TABLA DE CONTENIDO:
Introducción:
1. Objetivo.
2. Campo de Aplicación.
3. Referencia.
4. Definiciones.
5. Metodología.
6. Antecedentes.
7. Anexos.
INTRODUCCIÓN
Este método de ensayo describe la metodología para la determinación de residuos de ditiocarbamatos en frutas, vegetales y cereales. El ensayo consiste en degradar el producto a CS2 en presencia de ácido y cloruro de estaño, inyectado desde el Head-space al cromatógrafo y determinado por cromatografía de gases con detector ECD.
1. OBJETIVO
Cuantificación de residuos de ditiocarbamatos en frutas, vegetales y cereales por Head-space, cromatografía de gases con detector de captura electrónica GC-uECD y columna capilar por método de estándar externo.
2. CAMPO DE APLICACION
El alcance del método es para las siguientes matrices: frutas, vegetales y cereales.
El rango de trabajo lineal es de
0.17
mg/Kg a 2.0 mg/Kg (150 ug). Para concentraciones mayores tomar una alícuota del extracto final y diluir la muestra.3. REFERENCIA
3.1 Referencia del método.
a) Multi-residue method 5, Ditiocarbamates, general inspectorate for health protection, Ministery of public Health, Netherlands.
b) Analisys of ditiocarbamatos residues in foods of plant origin involving cleavage into carbon disulfure, parttioning in isooctane an determinative analysis by GC-ECD, Community Reference Laboratories for Residues of pesticides CRL, Germany.
3.2 Referencia de los documentos relacionados al procedimiento.
ITR-UCCIRT/Lab-03: Acondicionamiento de columna cromatografía capilar.
ITR-UCCIRT/Lab-06: Manejo del sistema de gases y la unidad de vacío de la UCCIRT.
ITR-UCCIRT/Lab-07: Lavado de material de vidrio UCCIRT.
4. DEFINICIONES
4.1 Ditiocarbamatos:
Los compuestos ditiocarbamatos comprenden una serie de sustancias que tienen una estructura química relacionada con la de los insecticidas y herbicidas carbamatos y su acción plaguicida se ejerce casi exclusivamente contra hongos.
5. METODOLOGÍA
5.1 Principios del método
La muestrapreparada es suspendida en una solución ácida de cloruro estañoso SnCl2, a 80 °C durante 2 horas, la reacción con los ditiocarbonatos presentes da lugar a la formación de disulfuro de carbono CS2, el cual es determinado por cromatografía de gases con headspace y con detector de captura de electrones, ECD.
La calibración se efectúa mediante la preparación de una curva matriz (de 3 a 6 niveles de calibración), a partir de una solución madre de CS2, los cuales siguen el mismo proceso de las muestras y son inyectados en un cromatógrafo de gases previamente acondicionado, el cual está provisto de una columna capilar no polar y un detector de captura de electrones. Del cromatograma obtenido, se derivan el tiempo de retención y la respuesta de señal del detector.
El extracto obtenido de la muestra, se inyecta al sistema cromatográfico. Se comparan los datos cromatográficos del extracto con los de la curva patrón, se identifican en la muestra
el pico
del componente de interés con su área correspondiente, la cual es proporcional a su concentración. Se calculan las concentraciones mediante el método del estándar externo.5.2 Precauciones de seguridad
5.2.1 Se requieren mandil, guantes y anteojos de protección.
5.2.2 El CS2 debe manejarlas con extremo cuidado y evitar el contacto, inhalación e ingestión.
5.2.3 Antes de iniciar algún mantenimiento del inyector (manga de entrada (liner) o septum) o en el caso de instalar/desconectar la columna, se apagan el inyector, detector y el horno y se espera que enfríen para evitar quemaduras.
5.2.4 Al cortar la columna capilar se recomienda usar lentes de protección para evitar lesiones por posibles partículas emitidas.
