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UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
GRADO EN QUÍMICA
Trabajo Fin de Grado
Métodos para la
determinación de esteroles en aceites vegetales
Alumno: Cristóbal Salido Peña
FIRMA
Jaén, junio de 2022
1 ÍNDICE
1. RESUMEN. ... 3
2. ABSTRACT. ... 3
3. OBJETIVOS ... 5
4. INTRODUCCIÓN. ... 7
4.1 Diferenciación de esteroles por su estructura. ... 7
4.1.1 Naturaleza de la cadena lateral ... 7
4.1.2 Número de grupos metilo en la posición C-4. ... 8
4.2 Fuentes de esteroles. ... 10
4.3 Fitoesteroles en los aceites vegetales y sus beneficios para la salud. ... 13
4.3.1 Fitoesteroles en el aceite de maíz. ... 14
4.3.2 Fitoesteroles en el aceite de algodón. ... 15
4.3.3 Fitoesteroles en el aceite de palma. ... 15
4.3.4 Fitoesteroles en el aceite de colza. ... 15
4.3.5 Fitoesteroles en el aceite de cártamo. ... 16
4.3.6 Fitoesteroles en el aceite de soja. ... 16
4.3.7 Fitoesteroles en aceite de girasol. ... 17
4.3.8 Fitoesteroles en el aceite de oliva ... 17
5. EXTRACCIÓN DE ACEITES DE SEMILLAS OLEAGINOSAS Y DE OLIVA. PROCESO DE REFINACIÓN DE ACEITES VEGETALES. ... 19
5.1 Procedimiento de extracción de aceites a semillas oleaginosas y extracción del aceite de oliva a las aceitunas. ... 19
5.1.1 Extracción de aceites a semillas oleaginosas ... 19
5.1.2 Extracción del aceite de oliva. ... 19
5.2 Proceso de refinación de aceites vegetales de semillas oleaginosas y del aceite de oliva. ... 20
2
5.2.1 Proceso de refinación de semillas oleaginosas ... 20
5.2.2 Proceso de refinación del aceite de oliva. ... 20
6. EXTRACCIÓN DE FITOESTEROLES DEL ACEITE VEGETAL. ... 21
6.1 Procedimientos de extracción. ... 21
6.2 Extracción por destilación molecular. ... 23
6.3 Cristalización en disolvente. ... 24
6.4 Cromatografía en contracorriente de alta velocidad. ... 24
6.5 Extracción por fluidos supercríticos. ... 25
6.6 Procesos enzimáticos. ... 26
7. ANÁLISIS DE FITOESTEROLES. ... 34
7.1 Análisis por cromatografía de gases (CG). ... 34
7.1.1 Cromatografía de gases con un detector de ionización de llama acoplado (CG-FID) ... 35
7.1.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS) ... 38
7.2 Análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). 39 7.2.1 Cromatografía de gases con un detector ultravioleta acoplado (HPLC-UV). ... 40
7.2.2 Cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (HPLC- MS). ... 41
8. CONCLUSIONES ... 44
9. BIBLIOGRAFÍA. ... 45
3 1. RESUMEN.
Los fitoesteroles son un tipo de esteroles presentes en los aceites vegetales. Los fitoesteroles están siendo estudiados más a fondo debido a sus beneficios de prevención de enfermedades cardiovasculares, ya que disminuyen el nivel de LDL y mantienen los niveles de HDL, lo cual indica que son muy beneficiosos para la salud cardiovascular. Después de revisar la estructura de los fitoesteroles y las fuentes naturales de estos compuestos, se estudiará la extracción del aceite de semillas oleaginosas y de la aceituna. Posteriormente se presentará la extracción y purificación de fitoesteroles de aceites vegetales, como paso previo al análisis; entre las técnicas más importantes resaltaremos la extracción con fluidos supercríticos, destilación molecular, extracción con solventes, cromatografía a contracorriente de alta velocidad y el proceso enzimático. Por último, revisaremos los métodos de análisis de fitoesteroles en aceites vegetales más importantes, que serán la cromatografía líquida con detección ultravioleta, cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas y cromatografía de gases con detector de ionización de llama y acoplada a espectrometría de masas.
2. ABSTRACT.
Phytosterols are a type of sterols present in vegetable oils. Phytosterols are being studied further due to their cardiovascular disease prevention benefits, as they lower LDL levels and maintain HDL levels, indicating that they are very beneficial for cardiovascular health. After reviewing the structure of phytosterols and the natural sources of these compounds, the extraction of oil from oilseeds and olives will be studied. Subsequently, the extraction and purification of phytosterols from vegetable oils will be presented, as a previous step to the analysis; among the most important techniques we will highlight the extraction with supercritical fluids, molecular distillation, solvent extraction, high-speed countercurrent chromatography and the enzymatic process. Finally, we will review the most important methods of analysis of phytosterols in vegetable oils, which will be liquid chromatography with ultraviolet detection, liquid chromatography coupled mass spectrometry, gas chromatography coupled to mass spectrometry, and gas chromatography with flame ionization detector.
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5 3. OBJETIVOS.
El objetivo general de este trabajo fin de grado es recopilar información mediante una revisión bibliográfica sobre los métodos existentes para la determinación de esteroles en aceites vegetales tanto desde de las técnicas para la cuantificación como las técnicas para el tratamiento de muestra usadas en los últimos años.
Entre los objetivos específicos se pueden destacar:
- Realizar una breve introducción de los diferentes tipos de esteroles que se pueden encontrar en muestras vegetales.
- Exponer los métodos más utilizados para el tratamiento de muestra de esteroles en aceites vegetales.
- Examinar las técnicas analíticas de mayor importancia para la cuantificación de esteroles enaceites vegetales.
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7 4. INTRODUCCIÓN.
Los esteroles son compuestos derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno, en su estructura contienen entre 27 y 29 átomos de carbono. Presentan una cadena lateral en el carbono 17 y un grupo alcohol o hidroxilo en el carbono 3. Estos pueden presentarse en forma libre o esterificada (unidos a ácidos grasos por los grupos hidroxilo presentes en su estructura), que se denomina ésteres de esteroles (QUÍMICA.ES, 2022).
Figura 4.1. Estructura del ciclopentanoperhidrofenantreno. (Fuente: Parada, 2022)
4.1 Diferenciación de esteroles por su estructura.
Los esteroles se pueden diferenciar atendiendo a su estructura, para ello nos fijaremos en su cadena lateral unida al carbono 17 y dependiendo también del número de grupos metilo que presente la estructura en el C-4. A continuación se describirán los diferentes tipos de esteroles en función de su estructura.
