Cromatografía Líquida

C ro m a to g ra fí a L íq u id a T ip o s d e C ro m a to g ra fí a L íq u id a ( L C ) - C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o - E n f a s e n o rm a l - E n f a s e r e v e rs a - C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r - C ro m a to g ra fí a q u ir a l -C ro m a to g ra fí a d e a d s o rc ió n - C ro m a to g ra fí a d e i n te rc a m b io i ó n ic o ( IE X ) - A n ió n ic a - C a ti ó n ic a - C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC ) - C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o - E l s o p o rt e t ie n e n a tu ra le z a i n e rt e . L o s c o m p u e s to s d e l a m u e s tr a n o i n te ra c c io n a n c o n l a m a tr iz s in o c o n e l fl u id o q u e l a s o lv a ta , q u e e s l a v e rd a d e ra f a s e e s ta c io n a ri a . - C . lí q u id o -l íq u id o . L a f a s e e s ta c io n a ri a l íq u id a s e r e ti e n e s o b re l a s u p e rf ic ie d e l s o p o rt e p o r a d s o rc ió n f ís ic a . - C . d e f a s e u n id a q u ím ic a m e n te . L a f a s e e s ta c io n a ri a s e u n e q u ím ic a m e n te a l a s u p e rf ic ie d e l s o p o rt e . - E l m a te ri a l d e p a rt id a s o p o rt e p a ra p re p a ra r la f a s e e s ta c io n a ri a e s s íl ic e . P a rt íc u la s m e c á n ic a m e n te r e s is te n te s , p o ro s a s y u n if o rm e s d e d iá m e tr o d e 3 , 5 o 1 0 µ m . - L a s íl ic e s e h id ro liz a p a ra l ib e ra r g ru p o s s ila n o l, q u e s e p u e d e n d e ri v a ti z a r fá c ilm e n te . E n g e n e ra l la d e ri v a ti z a c ió n n o e s t o ta l p o r im p e d im e n to e s té ri c o . L o s g ru p o s – O H lib re s s e p u e d e n b lo q u e a r c o n m o lé c u la s p e q u e ñ a s p a ra e v it a r e fe c to s r e la c io n a d o s c o n l a p o la ri d a d .

-Si-OH

-Si-

HO

-Si-

HO i- -S H O

i- -S H O i-O -S H

i-O -S H

i-O -S H

i-O -S H

-Si-OH -Si-OH

-Si-O H

-Si-OH -Si-OH

-Si-OH -Si-OH -Si-OH

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o e n f a s e n o rm a l - U s o d e f a s e e s ta c io n a ri a p o la r y d e u n d is o lv e n te a p o la r c o m o f a s e m ó v il. - L o s r e lle n o s c o m e rc ia le s d e f a s e n o rm a l u n id a q u ím ic a m e n te t ie n e n c o m o g ru p o o rg á n ic o e n l a c a d e n a d e l s ilo x a n o u n g ru p o f u n c io n a l p o la r: c ia n o < d io l < a m in o - E l c o m p o n e n te m e n o s p o la r e lu y e p ri m e ro d e b id o a q u e re la ti v a m e n te e s m á s s o lu b le e n l a f a s e m ó v il. -E l o rd e n d e p o la ri d a d e s p a ra l o s g ru p o s f u n c io n a le s m á s c o m u n e s e n lo s a n a lit o s e s :

hidrocarburo < éter < cetona < aldehído < amina < alcohol < carboxílico

- U n a u m e n to d e l a p o la ri d a d d e l a f a s e m ó v il p ro v o c a l a d is m in u c ió n d e l ti e m p o d e e lu c ió n . - L o s d is o lv e n te s u ti liz a d o s c o m o f a s e m ó v il s o n m u y a p o la re s c o m o c lo ro fo rm o , d ie ti le te r, h e x a n o .

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o e n f a s e r e v e rs a

La hidrólisis del xiloxanoocurre a valores de pH por encima de 7.5

-El 75% de toda la cromatografía de alta eficacia se realiza con esta técnica. -La fase estacionaria es más hidrofóbicaque la fase móvil. -En rellenos C 8(octilo) y C 18(octadecilo) los grupos hidrocarburo se alinean uno junto a otro y en perpendicular a la superficie de la partícula, dando lugar a una estructura similar a una brocha. Grupo silanollibre Grupo octadecilo Bloqueo de grupos silanol

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o e n f a s e r e v e rs a

-Uso de gradientesde proporción de disolvente orgánico, desde un alto contenido acuoso en condiciones iniciales a mayor contenido orgánico para facilitar la elución de los compuestos más apolares. Ajusta los t Ry disminuye el ensanchamiento de banda. -La temperaturaes otro factor crítico en cromatografía en fase reversa. La viscosidad de la fase móvil disminuye con mayores temperaturas de columna, y por ello la transferencia de masa entre la fase móvil y la estacionaria es mejor y la resolución aumenta. La temperatura de la columna se controla y fija. -Las aplicaciones de esta técnica son muchas, pero en general se aplica al análisis de moléculas pequeñas, incluyendo metabolitos o fármacos.

