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LIGHT DIAGNOSTICS™
SimulFluor
PARAINFLUENZA 1, 2 /3 DFA KIT
Ensayo de immunofluorescencia directa para la diferenciación del virus de la Parainfluenza 3 de la Parainfluenza 1 y 2
Suplemento Español De la Lengua
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Uso previsto
Il SimulFluor Parainfluenza 1, 2/3 DFA Kit de Light Diagnostics™ está indicado para la detección simultánea de los virus de la parainfluenza 1 y 2 y para la identificación del virus de la parainfluenza 3 después de la amplificación en cultivos celulares.
Resumen y explicación
En el hombre, los virus respiratorios son responsables de una proporción significativa de enfermedades. Algunos virus (por ej., el virus de la influenza) son estacionales en tanto que otros (por ej. los adenovirus) afectan predominantemente a distintos grupos de edad. En una población dada, los virus respiratorios pueden ser responsables de una considerable morbilidad. El advenimiento de tratamientos antivíricos apropiados contra algunos virus respiratorios hace imperativa la investigación rápida para la identificación de estos microorganismos, lo que permitirá la institución precoz del tratamiento. Los dos agentes antivíricos más ampliamente usados en la actualidad son la amantadina/rimantadina para la influenza A y la ribavirina para la bronquiolitis producida por el virus respiratorio sincitial. Ambos agentes tienen mecanismos de acción distintos aunque la mayoría afectan a los estadios precoces de la infección, tales como la penetración o la descapsulación (12,19). En las concentraciones fisiológicas alcanzables, la amantadina y la rimantadina inhiben específicamente la replicación del virus de la influenza A (4). La ribavirina tiene una actividad de amplio espectro in vitro contra múltiples virus tales como el virus respiratorio sincitial, sarampión, influenza A y B, y parainfluenza (7,13,14).
Los virus de la parainfluenza, combinados con el virus respiratorio sincitial, representan los patógenos respiratorios más significativos de las vías respiratorias altas en los lactantes y niños pequeños (1,2,3,5). Se han identificado cuatro tipos de virus de la parainfluenza en niños y adultos. Los tipos 1 y 2 son causas importantes de laringotraqueobronquitis (crup). La gravedad de la enfermedad es mayor en los niños de 2 a 4 años (6). La infección por el virus de la parainfluenza del tipo 3 también puede dar lugar a crup, y ocupa el segundo lugar tras el virus respiratorio sincitial, como causa de bronquiolitis y neumonía en el lactante (8,9,10,11,15). La enfermedad debida a la infección por el tipo 3 es más grave en los niños de menos de 1 año de edad (6). En los niños de más edad y en adultos, la enfermedad puede ser asintomática o similar a un resfriado (16). La laringotraqueobronquitis grave durante la lactancia o en la primera infancia puede conducir a hiperactividad bronquial después del ejercicio en los niños mayores o adolescentes. Sin embargo, sigue estando sin determinar si la hiperactividad bronquial era una
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afección preexistente que desempeñó un papel en la patogenia del crup, o si se desarrolla como una complicación de la enfermedad de crup grave (17,18).
El tipo 4 del virus de la parainfluenza se ha asociado solamente a enfermedad leve de las vías respiratorias altas en los adultos y los niños, y es difícil de identificar en cultivos celulares (6).
Los virus de la parainfluenza pertenecen al género Paramyxovirus de la familia Paramyxoviridae. Son virus encapsulados de 150-200 nm de diámetro con un genoma de ARN monocatenario con polaridad negativa (20).
Los virus de la parainfluenza crecen bien en las estirpes primarias de células de riñón de simio o humano y en la estirpe LLC-MK2, una estirpe de células heteroploides de riñón de mono rhesus (21). Para la recuperación de los tipos 1 y 2, pero no para el tipo 3, es necesaria la presencia de tripsina en el medio. La infección del cultivo tisular por el virus se puede identificar mediante hemadsorción con hematíes de cobaya. Los tipos 2 y 3 se pueden reconocer por la formación de sincitios.
El método más sensible para la identificación de los virus de la parainfluenza es el aislamiento en cultivo y la confirmación, que es el método estándar en la mayoría de los laboratorios. Il SimulFluor Parainfluenza 1, 2/3 DFA Kit de Light Diagnostics™ utiliza anticuerpos monoclonales para detectar simultáneamente los virus de la parainfluenza 1 y 2, e identificar el virus de la parainfluenza 3 después de la amplificación en cultivo, proporcionando unos resultados claros y fáciles de interpretar.
Principio de la prueba
Il SimulFluor Parainfluenza 1, 2/3 DFA Kit de Light Diagnostics™ utiliza un único reactivo para la detección simultánea en un paso de los virus de la parainfluenza 1 y 2 y para la identificación del virus de la parainfluenza 3 en cultivos celulares infectados. Il SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent de Light Diagnostics™ contiene dos componentes. El componente primario está dirigido contra el virus de la parainfluenza 1 y 2; el segundo componente está dirigido específicamente contra el virus de la parainfluenza 3. Los anticuerpos monoclonales de los componentes se unirán al antígeno vírico apropiado en la muestra del portaobjetos. El anticuerpo no unido se lava del portaobjetos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La iluminación con luz ultravioleta permite la visualización de los complejos antígeno-anticuerpo por medio de microscopía de fluorescencia. Las células infectadas por el virus de la parainfluenza 1 y 2 mostrarán una fluorescencia color verde manzana; mientras que las células infectadas por el virus de la parainfluenza 3 exhiben una fluorescencia de color amarillo oro. El componente primario tiñe las células
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infectadas por el virus de la parainfluenza 1 y 2 de color verde manzana brillante, pero no distingue entre estos virus. El componente secundario tiñe de color amarillo oro brillante las células infectadas por el virus de la parainfluenza 3 y permite la diferenciación del virus de la parainfluenza 3 de los de la parainfluenza 1 y 2 en un solo pocillo. Las células no infectadas se tiñen de un color rojo pálido debido a la presencia del contraste del Evans Blue en el reactivo.
Componentes del kit
1. SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent – 5297: Un (1) frasco cuentagotas de 2 ml que contiene un componente primario específico para el virus de la parainfluenza 1 y 2 y un componente secundario específico para el virus de la parainfluenza 3, estabilizante proteico, Evans Blue y azida sódica al 0,1%
(conservante).
La cantidad suministrada es suficiente para 50 pruebas. Estimación se basa en las pruebas de caída de 40μL; el número real de las pruebas pueden variar.
2. Para 1, 2, 3 Control Slide; 5011: Dos (2) portaobjetos control que contienen un pocillo infectado (positivo) y un pocillo no infectado (negativo) para cada virus de la parainfluenza 1, 2 y 3.
3. Phosphate-Buffered Saline (PBS); 5087: Un (1) paquete de sales de PBS que producirán 1 litro tras reconstituirlas con agua destilada. Guarde en un envase cerrado y limpio, a temperatura ambiente.
4. Tween 20 / Sodium Azide Solution (100X); 5037: Un (1) frasco de 10 ml de solución monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween 20) y azida sódica concentrada, para diluir 1:100 en PBS.
5. Mounting Fluid 5013: Un (1) frasco cuentagotas de 10 ml que contiene tampón Tris, glicerina, amplificador de la fluorescencia y azida sódica como conservante. Guarde a temperatura entre 2° y 25ºC.
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Materiales necesarios no suministrados
1. Cultivo celular para el aislamiento de los virus respiratorios: Todos los laboratorios deben mantener reservas de células viables en el paso o estado apropiado para realizar de forma eficiente la replicación de los virus respiratorios de las muestras procesadas de los pacientes. Estas células deben ser comprobadas periódicamente para conocer su capacidad para servir de soporte al crecimiento de los virus respiratorios. Se pueden obtener estirpes celulares apropiadas del ATCC® (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA.
2. El medio de transporte vírico (MTV), que es un medio no inhibidor para los virus respiratorios y las células del cultivo tisular, utilizado para el aislamiento de virus: Un medio apropiado es HBSS (Hank´s balanced salt solution, solución salina equilibrada de Hank) con antibióticos y un estabilizador proteico. Evite el uso de sueros animales (excepto FBS (fetal bovine serum, suero bovino fetal) precalostral) como estabilizador proteico para prevenir las interferencias de los anticuerpos inherentes.
3. Para el mantenimiento después de la infección con el virus se pueden utilizar medios de cultivo como el RPMI o EMEM (Eagle´s Minimum Essential Medium, medio esencial mínimo de Eagle) con la cantidad apropiada de FBS precalostral.