4.1.1 Naturaleza de la cadena lateral
Se pueden diferenciar los esteroles a través de la cadena lateral situada en el C- 17. Por ejemplo, se comprueba en los siguientes esteroles: Campesterol, sigmasterol y sitosterol que tienen la estructura exactamente igual, pero varía la cadena lateral. El estigmasterol tiene un doble enlace en la cadena lateral que los otros dos no poseen, y el β -sitoesterol se diferencia del campesterol en que tiene un etilo unido a la cadena y el campesterol en lugar de un etilo contiene un metilo unido. (Muñoz, 2022).
8 En las siguientes imágenes se puede comprobar la diferencia entre Campesterol, sigmasterol y el β-sitosterol por las diferencias que presentan en la cadena lateral.
Figura 4.2. Campesterol. (Fuente: LGC, 2022)
Figura 4.3. β-Sitoesterol. (Fuente: Molekula, 2022)
Figura 4.4. Estigmasterol. (Fuente: UNIIQUIM, 2022)
4.1.2 Número de grupos metilo en la posición C-4.
Según el número de grupos metilo en la posición C-4, los esteroles se pueden clasificar en tres grupos: Los 4-desmetilesteroles (se denominan comúnmente fitoesteroles, no presentan ningún grupo metilo en la posición C-4, algunos ejemplos pueden ser el campesterol, campestanol o el estigmasterol), Los 4,4-
9 dimetilesteroles (se denominan alcoholes triterpénicos y presentan dos grupos metilo en la posición C-4) y los 4-monometilesteroles se denominan metilesteroles (solamente tienen un metilo en la posición C-4). A continuación, se presenta un ejemplo de cada uno de ellos (Boskou, 1996).
Figura 4.5. Ejemplo de 4-desmetilesteroles: Campestanol.(Fuente: Avanti, 2022)
Figura 4.6. Ejemplo de 4,4-dimetilesteroles: Uvaol. (Fuente: Merck, 2022)
Figura 4.7. Ejemplo de 4-monometilesteroles: Gramisterol. (Fuente: OLIVAMINE, 2022)
10 4.2 Fuentes de esteroles.
Podemos encontrar esteroles en animales, plantas, hongos y bacterias. En el caso de los animales, los esteroles se denominan zooesteroles, de todos ellos el más importante es el colesterol, que es un lípido que está presente en la membrana de las células animales y puede encontrarse en el organismo libre o esterificado (LDL o HDL) (Carrero y Herráez, 2022). En los hongos, el esterol más importante es el ergosterol, que forma parte de la membrana celular de hongos y algunos protozoos (Bolíbar, 2022). En las bacterias, nos encontramos con los hopanoides, compuestos pentacíclicos similares a los esteroles y permiten a las bacterias resistir condiciones extremas de temperatura, presión, acidez o también medios altamente salinos (QUÍMICA.ES, 2022). Por último, tenemos los esteroles en las plantas, más comúnmente denominados fitoesteroles, que son en este trabajo los de más interés puesto que son los que estarán presentes en los aceites vegetales y que se desarrollarán con más detalle en los siguientes apartados. De entre ellos los más abundantes son (Beta- sitoesterol, campesterol y stigmasterol, constituyendo el 95%-98% de los más de 40 fitoesteroles identificados) (Muñoz, 2011).
A continuación, se muestran ejemplos de estructuras de diferentes tipos de esteroles presentes en animales, hongos, plantas y bacterias.
Figura 4.8. Colesterol. (Fuente: Badali, 2013)
11 Figura 4.9. Ergosterol. (Fuente: Alchetron, 2022)
Figura 4.10. Diplopterol, un ejemplo de hopanoide. (Fuente: Sáenz et al., 2015)
Figura 4.11. Campesterol. (Fuente: LGC, 2022)
12 Figura 4.12.β-Sitoesterol. (Fuente: Molekula, 2022)
Figura 4.13. Estigmasterol. (Fuente: UNIIQUIM, 2022)
Figura 4.14. Avenasterol. (Fuente: INNOPHAMEM, 2022)
13 Figura 4.15. Brassicasterol. (Fuente: LGC, 2022)
4.3 Fitoesteroles en los aceites vegetales y sus beneficios para la salud.
En este apartado se abordarán los diferentes tipos de fitoesteroles presentes en algunos de los aceites vegetales más importantes. Pero antes es importante ahondar en el conocimiento de los fitoesteroles y sus beneficios para la salud, la función que estos tienen en las plantas y los alimentos en los que están presentes entre los que se encuentran los aceites vegetales (Silva et al.,2015).
Los fitoesteroles tienen un papel fundamental en la supervivencia de las plantas, entre las funciones más importantes destacan las siguientes: Desempeñan un papel esencial en la regulación de la fluidez y permeabilidad de la membrana celular; están involucrados en el proceso de embriogénesis de la planta; tienen un papel fundamental en el crecimiento; participan en la defensa de la planta frente a factores bióticos o abióticos y participan en la relación de la planta con el medio, advirtiéndola de condiciones ambientales o de presencia de microorganismos (Silva et al., 2015).
Los fitoesteroles tienen numerosos beneficios para la salud. Son importantes para la salud cardiovascular ya que disminuyen los niveles de colesterol malo (LDL) en el organismo y mantiene los de colesterol bueno (HDL). También tienen propiedades antioxidantes y se ha descubierto que reducen el riesgo de sufrir aterosclerosis y favorecen el control de la glucosa en sangre (Gottau, 2018)
14 Algunos de los alimentos ricos en fitoesteroles son los frutos secos, las semillas y legumbres, trigo y maíz, frutas y verduras y aceites vegetales. En el caso de los frutos secos todos contienen gran variedad de fitoesteroles, pero donde más abundan es en las almendras. En semillas y legumbres hay que destacar las alubias como unas de las que más fitoesteroles contienen entre todas. El trigo y el maíz contienen más fitoesteroles si se aportan en su versión integral o con todo el grano completo. En frutas y verduras destacan el plátano, la lechuga y la manzana. Por último, los aceites vegetales son de gran interés en este apartado porque son la principal fuente de fitoesteroles según American Dietetic Association, siendo el aceite de maíz, el de girasol y el de soja los que muestran mayor concentración (Gottau, 2018).
Cabe destacar que la composición de los fitoesteroles en aceites vegetales puede variar dependiendo de varios factores como la madurez, el estrés hídrico, la localización geográfica, el almacenamiento o el tratamiento. El contenido de fitoesteroles de las semillas oleaginosos es muy variable y determina en parte el contenido en sus correspondientes aceites. A continuación, se introducirán los diferentes tipos de fitoesteroles presentes en algunos de los aceites vegetales más importantes (Silva et al., 2015).
4.3.1 Fitoesteroles en el aceite de maíz.
El aceite de maíz tiene la cualidad de potenciar el sabor de los alimentos con los que se mezcla. Se suele utilizar para sustituir la grasa animal como la mantequilla, aunque en la industria alimentaria también se utiliza como sustituto del aceite de oliva ya que es más económico. Es rico en vitamina E, tiene efecto antioxidante, puede en cosmética nutrir e hidratar la piel y tiene alto contenido en Omega 6 (Maki, 2013)
El aceite de maíz posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 11700 mg/Kg. De esta concentración: el 23% es campesterol, 6%
estigmasterol, 66% β-Sitosterol, 4% Δ5-Avenasterol, 1% ∆7-Estigmasterol, 0%
Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 0% de otros (García, 2019).
