ESTUDIO COMPUTACIONAL DE AGREGADOS DE ANFOTERICINA B CON MOLÉCULAS HIDRÓFOBAS CON POTENCIAL USO PARA MODIFICACIÓN DE
COPOLÍMEROS EMPLEADOS EN LA ENCAPSULACIÓN DE ANFOTERICINA
ESNEIDER GRANDAS CIFUENTES
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ D.C
2021
ESTUDIO COMPUTACIONAL DE AGREGADOS DE ANFOTERICINA B CON MOLÉCULAS HIDRÓFOBAS CON POTENCIAL USO PARA MODIFICACIÓN DE
COPOLÍMEROS EMPLEADOS EN LA ENCAPSULACIÓN DE ANFOTERICINA
ESNEIDER GRANDAS CIFUENTES
TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA
DIRECTORA
SOL MILENA MEJÍA CHICA, Ph.D
LÍDER DE LA LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: QUÍMICA COMPUTACIONAL GRUPO DE INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA UNIVERSIDAD JAVERIANA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ D.C
2021
NOTA DE ACEPTACIÓN
PRESIDENTE DEL JURADO
DIRECTOR EXTERNO JURADO
DIRECTOR INTERNO JURADO
BOGOTÁ D.C, MARZO DE 2021
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a todos aquellos que han creído en mí, aquellos que salen adelante y que están al lado mío, este trabajo va dedicado a mi familia, amigos, las universidades e instituciones que me acogieron y me permitieron acceder al conocimiento.
Dedicado a mi mamá, papá, hijos, hermano, esposa y a todos los que me vieron día a día estudiando y esforzándome por salir adelante.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no ha sido solo esfuerzo mío, sino de muchas personas que estuvieron al lado mío apoyándome y dándome la motivación para poder llevarlo a cabo, instituciones como la Universidad Distrital Francisco José de Caldas que me acogió y de la cual aprendí todo lo que sé ahorita en este punto de mi vida. A la Pontificia Universidad Javeriana agradezco por contar con personas como la profesora Sol que nos abre las puertas para poder aprender y apoyar en una línea de investigación.
Agradezco a mi familia, a mis amigos, a todos mis seres queridos que han creído en mí y que siempre estuvieron y vieron todo lo que uno lucha para salir adelante, me encuentro supremamente agradecido con todos.
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ... 15
2. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN ... 17
3. MARCO CONCEPTUAL... 23
3.1 ANFOTERICINA B ... 23
3.1.1 Características de la Anfotericina B ... 24
3.1.2 Agregados de Anfotericina B ... 26
3.1.3 Estudios computacionales realizados con la Anfotericina B ... 27
4. OBJETIVOS ... 29
5. METODOLOGÍA ... 30
5.1 Elección de las moléculas hidrófobas ... 30
5.2 Obtención de estructuras de partida de los monómeros... 30
5.3 Obtención de estructuras estables de los monómeros ... 30
5.4 Determinación de estructuras de partida de los dímeros ... 31
5.5 Clasificación energética de los dímeros ... 31
6. RESULTADOS ... 32
6.1 Moléculas hidrófobas con potencial uso para modificación ... 32
6.1.1 Dodecanol ... 32
6.1.2 Colesterol ... 33
6.1.3 ɣ-ciclodextrina ... 35
6.1.4 Resorcinol ... 37
6.1.5 DSPE (1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fostafoetanolamina) ... 38
6.2 Obtención de estructuras de partida de monómeros ... 39
6.3 Optimización de los monómeros ... 41
6.3 Momentos dipolares de las moléculas seleccionadas para la formación de dímeros ... 44
6.4 Mapas de potencial electrostático (MPE) ... 46
6.5 Estructuras iniciales de los dímeros ... 49
6.6 Dímeros resultantes de la interacción entre anfotericina con moléculas hidrofobas ... 53
6.6.1 Determinación del ΔE usando la corrección de la energía del punto cero (ZPE). ... 59
6.6.2 Dímeros: grafos moleculares (obtenidos con el programa AIMALL Professional) ... 61
7. CONCLUSIONES ... 64
8. SUGERENCIAS ... 67
9.PERSPECTIVAS ... 68 10. BIBLIOGRAFíA ... 69
FIGURAS
Figura 1 Micrografías de tres hongos (a) Candida albicans, (b) Aspergillus fumigatus, (c) Cryptococcus
neoformans.. ... 17
Figura 2 Encapsulación de fármaco cristalizado en medio acuoso en bicapa lipídica. ... 19
Figura 3 Presentación de medicamento Ambisome. ... 20
Figura 4 Estructura de la Anfotericina B. ... 23
Figura 5 Ergosterol y colesterol, comparativo estructural. ... 27
Figura 6 Geometría del complejo después de la minimización de la energía (molécula de esterol en verde, AmfB en azul y agua en gris claro). ... 27
Figura 7 Dodecanol o alcohol láurico en su nomenclatura tradicional presentado de 3 maneras (a) representación lineal, (b) producto físico, (c) estructura en 3D. ... 32
Figura 8 Estructura básica de un esterol, estareno. ... 33
Figura 9 Estructura molecular del Colesterol. ... 34
Figura 10 Colesterol en membrana celular. ... 35
Figura 11 Estructura de la ɣ-Ciclodextrina. ... 35
Figura 12 Alfa, Beta y Gamma ciclodextrina de izquierda a derecha. ... 36
Figura 13 Estructura molecular del Resorcinol. ... 37
Figura 14 Estructura lineal del compuesto 1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfatoetanolamina. ... 38
Figura 15 Visualización de los resultados en el visualizador GaussView05, ejemplo γ-ciclodextrina. ... 43
Figura 16 Ejemplo del encabezado de los archivos de entrada para los cálculos de optimización y frecuencias; ejemplo para la γ-ciclodextrina... 44
Figura 17 Polaridad de los monómeros (a) Momentos dipolares clasificados de menos polar (metano) a más polar (AmfB), (b) y (C) resultados visualizados con el Gaussiview05. ... 45
Figura 18 Mapas del potencial electrostático molecular (MEP) de la anfotericina y de los seis compuestos escogidas en orden de mayor a menor momento dipolar. ... 48
Figura 19 Mapas del potencial electrostático molecular (MEP) de la anfotericina y las moléculas escogidas. Igual rango: [-4,946e-2; 7.053e-25]. ... 48
Figura 20 Posibles orientaciones de los dímeros anfotericina-ciclodextrina de acuerdo a las interacciones polar-polar y apolar-apolar según sus MPEs. ... 49
Figura 21 Propuesta de dímeros en posiciones aleatorias entre la AmfB y el DSPE. ... 50
Figura 22 Propuesta de dímeros en posiciones aleatorias entre la AmfB y colesterol... 51
Figura 23 Propuesta de dímeros en posiciones aleatorias entre la AmfB y dodecanol. ... 51
Figura 24 Propuesta de dímeros en posiciones aleatorias entre la AmfB y resorcinol. ... 52
Figura 25 Propuesta de dímeros en posiciones aleatorias entre la AmfB y γ ciclodextrina. ... 53
Figura 26 Geometrías optimizadas de los 5 dímeros más estables de cada tipo. Entre paréntesis está la entalpía de dimerización en kcal/mol. ... 56
Figura 27 Datos energéticos de los monómeros y dímeros optimizados junto con sus entalpias y energías de dimerización. ... 58
Figura 28 Recortes de la salida de los cálculos en Gaussian para obtener la función de onda de la - ciclodextrina, el colesterol y el dimero 1-AmfB-Cole. ... 61
Figura 29 Grafo molecular del dímero 1-AmfB-Cole. Esferas moradas: H, esperas grises: C, esperas rojas:
O, esfera azul N, esferas de menor tamaño verdes: BCP (puntos críticos de enlace), azules: CCP (puntos críticos de caja), rojos: RCP (puntos críticos de anillo) Líneas punteadas indican interacciones entre los átomos que conectan. Para facilidad a la hora de entender qué parte es el colesterol y que parte es de la anfotericina B, en la parte inferior se colocó la geometría optimizada visualizada con el programa
GaussView05. ... 62 Figura 30 Ejemplo de la tabla en la que se reúnen los valores de los parámetros topológicos evaluados en los puntos críticos de enlace. ... 63
TABLAS
Tabla 1 Estructuras iniciales de los diferentes compuestos y las bases de datos de las que fueron
tomadas. ... 40
Tabla 2 Geometrías de compuestos optimizados y tiempo empleado para la optimización (M06-2x/6- 311G(d,p)). ... 41
Tabla 3 Datos termodinámicos (Hartrees) y momento dipolar (D) de dímero AmfB-DSPE. ... 53
Tabla 4 Datos termodinámicos (Hartrees) y momento dipolar (D) de los dímeros AmfB-Cole. ... 54
Tabla 5 Datos termodinámicos (Hartrees) y momento dipolar (D) de los dímeros AmfB-Dode. ... 54
Tabla 6 Datos termodinámicos (Hartrees) y momento dipolar (D) de los dímeros AmfB-Resor. ... 55
Tabla 7 Datos termodinámicos (Hartrees) y momento dipolar (D) de los dímeros AmfB-gammaCd. ... 55
Tabla 8 Energía de dimerización de los dímeros más estables de cada tipo. ... 59
RESUMEN
El presente trabajo es un aporte a un proyecto macro en el que los resultados experimentales junto con los resultados computacionales pretenden proponer nuevos y/o mejoramiento de los métodos actualmente empleados para la encapsulación de la anfotericina B (AmfB) para implementarla como un tratamiento de vía oral y posiblemente domiciliaria y de este modo tener una alternativa a su aplicación vía intravenosa, lo que es costado y requiere de la asistencia al hospital.