4. Tubos de cultivo, “dram vials” o placas multipocillos estériles 5. Acetona, grado reactivo o mejor
Nota: La acetona es higroscópica y se debe guardar en envases cerrados herméticamente. La presencia de humedad en la acetona puede dar lugar a un aspecto brumoso del sustrato durante la microscopía de fluorescencia.
6. Portaobjetos de vidrio, limpiados con acetona, con pocillos al menos de 6 mm de diámetro en una capa hidrófoba
7. Pipetas estériles 8. Cámara húmeda
9. Solución de hipoclorito sódico (0,05%) 10. Cubreobjetos del nº 1
11. Incubador de 37ºC con reóstato para la regulación de temperatura.
12. Torundas estériles 13. Pinzas
14. Frascos para la obtención y transporte de las muestras
15. Microscopio de fluorescencia con la combinación apropiada de filtros para la fluoresceína (pico de excitación 490 nm, pico de emisión 520 nm)
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16. Perlas estériles de vidrio (diámetro de 1 a 3 mm) 17. Centrífuga
18. Vórtex o agitador por ultrasonido 19. Agua destilada o desionizada
Estabilidad y almacenamiento
Si se almacenan entre 2º y 8ºC, SimulFluor Para 1, 2/ 3 DFA Kit de Light Diagnostics™ es estable hasta la fecha de caducidad que está impresa en la etiqueta. No congele ni exponga a temperaturas elevadas. Deseche los restos de reactivo después de la fecha de caducidad del kit.
Advertencias y precauciones
• La azida sódica (presente en el reactivo de SimulFluor, disolución PBS/Tween 20 y el medio de montaje) puede reaccionar con tuberías de plomo o cobre, formando azidas metálicas potencialmente explosivas. Al desechar estos materiales, enjuague con abundante agua para evitar la acumulación de azida.
• La dilución o las mezclas de los conjugados o de los anticuerpos monoclonales pueden causar resultados erróneos.
• No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.
• Manejar todas las muestras y el material como potencialmente infecciosos.
Descontaminar con hipoclorito de sodio al 0,05% (una dilución 1:100 de lejía doméstica) antes de desecharlos.
• No exponga los reactivos a luz intensa durante el almacenamiento o la incubación.
• Evite el contacto con el Evans Blue (presente en el SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent 5297), pues es un carcinógeno potencial. Si entrara en contacto con la piel, enjuague con agua abundante.
• La acetona es sumamente inflamable y su ingestión o inhalación es nociva para la salud. Conserve este producto alejado del calor, chispas o llamas.
Evite la inhalación de los vapores. Utilice una ventilación apropiada.
• No pipetee los reactivos con la boca.
• No sustituya los reactivos de otros fabricantes.
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• La modificación del protocolo proporcionado puede causar resultados erróneos.
• Al teñir múltiples muestras en un portaobjetos, evite la contaminación cruzada entre las mismas.
• El Mounting Fluid 5013 contiene un amplificador de la fluorescencia que puede resultar destructivo para las mucosas. Evite el contacto directo con la piel o las mucosas. Si ocurriera el contacto, enjuague con abundante agua.
Obtención de muestras
Los procedimientos adecuados de extracción, transporte, procesamiento y almacenamiento de las muestras son fundamentales para el aislamiento y la confirmación de las infecciones por los virus de la parainfluenza 1, 2, 3. Los aspirados de las secreciones respiratorias son las muestras de elección (1), aunque también pueden utilizarse exudados nasofaríngeos o faríngeos (2).
Los lavados nasales y los aspirados nasofaríngeos o traqueales son ideales como muestras para examen, ya que contienen abundantes células epiteliales. Las muestras de lavados nasofaríngeos se obtienen poniendo de 3 a 5 ml de suero salino en la fosa nasal del paciente, estando éste en decúbito supino. Se succiona suavemente el suero salino con una jeringuilla, una pera de goma o un catéter conectado a una trampa de moco.
Los exudados nasofaríngeos, faríngeos o nasales frecuentemente no contienen una cantidad adecuada de células epiteliales columnares y ciliadas, esenciales para la detección de los patógenos respiratorios víricos.
Transporte inmediatamente la muestra en hielo después de su recogida. Las muestras para el aislamiento en cultivo se deben congelar a -70 C si no van a procesarse en un plazo de 72 horas después de su recogida. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.
El tipo de muestra obtenida y su procesamiento posterior dependen de la enfermedad y del virus que hay que detectar. Se puede encontrar información detallada sobre los síntomas y las técnicas de obtención de muestras en el Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5ª ed. (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C., Parainfluenza Viruses, Ch. 82; Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.
El transporte adecuado de las muestras debe cumplir con todas las leyes y reglamentaciones aplicables relativas al transporte de muestras biológicas.
Procesamiento de muestras
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Antes de procesar las muestras, compruebe que se han recogido y transportado correctamente. La manipulación incorrecta de las muestras puede causar resultados erróneos.
Procesamiento de la muestra para cultivo / aislamiento:
Aspirados nasofaríngeos, aspirados traqueales, lavados nasales, lavado bronquial:
1. Saque la muestra del envase original y colóquela en un tubo estéril de 10 a 15 ml para centrífuga.
2. Agregue suficiente PBS frío hasta un volumen de 2,0 a 2,5 ml.
3. Mezcle agitando en el vórtex. Si la muestra se utiliza únicamente para aislamiento vírico, proceda con el paso 4.
4. Sonique la muestra a 8-12 Kc/seg. durante 30-60 segundos para disgregar las células y liberar las partículas víricas.
5. Centrifugue la muestra a 300-500 x g, a 2° y 8°C, durante 10 minutos, para sedimentar los restos celulares.
6. Separe el sobrenadante de los restos celulares.
7. El sobrenadante se puede mezclar con solución antibiótica 10x, y dejarlo a 2°
y 8°C durante 30-60 minutos antes de la inoculación para evitar el sobrecrecimiento bacteriano.
Exudados nasofaríngeos, faríngeos y nasales:
1. Agite la muestra vigorosamente en el vórtex, para separar las células de la torunda.
2. Para aumentar la recuperación vírica, agregue algunas perlas estériles de vidrio a la muestra y agite en el vórtex durante un minuto, o sonique a 8-12 Kc/seg., durante 30-60 segundos.
3. Deseche la torunda en una solución de hipoclorito de sodio.
4. Centrifugue la muestra a 300-500 x g, a 2° y 8°C, durante 10 minutos, para sedimentar los restos celulares.
5. Utilice el sobrenadante como material de inoculación.
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Preparación del cultivo / aislamiento
Siembra de tubos estándar:
1. Examine los cultivos celulares inmediatamente antes de sembrar las muestras para verificar que la morfología sea adecuada.
2. Aspire el medio de crecimiento de los tubos.
3. Agregue entre 0,2 y 0,5 ml del inóculo en cada tubo.
Nota: El uso de varias estirpes celulares o de cultivos repetidos puede mejorar la eficacia del aislamiento del virus.
4. Incube los cultivos en tubos en una rejilla inclinada entre 35 y 37 C durante 1 hora.
5. Después de la adsorción o centrifugación, aspire el inóculo y agregue suficiente medio de mantenimiento para cubrir completamente la monocapa de células.
6. Incube entre 35 y 37°C en tambores giratorios.
7. Examine la monocapa diariamente. Las células se pueden enjuagar suavemente 2 ó 3 veces con medio de mantenimiento previamente equilibrado si la muestra pareciera tóxica para la monocapa.
8. Renueve el medio de cultivo cada 3 a 5 días.
Nota: Se debe sembrar una muestra de cada lote de las estirpes celulares empleadas para el cultivo celular con cepas representativas de parainfluenza 1, 2 y 3 para establecer la susceptibilidad a la infección por influenza y el desarrollo posterior de CPE. Los cultivos celulares no inoculados también deben crecerse y examinarse diariamente en busca de virus y micoplasma.
Estos funcionarán como control de la morfología celular normal y pueden resultar útiles para detectar un CPE temprano. A menos que estos cultivos celulares control tengan un crecimiento adecuado, los resultados del aislamiento en cultivo celular deben considerarse no válidos.
9. Examinar los tubos diariamente para comprobar el CPE (cytopathic effect, efecto citopático), realizar la prueba de hemadsorción o ambos. Si se observa CPE o hemadsorción positiva, desprender las células del tubo mediante raspado o tripsinización.
10. Para preparar los portaobjetos, aspirar el medio de cultivo del tubo. Guardar el medio de cultivo a 2° y 8°C hasta que se haya terminado la prueba. Si fuera necesario un análisis adicional, se puede intentar aislar al virus de este medio.
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11. Lave suavemente la monocapa de células tres veces con 1 ó 2 ml de HBSS o PBS. Deseche todos los lavados en una solución de hipoclorito de sodio.