5.3 Precauciones
5.3.1 Precauciones de operación.
5.3.1.1 Es muy importante la limpieza del material de vidrio utilizado en este método para evitar interferencias durante el análisis. Aplique instructivo ITR-UCCIRT/Lab-07 Lavado de material de vidrio UCCIRT.
5.3.1.2 Se utiliza reactivos de grado analítico o de grado plaguicida que cumplan con las normas internacionales de calidad (ACS, ISO).
5.3.1.3 Cuando se preparar un reactivo o muestra de control se debe llenar el registro correspondiente REG-UCCIRT/ Lab-46 disponible en PRO-UCCIRT/Lab-06 Control de datos.
5.3.1.4 Se consulta el manual de operación del equipo cromatográfico para el buen manejo, mantenimiento preventivo y el manual de referencia del software para el manejo de los datos cromatográficos.
5.3.1.5 Se cambia el septum del equipo cromatográfico después de 200 inyecciones y se limpia el liner después de 200 inyecciones, pero cuando el equipo se utilice con otras columnas para otras aplicaciones cambiar cuando se realice dicho cambio.
5.3.1.6 En el cromatograma obtenido de la mezcla patrón se verifica si hay buena respuesta de señal para cada compuesto, una forma simétrica del pico, una línea de base regular y estable, y ausencia de picos interferentes. En caso contrario, se deben revisar las soluciones estándares preparadas o comprobar el buen funcionamiento del equipo.
5.4 Equipos y materiales
5.4.1 Sistema de cromatografía de gases el cual consiste en los siguientes elementos:
a. Inyector 'split/splitless' acoplado a Headspace.
b. Detector de captura electrónica uECD.
c. Columna capilar (RTx-5MTs 30m de longitud con 0.53 mm de diámetro interno y 1.5 m de espesor de película).
d. Línea de gas portador (nitrógeno ultra alta pureza), provista de tres purificadores especiales para la eliminación consecutiva de trazas de humedad, oxígeno y compuestos orgánicos en el gas portador.
e. Sistema de datos para registrar, manejar y calcular los parámetros y datos cromatográficos (computadora con instalación de software del equipo e impresora).
f. Estufa exclusivamente para análisis cromatográficos.
g. Balanza analítica con precisión de 0,1 mg.
h. Centrifuga refrigerada.
i. Baño maría a 80 °C.
j. Materiales de vidrio del laboratorio.
Frascos volumétricos, pipetas volumétricas, espátulas, pipetas Pasteur, micropipetas, Erlenmeyer de 125 con tapa esmerilada, todo material limpio y lavado según instructivo ITR-UCCIRT/Lab-07.
5.5 Reactivos
Se utiliza reactivos de grado analítico o superior (preferiblemente de grado plaguicida) que cumplen las normas internacionales de calidad (ACS o SO).
Por lo general el tiempo de preservación de los reactivos es un año como máximo, salvo que se indique lo contrario. Todos los reactivos se deben almacenar en recipientes adecuados, provistos de etiquetas con el nombre del reactivo, concentración, medio, fecha de preparación, fecha de vencimiento e iniciales del analista.
En caso de preparar un reactivo, se debe llenar el registro correspondiente, asimismo mantener un registro de la temperatura del refrigerador donde se almacenan los reactivos estándares.
a) metanol:
Grado ultraresiduos para GC, exento de interferencias bajo las condiciones del análisis.
b) Disulfuro de carbono CS2.
c) Estándar de thiram.
d) Cloruro estañoso SnCl2 P:A.
e) Ácido clorhídrico 37% para análisis.
f) Solución Stock de CS2 1 mg/ml en metanol.
