Biotecnología microbiana
Es la disciplina que utiliza los microorganismos vivos o sus productos en procesos industriales.
La biotecnología microbiana se puede dividir en dos fases distintas:
1. Tecnología microbiana tradicional, que se refiere a la fabricación a gran escala de productos que los microorganismos son capaces de fabricar.
2. Tecnología microbiana con organismos alterados genéticamente
mediante procesos de ingeniería genética.
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Microorganismos Industriales y Productos Industriales
• Su fuente es la naturaleza
• No todos los microorganismos (MOs) tienen uso industrial
• Los hongos (levaduras y mohos) y algunos procariotas (Streptomyces) son los mas usados.
• Se seleccionan los que producen uno o mas productos de interés
• Se modifican géneticamente por mutación o recombinación para aumentar el o los metabolitos de interés.
• Las vías metabólicas menores se reprimen o eliminan.
• Pueden presentar propiedades de desarrollo pobres, pérdida en la capacidad de esporulación, propiedades bioquímicas y celulares alteradas.
• Las cepas modificadas son conservadas en los laboratorios de microbiología de las industrias y en distintas colecciones nacionales de microorganismos tipo.
Colecciones Nacionales de microorganismos tipo
Están disponibles para fines docentes, de investigación o industriales.
Las cepas que producen los mejores rendimientos (con derechos de propiedad o patentadas) no están en estas colecciones.
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Mejoramiento de la cepa de Penicillum chrysogenum, productora de la penicilina.
A través de los años y de numerosos procesos la producción de penicilina por el hongo Penicillum chrysogenum pasó de 1-10 ug/ml a 50.000 ug/ml.
Este incremento de 50.000 veces se obtuvo por el mejoramiento de la cepa a través de mutación y selección sin incluir manipulación genética y por cambios en el medio y en las condiciones de crecimiento. La introducción de nuevas técnicas genéticas condujo posteriormente a incrementos mucho mas modestos en el rendimiento.
Conjunto de mutaciones realizadas por cuatro grupos de investigadores para obtener una cepa de Penicillum
chrysogenum capaz de sintetizar penicilina para una
exportación comercial. “S”, mutación espontánea; “X”, rayos X; “UV”, radiación ultra violeta; “NM”, gas mostaza.
Los métodos fermentativos habituales rinden más de 20 g/litr
Requisitos de un microorganismo industrial El microorganismo debe:
1- Producir la sustancia de interés 2- Obtenerse en cultivo puro
3- Ser genéticamente estable.
4- Poder desarrollarse en cultivos a gran escala.
5- Poder mantener el cultivo del MO durante períodos largos en el laboratorio y en la planta industrial.
6- Tener un tiempo de duplicación bajo y fabricar el producto deseado en un período corto.
Crecimiento rápido → ocupar menos tiempo los equipos industriales
→ disminuir los riesgos de contaminación.
→ mejor control de los factores ambientales
7- Ser susceptible de manipulación genética.
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Medios de cultivo industriales
Se usan muchas veces como medios de cultivo a gran escala desechos carbonados provenientes de otras industrias.
-licor de maceración del maíz (rico en nitrógeno y factores de crecimiento).
- suero de leche (contiene lactosa y minerales)
-otros materiales residuales de la industria con elevado contenido en carbono orgánico.
9- En la industria se prefieren los MOs grandes como los hongos,
levaduras y bacterias filamentosas para poder separar las células
microbianas del medio de cultivo con facilidad ya que este proceso es
muy costoso a gran escala. Es mas económico efectuar la separación
por filtración que por centrifugación.
Condiciones que no debe tener un microorganismo industrial
Los microorganismos industriales no deben:
• 1- ser peligrosos para el hombre, animales y plantas de interés económico.
• 2- liberar toxinas, o si lo hacen deben poder ser eliminadas
fácilmente.
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Los productos industriales de interés pueden ser de varios tipos:
1- Las células propiamente dichas, por ej. las levaduras cultivadas para alimentos, panadería o cerveza.
2- Las sustancias producidas por las células. Ejemplos de estas últimas son:
- las enzimas como la glucosa isomerasa
- agentes farmacológicos activos como los antibióticos, esteroides y alcaloides
- productos químicos y aditivos alimentarios como el aspartame, edulcorante de alimentos y bebidas de bajas calorías (fabricado a partir de L-fenilalanina mas L-ácido aspártico); el L-glutamato, utilizado para reforzar el sabor y para ablandar las carnes; el L- aspartato y alanina para enriquecer el sabor de jugos de fruta;
la glicina para mejorar el sabor de alimentos edulcorados; la L-
lisina y la DL-metionina como aditivos nutritivos en alimentos
para animales.
Productos Industriales
Varias enzimas importantes de uso comercial son producidas por MOs, incluyendo enzimas que digieren el almidón (amilasas), proteínas (proteasas, renina) y las grasas (lipasas). Penicilina acilasa es usada para producir penicilinas sintéticas. Los metabolitos microbianos son otro grupo importante de productos industriales. Estos metabolitos pueden ser productos de la fermentación como el etanol, ac. acético o ac. láctico; factores de crecimiento claves como los aminoácidos, las
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Crecimiento y formación de productos en procesos industriales El crecimiento microbiano comprende distintas etapas: fase de
latencia, fase exponencial y fase estacionaria.
Procesos donde lo que interesa es el metabolito microbiano.
Hay dos tipos básicos de metabolito microbiano:
1- metabolito primario es el que se fabrica durante la fase exponencial del crecimiento del microorganismo.
2- metabolito secundario es el que se fabrica cerca del final de la
fase logarítmica de crecimiento, con frecuencia , cerca de la fase
estacionaria de crecimiento.
Comparación entre metabolitos primarios y secundarios
Metabolitos microbianos primarios
Un proceso típico microbiano en el cual el producto de interés se forma durante la fase primaria de crecimiento es la fermentación alcohólica (etanólica).
El etanol es un producto del metabolismo anaeróbico de la levadura y de ciertas bacterias, y se forma como parte del metabolismo energético. Dado que el crecimiento sólo se puede dar si se efectúa la producción de energía, la producción de etanol corre paralelamente con el crecimiento.