12. Agregue una décima parte del volumen de cultivo original de tripsina y deje reposar durante 30 segundos. Golpee suavemente el recipiente de cultivo para desprender las células. Resuspenda las células en 2 ml de HBSS o PBS.
Centrifugue la suspensión de células entre 300 y 500 x g durante 10 minutos.
Resuspenda las células sedimentadas en 0,3 ml de PBS estéril para obtener una suspensión ligeramente turbia.
Nota: Una alternativa es despegar la monocapa de células del tubo con una varilla de vidrio o una pipeta estéril en un pequeño volumen de PBS.
13. Poner una gota de la suspensión celular sobre un portaobjetos limpiado con acetona. Esperar a que el portaobjetos se seque al aire totalmente.
14. Fije el portaobjetos en acetona fría (2° y 8°C) durante 10 minutos. No deje que la acetona se contamine con agua y sales. Esto puede producir una tinción brumosa.
15. Esperar a que el portaobjetos se seque al aire. Los portaobjetos deben teñirse lo antes posible. Si es necesario guardar los portaobjetos fijados, colocarlos en un contenedor desecado, a ≤-20ºC.
16. Proceder a la sección del "Procedimiento de la inmunofluorescencia" después de terminar la sección de "Preparación del reactivo".
Siembra de cultivos en “shell vials”:
1. Examine los cultivos celulares inmediatamente antes de sembrar las muestras para verificar que la morfología sea adecuada.
2. Aspire el medio de cultivo de los shell vials.
3. Agregue entre 0,2 y 0,5 ml del inóculo en cada shell vial.
4. Centrifugue a temperatura ambiente durante 30 minutos entre 500 y 700 g.
5. Después de la centrifugación, aspire el inóculo y agregue suficiente medio de mantenimiento para cubrir completamente la monocapa de células.
6. Incube entre 35 y 37°C.
7. Examine los shell vials diariamente en busca de efecto citopático y realizar la prueba de hemadsorción. Los shell vials pueden teñirse entre 24 y 96 horas después de la infección o a los tiempos óptimos que determine cada laboratorio.
8. Para preparar los cubreobjetos para la tinción, aspirar el medio de cultivo y guardarlo entre 2° y 8°C hasta que se haya terminado la prueba. Si fuera necesario un análisis adicional, se puede intentar aislar al virus de este medio.
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9. Lavar suavemente la monocapa celular tres veces con 1 ml de PBS. Deseche todos los lavados en una solución de hipoclorito de sodio.
10. Aspirar el PBS del shell vial y fijar como sigue: Agregar 1 ml de acetona fría, aspirarlo y rellenar inmediatamente con 1 ml de acetona fría (2° y 8°C).
Fijar durante 10 minutos a 2° y 8°C.
11. Aspirar la acetona y esperar a que los cubreobjetos se sequen al aire totalmente. Lavar con 1 ml de PBS, aspirar y teñir inmediatamente. Si es necesario guardarlos, colocar los shell vials en un contenedor desecado a ≤ -20°C.
Nota: Los shell vials guardados se deben lavar con 1 ml de PBS antes de la tinción.
12. Proceder a la sección del "Procedimiento de la inmunofluorescencia" después de terminar la sección de "Preparación del reactivo".
Procedimiento de prueba
Preparación de los reactivos:
Disolución del PBS/ Tween 20
1. Disuelva el contenido del paquete de PBS en 950 ml de agua destilada.
2. Agregue el concentrado de Tween 20 / Sodium Azide 100X (10 ml) al PBS y mezcle bien.
3. Lleve el volumen de la mezcla hasta 1 litro con agua destilada. Transfiera a un envase, limpio y etiquetado, para su almacenamiento y ciérrelo herméticamente. Guarde a temperatura ambiente.
Todos los demás reactivos se proporcionan listos para su uso.
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Procedimiento (de tinción) inmunofluorescente directo sugerido:
1. Permita que los portaobjetos de testigo fijados en acetona, la muestra y los reactivos alcancen la temperatura ambiente.
Nota: No permita que se sequen los portaobjetos en ningún momento durante el proceso de tinción.
2. Agregue suficiente SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent 5297 para cubrir las células; 1 gota por mancha celular y 4 a 6 gotas para los shell vials.
3. Incube a 37°C durante 15 minutos, opcionalmente 30 minutos, en una cámara húmeda.
4. Enjuague el portaobjetos suavemente con una piseta de solución de PBS/Tween 20 durante 10 a 15 segundos para eliminar el exceso de solución de anticuerpo monoclonal, tenga cuidado de dirigir el chorro lejos del pocillo.
Para shell vials: aspire el reactivo del frasco y lave suavemente cada shell vial 3 veces con 1 ml de solución de PBS/Tween 20.
5. Sacuda el exceso de PBS/Tween 20 de los bordes del portaobjetos.
6. Prepare bajo un cubreobjetos con Mounting Fluid acuoso pH 8,5 5013 o equivalente. Para shell vials: aspire el PBS/Tween de los shell vials.
Levante cada cubreobjetos con una aguja doblada fijada a una jeringa pequeña y sáquelo cuidadosamente con pinzas. Prepare cada cubreobjetos con el LADO DE LAS CÉLULAS HACIA ABAJO sobre un portaobjetos de vidrio con líquido de preparación.
7. Elimine el exceso de líquido de preparación de los bordes del cubreobjetos.
Nota: Para obtener mejores resultados, examine los portaobjetos inmediatamente después de teñir. Si los portaobjetos tuvieran que almacenarse, guárdelos entre 2° y 8°C en un envase seguro y protegidos de la luz.
8. Examine los portaobjetos, con un microscopio de fluorescencia a 160-200x, en busca de células que presenten fluorescencia. Puede realizarse un examen detallado a 400x.
Nota: El buen funcionamiento del microscopio de fluorescencia tiene una importancia crucial para lograr resultados de análisis satisfactorios. Dado que los objetivos, la intensidad y potencia de la lámpara y los filtros pueden afectar a los resultados, el empleo de un testigo positivo verificará el funcionamiento de los reactivos, la metodología de cultivo y el microscopio.
Interpretación de los resultados
12 Control de calidad
Con cada lote de muestras hay que analizar los portaobjetos de control. Los portaobjetos de control proporcionados en el kit son para demostrar el funcionamiento apropiado de los componentes del kit y del procedimiento de tinción inmunofluorescente.
También se pueden analizar preparaciones de control de aislados respiratorios conocidos y de células no infectadas para asegurar la idoneidad de los procedimientos de tinción para el análisis de la muestra. Además, hay que mantener y probar tubos estándar o shell vials inoculados con tinciones de referencia de los virus respiratorios y cultivos no inoculados para asegurar la idoneidad de los procedimientos de cultivo, aislamiento y tinción
Nota: Examine bien todo el portaobjetos para ver la presencia de fluorescencia asociada a las células.
Examinar primero los portaobjetos de control para comprobar la idoneidad de la tinción. El control positivo debe mostrar células con fluorescencia nuclear, citoplasmática o de ambas zonas, dependiendo de la etapa del crecimiento. El control negativo debe mostrar células teñidas de un color un rojo pálido debido al contraste con del Evans Blue.
Resulta útil examinar las células negativas antes que las positivas para determinar si hay tinción de fondo.
Aislamiento y confirmación del cultivo celular:
Cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia estándar, las células infectadas por virus de la parainfluenza 1 y 2 mostrarán fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo, en el citoplasma o en ambas localizaciones, según se describe más abajo. Las células infectadas por el virus de la parainfluenza 3 muestran una fluorescencia de color amarillo oro brillante o dorado anaranjado en el citoplasma.
Una reacción de tinción positiva para cualquiera de los tres virus requiere la presencia de al menos 2 células intactas que presenten fluorescencia específica.
El control negativo debe mostrar células teñidas de un color un rojo pálido debido al contraste con del Evans Blue.
Precaución: Debe ignorarse la fluorescencia de fragmentos celulares debida al atrapamiento del reactivo en dichos restos. Si los controles positivo y negativo no pueden ser claramente distinguidos, la prueba no es válida.
A continuación, se describen los patrones de tinción observados con los virus de la parainfluenza 1, 2 y 3:
Parainfluenza tipos 1 y 2
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La fluorescencia es verde manzana brillante, confinada al citoplasma. La tinción citoplasmática es punteada, con inclusiones irregulares.
Parainfluenza tipo 3
La fluorescencia es amarillo oro brillante, confinada al citoplasma. La tinción citoplasmática es punteada, con inclusiones irregulares.