En este trabajo se evaluó de manera computacional, empleando métodos de la Teoría del Funcional de la densidad (DFT), una serie de compuestos hidrófobos con potencial uso para la modificación de los copolímeros que encapsulan la AmfB disminuyendo sus efectos secundarios como respuestas adversas que se puedan presentar en el cuerpo humano. Este es un ejemplo del uso de la química computacional en temas relacionados con la rama de la medicina en cuanto a la posibilidad de plantear posibles reestructuraciones de materiales a partir de estudios de modelado computacional antes de invertir en reactivos disminuyendo además la exposición a diferentes sustancias químicas.
Para esta investigación se tomaron las geometrías de partida de los compuestos hidrófobos (Dodecanol, Resorcinol, ɣ-Ciclodextrina, Colesterol, 1,2-diasteroil-sn-glicero-3- fosfatoetanolamina (DSPE)) así como de la AmfB a partir de estructuras reportadas en bases de datos aprobadas por la comunidad científica y/o a partir de la determinación de posibles confórmeros empleando el visualizador Gaussview en la opción de dibujo de moléculas.
Posteriormente se realizó su optimización geométrica utilizando la base 6-311G(d,p) y el nivel de teoría M06-2X. Todos los cálculos de estructura electrónica (optimización, frecuencias, energías puntuales, cargas atómicas, etc) se llevaron a cabo en el software Gaussian 09. Empleando la misma aproximación teórica se optimizaron los diferentes dímeros postulados a interaccionar entre nuestra molécula de estudio la AmfB y los compuestos hidrófobos previamente optimizados.
Se lograron optimizar y comprobar como estables (cero frecuencias imaginarias), 19 dímeros: 6 dímeros como el dodecanol (1 a 6), 6 dímeros con colesterol (1, 2, 3, 4, 7, y 8), 4 dímeros con
resorcinol (1, 2, 6 y 8), 2 dímeros con DSPE (1 y 4) y 1 dímero con γ-ciclodextrina (4). Nótese que los números entre paréntesis indican la enumeración empleada para diferenciar los dímeros, así, por ejemplo, el 4 para la γ-ciclodextrina indica que es el dímero nombrado: 4-gamma-amfB.
No se encontró relación en la polaridad de los compuestos hidrófobos comparadas con polaridad de la AmfB (momento dipolar) y el orden de afinidad obtenido con datos energéticos.
A partir de datos termodinámicos se pudo determinar el siguiente orden de afinidad entre la AmfB y los diferentes compuestos hidrófobos:
1) Anfotericina B – 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatoetanolamina (DSPE) 2) Anfotericina B – ɣ- ciclodextrina
3) Anfotericina B – Colesterol 4) Anfotericina B – Resorcinol 5) Anfotericina B - Dodecanol
Por lo tanto, se propone el 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatoetanolamina (DSPE) y la ɣ- ciclodextrina como los compuestos hidrófobos más promisorios para aumentar la afinidad por la anfotericina de los copolímeros empleados en su encapsulación.
Es evidente que el tipo y abundancia de las interacciones intermoleculares juegan un papel fundamental para entender el orden de afinidad encontrado y para ello se propone como perspectiva a este trabajo realizar trabajos posteriores en donde en más detalle se caractericen dichas interacciones débiles con herramientas como el análisis topológico de la densidad electrónica.
Palabras claves: DFT, Anfotericina B, Dímeros, Compuestos hidrófobos, Interacciones débiles.
RESUMEN ANALÍTICO EDUCATIVO
Los avances tecnológicos y las tecnologías de la información han sido uno de los grandes avances para la población educativa colombiana, teniendo en cuenta el que se facilita su uso con el advenimiento e incremento de la implementación de las TIC´s en las aulas de clase, de modo que se puede avanzar en el cambio de la manera como se está presentado la ciencia a los estudiantes.
Además de esto, los procesos de trasposición didáctica por los aportes de Chevallard, permiten una mejor centralización del conocimiento científico escolar; creando así en los estudiantes imágenes mentales más acertadas conforme a lo que se espera de la temática a enseñar. Como por ejemplo temas tan abstractos tales como el átomo, la molécula, soluciones homogéneas o heterogéneas, entre otros. De este modo se logran establecer herramientas que nos permitirán moldear modelos icónicos, analógicos y simbólicos con los cuales el estudiante tendrá un conocimiento científico escolar más cercano al conocimiento científico, ya que ésta ha sido la principal barrera por la cual los estudiantes no logran comprender de manera apropiada los conocimientos presentados en una sesión de clase, y por la que la ciencia se torna aburrida y poco provechosa para la población estudiantil.
La implementación de las herramientas tecnológicas ayuda de manera puntual en los problemas que presentan los docentes con las analogías que no son apropiadas para los conceptos presentados.
De esta manera se presentaría la información de manera más clara y concisa, en donde el docente debe mantener el rol de guía en el aula de clase, y por ende permanecer en la relación horizontal en la cual es tan importante el estudiante como el docente. Por lo tanto, el docente se ve como un facilitador de la información y una guía para el cumplimiento de los objetivos que se propongan para el desarrollo de las habilidades y competencias que tenga el estudiante según los estándares educativos implementados en Colombia, por lo que las edades cognitivas, también son parte fundamental para el aprendizaje del estudiante.
Es importante que en la labor docente y principalmente en materias de ciencias exactas, como lo es nuestro foco en esta investigación, no dejar de lado el avance tecnológico en el cual la sociedad se encuentra inmersa y más que una desventaja en las aulas de clase, al considerarlo un foco de
distracción, usarlo de manera asertiva para llamar la atención de los estudiantes y que todos sean partícipes de ello.