Metabolismo microbiano secundario
Los metabolitos producidos durante la fase
estacionaria suelen llamarse metabolitos secundarios y
son algunos de los más comunes e importantes de
interés industrial. Este es el caso de la mayoría de los
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Comparación entre metabolitos primarios y secundarios a) Metabolismo primario: formación de
alcohol por la levadura. b) Metabolismo secundario: formación de penicilina por el hongo Penicillium chrysogenum, presentando la separación de la fase de crecimiento (trofofase), y la fase de producción (idiofase). Nótese en b) que la penicilina no se produce hasta que el crecimiento ha entrado en la fase media y mayor parte del producto se forma después de que el crecimiento ha entrado a la fase estacionaria. En ambos gráficos a) y b) los ejes son aritméticos y no logarítmicos.
a
b
Mientras que el metabolismo primario es generalmente similar en todas las células, el metabolismo secundario presenta claras diferencias entre un organismo y otro.
Las características reconocidas del metabolismo secundario son:
1- Cada metabolito secundario sólo lo forman relativamente pocos organismos.
2- Los metabolitos secundarios aparentemente no son esenciales para el crecimiento y la reproducción.
3- La formación de metabolitos secundarios depende fundamentalmente de las condiciones de cultivo, sobre todo de la composición del medio.
Con frecuencia, se produce la represión de la formación del metabolito secundario.
4- Los metabolitos secundarios se producen como un grupo de
estructuras muy relacionadas. Por ejemplo, se ha encontrado que una sola cepa de Streptomyces produce alrededor de 30 antibióticos
distintos, pero relacionados, del tipo antraciclina.
5- Se puede incrementar enormemente la sobreproducción de los
metabolitos secundarios, mientras que los metabolitos primarios
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Las vía metabólicas del metabolismo secundario surgen del metabolismo primario.
• El metabolito secundario, generalmente se produce a partir de varios
productos intermediarios acumulados ya sea en el medio de cultivo o en las células, durante el metabolismo primario.
• Las enzimas que intervienen en la producción de metabolito secundario se regulan por separado de las del metabolismo primario.
• En algunos casos se han identificado inductores de metabolitos
secundarios por ejemplo, se ha identificado un inductor específico para la producción de estreptomicina, compuesto que se llama factor-A.
• La mayor parte de los metabolitos secundarios son moléculas orgánicas
complejas que requieren una gran cantidad de reacciones enzimáticas
específicas para su síntesis, (72 etapas para tetraciclina; 25 etapas para
eritromicina).
Características de la fermentación en gran escala
En microbiología industrial, el término fermentación se refiere a cualquier proceso microbiano a gran escala, tanto si se realiza aeróbica como anaeróbicamente, es decir tanto si es o no bioquímicamente una fermentación.
De hecho la mayor parte de las fermentaciones industriales son aeróbicas. El tanque en el cual se lleva a cabo la fermentación industrial se llama fermentador y el microorganismo que se utiliza se llama fermento.
El fermentador puede variar de tamaño de la escala pequeña de laboratorio (5 -10 litros) a la enorme escala industrial (400.000 litros). Las dimensiones dependen del tipo de proceso y de cómo opera. Los procesos manejados en lote o batch requieren fermentadores más grandes que los que operan en forma contínua o semicontínua.
Los fermentadores industriales se pueden dividir en dos clase principales, para procesos anaeróbicos y para procesos aeróbicos. Los fermentadores anaeróbicos requieren poco equipo especial, excepto para la remoción del calor generado durante la fermentación, en tanto que los fermentadores aeróbicos requieren equipo mucho más elaborado para asegurar la correcta mezcla y aireación.
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Construcción de un fermentador aeróbico
Los fermentadores a gran escala son casi siempre de acero inoxidable. Es prácticamente un cilindro grande cerrado por arriba y por abajo, dentro del cual se han ajustado varios tubos y válvulas. Tiene una cubierta externa de enfriamiento, a través de la cual se hace pasar vapor o agua de enfriamiento. En el caso de fermentadores muy grandes el intercambio de calor a través de la cubierta es insuficiente de modo que hay que adaptar serpentines internos a través de los cuales se pasa vapor o agua de enfriamiento.
En equipos a gran escala se necesita optimizar el sistema de aireación ya que la transferencia de oxígeno del gas al líquido es un proceso muy difícil porque el oxígeno es poco soluble en agua y un fermentador con una gran población microbiana tiene una tremenda demanda de oxígeno para el cultivo. Se necesitan dos dispositivos diferentes para asegurar la adecuada aireación: un dispositivo de aireación llamado difusor, y un dispositivo de agitación llamado impulsor. Para lograr una mezcla más eficiente se utilizan deflectores.
El microbiólogo industrial debe conocer muy bien la extremadamente compleja dinámica de los fluidos en los fermentadores para diseñar y operar de un modo eficiente los mismos
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Fermentadores: a) de laboratorio; b) esquema de fermentador
industrial; c) interior de un fermentador industrial.
a) Conjunto de fermentadores pequeños para investigación usado en el desarrollo del proceso. b) Gran batería de fermentadores al aire libre (240 m3) que se utiliza para la fabricación de alcohol en Japón. Dada la gran diferencia de sus tamaños, la misma fermentación microbiana tendría que
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Control y monitoreo del proceso
Debido a los altos costos de producción, los fermentadores industriales están cuidadosamente controlados. No solo se controla el crecimiento y la producción del producto , sino que se deben controlar otros factores
ambientales a medida que el proceso se efectúa.
Los factores ambientales controlados más frecuentes son: la concentración de oxígeno, pH, masa celular, temperatura y concentración del producto. También hay que controlar la formación de espuma. En la actualidad se utilizan computadoras para controlar los procesos de fermentación ya sea en la obtención de datos o en el control de varios factores ambientales.
La obtención de datos a medida que el proceso de fermentación tiene lugar se llama adquisición inmediata. Las computadoras también pueden graficar los datos obtenidos permitiendo al operador tener una representación visual del progreso de la fermentación. Las computadoras permiten también almacenar los datos para poder analizarlos. Las computadoras permiten un control inmediato del proceso a través de la modificación de los parámetros ambientales a medida que la fermentación progresa o agregando un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento evitando que el mismo sea metabolizado a productos indeseables.
a) Una gran planta de fermentación.
Sólo se ve la parte superior de los fermentadores, que pueden tener una altura de varios pisos.
b) Habitación de control por ordenador para una gran planta de
fermentación
Los procesos microbianos deben ser controlados en forma continua,
usualmente esto se hace por medio de computadoras, a fin de asegurar
rendimientos satisfactorios de los productos que se desean.
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Escalado de la fermentación
Escalado o cambio de escala es la adaptación de un proceso industrial desde las condiciones de un pequeño laboratorio a las de una fermentación comercial a gran escala.
La mezcla y la aireación son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeño que en el fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamaño del equipo, cambia la relación superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un área superficial determinada.