15 4.3.2 Fitoesteroles en el aceite de algodón.
El aceite de semilla de algodón se emplea con regularidad en la industria alimentaria, ya que tiene la capacidad de extender la vida útil de los alimentos.
Puede encontrarse en alimentos como patatas fritas, bollería, mahonesa, margarina y aderezos para ensaladas. Tiene efectos antiinflamatorios, contribuye a la salud cardiovascular, ayuda ante la actividad antitumoral y ayuda al cuidado de la piel (Rohor, 2022).
El aceite de algodón posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 4260 mg/Kg. De esta concentración: el 4% es campesterol, 0,9%
estigmasterol, 93% β-Sitosterol, 2.1% Δ5-Avenasterol, 0% ∆7-Estigmasterol, 0%
Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 0% de otros (García, 2019).
4.3.3 Fitoesteroles en el aceite de palma.
El aceite de palma es un aceite que se obtiene de la pulpa o mesocarpio del fruto de la palma, siendo el más común el aceite de la palma africana. Tiene usos esenciales que se destinan a la industria alimentaria y también aporta a la industria cosmética (Ortuño, 2022).
El aceite de palma posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 2530 mg/Kg. De esta concentración: el 14,2% es Campesterol, 7,9%
Estigmasterol, 74,7% β-Sitosterol , 2% Δ5-Avenasterol, 1,2% ∆7-Estigmasterol, 0% Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 0% de otros (García,2019).
4.3.4 Fitoesteroles en el aceite de colza.
En la década de los 70 del siglo pasado las semillas de colza pasaron por métodos tradicionales de fitomejoramiento que dieron como producto las semillas de canola. La canola se ubica en segundo lugar como planta oleaginosa cultivada en el mundo y no solamente se usa en la fabricación de aceite para ensaladas y frituras, sino también en la elaboración de margarinas, mantecas y otros productos alimenticios (Giacopini, 2012).
El aceite de colza posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 6120 mg/Kg. De esta concentración: el 25% es Campesterol, 0%
16 Estigmasterol, 58% β-Sitosterol, 2% Δ5-Avenasterol, 5% ∆7-Estigmasterol, 0%
Δ7-Avenasterol, 10% Brasicasterol y 0% de otros (García, 2019).
4.3.5 Fitoesteroles en el aceite de cártamo.
El cultivo de cártamo es uno de los más antiguos de la humanidad, aunque no fue hasta la década de los 50 que se potenció su siembra por todo el mundo para extraer el aceite de sus semillas. Esta planta viene de la familia de los cardos, también llamada Alazor, es originaria de Oriente y, en principio, fue cultivada por sus vistosas, flores que se usaban como colorante alimenticio o tintura.
Después del aceite de colza, el de cártamo es uno de los que menos grasas saturadas contienen y uno de los más ricos en ácido graso esencial linoleico.
Además, aportan mucha vitamina E a la dieta. Tiene un color ámbar y un suave sabor a avellana, cuando está refinado el sabor es neutro y presenta un color amarillo pálido. Es muy efectivo en la dieta para equilibrar los niveles de colesterol por su riqueza en fitoesteroles (El correo del sol,2022).
El aceite de cártamo posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 3480 mg/Kg. De esta concentración: el 12,9% es Campesterol, 8,9%
Estigmasterol, 52% β-Sitosterol, 1,1% Δ5-Avenasterol, 20,2% ∆7-Estigmasterol, 2,9% Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 2% de otros (García, 2019).
4.3.6 Fitoesteroles en el aceite de soja.
El aceite de soja se extrae de las semillas de la soja, una legumbre de origen asiático. El contenido de aceite en la semilla puede variar de un 15 a un 23 % dependiendo de la variedad de soja. Una vez extraído, se somete a un proceso de refinado que da lugar a un aceite de color amarillo claro y de sabor bastante suave (MMF, 2022).
El aceite de soja posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 3610 mg/Kg. De esta concentración: el 20% es Campesterol, 19,9%
Estigmasterol, 52,9% β-Sitosterol 3% Δ5-Avenasterol, 3,1% ∆7-Estigmasterol, 1,1% Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 0% de otros (García, 2019).
17 4.3.7 Fitoesteroles en aceite de girasol.
El aceite de girasol constituye el 80% de la producción de aceite de semillas en España y forma parte del 10% de la producción mundial del aceite de girasol.
Podemos dividir los componentes del aceite de girasol en dos partes: a) la parte mayoritaria, que forma el 98% en peso del aceite, en la que se encuentran los triacilglicéridos; b) la parte minoritaria en la que nos encontramos los diacilgliceroles, fosfolípidos, ácidos grasos libres, fitoesteroles, hidrocarburos, tocoferoles, ceras, alcoholes alifáticos, trazas metales, carotenoides, compuestos fenólicos y clorofilas (Velasco et al., 2011).
El aceite de girasol cultivado posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 3910 mg/Kg. De esta concentración: el 7,9% es Campesterol, 7,7% Estigmasterol, 60,1% β-Sitosterol, 4,1% Δ5-Avenasterol, 15,1 % ∆7-Estigmasterol, 4,1% Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 1% de otros (García, 2019).
4.3.8 Fitoesteroles en el aceite de oliva
Desde un punto de vista bromatológico el aceite de oliva posee dos fracciones, la fracción saponificable y la insaponificable. La fracción saponificable (mayoritaria), constituye el 98% en peso del aceite y en ella están presentes los siguientes componentes: a) triglicéridos, que componen la mayor parte de la materia saponificable) los diglicéridos; c) los monoglicéridos; y d) los ácidos grasos libres. La fracción insaponificable (minoritaria), constituye el 2% en peso de aceite de oliva y dentro de esta fracción se encuentran los fitoesteroles y componentes que derivan o no de ácidos grasos. Dentro de los derivados de ácidos grasos se encuentran: fosfolípidos, ceras y los ésteres de esteroles; y dentro de los no derivados de ácidos grasos podemos encontrar compuestos como: hidrocarburos (naftaleno, fenantreno, fluoranteno, criseno, perileno y 1,2- benzoantraceno), alcoholes grasos (entre los que se encuentran los alcoholes alifáticos o lineales y los triterpénicos), tocoferoles, dialcoholes, pigmentos, compuestos fenólicos, ácidos fenólicos, alcoholes fenólicos, secoiridoides, lignanos, flavonoides, compuestos volátiles y aromáticos y por último los compuestos de nuestro interés en este caso, los fitoesteroles (Alcántara, 2009).