1. INTRODUCCIÓN
Los avances en la medicina han llevado al ser humano a mejorar su calidad de vida como, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes infectados con el virus del VIH, diferentes métodos como trasplantes de órganos y el desarrollo de medicamentos. Sin embargo, no se puede desconocer que el crecimiento poblacional ha hecho al ser humano más susceptible a infecciones fúngicas provenientes de patógenos, de los cuales entre los más comunes encontramos a: Candida albicans (Amorim-Vaz S, 2015), Aspergilus fumigatus y Cryptococcus neoformans (Schmiedel, 2016).
Entre los tratamientos que se usan actualmente encontramos la suspensión coloidal Fungizone®
compuesta por Anfotericina B (AmfB) y desoxicolato de sodio como surfactante. El Fungizone®
es considerado como un tratamiento estándar debido a su alta efectividad (Saravolatz, 2003), pero un inconveniente es su alto grado de toxicidad, por lo que de igual manera se ha empleado otro medicamento conocido como Ambisome® que se desarrolla por formulaciones liposomales. Este último ha logrado disminuir la toxicidad en comparación con el primer compuesto, sin embargo, algunas de sus desventajas corresponden a su empleo de dosis más altas y al elevado costo del tratamiento.
Fungizone® (Italia, 2009) tiene un costo-efectividad por muerte evitada que podría ascender a los 16 millones de pesos, mientras que el Ambisome® puede llegar a costar hasta 46 millones de pesos (Gamboa, 2012). Además, ambos medicamentos se deben administrar únicamente por vía intravenosa, lo que incrementa los gastos, ya que además se debe contar con largos periodos de hospitalización para la administración del medicamento. Teniendo en cuenta lo anterior, es importante pensar en la accesibilidad de la población que no cuenta con los recursos y en los países en los cuales sus ingresos son bajos para proporcionar un servicio de salud de este tipo.
Los avances en la nanotecnología permiten proponer una nueva administración de este medicamento utilizando la formulación de AmfB en micelas obtenidas a partir de copolímeros en bloque y el desarrollo de un vehículo apropiado para hacer este compuesto de administración oral.
Evitando entonces, que el producto esperado no tenga interacciones con los jugos gastrointestinales. Específicamente, lo que se busca es que el medio de encapsulación presente mayor durabilidad hasta lograr llegar a su punto de acción (Hamill, 2013). Investigaciones
realizadas por Diaz y colaboradores, han reportado que se logran liberaciones controladas en el cuerpo de la AmfB mediante la técnica de auto-ensamble con la utilización de un tribloque de copolímeros (Díaz, 2015). En dicho estudió se evaluaron las concentraciones micelares críticas (CMC) por métodos espectrométricos para así determinar la disminución de la hemotoxicidad, consecuente a esto se lograron establecer interacciones con compuestos como el colesterol y el ergosterol. Por lo tanto, teniendo en cuenta el carácter hidrofóbico de la AmfB, se puede sugerir que se podrían modificar los copolímeros con moléculas hidrófobas como el colesterol y el ergosterol para mejorar el proceso de encapsulación y posterior liberación del fármaco. Para lo cual el análisis computacional puede ayudar a determinar un orden de afinidad entre la AmfB y dichas moléculas hidrófobas. Se espera entonces que este conocimiento aporte al diseño subsecuente de una metodología experimental de síntesis de polímeros modificados con alguno de dichos compuestos, ojalá minimizándose futuros gastos de síntesis de dichos copolímeros para que este compuesto pueda ser administrado de manera oral y se atienda mejor a las necesidades y los avances en la medicina.
2. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
A lo largo de la historia el hombre se ha encontrado muy expuesto a infecciones fúngicas que se dan de manera progresiva y que por naturaleza propia son en su gran mayoría peligrosas. De todas las infecciones fúngicas que se han determinado en los humanos nos centraremos en 3 tipos de los más comunes, ver Figura 1, para los cuales se encuentran mayores registros en los expedientes médicos: Candida albicans (Amorim-Vaz S, 2015), responsable de la candidiasis invasora, la cual es principalmente asociada a animales de sangre caliente y afecta primordialmente las vías respiratorias, mucosas, tractos digestivos, vagina, uñas, piel (Vircell, 2014). Esta infección afecta principalmente a pacientes que presentan inmunodeficiencia, enfermedades donde se presenten bajos niveles de leucocitos, por lo cual generan complicaciones en la enfermedad primaria del paciente infectado; Aspergillus fumigatus responsable de la aspergilosis, generalmente crecen en hojas muertas, frutos secos, granos almacenados, vegetación en descomposición, estiércol, la mayoría de la aspergilosis se presenta en complicaciones de tipo pulmonar como asma, fibrosis quística (Rockville, 2019); entre otras y por último la Cryptococcus neoformans (Schmiedel, 2016), responsable de la criptococosis, se presenta en países como Canadá, África y Estados Unidos. Es un agente fúngico que se encuentra principalmente en la tierra, se propaga fácilmente por el aire llegando a las vías respiratorias afectando con mayor facilidad a pacientes con inmunodeficiencia, pacientes con VIH, leucemia, pacientes con cáncer, entre otras enfermedades (Rockville, 2019).
(a) (b) (c)
Figura 1 Micrografías de tres hongos (a) Candida albicans, (b) Aspergillus fumigatus, (c) Cryptococcus neoformans..
Tomados de:
• (a): https://secuvita.es/investigadores-estudian-la-interaccion-del-hongo-candida-albicans-con-celulas- madre-para-combatir-infecciones/
• (b): https://mycology.adelaide.edu.au/descriptions/hyphomycetes/aspergillus/
• (c): https://www.ppdictionary.com/mycology/neoformans.htm
Antes de 1959 este tipo de infecciones invasivas fúngicas eran tratadas con el medicamento conocido como Nistatina creado por las científicas Rachel Fuller Brown (1898-1980) y Elizabeth Hazen (1885 -1975) (Brown-Hazen, 2017), un antifúngico eficaz contra las enfermedades invasivas creado en el año de 1948 como lo eran la Candida albicans y la Cryptococcus neoformans. En ese entonces el medicamento que tenía resultados frente a bacterias que afectaran la condición humana, era la penicilina, también cultivada y extraída de hongos, muy efectiva contra la micosis muy frecuentemente presentada (Senzill, 2017). Con el paso del tiempo se vio necesario intervenir en la toxicidad que estaba generando este agente antimicótico para el ser humano.
El medicamento conocido como Nistatina (Nis.), considerado y clasificado como un antibiótico antifúngico poliénico que se presenta en tres diferentes tipos de estructuras tipo A, tipo B y tipo C, extraído del hongo Streptomyces noursei, es un antibiótico que presenta insaturaciones en la mayoría de su estructura, siendo categorizada como una molécula con un macrociclo en su estructura. Se considera un macrociclo a aquella molécula o macromolécula que posea en su estructura un anillo de 9 o más átomos posicionados de manera tal que formen un ciclo a condiciones ambiente. La Nis. puede generar confórmeros con las estructuras de tipo A y B por lo que su proceso de aislamiento no se puede realizar con procesos físicos, cuando la Nis. se encuentra en cristales mantiene su uniformidad a temperaturas inferiores a 200 °C por lo que la hace más asertiva para el tratamiento médico, mientras que la estructura de tipo C presenta mayores irregularidades en la uniformidad de su estructura (Shim, 2011).