El escalado de la fermentación en el fermentador industrial es la tarea del ingeniero bioquímico, quien esta familiarizado con la transferencia de gases, la dinámica de fluidos y la termodinámica. El papel del microbiólogo industrial en el proceso de escalado es trabajar estrechamente con el ingeniero bioquímico para asegurar que se han abarcado los parámetros necesarios para una fermentación exitosa y que se dispone de las cepas microbianas apropiadas para una fermentación en gran escala.
Las distintas etapas de escalado que deben realizarse para llegar de un proceso de laboratorio a un proceso industrial son las siguientes:
1- Experimentos en el matraz de laboratorio que son generalmente la primera indicación que es posible un proceso de interés industrial.
2- El fermentador de laboratorio, un fermentador a escala pequeña, generalmente de vidrio y de 5 a 10 litros de capacidad. En el fermentador de laboratorio es posible ensayar variaciones en el medio de crecimiento, temperatura, pH, etc., ya que los costos son bajos tanto en el equipo como en los medios de cultivo.
3- La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aquí las condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentación y un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo más similares a las del fermentador industrial.
4- El fermentador industrial mismo, generalmente de 10.000 a 400.000 litros
24 En los estudios de escalado para los procesos aeróbicos, el
parámetro de mayor importancia que se debe controlar durante el aumento de escala es la velocidad de transferencia de oxigeno; se debe mantener la tasa de oxigeno constante al incrementar las dimensiones del fermentador.
La tasa de oxigeno expresa el consumo de oxigeno en mMoles de O2/l/hora que se requiere para obtener el optimo rendimiento.
Esquema general de un proceso de fermentación a gran escala.
El producto comercial esta usualmente en las células o en la fracción libre de células, pero no en ambas fracciones. De acuerdo a esto una de ambas fracciones debe ser posteriormente procesada (señalada con el símbolo “+”) o descartada (señalada con el símbolo “-”).
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ANTIBIOTICOS
Antibióticos: aislamiento y caracterización
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por los MOs que matan o inhiben el crecimiento de otros MOs.
Los antibióticos son metabolitos secundarios típicos.
Los que se usan comercialmente son producidos por hongos filamentosos y por bacterias del grupo de los actinomicetos.
La mayoría se usa para el tratamiento de enfermedades bacteriana y algunos pocos son contra enfermedades fúngicas.
Los géneros mas comunes son Streptomyces, Penicillum y Bacillus.
Fabricar o producir comercialmente un antibiótico requiere además de un alto rendimiento, desarrollar un método eficiente de purificación. Por ejemplo si el antibiótico es soluble en un compuesto orgánico inmiscible en agua esto implica una purificación sencilla y de bajo costo por la facilidad de poder concentrarlo. Si el antibiótico no es soluble en algún disolvente, hay que separarlo por: a) adsorción; b) intercambio iónico; c) precipitación química. La meta es obtener un producto cristalino de elevada pureza.
Para obtener cepas con altos rendimientos el químico debe obtener cepas que no produzcan impurezas indeseables o desarrollar métodos para
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Aislamiento de antibióticos y método para probar el espectro de actividad antibiótico de un microorganismo
La forma tradicional por la que se descubren nuevos antibióticos
consiste en el rastreo (screening). Con este tipo de aproximaciones se
aísla de la naturaleza, un gran número de posibles MOs productores
de antibióticos (a). En estos aislamientos se ensaya la producción de
antibióticos viendo si producen cualquier sustancia difusible que inhiba
el crecimiento de ciertas bacterias representativas de patógenos
bacterianos usadas como control en el test (b). Aquellos aislamientos
que sean candidatos de la producción de antibióticos se estudian
posteriormente, a fin de saber si los antibióticos que produce son
nuevos o no. Cuando se descubre un MO que produce un nuevo
antibiótico, éste se produce en cantidades suficientes para poder
analizar su estructura y determinar luego su toxicidad y actividad
terapéutica en animales infectados. La mayoría de los antibióticos
nuevos fallan en el test en animales de experimentación. No obstante
la búsqueda continúa ya que se estima que las especies del género
Streptomyces producen unos 100.000 antibióticos diferente.
Aislamiento de antibioticos Placa de agar
Halo de inhibición Penicilina
Cultivo bacteriano
30 Producción mundial anual y consumo de antibióticos.
- Cada año se manufacturan más de 500 toneladas de agentes quimioterapéuticos.
- Agente quimioterapéutico es todo compuesto químico que puede usarse por vía interna para controlar las enfermedades infecciosas. Son de gran utilidad en medicina clínica y veterinaria, así como en agricultura.
- El elemento clave de todo agente quimioterapéutico es la toxicidad selectiva, es decir , la capacidad de inhibir a las bacterias u otros agentes patógenos sin afectar al hospedador. Se los puede agrupar en dos categorías generales, los agentes sintéticos y los antibióticos.
Cefalosporinas inhiben la síntesis de la pared celular.
Macrólidos ej. Eritromicina inhibe subunidad 50S (síntesis de proteínas).
Quinolonas ej. Ácido nalidíxico interaccionan la DNA girasa.
Penicilinas. Inhiben síntesis de pared Aminoglicósidos ej Estreptomicina inhibe subunidad 30S (síntesis de proteínas).
Producción industrial de la penicilina
El anillo β-lactámico característico de las penicilinas se muestra en color marrón oscuro. Son producidas por varios hongos de los géneros Penicillum y Aspergillis y por algunos procariotas. La fermentación normal conduce a la producción de penicilinas naturales. Si durante la fermentación de añaden precursores específicos, se forman algunas penicilinas biosintéticas. Las penicilinas semisintéticas se producen añadiendo por métodos químicos una cadena lateral específica al núcleo del ácido 6-aminopenicilánico en la posición R. Las penicilinas semisintéticas son las que tienen la mayor utilidad clínica, puesto que por lo general son activas frente a bacterias Gram negativas y pueden administrarse por vía oral.
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Estructuras de algunas penicilinas importantes
Cinética de fermentación de la penicilina con Penicillum chrysogenum.
La producción de penicilina es un proceso aeróbico, se requiere una aireación muy eficiente.
La penicilina es un metabolito secundario. Durante la fase de crecimiento se produce muy poca penicilina, pero una vez que se ha consumido la fuente de carbono casi completamente, empieza la fase de producción de la penicilina. Alimentando el fermentador con diversos componentes del medio de cultivo, se puede alargar por varios días la fase de producción. El licor de maíz es uno de los principales ingredientes de la mayoría de los medios de producción de penicilina. Esta sustancia contiene la fuente de nitrógeno y otros factores de crecimiento. La fuente de carbono es generalmente la lactosa. La penicilina se secreta al medio y una vez que las células se separan por filtración, se baja el pH del medio y se extrae el antibiótico con un disolvente orgánico. Después de concentrarse en el solvente, el antibiótico se vuelve a extraer en medio acuoso a pH alcalino, posteriormente se concentra y cristaliza. Por este método se puede obtener rápidamente penicilina con un alto nivel de pureza.