-El recubrimiento enlazado se puede tratar como si fuera un líquido convencional retenido físicamente similar a una fase estacionaria de líquido-líquidoordinaria (C. de reparto). -Los disolventes más utilizados como fase móvil son agua con proporciones variables de acetonitrilo y/o metanol. -El componente más polar de la muestra eluyeprimero -Modificar el factor de retención, k’es lo normal para mejorar la resolución de la separación. Ello se hace variando la polaridad de la fase móvil, con la proporción de disolventes polares/apolares. Una disminución de la polaridad de la fase móvil provoca la disminución del tiempo de elución.

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l - C ro m a to g ra fí a d e r e p a rt o e n l a q u e l a f a s e e s ta c io n a ri a e s tá c o n s ti tu id a p o r e l lí q u id o a tr a p a d o e n l o s p o ro s d e l a m a tr iz . -N o h a y i n te ra c c ió n c o n l a m a tr iz d e n in g ú n t ip o p o r lo q u e l a c o m p o s ic ió n d e l a f a s e m ó v il n o e s t a n d e te rm in a n te c o m o e n o tr a s t é c n ic a s . -E lu c ió n i s o c rá ti c a . P a ra e v it a r in te ra c c io n e s i n e s p e c íf ic a s s e s u e le a ñ a d ir N a C l. C o n d ic io n e s n o rm a le s s o n t a m p ó n f o s fa to s ó d ic o 2 0 m M , p H 7 .0 , c o n N a C l 0 .1 5 M . - U s o d e d is o lu c io n e s t a m p o n a d a s p a ra l a s e p a ra c ió n d e m a c ro m o lé c u la s ( p ro te ín a s ) e n f u n c ió n d e l ta m a ñ o . - L a s s e p a ra c io n e s s e p u e d e n l le v a r a c a b o e n l a p re s e n c ia d e i o n e s m e tá lic o s e s e n c ia le s o c o fa c to re s , y u s a n d o d e te rg e n te s , u re a o g u a n id in a . T a m b ié n s e p u e d e v a ri a r la c o n c e n tr a c ió n d e s a le s o l a t e m p e ra tu ra e n f u n c ió n d e l e x p e ri m e n to .

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l -L o s c o m p o n e n te s m á s g ra n d e s d e l a m u e s tr a e lu y e n p ri m e ro a l n o p e n e tr a r e n l o s p o ro s . L o s m á s p e q u e ñ o s p a s a n p o r to d o s l o s p o ro s y s u t ie m p o d e e lu c ió n (

t R

) e s m a y o r. -L a m a tr iz m á s h a b it u a l e s d e x tr a n o e n tr e c ru z a d o .

F ra c c io n a m ie n to d e p ro te ín a s e n f u n c ió n d e s u t a m a ñ o .

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l V

e

= V

0

+ K

d

—V

i

K

d

= ( V

e

-V

0

)/ V

i

= c

S

/c

M

A p lic a c ió n . D e te rm in a c ió n d e l p e s o m o le c u la r d e p ro te ín a s V

t

= V

0

+ V

i

+ V

g

V0 Ve Vt-V0

Vt Volumen

Se ña l

Tamaño intermedio

In ye cc ió n

Gra n t am añ o

Pe qu eñ o t am añ o

(Vol. total) (Vol. muerto)

V

t

V

0

V

t

-V

0

V

i

(V o l. i n te rn o ) V

g

(V o l. d e l g e l/ m a tr iz )

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l A p lic a c ió n . D e te rm in a c ió n d e l p e s o m o le c u la r d e p ro te ín a s

K av

e s f á c ilm e n te c a lc u la b le y p e rm it e l a d e te rm in a c ió n d e p e s o s m o le c u la re s s ó lo m id ie n d o l o s v o lú m e n e s d e e lu c ió n d e l a m u e s tr a y e s tá n d a re s ( in c lu y e n d o p a ra V

0

y V

t

).