18 El aceite de oliva posee un contenido promedio moderado de fitoesteroles totales de 1440 mg/Kg. De esta concentración: el 2% es campesterol, 0,7%
estigmasterol, 90,1% β-Sitosterol, 2,1% Δ5-Avenasterol, 4,2 % ∆7-Estigmasterol, 0% Δ7-Avenasterol, 0% Brasicasterol y 0% de otros (García, 2019).
A continuación, se muestra una tabla resumen de los contenidos de fitoesteroles en estos tipos de aceites vegetales que se han comentado.
Tabla 4.1 Tabla resumen de tipos de fitoesteroles y concentraciones en diferentes aceites vegetales. Fuente (García, 2019).
Tipo de aceite
Total (mg/Kg)
Campes terol (%)
Estigma sterol (%)
Β- Sitoster ol (%)
Δ5- Avenast erol (%)
Δ7- Estigma sterol (%)
Δ7- Avenast erol (%)
Brassic asterol (%)
Otros (%)
Maíz 1170 23 6 66 4 1 0 0 0
Algodón 4260 4 0,9 93 2,1 0 0 0 0
Oliva 1440 2 0,7 91 2,1 4,2 0 0 0
Palma 2530 14,2 7,9 74,7 2 1,2 0 0 0
Colza 6120 25 0 58 2 5 0 10 0
Cártamo 3480 12,9 8,9 52 1,1 20,2 2,9 0 2
Soja 3610 20 19,9 52,9 3 3,1 1,1 0 0
Girasol 3910 7,9 7,7 60,1 4,1 15,1 4,1 0 1
19 5. EXTRACCIÓN DE ACEITES DE SEMILLAS OLEAGINOSAS Y DE OLIVA.
PROCESO DE REFINACIÓN DE ACEITES VEGETALES.
5.1 Procedimiento de extracción de aceites a semillas oleaginosas y extracción del aceite de oliva a las aceitunas.
5.1.1 Extracción de aceites a semillas oleaginosas
Las semillas oleaginosas suelen ser sometidas a un pre-tratamiento, que consiste en un acondicionamiento para eliminar la humedad de la semilla, lo que facilita la extracción. Más tarde se tritura la semilla para facilitar el contacto de los disolventes con el aceite de su interior. Después es sometida a extracción, siguiendo generalmente alguna de las siguientes modalidades: a) extracción acuosa, en la que el aceite se separa del agua por su insolubilidad (poco utilizado por la industria); b) extracción por prensado en la que el aceite sale por la reducción del volumen de la pulpa; c) empleo de hidruros halogenados; d) extracción con alcoholes o mezclas de alcoholes; e) extracción por fluidos supercríticos o extracción. Si se ha empleado algún disolvente, hay que separarlo después por ejemplo con una técnica como la destilación o incluso se puede utilizar un rotavapor (para trabajo a escala de laboratorio) (AULAFÁCIL, 2022).
5.1.2 Extracción del aceite de oliva.
Primero se le realiza un pre-tratamiento a las aceitunas recolectadas, este pre- tratamiento consiste en separar materiales menos densos (hojas, hierva y ramas), haciendo uso de un ventilador que introduce aire hacia el fruto recolectado, dentro del pre-tratamiento también hay que destacar el lavado, en el que se separan materiales más densos de la aceituna (polvo, tierra, trozos de piedra, etc), esta separación se lleva a cabo sabiendo que la densidad de la aceituna es más pequeña y las aceitunas flotan en el agua y se separan de ella con el uso de un tamiz (Alcántara, 2009).
Más tarde, la aceituna es molida haciendo uso de un molino de piedra, un molino continuo con martillo de piedra, un molino de martillos o un molino de discos metálicos. Cuando esta operación termina, se procede al batido, que consiste en
20 eliminar las emulsiones formadas y facilitar la agregación de las gotas de aceite.
Por último, se realiza una centrifugación para separar el aceite del alpechín u orujo (Alcántara, 2009).
5.2 Proceso de refinación de aceites vegetales de semillas oleaginosas y del aceite de oliva.
5.2.1 Proceso de refinación de semillas oleaginosas
En los aceites de semillas oleaginosas, el primer paso es el desgomado, en el que se eliminan los fosfolípidos. Después se procede a la desodorización. El proceso de desodorización es un proceso de destilación por arrastre con corriente de vapor para eliminar los ácidos grasos libres y los componentes volátiles presentes en el aceite. Estas sustancias afectan negativamente al olor, sabor, color y estabilidad del producto final. Se pasa vapor a través del aceite a muy baja presión, una temperatura relativamente alta y condiciones de alto vacío. Algunos de los procesos de la desodorización son: Desaireación, extracción precia y retención, extracción posterior y extracción de ésteres de glicilo, condensación de impurezas eliminadas y refrigeración (Alfa Laval, 2022).
5.2.2 Proceso de refinación del aceite de oliva.
Para realizar la refinación al aceite de oliva, primero se realiza una depuración o desgomado, en la que se eliminan los fosfolípidos fundamentalmente. Más tarde se realiza una neutralización en la que se produce la eliminación de la acidez libre y una vez neutralizado se produce la decoloración en la que eliminan las sustancias que dan el color al aceite que son las clorofilas y los carotenos. El penúltimo paso es la desodorización del aceite en la que aplicando calor y una corriente de vapor se eliminan los compuestos que dan un sabor y un olor desagradable al aceite. Por último, se procede a la winterización en la que se eliminan los triglicéridos de punto de fusión más elevado, haciendo que el aceite se mantenga líquido a temperaturas más bajas (Aceite de las Valdesas, 2022).
21 6. EXTRACCIÓN DE FITOESTEROLES DEL ACEITE VEGETAL.
El primer paso en todos los métodos de análisis de fitoesteroles es su extracción a partir del aceite vegetal, separándolos del resto de la matriz, que es extraordinariamente compleja. Los fitoesteroles tienen poca solubilidad en alimentos grasos, fácil reactividad y alto punto de fusión. Para la separación de moléculas biológicas se tiene que tener en cuenta factores como: tamaño, densidad, difusividad, forma, polaridad, solubilidad, carga electrostática y volatilidad de los compuestos sometidos a separación. Se pueden utilizar enfoques tradicionales de extracción de fitoesteroles, como la destilación molecular, la cromatografía sobre gel de sílice, la extracción líquido-líquido y sólido-líquido, aunque conducen a baja pureza en el producto final que se obtiene. En este caso, nosotros seguiremos una ruta de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales para su posterior separación y análisis. En esta ruta de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales utilizaremos el destilado de desodorización en aceite comestible (Dikshit et al.,2019)
En los últimos años se han utilizado técnicas convencionales como son:
extracción soxhlet, la maceración, el calentamiento a reflujo, la percolación o la hidrodestilación (Ferdosh et al., 2018). El aspecto negativo de estas técnicas es la potencial toxicidad para los seres humanos y el medio ambiente de los disolventes orgánicos utilizados. Por ello pondremos especial énfasis en técnicas avanzadas de extracción de fitoesteroles, que son menos tóxicas para los seres humanos y más respetuosas para el medio ambiente.