En un frasco volumétrico colocar 126 ml, metanol, y añadir 100 µl de CS2, tapar inmediatamente y homogenizar. La solución preparada es estable durante 1 semana, guardada a 4°C. Descartar antes si hay aparición de moho
g) Solución Patrón de CS2- (40µg/ml)
En un frasco volumétrico colocar 24 ml de metanol y pipetea 1 ml de solución stock de CS2 (5.5.7). La solución preparada es estable durante 1 semana, guardada a 4°C. Descartar antes si hay aparición de moho.
h) Solución de reactivo hidrolisis
En un vaso disolver 1.5 g de cloruro estañoso SnCl2 en 100 ml de ácido clorhídrico 4N (33 ml acido al 37% en 100 ml agua). La solución preparada es estable durante 1 año, guardada a temperatura ambiente.
i) Solución stock de thiram (0.1mg/ml)
En un frasco volumétrico de 100 ml, pesar 10 mg de thiram y enrasar a 100 ml con metanol.
5.6 Optimización del método
Consúltese el manual de operación del equipo cromatográfico para el buen manejo y mantenimiento preventivo, y el manual de referencia del software para el manejo de los datos cromatográficos.
5.6.1 Condiciones cromatográficas.
Usar el equipo con las condiciones cromatográficas dadas en la tabla 1, variar las condiciones de temperatura o rampas del horno si existen interferencias en la matriz de la muestra analizada.
Tabla1: Parámetros de cromatografía de gases
5.6.2 Acondicionamiento del sistema
5.6.2.1 Seguir las instrucciones del instructivo ITR-UCCIRT/Res-14 Manejo del cromatógrafo de gases con detector uECD, para el encendido y manejo del equipo.
5.6.2.2 Se carga el software ‘Chem station” mediante un doble clic sobre el ícono 1, ubicado en el escritorio de la computadora.
5.6.2.3 En el caso que el programa no haya cargado el método ‘ditiocarbamatos.m’ (indicado en la casilla correspondiente de la ventana activa), se selecciona el comando ‘File’, seguido por ‘Load’, ‘Method’, ‘ditiocarbamatos y ‘Ok’.
5.6.2.4 En el método ‘ditiocarbamatos.gcm’ están almacenados todos los parámetros cromatográficos relevantes de los cuales algunos son mencionados en la tabla 1.
5.6.2.5 Cuando el detector uECD alcance la temperatura programada (250 C), se sube la temperatura del inyector a 200 C y el horno a 200 C para acondicionar el sistema (mediante software o teclas y sus tablas de control respectivas).
Columna RTx5Sil, 30 m x 0.53 mm x 1.5 µm, Tmax = 310 ºC Inyector Split/splitless', 200 °C acoplado a Headspace Detector uECD a 250 °C
Makeup (N2) = 60 ml/min
Horno 35°C 5min, 30°C/min a 220°C 5 min
Gas portador N2, flujo: 3.06 ml/min (velocidad lineal cte.) Modo Inyección Split-Headspace
Headspace Temperaturas oven 75°C Loop 85°C Tr line 115°C Agitacion lenta
GC cyclo time 30 min Vial temp equilibrio 30 min Presion time 0.2 min Loop equi time 0.05 min Injection time 1.5 min
5.6.2.6 Se vuelve a restablecer las condiciones operacionales normales, fijando la temperatura del inyector a 200 C y el horno a 35 C (mediante el software o teclas
‘Download Parameters’).
5.6.2.7 Para comprobar el buen funcionamiento del cromatógrafo de gases y posibles interferencias, se opta primero por la inyección de 1 o 2 alícuotas del estándar.