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Purificación de antibióticos
Purificación de un antibiótico.
Instalación para extraer un antibiótico del caldo de fermentación
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AMINOACIDOS
Los aminoácidos tienen muchos usos en la industria alimentaria, en medicina y como precursores de la industria química. El más
importante comercialmente es el ácido glutámico, que se utiliza
para aumentar el sabor. La L-Lisina y la DL-metionina como aditivo
alimentario para piensos para animales. La L- triptofano y L-histidina
como nutritivo alimentario en leches en polvo. Otros aminoácidos
importantes son el L- ácido aspártico y la L-fenilalanina, que son los
ingredientes del edulcorante artificial aspartame, un ingrediente en
las bebidas bajas en calorías y en otros productos sin azúcar.
Si bien la mayor parte de los aminoácidos se puede producir por síntesis química, esta última da como resultado las formas L y D. Si se necesita la forma L, bioquímicamente importante, entonces es necesario aplicar un método de fabricación enzimático o microbiológico.
La producción microbiológica de los aminoácidos puede hacerse
por fermentación directa, en la cual un microorganismo
produce el aminoácido en un proceso estándar de
fermentación, o mediante síntesis enzimática, donde el
microorganismo es la fuente de una enzima y entonces se
utiliza ésta en el proceso de producción.
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Regulación de la biosíntesis de aminoácidos
- La síntesis de los aminoácidos se lleva a cabo a través de una serie de etapas en las que intervienen distintas enzimas a partir de precursores de la vía glucolítica o del ciclo del ácido tricarboxílico.
-La regulación de la síntesis de los aminoácidos se efectúa por retroalimentación, es decir que la primera etapa enzimática suele estar sometida a inhibición por retroalimentación por el producto final de esa vía.
- Así al aumentar la concentración de un determinado aminoácido, se inhibe la actividad de la enzima que conduce a la biosíntesis de ese aminoácido, dando como resultado una reducción en la síntesis.
- Una forma de lograr la sobreproducción de un determinado
aminoácido es obtener una mutante en la primera y única enzima
de esa vía de síntesis del aminoácido, de forma tal que ya no esté
sometida a la inhibición por retroalimentación.
Inhibición de la actividad enzimática por retroalimentación La inhibición por retroalimentación se observa principalmente en la regulación de las rutas biosintéticas complejas, tales como las rutas implicadas en la síntesis de un aminoácido o de una purina.
Tales rutas requieren muchas etapas enzimáticas y el producto
final, aminoácido o nucleótido, está separado del sustrato inicial
por muchas etapas. Aún así el producto final es capaz de
retroalimentar la primera etapa de la ruta y regular su propia
biosíntesis. En la inhibición por retroalimentación, el aminoácido u
otro producto final de la ruta biosintética inhibe la actividad de la
primera enzima de esta ruta. Esto se debe a una propiedad de la
enzima inhibida conocida como alosterismo. Una enzima
alostérica tiene dos sitios de unión importantes, el sitio activo,
donde se une el sustrato , y el sitio alostérico, donde se une
reversiblemente el inhibidor, llamado a veces efector. Cuando un
inhibidor se une, por lo general no covalentemente, al sitio
alostérico, la conformación de la molécula de enzima cambia, de
manera que el sustrato deja de unirse eficientemente al sitio
activo.
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Mecanismo de inhibición
enzimática por un efector alostérico
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Producción de la lisina utilizando Brevibacterium flavum.
La lisina es un aminoácido esencial para el hombre y es utilizada como aditivo alimentario. Se produce comercialmente utilizando la bacteria Brevibacterium flavum. La síntesis de lisina, como la de otros aminoácidos se encuentra estrictamente regulada.
Para poder obtener los aminoácidos en forma económica es necesario obtener cepas sobreproductoras, es decir que no sufran el fenómeno general de inhibición por retroalimentación. En la vía bioquímica que conduce desde el aspartatoa la lisina, esta última puede inhibir por retroalimentación la actividad de la enzima aspartatoquinasa. La sobreproducción de lisina puede obtenerse aislando mutantes en las cuales la aspartatoquinasa no esté sujeta a retroinhibición. Esto se logra aislando mutantes resistentes a un análogo de la lisina, la S- aminoetilcisteína (AEC), que se une al sitio alostérico de la enzima e inhibe su actividad. Las mutantes resistentes a la AEC que se obtienen fácilmente por selección positiva, producen una modificación de la aspartatoquinasa con un sitio alostérico alterado que ya no reconoce la AEC o a la lisina, por lo que la retroinhibición por lisina está muy reducida. Dichas mutantes pueden producir hasta 60 g de lisina por litroen fermentadores industriales.
Producción de ácido glutámico
Un factor muy importante para lograr un proceso de producción comercial de un aminoácido es conseguir la excreción del mismo al medio de cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos indispensables como los aminoácidos. Aumentando la excreción se evitarían concentraciones relativamente altas dentro de la célula, que podrían ocasionar inhibición por retroalimentación, aún en mutantes resistentes. Una forma de obtener un nivel elevado de excreción de un aminoácido es el que se utiliza en la obtención del ácido glutámico. La producción y excreción del ácido glutámico depende de la permeabilidad celular. El organismo productor del ácido glutámico, Corynebacterium glutamicum, requiere la vitamina biotina, factor indispensable en la biosíntesis de los ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la membrana celular como resultado de una producción deficiente de fosfolípidos y bajo estas condiciones se excreta el ácido glutámico intracelular. El medio empleado para la producción del ácido glutámico contiene en una primera etapa suficiente biotina para obtener un buen desarrollo del microoganismo y en una segunda etapa la deficiencia de biotina asegura la excreción de ácido glutámico al medio. El descubrimiento del papel de la deficiencia en biotina en la producción del ácido glutámico ha permitido el desarrollo de métodos racionales para la formulación de un medio para producir este aminoácido.
44 Producción de cortisona utilizando Rhizopus nigricans
Los microorganismos pueden usarse para biocatalizar reacciones químicas específicas. Este proceso se denomina bioconversión o biotransformación, e implica el cultivo del MO en fermentadores grandes, seguido de la adición del compuesto químico que ha de ser convertido, en el momento adecuado. Después de un período de incubación, durante el cual el MO actúa sobre el compuesto químico, se extrae el caldo de fermentación y se purifica el producto que se desee.