A continuación, se presentan y discuten las técnicas de extracción encontradas en bibliografía empleadas más recientemente.
6.1 Procedimientos de extracción.
En un estudio realizado a partir de aceite de soja desodorizado, mezclan el aceite con hexano y gel de sílice formando una especie de pasta a la cual se le realiza una extracción soxhlet, utilizando hexano en la que los lípidos menos polares (tocoferoles) quedan disueltos en este disolvente. Luego a la pasta que queda rica en lípidos polares (que contiene los fitoesteroles y/o sus ésteres retenidos
22 sobre el gel de sílice) se le realiza una extracción con acetato de etilo, y queda una fracción de lípidos polares que más tarde será sometida a una saponificación en la que se separará la materia saponificable de la insaponificable, en esta última están presentes los fitoesteroles (Kasim et al., 2010).
En este caso, las semillas de girasol se les eliminaron la humedad en un horno y posteriormente se les hizo la extracción soxhlet en hexano. Cuando obtenemos el aceite, se hace una saponificación utilizando KOH, la materia insaponificable resultado de la saponificación se sometió a cromatografía en capa fina y cuando los analitos se separaron, se raspó las bandas correspondientes a los fitoesteroles y se disolvieron en diclorometano (Fernández-Cuesta et al., 2010).
En muestra la aceituna se trituró ésta en un molino y luego la pasta se centrifuga en un decantador de dos fases. El aceite se saponificó con KOH y se separó la fracción saponificable de la insaponificable en la que se encuentran los fitoesteroles. Por último, los esteroles de la fracción insaponificable se separan por cromatografía en capa fina de gel de sílice (Tekayaet al., 2012).
Se extrajeron fitoesteroles en otra ocasión en aceite de canola, que es extraído del fruto por diferentes métodos (extracción con solventes, prensado en caliente y prensado en frío). En este estudio se analizan la variación de fitoesteroles dependiendo del tipo de extracción de aceite a las semillas de canola. Al aceite de canola se le añadió un estándar interno y un conjunto de disolventes y se le realizó una extracción en fase sólida (SPE) en columnas que contenían sílice activada (Mirzaee et al., 2013).
Se extraen fitoesteroles (Brasicasterol, ergosterol, 24-metilen-colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23- estigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24- estigmastadienol, Δ7-estigmastenol, Δ7-avenasterol) en aceites comestibles. Se utiliza un patrón interno que en este caso es el α-colestanol y se realiza una saponificación haciendo uso de KOH. A la fracción insaponificable se le realiza una extracción líquido-líquido en un embudo de decantación con un disolvente orgánico (García-Llatas,2021).
23 En otro estudio se procedió a la extracción de fitoesteroles (campesterol, estigmasterol, β-sitosterol) de diferentes tipos de aceites. Para ello se realizó primero una saponificación con KOH. Más tarde la fracción insaponificable se extrajo con hexano y agua destilada y el sobrenadante se secó con nitrógeno.
Se realizó posteriormente una derivatización utilizando bis- trimetilsililtrifluoroacetamida (BSTFA) (Zhang et al., 2020)
Esta vez, (Luana et al. 2018) propusieron saponificación del aceite de oliva por un método asistido con ultrasonido utilizando KOH para extraer los fitoesteroles (Estigmasterol, β-sitosterol). Más tarde se produjo sobre la materia insaponificable una extracción líquido-líquido utilizando éter dietílico.
También se determinaron fitoesteroles (stigmasterol, β-sitosterol) de una muestra de aceite vegetal comestible. Para ello primero se le realizó al aceite una saponificación asistida con ultrasonidos utilizando KOH y más tarde se le realizó una extracción líquido-líquido con hexano (Zhang et al., 2019)
6.2 Extracción por destilación molecular.
La destilación molecular o destilación de ruta corta es una técnica que permite separar compuestos termolábiles a una temperatura más baja que el punto de ebullición utilizando condiciones de alto vacío. La ventaja que tiene esta técnica es que la temperatura de calentamiento (a presión reducida) puede ser mucho más pequeña que el punto de ebullición del líquido a presión estándar. A continuación, se detallará un estudio que empleó dicha técnica (Laboao, 2022).
Se recuperaron fitoesteroles de aceite desodorizado de soja utilizando el método de la destilación molecular. Primero se realizó una saponificación en la que se eliminaros ácidos grasos y se separaron al mismo tiempo los fitoesteroles que estaban unidos a ácidos grasos, quedando libres. A este producto se le realiza la destilación molecular para eliminar más ácidos grasos que puedan quedar libres y se observó un enriquecimiento de fitoesteroles del aceite desodorizado inicial que fue de 3,5 veces. Al producto de la destilación molecular, en el que están presentes tocoferoles y fitoesteroles, se le añade una mezcla de etanol y agua, en la que se forma un lodo rico en fitoesteroles que se filtra. En el filtrado quedan contenidos los tocoferoles (Ito et al., 2005).
24 6.3 Cristalización en disolvente.
Un enfoque para purificar fitoesteroles del destilado desodorizado del aceite de soja, se basa en la diferencia de solubilidad y la polaridad de disolventes para realizar una cristalización del soluto en un disolvente.
Un ejemplo de esta técnica, fue el uso de la cristalización en disolvente en aceite de soja desodorizado de semillas cultivadas en la India, que son sometidas a un refinado químico. De ahí se obtuvo el destilado desodorizado del aceite de soja.
En uno de los métodos de esta memoria, al desodorizado del aceite de soja se le realiza una saponificación. La materia insaponificable será sometida a un proceso de cristalización utilizando agua y hexano. Luego se filtró para obtener la mezcla cruda de fitoesteroles. A esta mezcla cruda de se le hizo una cristalización adicional con la misma cantidad de hexano y agua que al desodorizado del aceite de soja y se filtró una vez más (Khatoon et al., 2009).
Por otra parte, se hizo uso de la técnica de cristalización por disolvente para la extracción de fitoesteroles del desecho desodorizado del aceite de soja. Se sometió a la muestra a una descomposición catalítica con una disolución alcalina para transformar los ésteres (de ácidos grasos) de esteroles en fitoesteroles libres. Luego se añadió una mezcla de acetona y etanol para cristalizar los fitoesteroles y al enfriar cristalizaron y se filtraron a vacío para recuperarlos (Yang et al.,2010).
También se puede realizar una extracción de fitoesteroles del aceite desodorizado de soja. Los ésteres de esteroles se saponifican y quedan libres junto con los fitoesteroles que ya de por sí estaban libres, y se esterifican todos con metilo. Los fitoesteroles quedaron como ésteres metílicos de ácidos grasos.
