladas por el promotor ARE y su expresión es una barrera de protección contra el daño celular causado por estrés oxidativo. Las células tumorales poseen, regularmente, niveles muy bajos de expresión de tales enzimas, cuyo marcador bioquímico en diversos modelos experimentales es la inducción de la NQO-1 o NAD(P):H quinona oxidoreductasa.
células iniciadas), donde generalmente dicha expresión es reducida o está ausente totalmente (como en el caso del cáncer de próstata, Brooks et al., 2002).
Como demuestran los resultados de los experimentos descritos en la sección 5.1, las células de melanoma SK-MEL 2:
a. presentan un nivel basal de expresión de la NQO-1;
b. son susceptibles de incrementar los niveles de actividad de dicha enzima; c. la exposición de las células a naproxeno, bajo las condiciones in vitro de los
experimentos realizados, incrementa los niveles de expresión de la enzima estudiada (ver figuras 9 y 10).
Ninguno de los excipientes utilizados pudo duplicar el valor del CDQR (i.e. el
coeficiente de inducción de la quinona oxidoreductasa), criterio para considerar a una substancia como inductora de esta y otras enzimas de fase II (Prestera et al., 1993). Dicho valor se duplicó o sobrepasó solamente en presencia del naproxeno. El naproxeno disuelto en excipiente tópico mostró niveles un poco superiores de inducción enzimológica en comparación con el naproxeno disuelto en DMSO. No obstante, debe ensayarse la toxicidad in vivo tanto de ese excipiente como del DMSO ya que el análisis realizado fue in vitro y luego de una exposición de cinco minutos a los tratamientos, como es rutinario en este tipo de ensayos.
ligada a los microfilamentos de actina del citoesqueleto. KIAA0132 es el equivalente humano de la proteína murina Keap1 y los AINEs regulan su unión al Nrf2, alterando el estado de oxidación de los grupos tiol de las cisteínas que aferran al Nfr2 a su secuestrador citosólico (Sekhar et al., 2002). El estudio de Sekhar se centró en la indometacina, pero también mostró que el naproxeno es capaz de regular la liberación del Nrf2 de KIAA0132 y, así, inducir la expresión de la γ-glutamilcisteín sintetasa, una enzima de fase II que, al igual que la quinona oxidoreductasa (QR), es codificada por un gene regulado por el elemento ARE. La elección de la indometacina se debió a que se encontró en ella una actividad inductora superior al naproxeno, ibuprofeno, cetoprofeno y suprofeno, para la enzima mencionada. El mismo grupo de Sekhar y otros equipos de trabajo han demostrado que el OH del grupo carboxilo del AINE es esencial para la regulación negativa de la interacción KIAA0132-Nrf2, de forma que el factor de transcripción se libera, se transloca al núcleo e incrementa los niveles de ARNm de las proteínas reguladas por ARE, como en el caso de la inducción de la γ-glutamilcisteín sintetasa por indometacina.
modificación de las cisteínas en Keap1/KIAA0132 y el Nrf2, la que causaría la disrupción del complejo, con lo que el factor de transcripción puede entonces activar en el núcleo la sobre-expresión de la NAD(P)H:quinona oxidoreductasa, mecanismo que explicaría la inducciones mediadas por AINEs como la observada en ésta investigación. La estructura molecular del naproxeno concuerda con el modelo general de actividad propuesto por Prochaska et al. (1985), que desde aquél entonces registró la importancia de la ubicación de grupos hidroxilo en los compuestos aromáticos en la posición 2, y reconoció el hecho de que los inductores de las enzimas de fase II pueden provenir de muy diversas familias químicas.
Al igual que con la indometacina, sería interesante investigar si la señalización sensible al estado redox inducida por el naproxeno, está relacionada o no con la actividad de MEK 1 y ERK, que podrían regular la interacción Nrf2-KIAA0132; esto por cuanto inhibidores de MEK 1 (como el PD98059) pueden suprimir la acción de inducción de la respuesta Nrf2-ARE y el naproxeno debería actuar de forma similar a la indometacina (Sekhar, 2002). Este tipo de investigación estaría bien justificado, puesto que diversos estudios han relacionado la regulación de la actividad transcripcional del Nrf2 con vías de señalización mediadas por JNK, PKC, MEK 1 y PI3 (Huang et al., 2000; Yu et al., 2000; Zipper et al., 2000; Lee et al., 2001).