Para el año de 1959, la administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) aprueba el uso de la Nis. de manera limitada debido a su alto grado de toxicidad provocando afección en los riñones y pronunciando complicaciones en pacientes que ya presenten cuadro clínico de este tipo de infecciones. Es por ello que, entre las soluciones inmediatas, estuvo la introducción de un sistema liposomal para que no se depositara en los riñones, pero esto conlleva a otra afección, y es que debido a su mecanismo de reacción se hace más difícil de desechar del cuerpo y muchas veces no lleva al punto blanco donde debe hacer su acción si no que se deposita en la sangre, lo que la hace hematotóxico (Wasan, 2009). En muchas ocasiones la mala administración del medicamento provoca reacciones adversas al medicamento (RAM, por sus siglas en inglés) (Lescano, 2014). Las RAM más pronunciadas corresponden a
fiebres, náuseas, vómito, en algunos casos se presentan cuadros de nefrotoxicidad, cuando la Nis.
es administrada por largos periodos, también se logran establecer consecuencias como anemia, deficiencia en el sistema inmunológico y de la misma manera un déficit en la producción de células sanguíneas, con una reducción de actividad de las células productoras de plaquetas y demás células sanguíneas.
En la actualidad para el tratamiento de los diferentes tipos de micosis invasivas se emplean dispersiones liposomales como lo es el Fungizone®, teniendo en cuenta que una dispersión liposomal se refiere a una agregación con lípidos capaces de tener carácter hidrosoluble y liposoluble. Generalmente se encuentran formadas por fosfolípidos, ver Figura 2, en donde el medicamento se encuentra inmerso en un fluido o un sistema contenedor para hacer su liberación en un sitio específico.
Figura 2 Encapsulación de fármaco cristalizado en medio acuoso en bicapa lipídica.
Tomado de https://www.researchgate.net/figure/Liposome-modulated-for-drug-delivery-In-this-graphic-representation-apart- from-the_fig7_223987062)
Para controlar mejor su liberación, la Anfotericina B (AmfB) se emplea como el estándar de oro (Carrasco, 2010). Debido a sus resultados frente a pocas cepas resistentes, para el uso en vía intravenosa se emplea el desoxicolato de sodio que es un agente coadyuvante que permite disminuir la toxicidad del medicamento, también ayuda para la absorción del medicamento haciéndolo más duradero en el cuerpo humano (Deray, 2002). Debido a su alto grado de toxicidad y su poca accesibilidad del medicamento, el tratamiento con este medicamento puede llegar a ser muy costoso. Con el desarrollo y la implementación de nuevas técnicas para la encapsulación con
formulaciones liposomales encontramos otro medicamento análogo a este conocido como el Ambisome®, ver Figura 3, en el cual se logra disminuir su grado de toxicidad, pero con la gran desventaja de que se requieren grandes cantidades para poder neutralizar la infección (Amdermik, 2019).
Respecto a los tratamientos que se han realizado en Colombia, para el año 2012 se realizó una investigación donde las alternativas de tratamiento con el Fungizone® podían ascender a los 16 millones de pesos, teniendo en cuenta lo tóxico que puede llegar a ser este medicamento y más aún si los tratamientos médicos son los adecuados para que no presente los efectos secundarios (RAM). Si no se quiere este tipo de consecuencias la otra alternativa subyace en la implementación de las formulaciones liposomales, cuyo costo puede llegar a ascender a los 46 millones de pesos (Saravolatz, 2003).
Figura 3 Presentación de medicamento Ambisome.
Tomado de https://www.wellrx.com/ambisome/drug-images)
Desde el punto de vista de la investigación, con los avances en las capacidades de los computadores, ahora se cuenta con la herramienta de la química computacional que permite hacer predicciones y/o permite tener más evidencias a la hora de explicar resultados experimentales. Para el caso particular de algunos medicamentos, a continuación, se nombran dos casos exitosos del empleo de la química computacional en estudios de posibles medios de encapsulación de fármacos:
• T. Sivasankar (2012), con la implementación de la Teoría del Funcional de la densidad (DFT, por sus siglas en inglés) se evaluó la encapsulación de vainilamina con ciclodextrinas que fueron modificadas con la adición de un grupo hidroxipropil en su estructura con la finalidad
de aumentar la absorción de la estructura y disminuir la solubilidad en el medio. Los resultados indican que tanto las α como las β ciclodextrinas presentan una afinidad óptima para los procesos de encapsulación atribuyendo esto a las interacciones de van der Waals que se presentan entre las estructuras.
• Dutra (2016) presenta la encapsulación de la 1,4-dihidropiridina con derivados de CNT (10/10) usando métodos semiempíricos y DFT para lograr identificar que con el incremento del momento dipolar incrementa parcialmente la solubilidad en agua de la molécula, lo que la hace apta para ser un buen vehículo para la encapsulación del medicamento.
En cuanto a los aspectos que se deben de tener en cuenta nos muestra Sandoval-Peraza (2016) en su capítulo 7 Introducción a los procesos de encapsulación de moléculas nutracéuticas, que una molécula debe de cumplir con las siguientes características para que pueda ser encapsulada:
• Que el fármaco presente buena manipulación cuando se encuentre a altas concentraciones.
• Que presente estabilidad cuando se encuentre en cercanía con el material a encapsular en el momento de la dispersión o la emulsificación del mismo material.
• Que no reaccione con el material de encapsulamiento para que no afecte sus propiedades químicas.
• Que sea soluble en un medio polar, primordial como el agua o que se pueda fundir a baja la temperatura para poder generar su liberación.
Además de lo anterior se deben tener consideraciones en cuanto a los medios de dispersión, transporte, etc. y un adecuado control para la liberación en sitios específicos.
Desde este punto de vista, este trabajo se enmarca en una investigación macro que tiene en cuenta las difíciles problemáticas presentadas por la administración de la AmfB, y lo que se busca es proponer un tipo de formulación oral de la AmfB con su encapsulación por copolímeros en bloque anfifílicos y que presenten condiciones apropiadas para la encapsulación de fármacos. Se ha logrado determinar que la AmfB presenta mejor solubilidad cuando es puesta a interaccionar con compuestos hidrófobos y gracias a esta solubilidad se pueden presentar periodos prolongados en sitios blanco haciéndola así más eficaz y menos nociva (Botero, 2014). De esta manera se propone el modelamiento computacional de la AmfB con diferentes compuestos de naturaleza hidrófoba que podrían ayudar a la encapsulación.
Se espera que aprovechando el avance tecnológico en el poder del cómputo se podrían maximizar tiempos en producción y síntesis del medicamento sin generar desperdicio y ensayos a nivel experimental que podrían no dar resultado.
3. MARCO CONCEPTUAL
3.1 ANFOTERICINA B
La anfotericina B (AmfB) está categorizada como un antifúngico de alto espectro y amplio uso médico, se extrae del cultivo de Streptomyces nodosus que se presenta en los suelos del Río Orinoco especialmente en Venezuela. En su estructura se identifica un anillo de macrolactona β- glicosilada en el carbono 19, tiene una estructura de macrociclo al poseer más de nueve átomos en esta formación, también se enlaza al carbono 19 una cadena de poliénica de 7 enlaces dobles que le confiere un carácter hidrofóbico y otro hidrofílico por los grupos hidroxilados además de un ácido carboxílico y una amina primaria en su hexosamina, ver Figura 4. Gracias a estos componentes en su estructura, la AmfB presenta su carácter anfótero, teniendo en cuenta que un anfótero es aquel que tiene la capacidad de donar o recibir electrones según el medio en el cual se encuentre.
Características: presenta un anillo de macrolactona (C13 y C17). Fórmula molecular: C47H73NO17. Masa molar: 924,08 g/mol
Figura 4 Estructura de la Anfotericina B.