00

V V

V V K

te av

− − =

i

e gt

e d

V

V V V V V

V V K

0 0

0

− = − − − =

V0 Ve Vt-V0

Vt Volumen

Se ña l

Tamaño intermedio

In ye cc ió n

Gra n t am añ o

Pe qu eñ o t am añ o

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l A p lic a c ió n . D e te rm in a c ió n d e l p e s o m o le c u la r d e p ro te ín a s

Purificación de una enzima por cromatografía de filtración en gelen dextranoentrecruzado.

K

av log Pesomolecular

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e e x c lu s ió n m o le c u la r / fi lt ra c ió n e n g e l - S e p a ra c ió n e n g ru p o s , m o lé c u la s p e q u e ñ a s f re n te a m a c ro m o lé c u la s , s in u n fr a c c io n a m ie n to d e l a s m is m a s . - U ti lid a d e n “

desalar”

m u e s tr a s b io ló g ic a s , p a ra e lim in a r rá p id a m e n te ta m p o n e s o s a le s p ro v e n ie n te s d e p a s o s d e e x tr a c c ió n o p u ri fi c a c ió n . - L a s m a tr iz m á s u ti liz a d a s e s s e fa ro s a e n tr e c ru z a d a .

A p lic a c ió n . E lim in a c ió n d e t a m p o n e s y s a le s ( d e s a lt in g )

se ña l

tiempo / volumen

In ye cc ió n

V 0V t

proteína sal

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a q u ir a l

-Separación de moléculas ópticamenteactivas (con centros quirales). -Quirales aquella molécula no superponible con su imagen especular. -Importancia bioquímica y por ello, en la industria farmaceútica. El 60% de los medicamentos son quirales, y de ellos el 45% se venden como racematos. -Las únicas diferencias entre enantiómerosse observan en entornos quirales. -Para la separación cromatográfica se necesita una fase estacionaria quiral. S-quetoprofenoR-quetoprofeno Analgésico, antiinflamatorioPreviene pérdida de hueso periodontal

C ro m a to g ra fí a L íq u id a

Matriz

C ro m a to g ra fí a q u ir a l

-Inmovilización de una molécula quiralque interacciona con la muestra. -El reconocimiento implica interacciones de puente de hidrógeno, dipolares, transferencia de carga y/o de bloqueo estérico. Componente quiralAplicación (R)-fenilglicinaésteres, amidas, (R)-naftilglicinaalcoholes, cetonas (S)-valinaác. carboxílicos (S)-leucina (S)-prolinaaminas, amidas, (S)-indoline-carboxílicoamino alcholes

Ejemplos

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e a d s o rc ió n - L a m a tr iz i n te ra c c io n a r e v e rs ib le m e n te c o n t o d o s o p a rt e d e l o s c o m p o n e n te s d e l a m u e s tr a . - T é c n ic a s d if e re n te s e n f u n c ió n d e l ti p o d e i n te ra c c ió n q u e s e u ti lic e . P ro c e s o g e n e ra l:

1. Equilibrado. Condiciones iniciales para que interaccionen las moléculas de la muestra

2. Aplicación y Adsorción. Los componentes que no se unen son lavados de la columna.

3. Desorción. Condiciones de elución que perjudican la interacción con la matriz. Pasos o gradiente.

4. Lavado. Condiciones de elución más drásticas para que eluyael resto de componentes.

5. Regeneración. Re-equilibrado de las condiciones iniciales para la siguiente separación cromatográfica.

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te rc a m b io i ó n ic o ( IE X )

-Es una cromatografía de adsorción que se basa en las fuerzas electrostáticas creadas entre las especies de la muestra y la fase estacionaria. -La separación depende de la adsorción reversible de las moléculas cargadas de soluto en los grupos intercambiadores de iones de carga opuesta.

P ro c e s o :

1. Equilibrado.2. Aplicación y Adsorción.3. Desorción.4. Lavado.5. Regeneración.

+

+ + +

+ ++ ++

+++ ++ - o

+ + ++

++ ++ ++ ++

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te rc a m b io i ó n ic o ( IE X )

-Puesto que la separación depende de la carga, el pH de la fase móvil es un factor crítico en IEX. Para las moléculas de la muestra, la carga es mayor cuanto más alejado estéel pH de la fase móvil del valor de su punto isoeléctrico: pH = pI→z = 0 pH < pI→z = (+) pH > pI→z = (-) -Los disolventes más utilizados como fase móvil son agua con sustancias tamponadorasa baja concentración (20-50 mM) al pH elegido para las condiciones iniciales. -La elución de las especies retenidas se puede llevar a cabo cambiando el pH del medio o aumentando la fuerza iónica (generalmente). El uso de sales aporta los contra-iones necesarios para la fase estacionaria. Asícompiten con las cargas de los componentes de la muestra. -El componente que tenga mayor carga contraria a la fase estacionaria queda más retenido y eluyemás tarde.