Células negativas:
Resulta útil examinar las células negativas antes que las positivas para determinar si hay tinción de fondo. La tinción positiva para un virus está representada por la presencia, como mínimo, de dos o más células intactas que exhiban el tipo de fluorescencia descrita previamente.
Examine primero los portaobjetos de control para comprobar que la tinción sea la apropiada. El control positivo debe mostrar células con fluorescencia en el citoplasma. El control negativo debe mostrar células teñidas de un color un rojo pálido debido al contraste con del Evans Blue.
Precaución: Se debe ignorar la tinción fluorescente de los fragmentos celulares, causada al quedar atrapado el conjugado en dichos fragmentos. Si los controles positivo y negativo no pueden distinguirse claramente, la prueba no es válida.
Un resultado negativo no elimina la presencia de virus de la parainfluenza 1, 2 ó 3. El resultado negativo puede deberse a diversos de factores, como: muestra inadecuada, obtención y manipulación inadecuadas de la muestra, técnica de cultivo incorrecta, uso de una estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento, o los factores mencionados en “Limitaciones”. Todos los resultados negativos deben informarse como "No se observa ningún virus".
Ocasionalmente, se observará una fluorescencia inespecífica, tenue, de color verde-amarillo en la monocapa. Esto puede deberse a varios factores como lavado inadecuado o moco presente en la muestra que ha atrapado al conjugado.
Si los controles no funcionan según lo indicado, repita todo el análisis, incluyendo los controles. Si los controles aún no funcionan según lo indicado, comuníquese con el representante autorizado de EMD Millipore Corporation. El análisis no se considera válido hasta que los controles estén dentro de los límites descritos.
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Limitaciones
• Il SimulFluor Parainfluenza 1, 2/3 DFA Kit de Light Diagnostics™ no está pensado para la diferenciación del virus de la parainfluenza 1 y 2 en células infectadas. Se requieren pruebas adicionales para identificar específicamente estos virus.
• Un resultado negativo no elimina la presencia de la infección vírica. Los resultados se deben interpretar cuidadosamente, teniendo en cuenta la evaluación clínica del paciente y otras pruebas diagnósticas. El resultado negativo puede deberse a diversos factores como: muestra inadecuada, incorrecta obtención y manipulación de la muestra, técnica de cultivo incorrecta o estirpe celular o temperatura inadecuadas durante el aislamiento,
• Para que la prueba sea válida, es necesario procesar en cada muestra los controles positivo y negativo, que deben mostrar la tinción apropiada.
• No se han determinado las características del funcionamiento de este reactivo para la identificación de los virus de la parainfluenza 1, 2 ó 3 en muestras de pacientes.
• La tinción perinuclear o citoplásmica difusa puede corresponder a la unión no específica del anticuerpo debida a la presencia de receptor Fc en las células infectadas por virus herpes (16).
• El uso de un objetivo de 10x (ampliación 100x) puede que no proporcione los suficientes aumentos para visualizar la morfología de las células y el patrón de la tinción, particularmente en las células infectadas por VRS.
Valores esperados
Los resultados variarán dependiendo del estado socioeconómico, la edad de la población, la localización geográfica, la época del año (algunos virus son estacionales) y la manipulación de la muestra. Se ha analizado un total de 646 muestras en dos centros de la costa este, tres centros situados en el sur y dos centros situados en el mediooeste,, así como en tres centros de la costa oeste. Los centros incluyeron hospitales, hospitales infantiles, universidades y laboratorios de referencia. Las evaluaciones realizadas de septiembre de 1991 a julio de 1992 proporcionaron las siguientes tasas de detección: Parainfluenza 1 -- 1,7%
(11/646); Parainfluenza 2 -- 0,8% (5/646); Parainfluenza 3 -- 4,3% (28/646).
Características de la eficacia diagnóstica
15 Análisis de la reactividad cruzada
La reactividad de los anticuerpos monoclonales utilizados en el SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent ha sido probada frente a los microorganismos siguientes.
Los cultivos del ATCC (American Type Culture Collection, Colección Americana de Cultivos Tipo), Manassas, VA se identifican por el número de la cepa. Los prototipos indicados fueron aislados por los Centers for Disease Control, Atlanta, GA. Los cultivos restantes eran aislados clínicos, a menos que se indique lo contrario.
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Para 1 Para 2 Para 3
Adenovirus:
Tipos 1-47 prototipos; + 30 aislados clínicos actuales de los tipos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 37
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Poliomavirus: SV-40 - - -
Virus del herpes: 2 aislados clínicos del virus del herpes tipos 1 y 2, HSV-1 ATCC VR733, HSV-2 ATCC VR734; 1 aislado clínico de CMV y de VVZ
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Ecovirus: Aislados clínicos tipos 1, 4 ,6, 9, 11, 30, 33,
prototipo Echo-27, prototipo Polio-2 - - -
Coxsackievirus:
Prototipo A14, A24var (4 aislados), B4 (2 aislados) - - -
Enterovirus 70: 4 aislados - - -
Rinovirus: 6 aislados - - -
Coronavirus:
Prototipos OC43 y 229E - - -
Virus de la influenza tipo A:
2 aislados de cada de
Cepas A/Leningrado / 360/86 y A/Filipinas/2/82;
subtipo H3N2: A/Victoria/3/75 - 7 aislados, A/Texas/1/77 - 1 aislado,
Cepas A/Inglaterra/496/80 - 2 aislados, A/Inglaterra/X/82 - 12 aislados; subtipo H1N1:
A/USSR/90/77 - 2 aislados, A/Inglaterra/333/80 - 1 aislado; subtipos H3N2 y H1N1
todas las cepas - 25 aislados
- - -
Virus de la influenza tipo B:
2 aislados de B/USSR/100/83; 14 aislados de B/Singapur/222/79
- - -
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 1 y 6 + - - Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 2 y 6 - + - Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de los prototipos de los tipos 3 y 6 - - +
16
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Para 1 Para 2 Para 3
Virus de la parainfluenza:
Aislados recientes de cada uno de los prototipos de los tipos 4A y 4B y 6
- - -
Virus de la parotiditis: Prototipo,
6 aislados y CDC V5004 - - -
Virus del sarampión:
Cepa Edmonston; CDC V4009 - - -
Virus de simio:
Cepas de referencia 5 y 41 - - -
VRS:
Cepas de referencia Long, A2, 18537, V1680E y V670;
30 aislados recientes de las cepas del grupo 1 (similar a Long); 30 aislados de las cepas del grupo 2 (similar a 18537)
- - -
Acholeplasma laidlawii:
ATCC 23206 - - -
Bordetella bronchiseptica:
ATCC 10580 - - -
Bordetella pertussis:
ATCC 9340 - - -
Bordetella parapertussis:
ATCC 15237 - - -
Branhamella catarrhalis:
ATCC 25238 - - -
Chlamydia trachomatis:
Syva - - -
Corynebacterium diptheriae:
ATCC 13812 - - -
Legionella micdadei:
ATCC 33204 - - -
Legionella pneumophila:
CDC-BC 1640 - - -
Mycobacterium avium:
clínico - - -
Mycobacterium intracellularae:
clínico - - -
Mycobacterium tuberculosis:
clínico - - -
Mycoplasma fermentans:
ATCC 19989 - - -
Mycoplasma hominis:
ATCC 23114 - - -
Mycoplasma orale:
ATCC 23714 - - -
17
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Para 1 Para 2 Para 3
Mycoplasma pneumoniae:
Clínico - - -
Neisseria meningitidis:
ATCC 13077 - - -
Ureaplasma urealyticum:
ATCC 27618 - - -
Controles de la célula huésped: Todos los anticuerpos monoclonales dieron resultado negativo frente a los siguientes controles celulares:
Adenovirus Controles celulares pHEK, HEp-2, NCI-H292, RD, HLF, HeLa y A549
Poliomavirus Control de células PMK Enterovirus Controles de células RD y HLF
Paramixovirus Controles de células HEp-2, Vero y PMK
18
Comparación clínica para la confirmación del cultivo celular
La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon los anticuerpos monoclonales usados en el SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent con otros productos de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Para
1 Para
2 Para 3
Positivo verdadero 11 5 28
Positivo falso 0 0 0
Negativo verdadero 635 641 618
Negativo falso 0 0 0
Sensibilidad (%) 100 100 100
Especificidad (%) 100 100 100
Valor predictivo positivo (%) 100 100 100
Valor predictivo negativo (%) 100 100 100
La confirmación del cultivo celular de las muestras respiratorias del repositorio congelado fue probada en siete laboratorios clínicos de EE.UU. que compararon los anticuerpos monoclonales usados en el SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent con otros productos de diagnóstico in vitro. Los resultados son los siguientes:
ANTICUERPOS MONOCLONALES: Para
1 Para
2 Para
3
Positivo verdadero 33 5 16
Positivo falso 0 0 0
Negativo verdadero 118 146 135
Negativo falso 0 0 0
Sensibilidad (%) 100 100 100
Especificidad (%) 100 100 100
Valor predictivo positivo (%) 100 100 100
Valor predictivo negativo (%) 100 100 100
19
Características de la eficacia diagnóstica
Lo que sigue es un resumen de las sensibilidades relativas y las especificidades de los anticuerpos utilizados en el SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent. Los datos se obtuvieron en estudios clínicos llevados a cabo entre 1991 y 1998. Para más información sobre estos estudios, incluyendo los protocolos del mismo, la localización geográfica, el número y los tipos de muestras probadas, etc., contactar con nuestro representante autorizado de EMD Millipore Corporation.