Debido al ya mencionado carácter anfótero (Gamboa, 2012), la AmfB presenta tendencia a auto agregarse en medio acuoso y por lo tanto presenta baja solubilidad. Algunos análisis fisicoquímicos muestran que la AmfB solubiliza parcialmente en metanol y dimetilsulfóxido, también presenta solubilidad en compuestos apolares como metano, cloroformo, éter de petróleo, dimetilformamida, presenta muy baja solubilidad. Además de eso presenta insolubilidad en soluciones salinas con concentraciones inferiores a 100 ppm y un pH neutro (Hamill, 2013). Pese
a las tasas bajas de solubilidad, el medicamento exhibe carácter tóxico y acumulativo en diferentes partes del cuerpo como hígado, pulmones y riñones. Ya que la AmfB se tiende a desechar por la vía urinaria y debido a su carácter poco soluble en medios acuosos, en altas concentraciones se queda en el torrente sanguíneo; lo que provoca su hematotoxicidad (Kaminski, 2014).
3.1.1 Características de la Anfotericina B
La AmfB por su carácter hidrófobo tiende a la unión con moléculas como colesterol y ergosterol.
Cuando esta molécula actúa frente a un hongo presenta una unión con los esteroles de la membrana citoplasmática correspondiente al hongo, debido a esta unión, provoca daño en la célula como pérdida de la permeabilidad, lo que provoca un desbalance entre los iones dentro y fuera del citoplasma llevando a la apoptosis celular, entendiéndose como un efecto fungicida (Torrado, 2008). Esta es la principal acción de la AmfB para poder tener el efecto fungicida, de igual manera este comportamiento de unirse con los esteroles no sucede solo en los hongos sino también con las células del cuerpo humano provocando un deterioro grave por la pérdida consecuente de potasio.
Estos daños se ven mejor reflejados en el daño a nivel renal que provoca por su afinidad con el colesterol. Entre los modelos reportados para el mecanismo de reacción de la AmfB está el de la formación de poros tipo barril que son capaces de lograr la permeabilidad en la bicapa lipídica de las células, lo que provoca un incremento en la entrada y salida de iones. Varias unidades de la AmfB suelen agregarse en rangos de 4 a 12 subunidades, posicionándose de tal manera que su parte polar, la parte que se encuentra recubierta por los compuestos hidroxilados, queda en el interior del poro generado, mientras que la parte hidrofóbica que se encuentra conformada como ya habíamos mencionado por el grupo de polienos (hepteno) se orientan al exterior del poro (Gamboa, 2012).
Otra de las propuestas en cuanto a los mecanismos que presenta la AmfB corresponde al efecto oxidativo, el cual de manera puntual afecta a la célula del hongo provocando una ruptura total en los glóbulos rojos. Este efecto provoca la generación de compuestos oxigenados reactivos que afectan los componentes de la bicapa de las células.
En la tercera propuesta se evidencia una adsorción de las moléculas de AmfB por los esteroles presentes en las células tanto humanas como fúngicas, lo que genera un cambio en la estructuración en la membrana celular provocando de igual manera efectos como los anteriormente descritos en el primer modelo de reacción mencionado. Finalmente se presenta el mecanismo en el que la AmfB conforma agregados los cuales son capaces de generar absorción de moléculas de ergosterol presente en la membrana celular del hongo (Vogelsinger, 2006).
De esta manera es que se logra caracterizar el carácter tóxico que presenta la administración de la AmfB. Sin embargo, los pocos casos reportados de resistencia al medicamento lo hacen uno de los más efectivos contra las enfermedades invasivas, pero consecuentemente uno de los más tóxicos.
Con la finalidad de poder disminuir estas condiciones tóxicas que presenta la AmfB, se han estructurado formulaciones que incluyen el desoxicolato como vehículos estructurados con complejos lipídicos. Se han descrito tres tipos de formulaciones:
a) Anfotericina B Liposomal (L-AmfB): este tipo de agregado corresponde a una organización dada por una sola bicapa, la cual no presenta problemas en el momento de la producción de encapsulados, son mucho más versátiles y de carácter polivalentes, este tipo de formulación es muy común en la farmacología (Carmona, 2015). Esta formulación comercialmente es conocida como el Ambisome® en donde estas partículas en suspensión pueden llegar a tener diámetros de 60 a 70 nm.
b) Anfotericina B en Dispersion Coloidal (ABDC): se presenta al microscopio electrónico en forma de discos los cuales pueden llegar a medir alrededor de 120 a 140 nm, esto dado por las características propias del medicamento, que en algunas condiciones tiende a generar agregados por su naturaleza anfótera, esta formulación se conoce con el nombre de Amphotec®.
c) Anfotericina B Complejos Lipídicos (ABCL): se caracteriza por la disposición de una bicapa lipídica uniformemente establecida con distancias entre 1 a 11 µm entre ellas, conocida en la industria farmacéutica como Abelcet® (Fernández-García, 2017).
3.1.2 Agregados de Anfotericina B
Para las formulaciones de la AmfB, se debe tener en cuenta la concentración empleada pese a que su alto grado de toxicidad no debe de superar 0,1 µM. Ya que con esta concentración tiende a auto agregarse en formas micelares estables a través de interacciones entre los grupos polares y no polares de la misma molécula y con otras moléculas que se encuentren en cercanía a esta (Nakagawa,2015). La AmfB cuando se encuentra a concentraciones bajas (forma monomérica) presenta afinidad por el ergosterol presente en las membranas fúngicas, pero a altas concentraciones, la AmfB incrementa su afinidad por el colesterol y en mayor probabilidad cuando llega a su concentración crítica (Zielińska, 2016).
Estudios computacionales realizados por Kasai y colaborados (2011) utilizando dinámica molecular y DFT, demuestran que los agregados presentados se dan gracias a las uniones por fuerzas de van der Waals con la interacción entre nubes electrónicas de tipo π-π y por puentes de hidrógeno. Como se mostró en la Figura 4, la estructura principal de la AmfB contiene grupos hidroxilados, grupos ácidos y dobles enlaces, lo que la hace susceptible a que se den estos dos tipos de uniones. Experimentalmente, se puede describir la unión con uno de los esteroles como lo es el ergosterol midiendo su diferencial en la permeación de los iones potasio, como se describía en las características fundamentales de la AmfB. En esta técnica experimental se emplean técnicas de resonancia magnética de plasmones, logrando identificar que las formaciones de complejos con esteroles son 40 veces mayores con el ergosterol (erg) en comparación con el Colesterol (col):
AmfB-erg > AmfB-col (Kasai, 2011).
Las insaturaciones presentadas en el segundo anillo del ergosterol, cuya estructura se presenta en la Figura 5, ayudan a mejorar la afinidad por la AmfB, ya que su parte del polieno de carácter no polar incrementa la formación de nubes electrónicas que son de carácter π, por ende, la mayor localización de orbitales π la encontramos con el ergosterol, a pesar de que la diferencia estructural entre el colesterol y el ergosterol solo sea dos enlaces de tipo π. Sin embargo, el colesterol también es interesante, debido a que al no poseer una estructura tan rígida presenta mayor flexibilidad generando diferentes posicionamientos con moléculas afines en la conformación de dímeros (Mouri, 2008).
Figura 5 Ergosterol y colesterol, comparativo estructural.
3.1.3 Estudios computacionales realizados con la Anfotericina B
Para ejemplificar como los estudios computacionales pueden aportar al entendimiento de las interacciones entre la anfotericina y otras moléculas de interés, a continuación, se resaltan dos investigaciones:
• Baran (2009) generando una modelización molecular del complejo primario de AmfB y ergosterol en agua, a partir de estudios realizados con dinámica molecular, lograron obtener las posibles geometrías con los valores energéticos más favorables, Figura 6. Las interacciones de van der Waals, la presencia de puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo del esterol y los fragmentos polares que posee la anfotericina B se acoplan a un nivel alto dando la posibilidad de que se generen las opciones de compuestos Antibiótico-esterol.
Figura 6 Geometría del complejo después de la minimización de la energía (molécula de esterol en verde, AmfB en azul y agua en gris claro).
Tomado de (Baran, 2009).