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te rc a m b io i ó n ic o ( IE X ) M a tr ic e s : IE X a n ió n ic a y c a ti ó n ic a

Intercambiadores fuertes (Q y S) -Interacción más fuerte -Sufren menos variaciones en su capacidad de carga en función del pH -Rango mayor de pH de trabajo

Intercambiador aniónico, con contraiones

- - - - - -

- + +

+ + +

Intercambiador catiónico, con contraiones

+ - -

- - -

+

+ + + +

Intercambiadores aniónicosGrupo funcional Dietilaminoetil(DEAE)-O-CH 2-CH 2-N+ H(CH 2CH 3) 2 Amonio cuaternario (Q)-O-CH 2-CHOH-CH 2-O-CH 2-CHOH-CH 2-N+ (CH 3) 3 Intercambiadores catiónicosGrupo funcional Carboximetil(CM)-O-CH 2-COO- Metilsulfonato(S)-O-CH 2-CHOH-CH 2-O-CH 2-CHOH-CH 2SO 3-

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te rc a m b io i ó n ic o ( IE X ) A p lic a c io n e s - E s l a t é c n ic a c ro m a to g rá fi c a m á s f re c u e n te e n l a e n l a s e p a ra c ió n y p u ri fi c a c ió n ( fá c ilm e n te e s c a la b le a e s c a la s e m i- p re p a ra ti v a ) d e p ro te ín a s , p o lip é p ti d o s , á c id o s n u c le ic o s y o tr a s b io m o lé c u la s c a rg a d a s . - S e s u e le u ti liz a r c o m o p ri m e r p a s o e n u n a e s tr a te g ia c o m b in a d a d e p u ri fi c a c ió n d e p ro te ín a s p o r s u a lt a c a p a c id a d d e c a rg a y l im it a d o e fe c to e n l a e s tr u c tu ra / a c ti v id a d . E je m p lo

Purificación de una enzima por cromatografía de intercambio aniónico, en una columna de matriz de poliestirenoy divinilbenzeno(15 µmde tamaño de partícula) derivatizadacon grupos trimetilamonio(Q).

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C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC )

-Cromatografía de adsorción que se basa en las interacciones hidrofóbicascreadas entre las especies de la muestra y una fase estacionaria hidrofóbica. -La separación depende de la adsorción reversible de las partes hidrofóbicasde las moléculas (“parches hidrofóbicos”en el caso de proteínas). -Adsorción propiciada por sales anti-caotrópicas(propician el orden en las moléculas de agua y estabilizan interacciones intramoleculares de tipo no covalente y no iónico: hidrofóbicas, van derWaalsy puentes de hidrógeno), que son formadoras de estructuras. Son las mismas sales responsables delefecto “salting- out”en la precipitación fraccionada de proteínas.

ma tri z

ma tri z

ligandoligando

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC ) -M

atriz

- L a s e p a ra c ió n d e p e n d e d e l a a d s o rc ió n r e v e rs ib le d e l a s m o lé c u la s a l a m a tr iz q u e e s tá d e ri v a ti z a d a c o n g ru p o s h id ro fó b ic o s a lq u ilo o a ri lo . - E n g e n e ra l, c a d e n a s l in e a le s h id ro c a rb o n a d a s (a lq u ilo ) m u e s tr a n u n c a rá c te r h id ro fó b ic o p u ro , m ie n tr a s q u e l o s l ig a n d o t ip o a ri lo t ie n e n u n t ip o d e c o m p o rt a m ie n to m ix to d o n d e l a s i n te ra c c io n e s a ro m é ti c a s s e s u m a n a la s h id ro fó b ic a s . -L a c a p a c id a d d e c a rg a a u m e n ta c o n l a lo n g it u d d e l a c a d e n a c a rb o n a d a , p a ra u n m is m o g ra d o d e s u s ti tu c ió n . - L a e le c c ió n e n tr e l ig a n d o s a lq u ilo o a ri lo e s e m p ír ic a y d e b e s e r e s tu d ia d a p a ra c a d a s e p a ra c ió n c ro m a to g rá fi c a .