CONFIRMACIÓN DEL CULTIVO ANTICUERPOS
MONOCLONALES: Para 1 Para 2 Para 3
Positivo verdadero 11 5 28
Positivo falso 0 0 0
Negativo verdadero 635 641 618
Negativo falso 0 0 0
Sensibilidad relativa (%) 100 100 100
Intervalo de confianza del 95%: 8,5-30,2% 2,5-18% 29,0-62,1%
Especificidad relativa (%) 100 100 100
Intervalo de confianza del 95%: 97,0-99,2% 98,2-99,7% 93,8-97,1%
20
Resolución de problemas
La preparación de las muestras depende mucho de la técnica y puede afectar a los resultados que se obtengan. Para poder solucionar posibles problemas de eficacia, es necesario examinar todos los pasos del proceso.
Una disminución muy marcada de la fluorescencia podría indicar:
1) Un deterioro de los reactivos
2) Problemas relacionados con la microscopía 3) Otros problemas del equipo o de la técnica
• Verifique la fecha de caducidad de todos los reactivos empleados.
• Si los reactivos no hubieran caducado, verifique el funcionamiento del microscopio y vuelva a examinar los portaobjetos control.
• Si aún no se determinara el problema, verifique la operación de todo el equipo según el folleto y repita el análisis.
Para solicitar asistencia, llame al Servicio Técnico de EMD Millipore Corporation. Para encontrar la oficina más cercana, visite www.millipore.com/offices.
La sección de “Bibliografía” de este folleto informativo de IVD de Light Diagnostics™ aparece solamente en la versión completa en inglés. Consulte esta versión acerca de los detalles específicos del producto.
21
Glosario de Símbolos
Símbolo Se utiliza para Símbolo Se utiliza para
Número de catálogo
El uso por parte AAAA-MM-DD o AAAA MM-
Fabbricante
Representante autorizado en la Comunidad Europea Precaución, consulte
los documentos adjuntos
Contenido
suficiente para <n>
pruebas Diagnóstico in vitro
de dispositivos médicos
Límites de temperatura
Consulte las instrucciones de uso
Los riesgos biológicos
Control
El control negativo
El control positivo
22
GARANTÍA Y LIMITACIÓN DE RESPONSABILIDAD:
1. Millipore garantiza que sus productos cumplirán con sus especificaciones publicadas cuando sean usados de acuerdo con sus instrucciones durante un período de un año desde el envío de los productos.
2. El Cliente inspeccionará los Productos cuando éstos le sean entregados. Cualquier reserva relativa a defectos obvios o a falta de Productos, debidos a una posible falta por Millipore Iberica, S.A, debe ser notificada inmediatamente por escrito al transportista y por correo certificado a Millipore Iberica, S.A, durante los tres (3) días laborables siguientes a la entrega, o como muy tarde, durante los diez (10) días naturales siguientes a la fecha de facturación, en el caso de que se trate de una falta de Productos.
3. No puede devolverse un producto sin el previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A, y sin seguir sus indicaciones al respecto. Cualesquiera de los Productos devueltos sin previo acuerdo de Millipore Iberica, S.A no serán abonados en la cuenta del Cliente.
4. Millipore Iberica, S.A no será responsable por el deterioro de los Productos adquiridos por el Cliente como consecuencia de las incorrectas condiciones de almacenamiento. A este efecto, el Cliente se obliga a respetar las especificaciones y condiciones de uso de dichos Productos; en caso de incumplimiento, no será aplicable ninguna de las garantías otorgadas por Millipore Iberica, S.A.
5. En el supuesto de incumplimiento de dicha garantía, Millipore únicamente estará obligado a reparar o reemplazar, a su elección, el producto o parte de éste. Si después de realizar esfuerzos razonables al efecto Millipore no es capaz de reparar o reemplazar el producto o parte de éste, entonces Millipore deberá devolver al cliente todo el dinero satisfecho por dicho producto o parte de éste.
6. Con carácter general, cualquier garantía otorgada por Millipore Iberica, S.A no es aplicable en los siguientes casos: instalación, uso y mantenimiento incorrectos de los Productos, sin cumplir con las instrucciones dadas por Millipore Iberica, S.A. desgastes ocasionados por uso ordinario de los Productos o falta del adecuado mantenimiento.
7. Millipore no será reputado responsable por perjuicios indirectos como perjuicio comercial, pérdida de clientela, pérdida de Pedidos, otros problemas comerciales, daño emergente, daños a su propiedad o marcas, sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de los productos.
8. Cualesquiera acciones dirigidas contra el Cliente por un tercero constituye un perjuicio indirecto y no produce derecho alguno a compensación.
9. En cualquier caso, las multas y sanciones que puedan ser atribuidas a Millipore Iberica, S.A en supuestos en que la responsabilidad de ésta se haya reconocido, quedarían limitadas a una cantidad igual a las sumas efectivamente satisfechas a Millipore Iberica, S.A por el Cliente en concepto de la compra del producto del que se derive la responsabilidad de Millipore Iberica, S.A.
Tween® es una marca comercial de ICI Americas Inc.
ATCC® es una marca comercial de la American Type Culture Collection Corporation.
2019 EMD Millipore Corporation, una división de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania. Todos los derechos reservados. EMD, EMD Millipore, Millipore, la marca M, Light Diagnostics, SimulFluor y todas las demás marcas comerciales, a menos que específicamente identificados anteriormente en el texto como perteneciente a un tercero, son propiedad de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.
EMD Millipore Corporation
28820 Single Oak Drive Temecula, CA 92590 • United States Tel. : +1 (951) 676-8080 • Fax : +1 (951) 676-9209
www.millipore.com MDSS GmbH Schiffgraben 41
30175 Hanover, Germany
LIGHT DIAGNOSTICS™
SimulFluor
PARAINFLUENZA 1, 2 /3 DFA KIT
Ein Direkter Immunfluoreszenz-Assay für die Differenzierung des Parainfluenza 3
von Parainfluenza 1 und 2
Deutsche Sprachenergänzung
3297 50
1
Verwendungszweck
Der Light Diagnostics™ SimulFluor Parainfluenza 1, 2/3 DFA Kit ist für den gleichzeitigen Nachweis von Parainfluenza 1 und 2 und die Identifizierung von Parainfluenza 3 nach der Amplifikation in Zellkulturen bestimmt.
Zusammenfassung und Erläuterung
Respiratorische Viren sind für einen erheblichen Prozentsatz an Krankheiten der menschlichen Bevölkerung verantwortlich. Einige Viren (z. B. Influenza) sind saisonbedingt, während andere (z. B. Adenovirus) hauptsächlich unterschiedliche Altersgruppen betreffen. Respiratorische Viren können in einer beliebigen Bevölkerung für eine erhebliche Anzahl an Todesfällen verantwortlich sein. Mit der kommenden Einführung entsprechender Antivirentherapie gegen einige respiratorische Viren werden schnelle Siebtests zum Nachweis dieser Organismen unerlässlich, um eine Therapie frühzeitig bestimmen zu können. Die zwei am häufigsten verwendeten Antivirus-Agenzien für respiratorische Viren sind Amantadin/Rimantadin für Influenza A und Ribavirin für RSV-Bronchiolitis.
Beide Agenzien verfügen über unterschiedliche Wirkungsweisen, die jedoch meistens frühe Infektionsschritte wie das Eindringen oder das Freisetzen des Genoms (uncoating) einschließen (12,19). In physiologisch erzielbaren Konzentrationen blockieren Amantadin und Rimantadin spezifisch die Replikation von Influenza A (4). Ribavirin verfügt über ein breites Spektrum an In-vitro-Aktivität gegen eine Vielzahl an Viren wie RSV, Masern, Influenza A und B und Parainfluenza (7,13,14).