• Czub (2007) realizaron la investigación correspondiente a las interacciones de los derivados de la AmfB con membranas lipídicas con la ayuda de dinámica molecular, el estudio se realiza para comparar las propiedades estructurales y dinámicas de dos tipos de derivados de baja toxicidad identificando que la AmfB tiene mejor afinidad para penetrar en medios que sean hidrófobos. Con esto en mente, se realizaron cambios estructurales en el grupo amino y en el grupo carboxilo, resultando en una transición conformacional que presenta una dinámica distinta y provoca mejoras a nivel macroscópico como mejorar la selectividad.
Teniendo en cuenta todo este marco conceptual, la hipótesis planteada para el presente trabajo es:
La mayor abundancia y/o fortaleza de algunas interacciones intermoleculares entre la anfotericina y las moléculas con las que se agregue determinan su orden de afinidad.
4 . OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar el orden de afinidad entre la Anfotericina B (AmfB) y una serie de moléculas hidrófobas con potencial uso como modificadores de copolímeros anfifílicos empleados para la encapsulación de la anfotericina B.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Elegir el número y naturaleza de los compuestos con los que la AmfB formará dímeros.
2. Definir estructuras moleculares (3D) de partida de la AmfB y de los compuestos elegidos en el objetivo 1.
3. Obtener estructuras estables de los monómeros (AmfB y moléculas hidrófobas).
4. Determinar posibles estructuras de partida para los dímeros formados entre la AmfB y los compuestos hidrófobos.
5. Obtener estructuras estables de los dímeros entre la AmfB y las moléculas hidrófobas.
6. Clasificar energéticamente los dímeros (obtención de un orden de afinidad).
7. Determinar si la afinidad entre la AmfB y la serie de moléculas hidrófobas seleccionadas se puede explicar en términos de mayor a menor momento dipolar.
8. Relacionar una mayor estabilidad (afinidad) con la abundancia y fortaleza de las interacciones débiles que presente cada dímero.
5. METODOLOGÍA
5.1 Elección de las moléculas hidrófobas
Teniendo en cuenta que deben ser compuestos que no generen incidencia negativa en el cuerpo humano y que deben ser hidrófobos para aumentar la solubilidad de la AmfB y que este trabajo debe tener un alcance de trabajo de grado, los compuestos elegidos son los siguientes: Colesterol, Dodecanol, Resorcinol, -ciclodextrina, 1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfatoetanolamina (DSPE).
Para una descripción amplia de estos compuestos, remitirse a la sección Resultados/sección 6.1 moléculas hidrófobas con potencial uso para modificación.
5.2 Obtención de estructuras de partida de los monómeros
Las estructuras de partida de los diferentes monómeros se tomaron de las siguientes bases de datos:
Crystallography Open Database COD, PubChem open chemistry database, Water structure and science, Reaxys, Scopus, Science direct, Mendeley, entre otras.
5.3 Obtención de estructuras estables de los monómeros
Las optimizaciones y cálculos de frecuencia para determinar la estabilidad de las geometrías se realizaron con el software Gaussian 09 (Gaussian, 2017). Se empleó el método híbrido de la Teoría del Funcional de la densidad (DFT) M06-2X con la base la 6-311G(d,p). Algunos estudios computacionales en los que se emplearon la aproximación escogida para el presente estudio son los siguientes:
• (Alves, 2017): investigación DFT (M06-2x/6-311G(d,p)) para guanidina catalizada con anillos abiertos de carbonatos por aromáticos y alquil-aminas. Su objetivo fue evidenciar como se pueden fortalecer las interacciones débiles mediante el implemento de un catalizador.
Analizaron distancias de los puentes de hidrógeno que se formaron entre los compuestos logrando evidenciar la acción del catalizador y con ayuda de la energía libre establecieron cuáles sistemas son los más factibles de formarse.
• Zhao y Truhlar (2007): diseñaron y probaron dos funcionales nuevos del tipo híbridos, llamados M06 y M06-2X concluyendo que M06-2X es recomendado para aplicaciones que involucren estudios de datos termodinámicos, cinéticos, de interacciones no covalentes y energías de excitación de los estados de valencia a Rydberg para elementos de grupo principal (no metales). Con esto en mente, para nuestras estructuras que están formadas por no metales y que queremos ver la formación de interacciones no covalentes entre ellas, este funcional es idóneo.
5.4 Determinación de estructuras de partida de los dímeros
Una vez optimizados los diferentes monómeros, se calcularon mapas de potencial electrostáticos (MPE) para determinar los mejores sitios de interacción con la AmfB. La optimización de los dímeros y sus subsecuentes cálculos de frecuencias se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones empleadas con los monómeros: M06-2x/6-311G(d,p).
5.5 Clasificación energética de los dímeros
La mayor estabilidad se reportó teniendo en cuenta los datos termodinámicos del delta de E y delta de H, y la espontaneidad del proceso de dimerización se reportó con el delta de G, calculados con la aproximación de la supermolécula:
E = (Edímero + ZPE)– ((EAmfB + ZPE) + (Emonómero hidrófobo + ZPE)), ZPE: energía del punto cero
H = Hdímero – (HAmfB + Hmonómero hidrófobo)
G = Gdímero – (GAmfB + Gmonómero hidrófobo)
6. RESULTADOS
6.1 Moléculas hidrófobas con potencial uso para modificación
En esta sección se describirá una serie de 5 moléculas cuyas características las hacen pertinentes para estudiar su afinidad con la Anfotericina. Nótese que a la macro propuesta contribuyó el profesor León Pérez de la Universidad Nacional (León, 2015), quien realiza la parte experimental de la síntesis de los copolímeros y la encapsulación de la anfotericina, por lo que basado en su experiencia proponemos dichas 5 moléculas como las más promisorias:
6.1.1 Dodecanol
Conocido por su fórmula molecular C12H26O y su nombre convencional alcohol láurico en la Figura 7, el dodecanol tiene una masa molar de 186,399 g/mol. Se utiliza principalmente en la cadena de aseo por sus cualidades hidrofílicas e hidrofóbicas. Se emplea en la síntesis de compuestos como etoxilados, sulfatos, entre otros. También se emplea en la industria de la perfumería como base de aditivos lubricantes, presenta baja solubilidad en sustancias polares y se obtiene de los ácidos grasos provenientes del coco, este compuesto presenta un olor floral.
(A) (B) (C)
Figura 7 Dodecanol o alcohol láurico en su nomenclatura tradicional presentado de 3 maneras (a) representación lineal, (b) producto físico, (c) estructura en 3D.
Tomado de http://canacopegdl.com/keyword/lauryl-alcohol.html
El Dodecanol fue seleccionado para nuestro estudio por su capacidad de interaccionar con las moléculas tanto polares como no polares, su función de aglomerante al interaccionar con las partículas de mugre, como lo es en el jabón, nos permite esperar que el compuesto se comporte
como un fragmento símil al encontrado en las membranas plasmáticas tanto de las células humanas como de las células de los hongos. Puede interaccionar con el fármaco por su parte insaturada (hepteno) generando mayor estabilidad además de puentes de hidrógeno debido a su grupo hidroxilo; también podría enlazar y/o interactuar con componentes propios que se encuentren en el cuerpo humano, por ejemplo, con los iones más comunes, Na+ o K+, lo que podría provocar descompensaciones celulares en el cuerpo llegando a provocar en el peor de los casos la misma apoptosis en la célula.
6.1.2 Colesterol
El Colesterol es un esterol, se encuentra fundamentalmente en las membranas plasmáticas, este hace parte fundamental de todos los sistemas de los seres vivos.
Su estructura incluye un esterol como base principal y en el carbono 17, una cadena alifática en el caso del colesterol o el ergosterol que la diferencia de los demás esteroles (Legrand, 1992).
