PCR Múltiple en infecciones gastrointestinales:

(1)

PCR Múltiple en infecciones gastrointestinales

:

Diagnóstico microbiológico del síndrome diarreico agudo,

experiencia en la Universidad Católica

Dra. Paulette Legarraga

Departamento de Laboratorios Clínicos Escuela de Medicina

(2)

Temario

• Definiciones

• Diagnóstico microbiológico tradicional

• Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple

• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA

• Cultivos tradicionales

LO QUE SE SABE

LO QUE HEMOS APRENDIDO

• ¿Cuál es el rol patógenico de ciertos microorgnismos?

• ¿Costo-efectividad?

(3)

Consideraciones del síndrome diarreico

• 1,7 billones de casos de diarrea reportadas al año

• Segunda causa de muerte en <5 años en el mundo

• 2,2 millones de muertes/año

Definición ≥ 3 deposiciones líquidas al día

Clasificación según duración Aguda ≤14 días Persistente >14 y <30 días Crónica >30 días Clasificación según etiología

Infecciosa Bacterias, Virus, parásitos

No infecciosa Intolerancia alimentaria, reacciones medicamentosas, síndrome de intestino irritable, Enfermedades inflamatorias intestinales

IDSA, American College of Gastroenterology

Consideraciones del Sindrome diarreico

(4)

Diagnóstico microbiológico

“tradicional”

Bacteriológico:

• Hektoen (Salmonella, Shigella) • Mc Conkey Sorbitol (E. coli O157) • TCBS (Vibrio spp) • Cultivo de Campylobacter • CNI Yersinia • ASPlesiomonas shigelloides • (PCR) Parasitológico: • Observación microscópica • Inmunoensayos • (PCR) Virus: • Inmunoensayos/Detección antígenos • (PCR)

(5)

Diagnóstico microbiológico tradicional

Alto costo

Bajo

rendimiento

(2 a 5% ámbito

ambulatorio )

Consenso Síndrome diarreico agudo: recomendaciones para el diagnóstico microbiológico. Rev. Chil. Infectol, 2002; 19(2)

(6)

Rol de los NAAT en

el diagnóstico de diarrea

Infectious Diseases Society of America (IDSA). 2013. A guide to utilization of the microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases. Clin Infect Dis;57(4):e22-e121

(7)

Rol de los NAAT en

el diagnóstico de diarrea

Infectious Diseases Society of America (IDSA). 2013. A guide to utilization of the microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious Diseases. Clin Infect Dis;57(4):e22-e121

(8)

Gray et al. Epidemiol Infect. (2014) FilmArray® GI (Biofire) xTAG ®GPP (Luminex) Verigene® EP (Nanosphere) N° Patógenos detectados Bacterias 13 8 7 Virus 5 3 2 Parásitos 4 3 -TOTAL 22 14 9

Tiempo procesamiento 1 muestra en 80 min 24 muestras en 5 horas 1 muestra en 2 horas Equipo Tecnología PCR anidado+ curva de melting PCR+ detección por hibridación perlas PCR+ hibridación nanopartículas Sistema Cerrado/ automatizado Abierto/ semi-automatizado Cerrado/ automatizado

Paneles moleculares disponibles

(

Aprobados FDA)

Otros paneles disponibles no aprobados por FDA: Seeplex® Diarrhea ACE detection; EntericBio Panel ®, RIDA®GENE GI, otros

(9)

(10)

Temario

• Definiciones

• Diagnóstico microbiológico tradicional • Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple

• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA

• Cultivos tradicionales

LO QUE SE SABE

LO QUE HEMOS APRENDIDO

• ¿Cuál es el rol patógenico de E.coli?¿C. difficile? • ¿Costo-efectividad?

(11)

Algunas preguntas…

1. ¿Es necesario tener un examen tan amplio?

2. ¿Son la infecciones gastrointestinales mono o

polimicrobiana microbianas?

3. ¿Cuáles son los principales agentes etiológicos del SDA en diarrea aguda en adultos ambulatorios?

4. ¿Cuál es la sensibilidad de los cultivos tradicionales?

5. ¿Cambia conductas?