Parainfluenza-Viren, kombiniert mit RSV, stellen die bedeutendsten Pathogene der oberen Atemwege bei Säuglingen und Kleinkindern dar (1,2,3,5). Vier Typen von Parainfluenza-Viren wurden in Kindern und Erwachsenen identifiziert. Die Typen 1 und 2 sind die Hauptursache für Laryngotracheobronchitis (Krupp). Die Krankheit verläuft bei Kindern zwischen zwei und vier Jahren am schwersten (6).
Eine Infektion mit Parainfluenza Typ 3 kann ebenfalls zu Krupp führen und ist nach RSV die zweithäufigste Ursache für Säuglings-Bronchiolitis und -Pneumonie (8,9,10,11,15). Der Krankheitsverlauf bei Infektionen mit Typ 3 ist bei Säuglingen unter einem Jahr am schwersten (6). Bei älteren Kindern und Jugendlichen kann die Krankheit asymptomatisch verlaufen oder wie eine normale Erkältung erscheinen (16). Schwerer Krupp in früher Kindheit oder im Säuglingsalter kann in älteren Kindern oder Erwachsenen nach körperlicher Betätigung in bronchialer Hyperaktivität resultieren. Es bleibt jedoch unbestimmt, ob die bronchiale Hyperaktivität bereits vorlag und die Pathogenese des Krupp beeinflusste, oder
2
ob sie sich als Komplikation schweren Krupps entwickelt hat (17,18).
Parainfluenza vom Typ 4 wurde bei Erwachsenen und Kindern nur mit leichten Erkrankungen der oberen Atemwege in Verbindung gebracht und ist in Zellkultur schwer nachzuweisen (6).
Parainfluenza-Viren gehören zum Genus Paramyxovirus der Familie der Paramyxoviridae. Es handelt sich bei ihnen um behüllte Viren mit einem Einzelstrang-RNA-Genom negativer Polarität und einem Durchmesser von 150 bis 200 nm (20).
Parainfluenza-Viren werden am besten in primären Simian- oder humanen Nierenzelllinien und in LLC-MK2 angezüchtet, einer heteroploiden Zelllinie des Rhesusaffen (21). Trypsin ist im Medium für die Gewinnung der Typen 1 und 2, nicht jedoch des Typs 3 erforderlich. Die Virusinfizierung der Gewebekultur kann durch Hämadsorption von Meerschwein-Erythrozyten erkannt werden. Die Typen 2 und 3 können durch Synzytium-Bildung erkannt werden.
Die sensitivste Methode zur Identifizierung der Parainfluenzaviren besteht in der Kulturisolation und –bestätigung. Dies ist für die meisten Labore die Standardmethode . Der Light Diagnostics™ SimulFluor Parainfluenza 1, 2/
3 DFA Kit verwendet für klare, einfach zu interpretierende Ergebnisse monoklonale Antikörper zum gleichzeitigen Nachweis von Parainfluenza 1 und 2 und zur Identifizierung von Parainfluenza 3 nach der Amplifikation in Kultur.
Testprinzip
Das Light Diagnostics™ SimulFluor Parainfluenza 1, 2/ 3 DFA Kit verwendet ein einziges Reagenz für den gleichzeitigen Ein-Schritt-Nachweis von Parainfluenza 1 und 2 und die Identifizierung von Parainfluenza 3 in infizierten Zellkulturen bestimmt. Das SimulFluor Para 1, 2/ 3-Reagenz enthält zwei Komponenten. Die primäre Komponente wird gegen Parainfluenza 1 und 2 gerichtet; die zweite Komponente wird spezifisch gegen Parainfluenza 3 gerichet.
Die monoklonalen Antikörper in den Komponenten gehen eine Verbindung mit dem entsprechenden Virusantigen auf dem Proben-Objektträger ein.
Ungebundene Antikörper werden mit PBS (phosphate buffered saline, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) vom Objektträger gewaschen. Die Bestrahlung mit ultraviolettem Licht macht den Antigen-Antikörper-Komplex durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar. Mit Parainfluenza 1 und 2 infizierte Zellen weisen eine apfelgrüne Fluoreszenz auf, während mit Parainfluenza 3 infizierte Zellen eine goldgelbe Fluoreszenz aufweisen. Die primäre Komponente färbt die mit Parainfluenza 1 und 2 infizierten Zellen in hellem Apfelgrün, unterscheidet die Viren jedoch nicht voneinander. Die sekundäre Komponente färbt die mit Parainfluenza 3 infizierten Zellen in hellem Goldgelb und ermöglicht
3
die Unterscheidung von Parainfluenza 3 von Parainfluenza 1 und Parainfluenza 2 in einer einzigen Vertiefung. Nicht infizierte Zellen färben sich wegen der im Reagenz vorhandenen Evans Blue -Gegenfärbung mattrot.
Kit-Komponenten
1. SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent – 5297: Ein (1) 2 ml-Tropffläschchen mit einer primären, für Parainfluenza 1 und 2 spezifischen und einer sekundären, für Parainfluenza 3 spezifischen Komponente, Protein- Stabilisator, Evans Blue und 0,1 % Natriumazid (Konservierungsmittel).
Bereitgestellte Betrag is ausreichend für 50 Tests. Schätzung basiert auf Tests von 40 ul Tropfen beruhen; tatsächliche Anzahl der Tests können variieren.
2. Para 1, 2, 3 Control Slide - 5011: Zwei (2) Kontroll-Objektträger mit einer infizierten (positiven) Vertiefung und einer nicht infizierten (negativen) Vertiefung für jeweils Parainfluenza 1, 2 und 3.
3. Phosphate-Buffered Saline (PBS) - 5087: Eine (1) Packung phosphatgepufferte Kochsalze (PBS), ergibt nach Auflösen in destilliertem Wasser 1 Liter. In einem sauberen, verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur lagern.
4. Tween 20 / Sodium Azide Solution (100X) 5037: Ein (1) 10 ml- Fläschchen mit einem Konzentrat von Polyoxyethylen-Sorbitanmonolaurat (Tween 20) und Natriumazid (NaN3), in PBS 1:100 zu verdünnen.
5. Mounting Fluid - 5013: Ein (1) 10 ml-Tropffläschchen mit Tris-Puffer, Glyzerin, Fluoreszenzverstärker und Natriumazid als Konservierungsmittel.
Bei temperatur lagern bei 2-25ºC.
Zusätzlich erforderliche, nicht mitgelieferte Materialien
1. Zellkultur für die Isolierung von respiratorischen Viren: Jedes Labor muss Vorräte lebensfähiger Zellen in den entsprechenden Übertragungszuständen aufbewahren, die die effiziente Replikation respiratorischer Viren aus verarbeiteten Patientenproben ermöglichen. Diese Zellen müssen in regelmäßigen Abständen auf Eignung für die Anzüchtung respiratorischer Viren überprüft werden. Entsprechende Zelllinien können von der American Type Tissue Culture Collection ATCC®, Manassas, VA bezogen werden.
2. VTM (viral transport medium. Virustransportmedium), das sich weder auf die respiratorischen Viren , noch auf die zur Virusisolierung verwendeten
4
Gewebekulturzellen hemmend auswirkt: HBBS (Hank's balanced salt solution) mit Antibiotika und einem Proteinstabilisator ist ein geeignetes Medium. Den Gebrauch von tierischen Sera als Proteinstabilisator (außer präkolostralem fötalem bovinen Serum, FBS) vermeiden, um die störende Wirkung inhärenter Antikörper zu verhindern.
3. Es können Gewebekulturmedien wie RPMI oder Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit der entsprechenden Menge an präkolostralem FBS verwendet werden.
4. Sterile Röhrchen für Gewebekulturen, Dram-Fläschchen oder Platten mit Mehrfachvertiefungen
5. Aceton, chemisch rein oder besser
Hinweis: Aceton ist hygroskopisch und sollte in dicht verschlossenen Flaschen aufbewahrt werden. Wenn im Aceton Feuchtigkeit vorhanden ist, kann dies während der Fluoreszenzmikroskopie zu einer trüben Darstellung auf dem Substrat führen.
6. Aceton-gereinigte Objektträger aus Glas mit Vertiefungen von mindestens 6 mm Durchmesser in einer hydrophoben Maske
7. Sterile Pipetten 8. Feuchte Kammer
9. Natriumhypochlorit-Lösung (0,05%) 10. Deckgläser Nr. 1
11. 37°C-Inkubator mit Regelwiderstand für die Temperaturregulierung 12. Sterile Tupfer
13. Pinzette
14. Fläschchen für die Sammlung und den Transport der Proben
15. Fluoreszenzmikroskop mit entsprechender Filterkombination für Fluorescin (Anregungsmaximum 490 nm, Emissionsmaximum 520 nm)
16. Sterile Glaskügelchen (1–3 mm Durchmesser) 17. Zentrifuge
18. Vortex-Mischer oder Ultraschallgerät 19. Destilliertes oder deionisiertes Wasser
Stabilität und Lagerung
Wenn bei 2° bis 8°C gelagert, ist das Light Diagnostics™ SimulFluor Para 1, 2/ 3 DFA Kit bis zu dem auf dem Kitetikett aufgedruckten Verfallsdatum stabil.