Además de esto, los esteroles son provenientes de una estructura base conocida como ciclopentanoperhidrofenantreno, también conocida por el nombre de estareno, Figura 8, que es una molécula que consta de 17 carbonos, de esta estructura también se derivan estructuras tales como los alcaloides, vitaminas, glucósidos, saponinas, entre otros.
Figura 8 Estructura básica de un esterol, estareno.
Tomado de https://www.plantas-medicinal-farmacognosia.com/temas/lipidos/esteroles/
Este tipo de estructuras pueden tener isómeros que son denominados tipo alfa y beta donde el diferencial corresponde a isómeros Cis y Trans.
El colesterol con formula molecular C27H46O/C27H45OH, ver Figura 9, presenta una parte polar constituida por el grupo funcional hidroxilo. Sus ciclos condensados y los sustituyentes alifáticos le confieren solubilidad en compuestos apolares como cloroformo.
Figura 9 Estructura molecular del Colesterol.
Como se ha podido ver, al igual que nuestro compuesto de análisis en nuestro proyecto, el colesterol posee características polares y apolares, características que buscamos en nuestros compuestos de interés, las insaturaciones confieren gran afinidad por la AmfB.
Pero para este estudio sus características apolares y por su localización en las membranas nos propina buenas características que podrían hacerlo muy afín para poder generar interacciones en la formación de los dímeros de AmfB-Colesterol.
Por el alto contenido de colesterol que se encuentra en las membranas celulares como se muestra en la Figura 10, cuando la concentración de AmfB crece en el sistema, la AmfB logra interaccionar con este colesterol que se encuentra en las membranas provocando una expansión en las bicapas lo que provoca el incremento de la entrada y salida de los nutrientes como los iones importantes para mantener el equilibrio sin que se provoque la muerte celular, contrario a lo que provoca en las células de los hongos.
Figura 10 Colesterol en membrana celular.
Tomado de http://biomodel.uah.es/model2/lip/membranas-comp.html
6.1.3 ɣ-ciclodextrina
La ɣ-ciclodextrina en la Figura 11, con fórmula molecular C48H80O40 tiene una masa molar de 1297,12 g/mol y se conoce por otros nombres como ciclomaltooctasa y ciclooctaamilosa.
Figura 11 Estructura de la ɣ-Ciclodextrina.
Tomado de https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c4892?lang=en®ion=CO
Esta molécula se encuentra clasificada como oligosacárido cíclico que en la industria farmacéutica se utiliza para la encapsulación de compuestos hidrófobos en su cavidad central reduciendo la toxicidad de los mismos brindándoles protección para que pueda llegar al punto blanco de acción (Bravo, 2003).
Por la gran cantidad de grupos hidroxilos y su conformación estructural propicia para encapsular, la ciclodextrina es un gran candidato para presentar interacciones con la AmfB. Hay que tener en cuenta además que, hay tres tipos de ciclodextrinas: alfa, beta y gamma.
• α-ciclodextrina
Es una macromolécula que consta de 6 subunidades, de las cuales el componente principal es α- D-glucopiranosa la cual contiene en su parte central un carácter lipofílico, lo que la haría útil para este estudio estabilizando la molécula a encapsular con las unidades hidroxiladas.
• β-ciclodextrina
Está compuesta de 7 subunidades α-D-glucopiranosa, esta ciclodextrina presenta una solubilidad limitada en medio acuoso lo que implica que los compuestos que son resultantes de este presentan solubilidades bajas mucho más que en el caso de los sacáridos, esto podría considerarse pese a su gran cantidad de interacciones débiles, estos llegan a ser fuertes cuando se encuentra en estado cristalino.
• ɣ-ciclodextrina
Este tipo de ciclodextrina está compuesta por 8 subunidades de monómeros de glucosa, este tipo de ciclodextrina al ser de las más amplias (en el sentido que posee mayor cantidad de subunidades y poseen mayor diámetro interno) puede considerarse para el encapsulamiento de la anfotericina B. La parte apolar de la AmfB podría posicionarse en la parte interna.
En la Figura 12 se describe esquemáticamente los diámetros de encapsulación según cada tipo de ciclodextrina.
Figura 12 Alfa, Beta y Gamma ciclodextrina de izquierda a derecha.
Tomado de https://www.hagasesegunarte.com.ar/ciclodextrinas/
Algunos usos cotidianos de las ciclodextrinas son:
• Aumento de la solubilidad del fármaco que se encuentre encapsulado además de eso presenta mejor biodisponibilidad de los principios activos.
• En sus formas de agregados presenta una reducción de la volatilidad al mejorar su estabilidad.
• Permite la extracción selectiva de compuestos, por ejemplo, cuando se logran establecer las mejores condiciones, se logra la extracción del colesterol (Rozicky, 2013).
• En cuanto a las propiedades físicas como el sabor y olor, las ciclodextrinas logran un enmascaramiento total del principio activo.
• Mayor liberación de aromas, sabores y antimicrobianos.
Algunos de los tipos que se encuentran disponibles para su comercialización son la hidroxipropil alfa, beta, gamma ciclodextrinas (Mixcoha, 2006).
6.1.4 Resorcinol
Conocido como el benceno-1,3-diol, m-dihidroxidobenceno, con fórmula molecular C6H4(OH) y masa molar de 110,11 g/mol, el resorcinol se caracteriza por ser un sólido blanco con solubilidad en agua de 123 g/100 ml a 20 °C y presenta carácter reductor bajo. Este compuesto es emplea en la industria farmacéutica, para colorantes, aunque también en la mayoría de los casos se utiliza en la producción de resinas artificiales y en la producción de neumáticos.
El resorcinol está compuesto por un anillo aromático y dos grupos hidroxilos, comparte características símiles a las del fenol, ver Figura 13.
Figura 13 Estructura molecular del Resorcinol.
Tomado de http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/1004819
Esto implica que se desprotona con gran facilidad, logra la formación de isómeros funcionales donde un grupo funcional cambia a un lado o al otro manteniendo las propiedades del mismo compuesto (Arte, 2017). Debido a estas propiedades el compuesto es tenido en cuenta para nuestro estudio computacional donde sus grupos hidroxilos le aportan un carácter polar a la molécula, mientras que el centro de la molécula, el anillo aromático, le hace parcialmente no polar, a pesar de que la molécula presenta mejor solubilidad en agua que las anteriores.
6.1.5 DSPE (1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fostafoetanolamina)
El 1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fostafoetanolamina o DSPE en su forma abreviada, consta de una fórmula molecular de C41H82NO8P, tiene una masa molar de 748,07 g/mol con algunas denominaciones tales como L-β, γ-Diasteroil-α-cefalin; 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-PE;
Diasteroilfosfatidiletnalonamina; Dioctadecanoilfosfatidiletanolamina; L- BETA, gamma- distearoil-alfa-cefalin; (r) -distearoilfosfatidiletanolamina; la-fosfatidiletanolamina, distearoil.
Como se logra evidenciar en su estructura, Figura 14, se encuentra compuesto por dos largas cadenas alifáticas que le dan su carácter apolar, pero sus grupos funcionales con fosforo (ion fosfato) y nitrógeno (amida) le dan un carácter polar. Debido a la naturaleza presentada por el fosforo, se presta para la formación de enlaces que pueden ser de forma iónica o en algunos casos covalentes. Se encuentra seleccionado para nuestro estudio debido a que, al encontrarse en la cercanía de la membrana celular, podría generar interacciones con el medicamento de estudio, la AmfB.
Figura 14 Estructura lineal del compuesto 1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfatoetanolamina.