Más tarde se hizo una cristalización en disolvente utilizando agua-éter de petróleo como solvente (Yan et al., 2012).
6.4 Cromatografía en contracorriente de alta velocidad.
Esta técnica utiliza la fuerza centrífuga para retener la fase estacionaria y es un tipo de técnica cromatográfica de partición líquido-líquido Cromlab (2022). Esta separación tiene como base el coeficiente de partición de los compuestos entre
25 las dos fases. Básicamente, dos fases líquidas inmiscibles entre sí se mezclan para formar un sistema bifásico y se separan múltiples veces, los solutos individuales se aíslan en base a los diferentes coeficientes de reparto de cada compuesto en dicho sistema de doble fase. Una de estas dos fases es la fase líquida estacionaria y la otra es la fase líquida móvil. La fase móvil se va decantando a la salida de la celda y va pasando a otra celda, así sucesivamente.
Las ventajas de este método son las siguientes: Es un método económico, es una técnica muy eficiente, es rápida y se pueden utilizar gran cantidad de solventes (Sneha, 2019).
A continuación, se expondrán algunos ejemplos de estudios en los que se ha empleado este método, cada uno de ellos tiene un determinado sistema bifásico en la que se emplearán diferentes tipos de solventes, una velocidad de rotación determinada y un caudal determinado en la columna.
Podemos utilizar la cromatografía a contracorriente para purificar β-sitosterol, a partir de una mezcla de esteroles de una fuente vegetal, a esta mezcla se le realiza una cromatografía a contracorriente de alta velocidad para aislar el β- sitosterol de los demás fitoesteroles (Zhou et al., 2002).
También se puede usar cromatografía en contracorriente para extraer fitoesteroles de la semilla neem. La semilla de neem seca se molió y 50 g del polvo se maceraron 3 veces con una mezcla de hexano. Esto generó 15 g de aceite soluble en hexano. Al aceite soluble en hexano se le realizó un proceso de saponificación con hidróxido de potasio, en el que se aislaron los ácidos grasos. A la fracción insaponificable se le aplicó cromatografía en contracorriente de alta velocidad para aislar los fitoesteroles aún más de la fracción insaponificable (Gossé et al.,2005)
6.5 Extracción por fluidos supercríticos.
Un fluido supercrítico (SF) define el estado de una sustancia en el que la temperatura y la presión se elevan por encima de sus valores críticos. Los SF poseen las propiedades tanto de un gas como de un líquido y, por lo tanto, existen como un fluido en lugar de un gas o un líquido (Uddinet al., 2015). Una
26 ventaja de la extracción con el CO2, es que este se libera a la atmósfera y con él se puede trabajar en condiciones suaves de temperatura. Esta técnica es sobre todo utilizada para extraer con SF el aceite de semillas oleaginosas teniendo la peculiaridad de que se producen mínimas pérdidas de fitoesteroles en la extracción del aceite de la semilla oleaginosa.
En este caso, se realizó la extracción por fluidos supercríticos (SC-CO2) para la extracción de aceite de semillas de tomate, ajustando el caudal, la temperatura y la presión. El aceite de las semillas de tomate se saponificó con KOH y los fitoesteroles presentes en la fracción insaponificable se analizaron posteriormente (Eller et al., 2010).
Otro ejemplo del empleo de esta metodología en aceite de diferentes tipos de arroces puede encontrarse en bibliografía. Posterior a la extracción por fluido supercríticos se realizó al aceite una saponificación utilizando KOH y la fracción insaponificable se analizó más tarde (Mingyai et al., 2018).
6.6 Procesos enzimáticos.
Las enzimas hacen uso de su estereoselectividad y especificad para catalizar reacciones químicas, lo que puede ser muy útil para la recuperación y aislamiento de fitoesteroles. Esto quedará patente en algunos de los estudios que se expondrán a continuación.
Un buen ejemplo es el uso de una reacción enzimática para purificar fitoesteroles y tocoferoles de aceite de soja desodorizado mediante una reacción enzimática.
En este estudio lo primero que se planteó fue partir del desodorizado del aceite de soja y a este se la realizó una destilación molecular para recuperar los fitoesteroles, entre otros compuestos. Luego se le añadió la enzima Candida rugosa y los fitoesteroles se convertieron a ésteres (de ácidos grasos) de esteroles (acilesteroles). Luego los fitoesteroles se recuperaron como acilesteroles (Watanabe et al., 2004).
27 A continuación, se muestra una tabla resumen de la extracción de fitoesteroles en aceites vegetales. Los diferentes métodos de análisis, se van a explicar en más detalle en los siguientes apartados.
28 Tabla 6.1 Tabla resumen de extracción de fitoesteroles en aceites vegetales y diferentes métodos de análisis
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de
extracción de aceite de muestra.
Técnica de extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS FITOESTEROLES
% Recuperación y Pureza
referencia
Aceite desodorizado de soja
3 --- Extracción Soxhlet, extracción líquido-
líquido y
saponificación.
CG FID Aceite inicial:
9,75%± 0,12%
Después de
extracción:
55,5% ±0.56%
Recuperación:
94±0.19%
(Kasim et al., 2010)
Semillas de girasol
Sin especificar Extracción Soxhlet Saponificación y cromatografía en capa fina.
CG FID Contenido medio
fitoesteroles:
4704 mg
fitoesteroles/Kg de aceite
--- (Fernández-
Cuesta et al., 2010).
Aceituna Sin especificar Trituración de aceituna en un molino.
Centrifugación y decantación en dos fases.
Saponificación y cromatografía en capa fina
CG FID Contenido medio de
fitoesteroles 1935,34 mg fitoesteroles/kg aceite
--- (Tekayaet
al.,2012).
29 Tabla 6.1 Continuación
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de extracción de aceite de muestra.
Técnica de extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS FITOESTEROLES
%
Recuperación y Pureza
referencia
Semillas de canola
4 Extracción con
solventes, prensado en caliente y prensado en frío
SPE CG FID Contenido medio de
fitoesteroles en técnicas de extracción: 774 y 940 mg fitoesteroles/100 g de aceite
--- (Mirzaee et al.,2013).
Aceites comestibles
10 --- Saponificación
Extracción líquido- líquido
CG FID --- --- (García-
Llatas et al., 2021)
Diferentes tipos de aceites
3 --- Saponificación
Extracción del insaponificable con agua destilada y hexano.
Secado con
nitrógeno
CG MS --- --- (Zhang et
al., 2020)
30 Tabla 6.1 Continuación.
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de extracción de aceite de muestra.
Técnica de extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS FITOESTEROLES
% Recuperación y Pureza
referencia
Aceite de oliva 3 --- Saponificación
asistida con ultrasonidos Extracción líquido- líquido
HPLC UV --- --- (Luana et
al.,2018)
Aceite comestible
3 --- Saponificación
asistida con ultrasonidos Extracción líquido- líquido
HPLC MS --- --- Zhang et
al., 2019)
Aceite desodorizado de soja
Sin especificar --- Saponificación y posterior destilación molecular
HPLC UV --- Contenido de
producto: 19,1%
fitoesteroles
Ito et al.