5.6.3 Preparación de la curva de calibración
5.6.3.1 Se prepara una serie de patrones de calibración a un mínimo de 3 a 6 niveles de concentración añadiendo con pipeta a viales de autosampler, los volúmenes indicados de la mezcla patrón de CS2 (40 mg/ml) en la tabla 2:
Tabla 2: Niveles de concentración de los patrones de calibración
Estándares
Volumen de CS2 40 mg/ml
(µl)
Volumen final de
agua destilada (ml) concentración (ug/ml)
Est1 10 8.0 0.2
Est2 25 8.0 0.5
Est3 100 8.0 2.0
Est4 300 8.0 6.0
Est 5 500 8.0 10.0
5.6.3.2 Los estándares preparados siguen el procedimiento que las muestras a partir de 5.7.4.
5.6.3.3 Se realiza las corridas de cada estándar como se indica en la sección 5.7.5.
5.6.3.4 Se construye la curva de calibración, recalibrando cada nivel de concentración . Nota.- se verifica los coeficientes de correlación de cada compuesto (r2). Debe ser r2
>0.99, en caso contrario verifique el procedimiento y repita la curva de calibración.
5.6.4 Impresión de los datos cromatográficos
5.6.4.1 Cuando la corrida cromatográfica y el procesamiento de los datos por el software han terminado, se selecciona el comando ‘Report’ y se escoge un modelo de reporte creado en el programa y se selecciona el comando “print” para imprimir el cromatograma junto con el listado de los tiempos de retención y áreas integradas de los picos.
5.6.4.2 Con la ayuda de la tabla 3 y el gráfico 1, se estudia el cromatograma obtenido para el estándar de calibración, en condiciones óptimas de funcionamiento del cromatógrafo de gases, y se verifica la identificación de los picos (realizada por el software) que corresponden con la elusión de los compuestos.
5.6.4.3 En el cromatograma obtenido, se verifica si hay buena respuesta de señal para cada compuesto, una forma simétrica del pico, una línea de base regular y estable, y ausencia de picos interferentes. En el caso contrario, se deben revisar las soluciones estándares preparadas, o comprobar el buen funcionamiento del equipo.
Tabla 3: Tiempos de retención aproximados
No. Compuesto Tiempo de retención (min)
1 CS2 5.787
Gráfico 1: Cromatograma de un estándar de CS2 (10.0 µg/ml)
5.7 Análisis de muestra
5.7.1 Se prepara un blanco de reactivo,
con 3 ml de agua y 5 ml de reactivo hidrólisis,
se sigue todo el proceso de la muestra.5.7.2 Se prepara una muestra fortificada con estándar
de thiram de 100 ppm, 50 uL (o una alícuota menor o mayor)
en 2.5 g de muestra blanco.5.7.3 Se prepara cada
20
muestras un duplicado. Seguir el paso 5.7.3. para ambas muestras.5.7.4 Preparación de las muestras.
Las muestras que ingresan una vez identificado se trozan en pequeñas porciones, se le retira las pepas y cáscaras muy duras y de tamaño considerable por ejemplo de palta, durazno entre otros, luego se conservan a temperatura menor de – 10ºC, hasta el momento de su molienda y análisis.
Hidrolisis y partición:
a)
Se pesa 2.5 g de muestra homogénea en un vial headspace de 20 ml y seañade 0.5 ml de agua y 5 ml de reactivo hidrolisis
; para productos secos se debe moler finamente, se pesa 1 g de muestra y se adiciona2.5 ml de agua y se añade 5 ml de reactivo hidrólisis.
b) Se tapa y se coloca en baño maría durante 2 horas a 80°C con agitación
ocasional cada 20 minutos.
c) Se deja enfriar y se inyecta en el Headspace.
5.7.5 Determinación GC-ECD
5.7.5.1 Se crea una secuencia para la inyección de la muestras, en el real time presionando
“Bath Processing” guarde el bath creado con la fecha de inyección y el directorio correspondiente análisis de ditiocarbamatos.
5.7.5.2 Se ingresa la información necesaria (ver instructivo ITR-UCCIRT/Res-14) Se selecciona la location del vial (1), la sample name (mezcla estándar), method file (ditiocarbamatos). Inyec/location (1ul) y datafile (blanco) y otros. Ver tabla de secuencia tabla 4.