Si bien la bioconversión puede usarse para varios procesos, su principal utilización industrial ha sido la producción de algunas hormonas esteroideas.
Bioconversión microbiana
Solo la primera reacción es una bioconversión microbiana típica. Esta oxidación altamente específica es realizada por el hongo Rhizopus nigricans y omite una difícil reacción química. Todos los otros pasos se realizan químicamente.
Enzimas
Las enzimas extracelulares (exoenzimas) se secretan al medio de cultivo y son capaces de digerir polímeros insolubles como la celulosa, las proteínas y el almidón; posteriormente, los productos de digestión son transportados al interior de las células donde se utilizan como nutrientes para el crecimiento.
Algunas de estas exoenzimas se utilizan en las industrias alimentaria, láctica, farmacéutica y textil, y se producen en grandes cantidades por síntesis microbiana.
Las enzimas son biocatalizadores especialmente útiles porque a
menudo actúan en grupos funcionales químicos que son únicos,
distinguen fácilmente entre grupos funcionales similares de una
misma molécula y, en muchos casos, catalizan reacciones de
una forma estereoespecífica, produciendo sólo uno de los dos
posibles enantiómeros (por ejemplo, el enantiómero-D de un
azúcar , o un L-aminoácido.
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Proteasas, amilasas y jarabes ricos en fructosa
• Las enzimas que más se producen comercialmente son las
proteasas, que se usan como aditivos en los detergentes para lavar la ropa. La mayoría de los detergentes que se utilizan actualmente contienen proteasas, amilasas, lipasas, reductasas y otras enzimas.
Muchas de estas enzimas se aíslan de bacterias alcalófilas del género Bacillus. Otras enzimas importantes fabricadas
comercialmente son las amilasas y glucoamilasas, que se emplean
en la producción de glucosa a partir de almidón. La glucosa se
convierte luego en fructosa (que es más dulce que la glucosa y la
sacarosa) por acción de la enzima glucosa isomerasa. Este proceso
lleva a la obtención de un edulcorante rico en fructosa a partir de
almidón de maíz, trigo o papa.
En la conversión del almidón de maíz en el producto llamado jarabe de maíz rico en fructosa funcionan tres reacciones en secuencia, cada una de ellas catalizada por una enzima microbiana diferente.
1- La enzima alfa-amilasa lleva a cabo el ataque inicial sobre el polisacárido almidón, acortando la cadena y reduciendo la viscosidad del polímero. Esta se llama reacción de adelgazamiento.
2-La enzima glucoamilasa produce monómeros de glucosa a partir de los polisacáridos acortados, proceso llamado sacarificación.
3- La enzima glucosa isomerasa lleva a cabo la conversión final de la glucosa en fructosa, proceso que recibe el nombre de isomerización.
Las tres enzimas se producen por fermentación microbiana. El producto final de esta serie de reacciones es un jarabe que contiene cantidades aproximadamente iguales de glucosa y fructosa, el cual se puede adicionar directamente a bebidas refrescantes y a otros productos alimenticios. Esto permitió a Estados Unidos usar el almidón de maíz en lugar de importar la sacarosa y ahorrar millones de dólares por años.
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Extremoenzimas: enzimas de procariotas que viven en ambientes extremos.
Algunos procariotas llamados hipertermófilos, tienen un crecimiento óptimo a temperaturas muy altas y producen proteínas termoestables que funcionan a altas temperaturas. El término extremoenzimas se refiere a enzimas que funcionan en condiciones muy altas o muy bajas de temperatura, pH, salinidad, etc. Los organismos que las producen se denominan extremófilos.
Enzimas inmovilizadas
En algunos procesos biocatalíticos se desea convertir enzimas solubles en enzimas inmovilizadas. La inmovilización no solo facilita la reacción enzimática en condiciones de producción continua a gran escala, sino que también contribuye a la estabilización de las enzimas evitando su desnaturalización. Existen tres aproximaciones básicas para la inmovilización de enzimas.
1- Polimerización (entrecruzamiento, cross-linkage) de las moléculas de enzima. El enlace de unas moléculas de enzima con otras se hace a través de una reacción química con un agente bifuncional de entrecruzamiento como el glutaraldehido.
2- Unión de la enzima a un soporte. La unión puede hacerse por adsorción, enlace iónico, o enlace covalente. Los soportes usados son celulosas modificadas, carbón activado, arcillas minerales, óxido de aluminio y bolitas de vidrio.
3- Inclusión enzimática, que comprende la inclusión de la enzima en una membrana semipermeable. Las enzimas pueden encerrarse en microcápsulas, geles, membranas semipermeables de polímeros, o polímeros fibrosos como el acetato de celulosa.
Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas y el procedimiento utilizado depende de la enzima y de la aplicación industrial particular.
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Células inmovilizadas
• En algunos casos no es necesario utilizar la enzima purificada.
• Se pueden utilizar células inmovilizadas para utilizarlas en procesos industriales.
• En general se utilizan para procesos de flujo continuo.
• Se utilizan instalaciones mucho mas económicas.
• Un ejemplo es la utilización de células de Bacillus cuagulans
inmovilizadas para la conversión continua de jarabe de glucosa en
jarabe de fructosa. Este microorganismo es productor de glucosa
isomerasa, la enzima que convierte la glucosa en fructosa.
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Producción de productos de mamíferos por microorganismos modificados por ingeniería genética.
El mayor interés esta en la producción de proteínas y de péptidos de mamíferos por medios microbianos, ya que muchos de estos compuestos tienen un alto valor farmacéutico, son costosos y difíciles de obtener por otros métodos. A pesar de la excitante promesa de la ingeniería genética en la biotecnología, lograr la comercialización de un producto es una empresa gigantesca. Además de la correcta clonación y expresión del gen de interés en una bacteria o levadura, y de la purificación del producto deseado, se deben tomar en consideración otros aspectos como las pruebas clínicas y permisos gubernamentales. Cualquier producto sintetizado microbiológicamente, que se intente utilizar en el hombre, debe pasar pruebas clínicas exhaustivas. Por ej., la insulina producida microbiológicamente mediante la tecnología del DNA recombinante ha tenido que pasar pruebas clínicas estrictas con voluntarios humanos, a pesar de que se ha demostrado que la insulina producida microbiológicamente es idéntica a la proteína fabricada por humanos.
Si todo va bien en las pruebas clínicas, se puede pedir el permiso oficial, pero esto puede ser un proceso que consume mucho tiempo.