Tomado de https://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty_EN_CB9142109.htm
Estos son los compuestos que se emplearon para los cálculos buscando hallar un orden de mayor a menor energía de interacción con la AmfB, lo que podría aportar a proponer que mejoren el
encapsulamiento de la AmfB. Tema de gran importancia ya que en la actualidad hay un amplio espectro de cepas no resistentes que hacen de la AmfB un medicamento imprescindible para su uso en humanos. A pesar de la existencia de formulaciones liposomales, hay pocos compuestos de este tipo, por eso se juega un papel muy importante al reestructurar este tipo de sistemas para mejorar sus condiciones de liberación y disminución de su carácter tóxico.
Como ya se ha mencionado antes en las RAM (reacciones adversas al medicamento), para la década de los 90 la implementación de las formulaciones liposomales tenían una relación buena en cuanto a costo/efectividad y estas condiciones hacían poco favorable la implementación del medicamento, es por eso que la recurrencia a métodos alternativos al tratamiento ha llevado a que en la actualidad se busque formulaciones con núcleos micelares que presenten reacciones favorables para la administración de la AmfB y lograr aumentar su solubilidad.
Se han presentado reportes en la implementación de síntesis de copolímeros a partir de policarbonatos modificados con urea y ácido fenilborico (Academic 2019), otra corresponde al copolímero de poli(2-etil-2oxazolina)-b-poli(ácido aspártico) (Wang 2009) y un tercero en el que la AmfB se encuentra conjugada con el Polietilenglicol (PEG) (Wang, 2009). En cualquiera de los tres casos se mejora la solubilidad de la AmfB y además de eso, se reduce en un alto grado su toxicidad.
6.2 Obtención de estructuras de partida de monómeros
Se buscó en bases de datos reconocidas en donde se pudieron descargar los archivos de las estructuras moleculares determinadas experimentalmente, para evitar la búsqueda de confórmeros y el costo de los cálculos de estructura electrónica para dichos confórmeros.
A continuación, en la Tabla 1, se muestran algunas medidas tenidas en cuenta para identificar los cambios luego de optimizar los monómeros.
Tabla 1 Estructuras iniciales de los diferentes compuestos y las bases de datos de las que fueron tomadas.
Compuesto Estructura y características
Anfotericina B
Base de datos
http://www.chemspider.com/ch emical-
structure.10237579.html
Grupo funcional: hexosamina, grupos carboxilo, amina primaria
No se encontró una estructura 3D para cálculos computacionales; sin embargo, esta estructura luego de optimización llegó a un mínimo.
1,2 distearoil-sn-glicero-3- fosfatoetanolamina Base de datos
https://www.chemicalbook.com /ChemicalProductProperty_EN _CB9142109.htm
Grupo funcional: diglicérido
La estructura tomada del Chemical Book se encontró totalmente plana en la zona de los átomos de oxígeno, por lo que hubo que hacer algunos ajustes a la estructura antes de proceder con la optimización.
Colesterol Base de datos
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.g ov/compound/5997
Grupo funcional: hidroxilo en el carbono 3 y cadena alifatica en el carbono 17 , estructura base de ciclopentanoperhidrofenantreno.
El colesterol que se tomó de referencia presentaba una estructura en 3d que facilitó su optimización.
Dodecanol Base de datos
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.g ov/compound/8193
Grupo funcional: alcohol primario
Dado que esta estructura ha sido estudiada en casos anteriores, para esta optimización la estructura inicial contó con una geometría muy cerca al a estructura estable
Resorcinol
Base de datos Grupo funcional: aromático y diol.
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.g ov/compound/5054
Dado que esta estructura ha sido estudiada en casos anteriores, para esta optimización la estructura inicial contó con una geometría muy cerca al a estructura estable.
ɣ-ciclodextrina
Base de dates
WATER STRUCTURE AND SCIENCE
http://www1.lsbu.ac.uk/water/c ycloh.html
Grupo funcional (carbohidrato)
La estructura de partida, aunque presentó una geometría 3D, requirió de un número considerable de pasaos durante la optimización:
6.3 Optimización de los monómeros
Se debe tener en cuenta que el tiempo resultante de las optimizaciones (M06-2X/6-311G(d,p)) dependió de la cantidad de procesadores (disponibles) que se utilizaron en su momento y también según el tamaño de las moléculas, por ende se usó un máximo 40 procesadores (pero la mayoría de las veces no más de 10 o 15 procesadores), teniendo en cuenta que algunos resultados o la convergencia de los cálculos se obtenían según el archivo de salida en días, significa que estos datos podrían ser obtenidos en un tiempo real de hasta meses (ver Tabla 2).
Tabla 2 Geometrías de compuestos optimizados y tiempo empleado para la optimización (M06-2x/6-311G(d,p)).
Estructura Parámetro de comparación, Tiempo empleado, Energía (Hartrees)
Anfotericina Antes: ∢ 119,99998º Después: ∢ 119,37815º
Tiempo: 9 d, 16 h, 35 min 47,8 seg.
Energía: -8,31785E+11 DSPE
Distancia entre átomos finales de las cadenas alifáticas
∢ Antes:14,29092 Å
∢ Después: 32,34986 Å
Tiempo: 0 d., 22 h. 18 min. 55.5 seg.
Energía: -6,85083E+12
Colesterol Antes: ∢107,51360° Después: ∢108,11938°
Tiempo: 1 d., 6 h. 50 min. 32,7 seg.
Energía: -2,97097E+12
Dodecanol Antes: ∢107,07467° Después: ∢108,49517°
Tiempo: 0 d., 3 h. 20 min. 28,2 seg, Energía: -1,43888E+12
Resorcinol Antes: ∢108,90354° Después: ∢109,20358°
Tiempo: 0 d., 0 h. 18 min. 45,1 seg.
Energía: -1,00462+E12 Gamma ciclodextrina
Distancia interna:10,33654 Ǻ
Tiempo: 0d., 13 horas 27 minutos 15,4 segundos Energía: -1,28275E+12
DSPE homólogo
Este compuesto se realizó como propuesta a una posible reducción en el costo computacional. Pero el DSPE se optimizó correctamente por lo que no fue necesario su uso.
Tiempo: 0 días, 6 horas 40 minutos 35 segundos Energía: -4,16798E+12
Luego de optimizadas, a todas las moléculas se les corrió cálculos de frecuencias garantizando que tienen solo frecuencias positivas o, en otras palabras, ninguna frecuencia imaginaria (negativa);
ver en la Figura 15, un ejemplo de cómo se ven los resultados en el visualizador GaussView05, nótese, además, que computacionalmente se predicen comportamientos que pueden ser validados con experimentos tales como el espectro infrarrojo.
Figura 15 Visualización de los resultados en el visualizador GaussView05, ejemplo γ-ciclodextrina.
Nótense los largos tiempos de cómputo incluso empleando 20 procesadores, ver Figura 16. En este caso, las frecuencias tomaron un tiempo de CPU de 15 días, 7 horas y 24 minutos.
Figura 16 Ejemplo del encabezado de los archivos de entrada para los cálculos de optimización y frecuencias; ejemplo para la γ- ciclodextrina.
6.3 Momentos dipolares de las moléculas seleccionadas para la formación de dímeros
Dado que el orden de afinidad entre la anfotericina y la serie de moléculas hidrófobas escogidas podría tener una relación con la polaridad se analizó el dato de momento dipolar de cada monómero y se compararon con el momento dipolar de la anfotericina.
Para ello se incluyó entre las moléculas analizadas al metano para tener el punto de referencia de momento de momento dipolar de cero, ver Figura 17. Conforme a los valores presentados por los cálculos en Gaussian09, el momento dipolar es determinado en DEBYE (D) que según el sistema internacional SI es un valor más fácil de comprender pese a que originalmente la medida estaba presentada en columbio*metro a lo cual corresponde que 1C*m= 2.9979×1029 D.