5.7.5.3 Se crea la secuencia del bach de acuerdo a la tabla 4. Muestra: Código correlativo de muestra, ejemplo muestra M125
Tabla 4. Tabla de secuencia
Vial Name Sample Method name Inyec datafile
1 Bk ditiocarbamatos 1ul BkXX
2 Estándar 1 ditiocarbamatos 1ul STP01 3 Estándar 2 ditiocarbamatos 1ul STP02
4 Estándar 3 ditiocarbamatos 1ul STP03 5 Estándar 4 ditiocarbamatos 1ul STP04 3 Estándar 5 ditiocarbamatos 1ul STP05
2 Blanco ditiocarbamatos 1ul BR
4 Control ditiocarbamatos 1ul STC01
5 Muestra 125 ditiocarbamatos 1ul M125-1 5 Muestra 125 ditiocarbamatos 1ul M125-2
5.7.5.4 Se presiona la tecla ‘start’. El automuestreador automáticamente inyecta todas las muestras en el cromatógrafo de acuerdo a la tabla de secuencia. Se guardará el resultado y el cromatograma de cada muestra en el archivo asignado.
5.7.5.5 Después de analizar una serie de
20
muestras, se debe volver a calibrar mediante la inyección de por lo menos 1 estándar.5.7.6 Impresión de los datos cromatográficos
Para imprimir los datos cromatográficos del blanco, muestras y estándares, seguir el procedimiento descrito en párrafo 5.6.4.
5.8 Cálculos y expresión de resultados
5.8.1 La información para la cuantificación se encuentra en cada cromatograma de muestras, estándares y blancos respectivamente.
5.8.2 Cuantificación de ditiocarbamatos totales
Se deriva de la curva de calibración, tener en cuenta el factor de dilución de la muestra.
m p
m p
p
W A
Vf A /100) (P
= Q
C
Donde:
C = concentración de la muestra expresado como CS2, en mg/Kg
Qp = cantidad inyectada del plaguicida individual presente en la mezcla patrón, en mg/L
Pp = pureza del estándar de plaguicida individual en forma sólida en %;
Am = área de pico integrada del CS2 en el cromatograma del extracto de la muestra Ap = área de pico integrada del CS2 de la mezcla patrón
Wm = Peso de la muestra, en g Vf =volumen final en ml
Se reporta como ditiocarbamatos totales como CS2.
5.9 Control de Calidad
Parámetro de calidad
Interno Frecuencia Criterio de
aceptación Acción inmediata Acciones en casos reiterativos * Blanco reactivo En cada lote de
muestras analizadas < LoD
Corroborar la lectura, inyectando
nuevamente, y verificar blanco matriz
Verificar solventes usados.
Repetir lote analizado, tres o más casos consecutivos, generan un SACP.
Blanco matriz En cada lote de
muestras analizadas < LMR
Cuando no se encuentre disponible, utilizar como adición estándar,
No Aplica
Calibración curva matriz mínimo 3 puntos
En cada lote de
muestras analizadas r> 0.95 Calibrar nuevamente
Verificar mantenimiento del equipo. Repetir la curva de calibración y las inyecciones de las muestras
Duplicados
Cada 20 muestras analizadas o en cada lote.
RSD <20% Repetir la muestra analizada
Verificar la homogeneidad de la muestra y repetir el análisis de los duplicados.
Muestra o blancos fortificados
En cada lote de muestras analizadas
Recuperación 50%-130%**
Repetir la muestra analizada
Verificar la homogeneidad de la muestra y repetir análisis de la muestra fortificada.
Estándar de verificación de
calibración Cada 20 muestras
RSD < 20%
respecto a la calibración inicial
Calibrar nuevamente
Verificar estándares y fechas de vencimiento, calibrar nuevamente y repetir las inyecciones del lote analizado
* tres o más casos consecutivos generan una SACP
** Según el plaguicida y de acuerdo a las cartas de control.
LoD = Límite de detección del método LMR = tolerancias permitida
6. ANTECEDENTES
No Aplica.
7. ANEXO No Aplica.