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Producción de insulina
La insulina es un hormona. Es una proteína pancreática que regula el metabolismo de los carbohidratos en mamíferos. La diabetes es una enfermedad caracterizada por una insuficiencia de insulina y afecta a millones de personas. El tratamiento estándar consiste en la administración de ésta hormona periódicamente en forma oral o inyectable. La hormona proveniente de páncreas de terneros o de cerdos no resulta tan eficaz como la insulina humana y , además, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Por esta razón se ha llevado a cabo la clonación del “gen” de la insulina humana en bacterias.
La insulina humana consta de dos polipéptidos (A y B) conectados por puentes disulfuro. Estos dos péptidos están codificados por partes separadas del mismo gen de la insulina. El gen de la insulina codifica la preproinsulina, un péptido más largo que contiene una secuencia señal (implicada en la secreción de la proteína), los polipéptidos A y B de la molécula de insulina activa, y un polipéptido de unión que está ausente en la insulina madura. La proinsulina se forma a partir de la preproinsulina, y la conversión de proinsulina en insulina implica la ruptura enzimática del polipéptido de unión entre las cadenas A y B.
Procesamiento de la preproinsulina
La metionina inicial es eliminada de la cadena antes de que se sintetice la molécula completa de preproinsulina. Tras la eliminación del péptido líder, la molécula de insulina se pliega y el péptido C se elimina originando las cadenas A y B de la
56 Hasta el momento se han utilizado dos métodos para la producción de
insulina humana en bacterias: (1) producción de proinsulina y conversión en insulina mediante métodos químicos, y (2) producción de las cadenas A y B en dos cultivos bacterianos separados, así como unión de las dos cadenas mediante procedimientos químicos para producir la insulina. Para sintetizar insulina, la secuencia de DNA adecuada se realizó en forma química. La cadena A consta de 63 bases y la cadena B de 90 bases. En la proinsulina existen otras 105 bases adicionales que codifican el péptido C que conecta las cadenas A y B. Se añadieron bases en los extremos para el corte con enzimas de restricción adecuadas que permitieran clonar los fragmentos dentro de un plásmido vector. Para obtener una expresión eficaz, los genes se insertaron debajo de un promotor adecuado de Escherichia coli, pero de manera que el fragmento de insulina se sintetizara como parte de una proteína de fusión para que fuera más estable. Se colocó también un triplete que codifica para metionina en el punto que unía el gen de la insulina con la parte superior del gen de fusión para poder cortar luego el producto formado con bromuro de cianógeno aprovechando la propiedad de que la insulina no tiene residuos metionina en su molécula y el bromuro de cianógeno corta específicamente por los residuos metionina.
Cuando se utiliza el método de la proinsulina, la proinsulina aislada de las bacterias por el tratamiento con bromuro de cianógeno, se convierte en insulina cuando se forma el enlace disulfuro y se produce la eliminación enzimática del péptido de unión el cual se hace por tratamiento con las proteasas tripsina y carboxipeptidasa B, que no tienen efecto sobre la molécula de insulina.
Cuando la insulina se produce mediante los péptidos separados A y B, cada uno de los péptidos se aíslan de un cultivo independiente y las cadenas se separan mediante el corte con bromuro de cianógeno. Las cadenas cortas se conectan luego mediante un tratamiento químico que permite la formación de los puentes disulfuro.
En los dos casos el producto final es idéntico a la proteína purificada del páncreas humano y los costos son menores que los requeridos para la purificación de la insulina de cerdos o de terneros.
58 Ingeniería genética para la producción de insulina humana en bacterias
Ingeniería genética aplicada a la producción de xantano
Xantomonas campestris es una bacteria Gram negativa del suelo aeróbica obligada que produce el biopolímero xantano de importante valor comercial. Es un exopolisacárido que se produce como un subproducto del metabolismo secundario. El xantano tiene un alto PM y esta compuesto por un esqueleto de celulosa (glucosa-β1,4-glucosa) que tiene el trisacárido manosa-ácido glucurónico-manosa como rama lateral en forma alternada sobre dicho esqueleto. Posee además los sustituyentes acetato y piruvato sobre la primera y tercera manosa lateral.
60 El xantano tiene una viscosidad alta, es estable en ambientes físicos y
químicos extremos y tiene propiedades similares a las de un plástico. En particular las propiedades físicas lo hacen útil como estabilizante, emulsionante, adelgazante o agente para suspender otros compuestos.
Para la obtención exitosa del xantano en forma comercial se deben bajar los costos para lo cual se debe disponer de una fuente de carbono de costo bajo o nulo. Xanthomonas campestris puede utilizar en forma eficiente glucosa, sacarosa y almidón, pero no puede usar lactosa como fuente de carbono. El suero es un subproducto de la manufactura de los quesos. Este consta de 94% a 95% de agua, 3,4 a 4% de lactosa, pequeñas cantidades de proteínas, minerales y compuestos orgánicos de pajo PM. Diariamente se producen enormes cantidades de suero por la industria y son un problema importante. La liberación de este suero a ríos o lagos puede disminuir la cantidad de O2 disponible y por ende matar a muchos organismos acuáticos. El transporte de estos sueros a distintos sitios para su degradación puede ser extremadamente costoso y puede ser una fuente potencial de contaminación subterránea. Por otra parte los costos para remover los componentes sólidos del suero son prohibitivos. En consecuencia, se han desarrollado muchos esquemas para deshacerse de los sueros en forma creativa.
Teóricamente el suero puede ser usado como fuente de carbono para el crecimiento industrial de microorganismos importantes.
Con esto en mente X. campestris fue modificado genéticamente para crecer sobre suero. Los genes lacZY de Escherichia coli, los cuales codifican para la β-galactosidasa y la lactosa permeasa fueron clonados en un plásmido de amplio rango de huésped bajo el control transcripcional de un promotor de un bacteriófago de X.
campestris. Esta construcción fue introducida en E. coli y luego transferida de E. coli a X. campestris por conjugación triparental.
Los transformantes que mantuvieron el plásmido y que expresaron niveles altos de β-galactosidasa y de lactosa permeasa, utilizan la lactosa como fuente de carbono y produjeron altos niveles de xantano usando como fuente de carbono glucosa, lactosa o suero.
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FIN
• Bibliografía:
• Brock Biología de los Microorganismos (10ª Edición)
• Molecular Biotechnology Principles and Applications of
Recombinant DNA (Second Edition). Bernard R. Glick and Jack J.
Pasternak.
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Criterios mas importantes para el diseño de un fermentador
1.- El tanque debe diseñarse para que funcione asépticamente durante numerosos días, así como para las operaciones de más larga duración.