(2005)
31 Tabla 6.1 Continuación.
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de extracción de aceite de muestra.
Técnica de
extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS FITOESTEROLES
% Recuperación y Pureza
referencia
Aceite desodorizado de soja
3 --- Saponificación y
posterior
Cristalización en frío
HPLC UV % producto en peso: 3,1%
estigmasterol, 50,1%
campesterol, 34,3% Beta- sitosterol
Pureza: 97%
Rendimiento: 7,26- 9,25%
% Recuperación:
13,2-17,8%
(Khatoon et al., 2009).
Desodorizado aceite de soja
Sin especificar --- Descomposición catalítica y posterior cristalización
CG --- --- Pureza en
cristalizaciones sucesiva:1º :91,82, 2º: 92,73, 3º: 97,17.
Rendimiento en 1º:
22,95%
(Yang et al.,2010)
Desodorizado de aceite de soja
4 --- Saponificación
seguida de
esterificacion y posterior
cristalización del solvente
CG FID Composición final producto fitoesteroles: Brasicasterol (0,81 %), campesterol (27,72
%), estigmasterol (23,69 %) y β-sitosterol (44,72 %).
Pureza: 95,88%
Rendimiento:
6,64%
(Yan et al., 2012)
32 Tabla 6.1 Continuación
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de extracción de aceite de muestra.
Técnica de extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS
FITOESTEROLES
%
Recuperación y Pureza
referencia
Mezcla de fitoesteroles
Beta- sitosterol, entre otros
--- Cromatografía a corriente de alta velocidad.
HPLC UV ---- Pureza
producto final:
97%
(Zhou et al., 2002)
Semilla neem
13 Trituración de
semillas y disolución en mezcla de hexano
Saponificación
seguida de
Cromatografía a contracorriente de alta velocidad
CG FID Fracción insaponificable:
La fracción insaponificable estuvo constituida por 62,92% de β-sitosterol, 19,17% Δ7-estigmasterol, 15,65% Δ7 avenasterol, 1,18% 4-metilcolest-7-enol, y los compuestos minoritarios son 0,80%
Δ5 campesterol y 0,20% colesterol.
---
(Gossé et al.,2005)
Semillas de tomate
8 Extracción de
aceite por fluidos
supercríticos
Saponificación CG FID 12,30 mg fitoesteroles/ g de aceite.
Composición fitoesteroles del producto final extraido: 33 % de β-sitosterol, 22 % de cicloartenol, 10,4–11 % de estigmasterol, 10–11 % de cicloartenol, 5,2–5,6 % de colesterol, 4,8–5,2 % de campesterol, 0,7–1 % de colestanol y 0,3–0,5 % de brasicasterol
---
(Eller et al., 2010)
33 Tabla 6.1 Continuación
Muestra Nº de
fitoesteroles de interés
Técnica de extracción de aceite de muestra.
Técnica de extracción de fitoesteroles
Técnica de análisis
TIPO DE DETECTOR
NIVELES ENCONTRADOS FITOESTEROLES
%
Recuperación y Pureza
referencia
Aceite salvado de arroz
Beta-sitosterol, estigmasterol y campesterol entre otros
Extracción por fluidos
supercríticos
Saponificación CG FID Media fitoesteroles en
diferentes tipos de arroz:
8,78±0,28 mg fitoesteroles / g de aceite
---
(Mingyai et al., 2018)
Aceite desodorizado de soja
Sin especificar --- Destilado de
trayecto corto
seguido de
Extracción enzimática
CG --- --- Pureza: 97,2 %
Recuperación:
86,3%
(Watanabe et al.,2004)
* CG: Cromatografía de gases; FID: Detector de ionización de llama; HPLC: Cromatografía de líquidos; UV: Detector ultravioleta; SPE: Extracción en fase sólida
34 7. ANÁLISIS DE FITOESTEROLES.
En el análisis de fitoesteroles esta memoria se centrará sobre todo en CG y HPLC porque son las dos técnicas analíticas más importantes en el análisis de fitoesteroles.
7.1 Análisis por cromatografía de gases (CG).
Los fitoesteroles pueden analizarse por CG, sobre todo con detectores como el detector de ionización de llama (FID) o el espectrómetro de masas (MS), este último nos aportará información estructural de los fitoesteroles. Para el análisis de fitoesteroles con CG, la mayoría de veces se realiza una derivatización, en la que los fitoesteroles se transforman en derivados hidrofóbicos adecuados para el análisis por CG. Los fitoesteroles son compuestos termolábiles, por lo que la derivatización hará que mejore su estabilidad térmica, su volatilidad e incluso en algunos casos la sensibilidad en la detección. Esto también a su vez puede ser un inconveniente debido a que se puede producir la pérdida de analitos, más interferencias y además precisa de un tiempo de análisis mayor. Pese a todo lo anterior la CG tiene ventajas, ya que tiene una gran eficacia, se producen picos más estrechos y una mejor separación de los fitoesteroles que con HPLC (García-Llatas, 2021).
Hoy en día es una técnica analítica ampliamente utilizada en investigación, laboratorios universitarios o en la industria debido a su sensibilidad y selectividad.
La instrumentación, básicamente consiste en un inyector, una columna y un detector conectados entre sí. Las columnas empleadas en cromatografía de gases para el análisis de fitoesteroles son las columnas capilares, por tanto, la fase estacionaria es líquida. Es importante resaltar que los analitos o sus productos derivatizados (que es nuestro caso) deben ser térmicamente estables, se separan dependiendo de la volatilidad y además hay que tener en cuenta de que la fase móvil no interacciona con los analitos. Por tanto, los fitoesteroles se separarán dependiendo de la diferencia de volatilidad que presenten unos y otros en esta técnica. Los detectores empleados deben tener una sensibilidad
35 adecuada, buena estabilidad y reproducibilidad, un tiempo de respuesta relativamente rápido y deben ser versátiles (Abelló, 2022)
A continuación, se expondrán dos ejemplos de análisis de fitoesteroles en los que se empleó un CG.
Analizaremos los fitoesteroles presentes en aceite desodorizado de soja. Se realizó una derivatización y el análisis se llevó a cabo por CG con un Hewlett- Packard 5890 (Avondale, PA) conectado a una columna capilar DB1-ht y como gas portador se utilizó el nitrógeno. Al final se obtuvo una pureza y recuperación del 97,2 % y 86,3 %, respectivamente (Watanabe et al., 2004).