(12)

Nuestra experiencia

• Estudio prospectivo desde diciembre 2014 hasta

Octubre 2015

• Descripción etiológica del síndrome diarreico agudo

bacteriano en adultos ambulatorios que consultan al

servicio de urgencia mediante un PCR múltiple

IDSA Guidelines for the management of infectious diarrhea. Clin Infect Dis 2001; 32: 331-351

Diarrea aguda:

3 o más deposiciones líquidas por día, > 24

horas y < 14 días de duración

Caracterización etiológica del síndrome diarreico agudo en

adultos en un hospital universitario mediante un PCR múltiple

(13)

Materiales y métodos

Paciente

FilmArray panel GI procesado antes de 48 horas Coprocultivo + Tinción de

(14)

(15)

Nuestro estudio

Salmonella/Shigella Agar Hecktoen Campylobacter Tinción de Hucker Vibrio Agar TCBS

A. coprocultivo

B. Estudio según resultado de FilmArray

PARÁSITOS Observación microscópica y tinción de Zielh-Neelsen

Clostridium difficileo cultivo negativo

PCR específico ( C. difficile, Salmonella, Campylobacter, Shigella,

verotoxina 1 y 2)

BACTERIAS Búsqueda en coprocultivo o medio especial (Salmonella, Shigella,

(16)

Resultados

1. Positividad de las muestras por PCR múltiple

2. Co-infecciones

3. Agentes etiológicos: bacterianos (mención de algunos

especiales), virales y parasitarios

4. Resultados de los métodos convencionales (sensibilidad)

5. Conducta clínica

(17)

Resultados FilmArray

174 muestras procesadas

111 muestras positivas (65,3%) 60 muestras negativas (34,3%) 3 Inhibidas (1,7%)

(18)

Resultados

174 muestras procesadas

111 muestras positivas

por FilmArray (65,3%)

19 de 22 patógenos

 No se detectaron V. cholerae,

Cyclospora cayetanesis ni Entamoeba histolytica

(19)

Resultados

174 muestras procesadas

111 muestras positivas

por FilmArray (65,3%)

19 de 22 patógenos

(20)

Resultados

174 muestras procesadas

111 muestras positivas

por FilmArray (65,3%)

19 de 22 patógenos

83 (74,7%) Bacterias

(21)

Resultados

174 muestras procesadas

111 muestras positivas

por FilmArray (65,3%)

19 de 22 patógenos

83 (74,7%) Bacterias

27 (24,3%) Virus

(22)

Distribución co-infecciones

3 1 8 83 (74,7%) BACTERIAS 71 14 (12,6%) PARASITOS 10 27 (24,3%) VIRUS 18

(23)

¡¡Parece que se nos contaminó!!

• El 37% de la muestras (41/111) presenta dos o más

microorganismos

63 21,6 10,8 1,8 1,8 _0,9 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6

Porcentaje de infecciones según número de microorganismos

37%

(24)

Agentes etiológicos

45,0% 24,3% 20,7% 9,9% 9,0% 9,0% 2,7% 1,8% 0,9% 0,9% E.coli Virus Campylobacter Cryptosporidium Salmonella C. difficile Giardia Plesiomonas Vibrio Yersinia

IDSA Guidelines for the management of infectious diarrhea. Clin Infect Dis 2001; 32: 331-351

(25)

Agentes etiológicos

Distribución

E. coli

45,0% 24,3% 20,7% 9,9% 9,0% 9,0% 2,7% 1,8% 0,9% 0,9% E.coli Virus Campylobacter Cryptosporidium Salmonella C. difficile Giardia Plesiomonas Vibrio Yersinia 35,6% 31,5% 15,1% 11% 6,8% EPEC EAEC ETEC EC shiga toxina EI/Shigella 45% • 73 E. coli en 50 pacientes

(26)

E. coli

shiga-toxina positivo

• 8 muestras positivas

• 2 positivas para E. coli

O157

• Ambos pacientes hospitalizados



_{en ambos se suspende la terapia antibiótica}



1 de ellos con anemia y hematuria leve

(27)

Agentes etiológicos

Clostridium difficile

• 10 muestras positivas para

C. difficile

• _{Se obtuvo muestra para confirmación en 6 de ellas}

• Resultados GenXpert:

–

4 positivas

–

1 negativa

–

1 rechazada por muestra formada

• _{¿Falsos positivos?}

• ¿Son clínicamente relevantes?