2.- Se debe proporcionar un sistema adecuado de aireación y agitación para cubrir las necesidades metabólicas de los microorganismos.
3.- El consumo de energía debe ser tan bajo como sea posible.
4.- Debe tener un sistema para el control del pH.
5.- El fermentador debe tener un sistema para la toma de muestras.
6.- Debe existir un sistema para el control de la temperatura.
7.- Las pérdidas por evaporación no deben ser excesivas.
8.- El diseño del tanque debe ser tal que las operaciones laborales durante el funcionamiento, recolección, limpieza y mantenimiento sean mínimas.
9.- El tanque debe ser versátil para la aplicación de diversas modalidades de procesos.
10.- Las superficies internas del tanque deben ser lisas, utilizando, donde sea posible, soldaduras.
11.- La geometría del fermentador debe ser similar a otros tanques más pequeños o mayores de la planta o a los de la planta piloto para poder reproducir procesos a diferentes escalas.
12.- deben emplearse los materiales más baratos que proporcionen resultados satisfactorios.
13.- Debe existir un servicio adecuado de repuestos para el fermentador.
De los 13 puntos mencionados anteriormente, los dos puntos de mayor relevancia que hay que considerar son probablemente:
• 1- El mantenimiento de un ambiente aséptico.
• 2- Las condiciones aeróbicas adecuadas.
Los fermentadores más ampliamente utilizados a nivel industrial están provistos de mecanismos de agitación, dispersión y aireación así como de sistemas para el control de la temperatura, pH y formación de espuma.
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Tipos de fermentaciones
1.- Fermentación discontinua
2.- Fermentación alimentada (fed-batch) 3.- Fermentación continua
4.- Reactores de enzimas o células
inmovilizadas
1.- Fermentación discontinua
• Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o
bases para controlar el pH.
• La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la
concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte.
• En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios).
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2.- Fermentación alimentada (fed-batch)
• En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los sustratos se añaden al principio de la
fermentación. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentación alimentada que se utiliza en la producción de
sustancias como la penicilina. En los procesos alimentados, los
sustratos se añaden escalonadamente a medida que progresa la
fermentación. La formación de muchos metabolitos secundarios
está sometida a represión catabólica (efecto glucosa). Por esta
razón en el método alimentado los elementos críticos de la solución
de nutrientes se añaden en pequeñas concentraciones al principio
de la fermentación y continúan añadiéndose a pequeñas dosis
durante la fase de producción.
3.- Fermentación continua
• En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solución utilizada de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultáneamente del sistema.
4.- Reactores de enzimas o células inmovilizadas
Consiste en pasar el medio fresco a través de un biorreactor en el que por diversas técnicas hemos inmovilizado células (o enzimas).
En el biorreactor se producen las transformaciones bioquímicas que deseamos y recuperamos el producto transformado tras su paso por la columna. Con este sistema se eliminan los problemas de
desequilibrio (estabilidad) del sistema continuo clásico y además el
producto resultante está libre de células. Presenta el inconveniente
de que no todos los microorganismos pueden inmovilizarse.
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Reactores de enzimas o células inmovilizadas
• Existen tres métodos de inmovilizar las células:
a.- Asociación física mediante resinas de intercambio iónico. La unión se puede romper fácilmente.
b.- Unión covalente mediante glutaraldehido, tolueno, di-isocianato, iodo acetil celulosa. Unión fuerte aunque inactivación.
c.- Atrapamiento mediante colágeno, gelatina, agar, alginatos, poliacrilamida, poliestireno. Es el método más utilizado en
inmovilización de células; para ello se mezclan las células con el
polisacárido líquido y posteriormente se deja enfriar para que
solidifique. Finalmente se fragmenta o granula y se empaqueta en
una columna.
Objetivo fundamental de la industria de las fermentaciones:
1- minimizar costos
2- incrementar los rendimientos.
Este objetivo puede alcanzarse si se desarrolla el tipo de fermentación más adecuado para cada paso en particular.
El coste de producción de biomasa mediante cultivo continuo es
potencialmente inferior al de cultivo discontinuo, sin embargo, no se
utilizan de forma general en la industria debido fundamentalmente
al mayor nivel de experiencia que se tiene en el crecimiento de
células en fermentación discontinua.
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Aunque muchas fermentaciones para la producción de metabolitos funcionan bien como procesos continuos, sólo unos pocos procesos han resultado útiles para la aplicación práctica por varias razones:
a.- Muchos métodos de laboratorio operan continuamente durante solamente 20 a 200 horas; para que sea de utilidad industrial el sistema debe ser estable durante al menos 500 a 1.000 horas.
b.- Mantener las condiciones estériles a escala industrial a lo largo de un largo período de tiempo es difícil.
Limitaciones prácticas de los procesos continuos
para la fabricación de metabolitos
c.- La composición de los sustratos debe ser constante a fin de obtener una producción máxima. La composición de las soluciones de nutrientes industriales son variables (líquido de maceración del maíz, peptona, etc.) lo que puede originar cambios en la fisiología de la célula y disminuir la productividad.
d.- Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen
mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo
continuo más deprisa que las cepas de producción por lo que el
rendimiento disminuye con el tiempo ya que cada vez son menos
células las que sintetizan el producto de interés.
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FACTORES FISICO-QUIMICOS QUE AFECTAN AL RENDIMIENTO DE LAS FERMENTACIONES INDUSTRIALES
• 1.- Oxígeno
• 2.- Temperatura
• 3.- pH
1. Oxígeno: El suministro de O
2es uno de los factores más críticos en la operación de fermentación a gran escala.
- El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el
metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante.
- El oxígeno no es un gas muy soluble ya que, cuando se utiliza aire, una solución saturada de oxígeno en agua contiene aproximadamente 9 mg / L y 43 mg/L cuando se utiliza oxigeno puro. A medida que aumenta la temperatura disminuye la solubilidad del O
2-El suministro de O
2se logra pulverizando aire en el fermentador
durante el proceso.
2.-
Temperatura . Es otro parámetro importante.
- Si la temperatura es inferior a la óptima, hay un crecimiento retardado y menor productividad.
- Si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente
producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos.
- A fin de obtener rendimientos óptimos, las fermentaciones deben ser llevadas a cabo en un margen estrecho de temperatura y en lo posible constante.
- La velocidad de producción de calor debida a la agitación y a la
actividad metabólica de los microorganismos no se ve compensada
por las pérdidas de calor que resultan de la evaporación, por lo que
se debe recurrir a sistemas de refrigeración. Los mas usados son
las camisas de agua.