5
Nicht einfrieren oder hohen Temperaturen aussetzen. Entsorgen Sie nach dem Verfallsdatum des Kits alle verbliebenen Reagenzien.
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
• Natriumazid (im reagenz, losüng PBS/Tween 20 , und im Eindeckmedium enthalten) kann mit Blei- oder Kupferrohren zu potenziell explosiven Metallaziden reagieren. Beim Entsorgen mit viel Wasser nachspülen, um eine Anlagerung in den Wasserrohren zu vermeiden.
• Das Vermischen oder Verdünnen von Konjugaten oder monoklonalen Antikörpern kann zu falschen Ergebnissen führen.
• Die Objektträger dürfen während des Färbungsverfahrens nicht trocken werden.
• Behandeln Sie alle Einzelproben und Materialen als potenziell infektiös. Vor der Entsorgung mit 0,05-prozentigem Natriumhypochlorit (eine 1:100- Verdünnung handelsüblichen Chlor-Bleichmittels) dekontaminieren.
• Die Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation keinem hellen Licht aussetzen.
• Kontakt mit Evans Blue (im SimulFluor Para 1, 2, 3-Reagenz 5297 vorhanden) vermeiden, da es potenziell krebserregend ist. Bei Hautkontakt mit großen Mengen Wasser nachspülen.
• Aceton ist extrem entzündlich und schädlich, wenn es verschluckt oder eingeatmet wird. Von Hitze, Funken oder Flammen fernhalten. Das Einatmen der Dämpfe vermeiden. Für ausreichende Belüftung sorgen.
• Reagenzien nicht mit dem Mund pipettieren.
• Keine Reagenzien anderer Hersteller verwenden.
• Eine Änderung des mitgelieferten Protokolls kann falsche Ergebnisse verursachen.
• Beim Anfärben mehrerer Proben auf einem Objektträger eine Kreuzkontaminierung zwischen den Proben vermeiden.
• Mounting Fluid 5013 enthält einen Fluoreszenzverstärker, der die Schleimhäute angreifen kann. Direkten Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Wenn ein Kontakt erfolgt, mit großen Mengen Wasser nachspülen.
Probenentnahme
6
Ordnungsgemäße Verfahren bei Entnahme, Transport, Verarbeitung und Lagerung der Einzelproben sind für die Isolierung und den Nachweis der Parainfluenza 1, 2 und 3 Infektion von grundlegender Bedeutung. Absaugungen von respiratorischen Sekreten sind die bevorzugten Proben (1), Nasenrachenraum- oder Rachenabstriche können jedoch ebenfalls verwendet werden (2).
Nasale Spülungen und nasopharyngeale bzw. tracheale Absaugungen sind für die Untersuchung der Einzelproben ideal, da so eine große Anzahl von Epithelzellen gewonnen werden kann. Einzelproben von Nasenrachenraum-Spülungen werden entnommen, indem 3 bis 5 ml Kochsalzlösung in das Nasenloch des Patienten geträufelt werden, wobei sich der Patient in einer zurückgelehnten Position befindet. Die Salzlösung wird mit einer Spritze, einem Gummisaugball oder einem Katheter, der an einer Schleimauffangvorrichtung angebracht ist, behutsam abgesaugt.
Nasenrachenraum-, Rachen- oder Nasenabstriche enthalten oftmals keine genügende Anzahl an Flimmer- oder säulenförmigen Epithelzellen, die für den direkten Nachweis von respiratorischen Viruspathogenen unbedingt erforderlich sind.
Proben sofort nach der Sammlung auf nassem Eis transportieren. Proben für die Kulturisolierung sollten bei -70°C eingefroren werden, wenn die Verarbeitung nicht innerhalb von 72 Stunden nach der Entnahme erfolgt. Wiederholte Einfrier- /Auftau-Zyklen vermeiden.
Der Typ der entnommenen Einzelproben sowie deren nachfolgende Verarbeitung hängt von der Krankheit und dem nachzuweisenden Virus ab. Weitere Informationen über Symptome und Verfahren für die Probensammlung siehe The Manual of Clinical Microbiology, Balows, A. et al., eds. 5th ed. (1991). American Society for Microbiology, Washington, D.C., Parainfluenza Viruses, Ch. 82;
Animal and Animal Cell Culture Systems, Ch. 19.
Der Transport der Proben muss den geltenden Gesetzen und Vorschriften in Hinsicht auf den Transport von biologischem Probenmaterial entsprechen.
7
Probenverarbeitung
Vor der Verarbeitung der Einzelproben überprüfen, ob sie ordnungsgemäß entnommen und transportiert wurden. Eine unsachgemäße Behandlung der Einzelproben kann zu falschen Ergebnissen führen.
Einzelprobenverarbeitung für Kultur/Isolierung:
Nasopharyngeale Absaugungen, tracheale Absaugungen, Nasenspülungen, bronchiale Spülungen:
1. Die Probe aus dem Originalbehälter nehmen und in ein steriles Zentrifugenröhrchen von 10 bis 15 ml geben.
2. Genügend kalte PBS hinzufügen, um das Volumen auf 2,0 bis 2,5 ml aufzufüllen.
3. Zum Mischen vortexieren. Wenn die Einzelprobe ausschließlich für die Virusisolierung verwendet werden soll, mit Schritt 4 fortfahren.
4. Bei 8 bis 12 kHz 30 bis 60 Sekunden mit Ultraschall behandeln, um die Zellen aufzuschließen und Viruspartikel freizusetzen.
5. Die Einzelprobe mit 300 bis 500 x g bei 2° bis 8°C 8 bis 10 Minuten zentrifugieren, um Zelltrümmer abzuscheiden.
6. Den Überstand von den Zelltrümmern abgießen.
7. Der Überstand kann vor der Inokulation mit 10facher antibiotischer Lösung gemischt und bei 2° bis 8°C 30 bis 60 Minuten stehen gelassen werden, um ein Überwachsen mit Bakterien zu verhindern.
Nasenrachenraum-, Rachen- und Nasenabstriche:
1. Die Probe heftig vortexieren oder rühren, um die Zellen vom Abstrich zu trennen.
2. Fügen Sie der Einzelprobe zur gesteigerten Virusgewinnung einige sterile Glaskügelchen hinzu, und vortexen Sie eine Minute lang, oder behandeln Sie mit Ultraschall bei 8 bis 12 kHz für 30 bis 60 Sekunden.
3. Den Abstrich mittels Natriumhypochloritlösung entsorgen.
4. Die Einzelprobe mit 300 bis 500 x g bei 2 - 8 °C 8 bis 10 Minuten zentrifugieren, um Zelltrümmer abzuscheiden.
5. Den Überstand als Inokulationsmaterial verwenden.
8
Vorbereitung der Kultur/Isolierung
Inokulation von Standardröhrchen:
1. Zellkulturen unmittelbar vor der Inokulation mit Einzelproben auf ordnungsgemäße Morphologie überprüfen.
2. Das Wachstumsmedium aus den Röhrchen absaugen.
3. Jedem Röhrchen 0,2 bis 0,5 ml Inokulum hinzufügen.
Hinweis: Die Verwendung mehrerer Zelllinien oder replizierter Kulturen kann die Isolierungsrate des Virus erhöhen.
4. Inkubieren Sie die Röhrchenkulturen auf einem Gestell mit Neigung für 1 Stunde bei 35 bis 37°C.
5. Nach der Adsorption oder Zentrifugierung das Inokulum absaugen und genügend Aufbewahrungsmedium hinzufügen, um den Zell-Monolayer vollständig zu bedecken.
6. Inkubieren Sie bei 35 bis 37°C in Rolltrommeln.
7. Den Monolayer täglich untersuchen. Die Zellen können 2 bis 3 Mal behutsam mit vorgewärmtem Aufbewahrungsmedium gespült werden, wenn es den Anschein hat, dass sich die Einzelprobe zum Monolayer toxisch verhält.