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC )

-Fase móvil

- L a a d ic ió n d e s a le s a n ti c a o tr ó p ic a s (‘ ‘s a lt in g o u t’ ’) a l ta m p ó n d e e q u ili b ri o y a l a m u e s tr a a n te s d e s u i n y e c c ió n , p ro m u e v e n l a s in te ra c c io n e s e n tr e l a s m o lé c u la s d e l a m u e s tr a y e l lig a n d o d e l a m a tr iz . - E n e l c a s o d e p ro te ín a s , e l a u m e n to e n l a c o n c e n tr a c ió n d e s a le s p ro v o c a u n a u m e n to e n l a c a n ti d a d d e p ro te ín a u n id a d e m a n e ra l in e a l h a s ta u n a c o n c e n tr a c ió n d e s a l, y a p a rt ir d e a h í e l a u m e n to c o n ti n ú a d e m a n e ra e x p o n e n c ia l a l a c o n c e n tr a c ió n d e s a l. -S e ri e d e H

ofmeister

p a ra l a p re c ip it a c ió n d e p ro te ín a s : M a y o r e fe c to d e p re c ip it a c ió n ( “s a lt in g -o u t” ) A n io n e s : P O

43-

, S O

42-

, C H

3

-C O O

-

, C l

-

, B r

-

, N O

3-

, C lO

4-

, I

-

, S C N

-

C a ti o n e s : N H

4+

, R b

+

, K

+

, N a

+

, C s

+

, L i

+

, M g

2+

, C a

2+

, B a

2+

M a y o r e fe c to c a o tr ó p ic o (“ s a lt in g in ”)

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC )

-Adsorción propiciada por las sales “saltingout”. -La elución se provoca con un descenso en la concentración de la sal de la fase móvil. -Separación de los componentes de la muestra en función de los grupos hidrofóbicos expuestos en la superficie. -Atención en el trabajo con proteínas para evitar condiciones muy drásticas (tipo de ligando principalmente) que afecten irreversiblemente a la estructura de la proteína (desnaturalización). 1. Equilibrado.2. Aplicación y Adsorción.3. Desorción.4. Lavado.5. Regeneración.

↑(NH 4) 2SO 4↑(NH 4) 2SO 4↓(NH 4) 2SO 4↑(NH 4) 2SO 4(NH 4) 2SO 4

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e i n te ra c c ió n h id ro fó b ic a (H IC ) - L a b a s e p a ra a l a d s o rc ió n d e b io m o lé c u la s a l o s m e d io s d e c ro m a to g ra fí a d e in te ra c c ió n h id ro fó b ic a e s c o m p le m e n ta ri a a l o s d e l a c ro m a to g ra fí a d e in te rc a m b io i ó n ic o y f ilt ra c ió n e n g e l. P o r e llo p u e d e u ti liz a rs e e n e s tr a te g ia s c o m b in a d a s d e p u ri fi c a c ió n . - H IC e s l o s u fi c ie n te m e n te s e n s ib le c o m o p a ra s e r in fl u e n c ia d a p o r la p re s e n c ia d e g ru p o s n o -p o la re s n o rm a lm e n te e s c o n d id o s e n l a e s tr u c tu ra te rc ia ri a d e p ro te ín a s p e ro q u e p u e d e n s e r e x p u e s to s s i la c a d e n a p o lip e p tí d ic a n o e s tá c o rr e c ta m e n te p le g a d a .

Purificación de una enzima por cromatografía de interacción hidrofóbica, en una columna de matriz de poliestirenoy divinilbenzeno(15 µmde tamaño de partícula) derivatizadacon grupos isopropilo(ISO).

E je m p lo

1234

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d - S e p a ra r b io m o lé c u la s (p ro te ín a s ) e n b a s e a u n a i n te ra c c ió n r e v e rs ib le e n tr e u n a p ro te ín a s ( o g ru p o d e p ro te ín a s ) y u n l ig a n d o e s p e c íf ic o a c o p la d o a u n a m a tr iz c ro m a to g rá fi c a . -L a t é c n ic a e s i d e a l p a ra l a c a p tu ra d e b io m o lé c u la s s ie m p re q u e e x is ta u n l ig a n d o d is p o n ib le p a ra l a p ro te ín a d e i n te ré s . - T ie n e m u y a lt a s e le c ti v id a d y p o r e llo a lt a r e s o lu c ió n . A s í m is m o s u e le te n e r g ra n c a p a c id a d d e c a rg a d e l a p ro te ín a d e i n te ré s , a lt o r e n d im ie n to y m u y a lt a p u ri fi c a c ió n d e l a m u e s tr a . -L a s p ro te ín a s o b je ti v o s e r e c o g e n e n u n a f o rm a p u ri fi c a d a y c o n c e n tr a d a . -L a s i n te ra c c io n e s e n tr e l a p ro te ín a y s u l ig a n d o p u e d e n s e r e l re s u lt a d o d e i n te ra c c io n e s e le c tr o s tá ti c a s , h id ro fó b ic a s , d e f u e rz a s d e v a n d e r W a a ls y /o p u e n te d e h id ró g e n o .