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• 3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el
crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe
controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el
fermentador.
AGITACION Y MEZCLADO
• La agitación es la operación que crea o que acelera el contacto entre dos o varias fases. Una fermentación microbiana puede ser considerada como un sistema de tres fases, que implica reacciones líquido-sólido, gas-sólido y gas-líquido.
1.- La fase líquida contiene sales disueltas, sustratos y metabolitos.
Puede existir, en algunos casos, una segunda fase líquida si existe un sustrato inmiscible en agua como por ejemplo los alcanos.
2.- La fase sólida consiste en células individuales, bolitas de micelio, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan.
3.- La fase gaseosa proporciona un reservorio para el suministro de
oxígeno, para la eliminación del CO
2o para el ajuste del pH con
amonio gaseoso.
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Una adecuada agitación de un cultivo microbiano es esencial para la fermentación ya que produce los siguientes efectos en las tres fases:
1.- Dispersión del aire en la solución de nutrientes.
2.- Homogeneización, para igualar la temperatura, pH y concentración de nutrientes, en el fermentador.
3.- Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos.
4.- Dispersión de los líquidos inmiscibles.
Bajo estas premisas se podría concluir que cuanto mayor sea la agitación, mejor será el crecimiento. Sin embargo, la agitación excesiva puede romper las células grandes e incrementar la temperatura lo que ocasiona un descenso en la viabilidad celular. Por lo tanto, se debe
conseguir un balance entre la necesidad del
mezclado y la necesidad de evitar el daño
celular.
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Los diferentes tipos de agitación que se utilizan en las fermentaciones se incluyen dentro de las siguientes clases:
1.- Agitadores rotativos, los cuales tienen un sistema interno mecánico de agitación.
2.- Columnas de burbujas, la agitación se realiza mediante la introducción de aire a sobrepresión.
3.- Sistema aero-elevado (airlift), que pueden tener un circuito interno o externo. La mezcla y circulación de los fluidos son el resultado de las
corrientes de aire introducido, las cuales causan diferencias en la densidad dentro de las diferentes partes del fermentador.
De estos tres tipos el más utilizado es el primero ya que es más flexible en
las condiciones de operación, es más fácil de conseguir comercialmente,
provee una eficiente transferencia de gases a las células y es el tipo con el
que se tiene más experiencia.
Esterilización industrial
Es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción.
Hay que esterilizar:
1- El fermentador
2- Todo el equipamiento (uniones, válvulas, electrodos) 3- Medio de cultivo
4- Aditivos (antiespumantes)
- No es necesario esterilizar los ácidos y bases concentrados
- No deben existir roturas mecánicas en el fermentador que podrían permitir la
entrada de microorganismos.
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Bioreactor
Se puede esterilizar con:
1- Calor
2- Radiación
3- Producto químico
4- Separando los organismos viables mediante un procedimiento físico como la filtración.
Durante la fermentación se deben observar dos puntos para asegurar la esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y sale
ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO
• Porcalor.
• Por filtración.
Esterilización por calor
El exito de la esterilización por calor depende de:
1- el número y tipo de microorganismos presentes 2- la composición del medio de cultivo
3- el valor del pH
4- el tamaño de las partículas en suspensión.
Las células vegetativas son eliminadas rápidamente a temperaturas relativamente bajas, pero para la destrucción de las esporas se necesitan temperaturas de 121°C.
Esterilización por filtración
Se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solución de nutrientes que son sensibles al calor (vitaminas, antibióticos, componentes de la sangre, etc).
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A- Esterilización discontínua de los medios
- Esterilización Indirecta: consiste en inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines interiores.
- Procedimiento directo: consiste en inyectar vapor en la propia solución de nutrientes. Pre-requisito, tener vapor puro (libre de aditivos químicos).
Inconvenientes del proceso de esterilización discontinua
- Se requieren tiempos largos para alcanzar y mantener la temperatura de 121
oC.
- Es un procedimiento muy costoso, si el agua caliente que se produce durante el enfriamiento posterior del reactor no se aplica a algún uso.
- Las fases de calentamiento, esterilización y enfriamiento no solamente
matan a los microorganismos, sino que también alteran severamente la
solución de nutrientes (caramelización, deterioro de la calidad del medio,
destrucción de vitaminas, cambio de pH).
B.- Esterilización continua
- La esterilización continua es la etapa preliminar lógica en una fermentación continua a escala industrial
- Para obtener posibles mayores rendimientos en el tiempo y el espacio asignados se puede utilizar en la fermentación discontinua
- Mientras la esterilización discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a 121° C, la esterilización continua se lleva a cabo normalmente en 30-120 segundos a 140° C.
- El calentamiento del medio de cultivo para la esterilización continua puede ser llevado a cabo mediante inyección de vapor o mediante
intercambiadores de calor.
Inconveniente en el proceso de esterilización contínua
- Cuando se usa el método de intercambiadores de calor se pueden formar sales insolubles (p. ej. fosfato cálcico u oxalato cálcico) con algunas soluciones de nutrientes.
- Las soluciones que contienen almidón, que se hacen viscosas cuando se calientan, son difíciles de utilizar en procesos de esterilización continua.
- El tiempo de esterilización puede ser insuficiente si hay partículas insolubles
en el medio.
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ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACION
• El aire que se suministra al fermentador debe ser esterilizado.
• El número de partículas y microorganismos en el aire varía en gran medida dependiendo de la localización de la planta, el movimiento del aire y el tratamiento previo del aire.
Métodos existentes para la esterilización de los gases:
1-filtración
2- inyección de gas (ozono), 3- depuración de gas
4- radiación (UV) 5- calor
Solamente el calor y la filtración fueron utilizados industrialmente.
A partir de la crisis del petróleo de los años 70, el proceso de esterilización por
calentamiento eléctrico ha sido reemplazado por la filtración.
Esterilización del aire por filtración
- En los sistemas industriales actuales el aire se esteriliza por
filtración a través de filtros de cartuchos que poseen una estructura membranosa plegada (ésteres de celulosa, polisulfona o nylon).
- En la actualidad no existen filtros industriales absolutos para bacteriófagos.
- Los bacteriófagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por ejemplo en la producción de ácido glutámico por Corynebacterium
glutamicum o al trabajar con Escherichia coli.
- El aire que sale del fermentador también debe ser esterilizado, sobre todo si
se trabaja con organismos recombinantes. No sólo como medida de
seguridad, sino también para prevenir que las cepas industriales se
liberen al medio ambiente y por lo tanto estén disponibles de una
forma gratuita para los competidores.
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