8. Das Zellkulturmedium alle 3 bis 5 Tage erneuern.
Hinweis: Eine Einzelprobe jeder Menge der für die Zellkultur verwendeten Zelllinien sollte mit repräsentativem Parainfluenza-Arten 1, 2, und 3 inokuliert werden, um die Anfälligkeit für die Influenza-Infektion und die darauf folgende Entwicklung von CPE nachzuweisen. Es sollten außerdem nicht inokulierte Zellkulturen angezüchtet und täglich auf kontaminierende Viren oder Mycoplasma untersucht werden. Dies dient als Kontrolle der normalen Zellmorphologie und kann bei der Erkennung von frühzeitigem CPE hilfreich sein. Nur wenn diese Kontrollzellkulturen ein entsprechendes Wachstum aufweisen, können die Ergebnisse der Zellkulturisolierung als gültig betrachtet werden.
9. Die Röhrchen täglich auf CPE (cytopathic effect, zytopathischer Effekt) untersuchen und/oder auf Hämadsorption testen. Wenn CPE oder positive Hämadsorption beobachtet wird, die Zellen durch Schaben oder Trypsinisierung aus dem Röhrchen entfernen.
10. Zum Vorbereiten der Objektträger das Kulturmedium aus dem Röhrchen absaugen. Lagern Sie das Kulturmedium bei 2° bis 8°C, bis alle Tests durchgeführt wurden. Wenn weitere Tests erforderlich sind, kann die Virusisolierung mithilfe dieses Mediums versucht werden.
9
11. Den Zell-Monolayer drei Mal mit 1 bis 2 ml HBSS oder PBS spülen. Alle Spülungen in Natriumhypochloritlösung entsorgen.
12. Ein Zehntel des ursprünglichen Kulturvolumens an Trypsin hinzufügen und 30 Sekunden stehen lassen. Leicht an das Kulturgefäß tippen, um die Zellen zu lösen. Die Zellen in 2 ml HBSS oder PBS resuspendieren. Die Zellsuspension bei 300 bis 500 x g 10 Minuten lang zentrifugieren. Das Zellpellet in 0,3 ml steriler PBS resuspendieren, um eine leicht trübe Suspension zu erhalten.
Hinweis: Wahlweise hierzu kann der Zell-Monolayer mithilfe eines Glasstäbchens oder einer sterilen Pipette aus dem Röhrchen in ein kleines Volumen PBS geschabt werden.
13. Einen Tropfen der Zellsuspension auf einen Aceton-gereinigten Objektträger aufbringen. Den Objektträger vollständig an der Luft trocknen lassen.
14. Fixieren Sie den Objektträger in gekühltem Aceton (2° bis 8°C) für 10 Minuten. Das Aceton darf nicht durch Wasser und Salze verunreinigt werden. Dies kann eine trübe Färbung verursachen.
15. Objektträger an der Luft trocknen lassen. Die Objektträger sollten so schnell wie möglich angefärbt werden. Wenn eine Lagerung erforderlich ist, stellen Sie die fixierten Objektträger bei ≤ -20°C in einen Behälter mit Trocknungsmittel.
16. Nach der Bearbeitung des Abschnitts „Vorbereitung der Reagenzien“ mit dem Abschnitt „Immunfluoreszenzverfahren“ fortfahren.
Shell-Vial-Inokulationskulturen:
1. Zellkulturen unmittelbar vor der Inokulation mit Einzelproben auf ordnungsgemäße Morphologie überprüfen.
2. Das Wachstumsmedium aus den Shell-Vials absaugen.
3. Jedem Röhrchen 0,2 bis 0,5 ml Inokulum hinzufügen.
4. Bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 500 bis 700 x g zentrifugieren.
5. Nach der Zentrifugierung das Inokulum absaugen und genügend Aufbewahrungsmedium hinzufügen, um den Zell-Monolayer vollständig zu bedecken.
6. Inkubieren Sie bei 35 bis 37°C.
7. Untersuchen Sie die Shell-Vials täglich auf zytopathischen Effekt, und/oder testen Sie auf Hämadsorption. Shell-Vials können sich zwischen 24 und 96 Stunden nach Infektion anfärben, oder zu optimalen Zeitpunkten, wie vom jeweiligen Labor bestimmt.
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8. Um die Deckgläser für die Anfärbung vorzubereiten, saugen Sie das Kulturmedium ab, und lagern Sie es bei 2° bis 8°C, bis alle Tests durchgeführt wurden. Wenn weitere Tests erforderlich sind, kann die Virusisolierung mithilfe dieses Mediums versucht werden.
9. Spülen Sie den Zell-Monolayer drei Mal mit 1 ml PBS. Alle Spülungen in Natriumhypochloritlösung entsorgen.
10. Saugen Sie die PBS aus dem Shell-Vial ab, und fixieren Sie wie folgt: Fügen Sie 1 ml des gekühlten Acetons hinzu, saugen Sie ab, und füllen Sie sofort mit 1 ml gekühltem Aceton wieder auf (2° bis 8°C). Fixieren Sie 10 Minuten lang bei 2° bis 8°C.
11. Saugen Sie das Aceton ab, und lassen Sie die Deckgläser an der Luft vollständig trocknen. Spülen Sie mit 1 ml PBS, saugen Sie ab, und färben Sie sofort an. Wenn eine Lagerung erforderlich ist, stellen Sie die Shell- Vials bei ≤ -20°C in einen Behälter mit Trocknungsmittel.
Hinweis: Gelagerte Shell-Vials sollten vor dem Anfärben mit 1 ml PBS gespült werden.
12. Nach der Bearbeitung des Abschnitts „Vorbereitung der Reagenzien“ mit dem Abschnitt „Immunfluoreszenzverfahren“ fortfahren.
Färbungsverfahren
Reagenzvorbereitung:
PBS/Tween 20-Lösung
1. Den Inhalt des PBS-Päckchens in 950 ml destilliertem Wasser auflösen.
2. Das Tween 20 / Natriumazid 100x-Konzentrat (10 ml) zu der PBS hinzufügen und gut vermischen.
3. Mischen Sie gründlich und füllen Sie destilliertes Wasser auf 1 Liter auf. Die Lösung in einen sauberen, etikettierten Aufbewahrungsbehälter gießen und gut verschließen. Bei Raumtemperatur lagern.
Alle anderen mitgelieferten Reagenzien sind gebrauchsfertig.
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Empfohlenes Verfahren für Direkte Immunfluoreszenz (Anfärben):
1. Warten, bis der mit Azeton fixierte Kontroll- und/oder Testobjektträger und die Reagenzien Raumtemperatur angenommen haben.
Hinweis: Die Objektträger dürfen während des Färbungsverfahrens nicht trocken werden.
2. Genügend SimulFluor Para 1, 2/ 3 Reagent 5297 zum Bedecken der Zellen hinzufügen: Für Zellauftrag 1 Tropfen und für Shell-Vials 4–6 Tropfen.
3. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37°C, wahlweise 30 Minuten, in einer feuchten Kammer.
4. Den Objektträger 10–15 Sekunden lang behutsam mit einer Spritzflasche spülen, die PBS/Tween 20-Lösung enthält, um die überschüssige monoklonale Antikörperlösung zu entfernen, und darauf achten, dass der Strahl nicht auf die Vertiefung trifft. Bei Shell-Vials: Das Reagenz vom Vial absaugen und jedes Shell-Vial 3 Mal behutsam mit 1 ml PBS/Tween 20- Lösung waschen.
5. Schütteln Sie das überschüssige PBS/Tween 20 von den Objektträgern.
6. Das Produkt unter einem Deckglas mit wässrigem Mounting Fluid pH 8,5 5013 oder äquivalentes Produkt eindecken. Bei Shell-Vials: Das PBS/Tween von den Shell-Vials absaugen. Jedes Deckglas mit einer an einer kleinen Spritze befestigten gebogenen Nadel anheben und das Produkt mit einer Pinzette entfernen. Jedes Deckglas MIT DER ZELLENSEITE NACH UNTEN auf einem gläsernen Objektträger mit Mounting Fluid bedecken.
7. Überschüssige Flüssigkeit von den Rändern des Deckplättchens abgießen.
Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, die Objektträger direkt nach dem Färben ablesen. Wenn die Objektträger gelagert werden sollen, sind sie bei 2 bis 8 °C in einem sicheren Behälter in Dunkelheit zu lagern.
8. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 160- 200facher Vergrößerung auf Zellen, die Fluoreszenz aufweisen. Eine detaillierte Untersuchung kann bei 400facher Vergrößerung ausgeführt werden.
Hinweis: Die Leistung des Fluoreszenzmikroskops ist zum Erzielen befriedigender Testergebnisse von entscheidender Bedeutung. Da sich Objektive, Lampenstärke, Wattzahlen und Filter auf die Ergebnisse auswirken können, wird durch eine Positivkontrolle die Funktion von Reagenzien, der Kulturmethodologie und des Mikroskops überprüft.