En este segundo estudio también se realizará el análisis de fitoesteroles provenientes de aceite de soja a los que se les ha hecho una derivatización haciendo uso de un CG, con una columna capilar HP-5 para analizar la pureza de los esteroles. Esto dio un resultado de pureza del 91,82% la primera cristalización, 2º 92,73 y 3º 97,17% y un rendimiento en la primera cristalización del 22,95% de fitoesteroles (Yang et al., 2010).
En los dos estudios anteriores los autores no detallan el tipo de detector usado.
A continuación, se detallarán los detectores más utilizados en CG para el análisis de fitoesteroles, que son el detector FID y el de MS y señalaremos estudios en los que se han empleado respectivamente cada uno de ellos.
7.1.1 Cromatografía de gases con un detector de ionización de llama acoplado (CG-FID)
Este detector es considerado universal para compuestos orgánicos, y es el detector más importante de la CG actual, por supuesto es el detector más empleado en CG para el análisis de fitoesteroles. En este detector, la corriente gaseosa que sale de la columna pasa por una llama compuesta de hidrógeno y aire. El detector destruye la muestra que sale por la columna utilizando la llama y se producen en esta combustión iones y partículas cargadas que son responsables del paso de una corriente iónica débil entre dos electrodos (Abelló, 2022).
36 Figura 7.1. Cromatógrafo de gases con un detector de ionización de llama (CG-FID). Fuente:
(LECO, 2022)
A continuación, se expondrán algunos estudios en los que la detección se ha llevado a cabo mediante CG-FID para el análisis de fitoesteroles.
En este caso a los fitoesteroles extraídos del aceite de soja desodorizado se les realizó una derivatización y un posterior análisis con un CG que usa una columna de gel de sílice fundida, un detector FID y un gas portador que es nitrógeno. Se concluyó que el desodorizado del aceite de soja contiene un 9,75%±0,12 % de fitoesteroles libres (campesterol, estigmasterol y β-sitosterol), y con el tratamiento aplicado se convirtió en un producto final enriquecido que contiene 55,5%±0,56% fitoesteroles libres. La recuperación total de fitoesteroles fue del 94±0,19% (Kasim et al., 2010).
En otra muestra como por ejemplo semillas de girasol, los fitoesteroles extraídos del aceite de girasol se someten a una derivatización y posteriormente se realiza el análisis en un CG equipado con un FID, un inyector PTV (vaporización a temperatura programada), una columna capilar HP-5 y el gas portador es el hidrógeno. Se comprobó que el contenido medio de fitoesteroles del aceite fue de 4704 mg/kg de aceite (Fernández-Cuesta et al., 2010).
En otro estudio se analizaron los fitoesteroles del aceite de oliva que se derivatizaron y se analizaron mediante cromatografía de gases con un detector FID y el gas portador fue el helio. El resultado fue que el contenido en fitoesteroles era de 1935,34 mg/kg (Tekayaet al., 2012).
37 Por otro lado, (Mirzaee et al., 2013) emplearon un método CG-FID para analizar una muestra de aceite de canola. Cuando se les realiza la derivatización a estos fitoesteroles, se analizan mediante una columna capilar de sílice fundida, y como gas portador se seleccionó hidrógeno. La media en fitoesteroles (Brasicasterol, campesterol, estigmasterol y Sitosterol) de todos los métodos de extracción del aceite de canola que se siguieron fue aproximadamente de entre 774 y 940 mg/100 g de aceite.
En otro estudio, a los fitoesteroles (Brasicasterol, ergosterol, 24-metilen- colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23- estigmastadienol, clerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24- estigmastadienol, Δ7-estigmastenol , Δ7-avenasterol) presentes en aceites comestibles, a los que se les realizó una previa derivatización, se les realizó un análisis haciendo uso de una CG usando como gas portador helio y un detector FID (García-Llatas, 2021).
Se realizó una extracción de fitoesteroles al aceite desodorizado de soja y posteriormente se les realizó una derivatización. Se analizó por CG, que contiene una columna capilar HP-5, detector FID y utilizó como gas portador nitrógeno. La composición final de fitoesteroles fue de: Brasicasterol (0,81 %), campesterol (27,72 %), estigmasterol (23,69 %) y β-sitosterol (44,72 %). Un rendimiento de 6.64% con un 95,88% de pureza (Yan et al., 2012)
Otro ejemplo de un método CG-FID para el análisis de fitoesteroles, fue el que se realizó a fitoesteroles provenientes del aceite de la semilla Neem, que una vez extraídos se derivatizaron. Se usó una columna capilar y el gas portador utilizado fue el hidrógeno. Obteniendo se que la fracción insaponificable estuvo constituida por 62,92% de β-sitosterol, 19,17%∆7-estigmasterol, 15,65% ∆7-avenasterol, 1,18%
4-metilcolest-7-enol, y los compuestos minoritarios son 0,80% ∆5-campesterol y 0,20% colesterol (Gossé et a., 2005)
Un método GC-FID también fue empleado para analizar aceite de semillas de tomate. El contenido total de fitoesteroles fue de 12,30 mg/g de aceite con un contenido de esteroles individuales de alrededor del 33 % de β-sitosterol, 22 % de cicloartenol, 10,4–11 % de estigmasterol, 10–11 % de cicloartenol, 5,2–5,6 % de colesterol, 4,8–5,2 % de campesterol, 0,7–1 % de colestanol y 0,3–0,5 % de
38 brasicasterol, lo que indica que el aceite de semilla de tomate es una fuente de fitoesteroles con muchas propiedades beneficiosas (Eller et al., 2010).
El aceite de diferentes tipos de arroces se analizó haciendo uso de un CG-FID.
Los fitoesteroles se derivatizaron anteriormente y la muestra se inyectó en el GC con columna ZB-5MS y un detector FID.La fase móvil o gas portador fue helio.
Como resultado se concluyó que el β-sitosterol fue más abundante que el estigmasterol y el campesterol. La media de fitoesteroles en diferentes tipos de arroz está en torno a un 8,78 ± 0,28 mg/g (Mingyai et al., 2018)
7.1.2 Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-MS)
La principal ventaja de esta técnica, es que además de contar con la CG como técnica separativa, tiene acoplado un MS que separa los iones formados a partir de las moléculas dependiendo de la relación masa-carga que presenten. Por esta razón el acoplamiento CG-MS es una técnica separativa y además identificativa, que aporta información estructural a nivel molecular. La ionización que se producirá en el espectrómetro de masas puede producir fragmentación o no. Se emplea como fuente de ionización de los compuestos que llegan del CG luna fuente de impacto electrónico (EI) que produce una fuerte fragmentación de la molécula, lo que da información sobre la estructura del compuesto (Barreda, 2011).
Figura 7.2. Cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (CG-MS). Fuente:
(REPORTERO INDUSTRIAL, 2016)
En este caso, (Zhang et al., 2020), se desarrolló un método CG-MS para analizar fitoesteroles (campesterol, estigmasterol, β-sitosterol) en diferentes tipos de