–

50% requiere hospitalización (4/5 como patógeno único)

(28)

Agentes etiológicos

Distribución VIRUS

45,0% 24,3% 20,7% 9,9% 9,0% 9,0% 2,7% 1,8% 0,9% 0,9% E.coli Virus Campylobacter Cryptosporidium Salmonella C. difficile Giardia Plesiomonas Vibrio Yersinia 24,1% 24,1% 24,1% 20,7% 6,9% _Sapovirus Rotavirus Norovirus Astrovirus Adenovirus 24,3%

(29)

Parásitos

14 (12,6%)

Parásitos

11 Cryptosporidium

3 Giardias



En 11 de los 14 casos el parásito fue el único microorganismo

aislado



Sensibilidad de la microscopía: 64,3%



Muestra única!!!

90,9% (10/11)

33,3% (1/3)

Filmarray

Microscopía

(30)

Rendimiento del coprocultivo

174 muestras procesadas

111 muestras (+) por FilmArray (63,2%) 9 coprocultivos (+) → 6,3% (9/111)

 Bajo rendimiento general del coprocultivo

Resultados FilmArray

(31)

Sensibilidad cultivos tradicionales

83 (74,7%) Bacterias

17 (+) para Shigella/ Salmonella/Vibrio 53 % coprocultivos (+) 23 (+) Campylobacter 61% cultivo Campylobacter (+) 70% Cultivo Salmonella 100% Cultivo Vibrio No detectamos Plesiomonas No detectamos Yersinia 2 Plesiomonas 1 Yersinia

 Comparado con cultivo no se observaron falsos negativos en FilmArray

(32)

Algunas preguntas…

1. ¿Es necesario tener un examen tan amplio?

2. ¿Son la infecciones gastrointestinales mono o

polimicrobiana microbianas?

3. ¿Cuáles son los principales agentes etiológicos del SDA en diarrea aguda en adultos ambulatorios?

4. ¿Cuál es la sensibilidad de los cultivos tradicionales?

5. ¿Cambia conductas?

(33)

¿Cambio en la conducta clínica?

• Ambos pacientes con

E. coli

O157 fueron

hospitalizados (previo a conocer el resultado) y en

ambos casos se suspendió tratamiento al conocer los

resultados

• Todos los pacientes de esta serie recibieron

tratamiento para

C. difficile

• Un paciente con FilmArray repetidamente negativo

→ colonoscopía → cáncer

(34)

Costo

• Costo mayor que el de un coprocultivo solo

(35)

Impresión global

• Fácil y rápido

• Resultados en 2 horas

• Mejor sensibilidad que los métodos

tradicionales y buena especificidad

(36)

Temario

• Definiciones

• Diagnóstico microbiológico tradicional • Rol de los NAATs/Paneles de PCR múltiple

• Caracterización etiológica síndrome diarreico agudo SDA • Cultivos tradicionales

LO QUE SE SABE

LO QUE HEMOS APRENDIDO

• ¿Tiene algún significado clínico las infecciones polimicrobianas?

• ¿Cuál es el rol patógenico de E.coli?¿C. difficile?

• ¿Costo-efectividad? LO QUE AUN NO SE SABE…

(37)

Aprendimos algo de nuestra experiencia

pero aún queda mucho por responder

…

1. Porcentaje importante de infecciones múltiples

• ¿Requieren tratamiento? ¿Son más graves?

2. Cómo interpretar los resultados positivos para

C. difficile

?

Virus? Para

E. coli

? ¿Cuál es el rol de las

E.coli

?

• Se estima una colonización en paciente asintomático por C. difficile

entre 7 a 15%

• Virus pueden ser eliminados por varias semanas post infección (hasta 8 semanas para Norovirus)

• Portación asintomática en población pediátrica de hasta un 78%

3. Tiene mayor costo pero ¿Es costo-efectivo?

Enserink R, et al. (2014) High Detection Rates of Enteropathogens in Asymptomatic Children Attending Day Care. PLoS ONE 9(2)

(38)