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d

-Una purificación exitosa requiere un ligando bio-específico que pueda ser unido covalentementea una matriz cromatográfica. -El ligando acoplado a la matriz debe retener su capacidad de unión específica por las moléculas objetivo y, después de lavar el material que no ha interaccionado, la unión entre el ligando y la proteína objetivo debe ser reversible para permitir eluira la proteína en una forma activa. -Cualquier componente se puede usar como ligando para unir a unapareja. -Interacciones biológicas típicas usadas en cromatografía de afinidad son: •Enzima ↔análogo de sustrato, inhibidor, cofactor •Anticuerpo

↔

antígeno, virus, célula •Lectina

↔

polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula •Ácido nucleico

↔

secuencia complementaria, histonas, polimerasa, proteína de unión al ADN •Hormona, vitamina

↔

receptor, proteína transportadora •Glutatión

↔

proteínas de fusión GST o glutatión-S-transferasa •Iones metálicos (Ni)

↔

proteínas de fusión Poly-His, proteínas nativas con histidinascisteínasy/o triptófanosen su superficie.

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d

-Adsorción propiciada por un tampón de unión (“bindingbuffer”) que fomenta la interacción. -Muestra aplicada en las mismas condiciones. La molécula objetivo se une al ligando. -La molécula objetivo se recupera cambiando las condiciones para favorecer la elución. Puede ser una elución específica usando un ligando competitivo o inespecífica, cambiando el pH, fuerza iónica o polaridad. La muestra se recoge purificada y concentrada.

1. Equilibrado. 2. Aplicación y Adsorción. 3. Desorción. 5. Regeneración.

P ro c e s o

C ro m a to g ra fí a L íq u id a C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d - E n u n s o lo p a s o , la p u ri fi c a c ió n p o r a fi n id a d p u e d e o fr e c e r u n g ra n a h o rr o d e ti e m p o s o b re u n a e s tr a te g ia e n v a ri o s p a s o s c o n t é c n ic a s m e n o s s e le c ti v a s . - E l e fe c to c o n c e n tr a d o r p e rm it e p ro c e s a r g ra n d e s v o lú m e n e s d e m u e s tr a - L a s m o lé c u la s o b je to d e l a p u ri fi c a c ió n s e p u e d e n o b te n e r d e m e z c la s b io ló g ic a s c o m p le ja s , y p e q u e ñ a s c a n ti d a d e s s e p u e d e n p u ri fi c a r d e g ra n c a n ti d a d d e s u s ta n c ia s c o n ta m in a n te s .

Después de la elución de la muestra (paso 3) se procede a regenerar la columna o volver a las condiciones iniciales en las que volveráa interactuar más muestra por afinidad (paso 5).

M o d e lo

1234 y 5

se ña l

tiempo/volumen inyeccióntampón elución

C ro m a to g ra fí a L íq u id a

Ni2+ Matriz

Ni2+ Ni2+HHH H H

Proteína H

C ro m a to g ra fí a d e a fi n id a d - E l lig a n d o s o n c a ti o n e s d iv a le n te s d e N i

2+

o C u

2+

. - C o n d ic io n e s n a ti v a s n o rm a le s s o n a d s o rc ió n y l a v a d o c o n ta m p ó n f o s fa to p H 8 .0 , 5 0 m M , c o n N a C l 0 .3 M y e lu c ió n c o n e l m is m o t a m p ó n i n c lu y e n d o i m id a z o l 2 5 0 m M .

E je m p lo : P u ri fi c a c ió n d e p ro te ín a s d e f u s ió n P o ly -H is

m P

k c m r. xt E

do ru lu E

o un íd o N

o id va La

1 2 do do va La -Purificación de proteínas de fusión recombinantecon cola de histidinas(poly-His). 2+ -Matriz de agarosa con quelantepara Ni. -Ejemplo: Proteína recombinanteexpresada en E. coli, utilizando directamente el extracto celular para purificar la proteína objetivo.