MICROBIOLOGÍA
(Manual de Prácticas)
MICROBIOLOGÍA (PRÁCTICAS)
Objetivo:
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan:
Las buenas prácticas de trabajo en el laboratorio de Microbiología Aprender las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo
Familiarizarse con las técnicas empleadas en Microbiología para el cultivo y la manipulación de microorganismos en condiciones de esterilidad
Familiarizarse con el manejo del microscopio óptico para la visualización de microorganismos así como las tinciones más habituales en el laboratorio de Microbiología
Aprender otras técnicas como realizar un antibiograma
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Un laboratorio de Microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena técnica aséptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biológica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).
Aunque los microorganismos que se manipulan no sean considerados patógenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaución por su potencial patogenicidad.
Es necesario cumplir dos REQUISITOS BÁSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.) contaminen muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, es estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°). 4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben
evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán recipientes adecuados que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.
8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
9. No se debe pipetear nunca con la boca, utilizar siempre pipeteadores manuales. 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos,
PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL PARA ESTERILIZAR
1. OBJETIVO
El alumno preparará adecuadamente los diversos materiales de vidrio e instrumental para su esterilización.
2. INTRODUCCIÓN
Un requisito indispensable en los laboratorio de microbiología es que todo el material y medios de cultivo utilizados estén estériles y protegidos adecuadamente para conservar la esterilizad durante su uso y almacenamiento.
La esterilidad es un término utilizado en microbiología para indicar la ausencia de cualquier forma de vida en un objeto determinado y la esterilización es el proceso para llegar a este fin.
Los métodos de esterilización utilizados con más frecuencia en los laboratorios son el calor húmedo (autoclave) y el calor seco (horno).
Para llevar a cabo la esterilización por calor húmedo es necesario envolver los objetos en un material que permita el paso del vapor y que además los proteja posteriormente de la contaminación cuando entren en contacto con el ambiente; de este modo, los matraces, tubos y pipetas deben taparse con algodón y éste debe protegerse con papel para que no se humedezcan. En el caso de las cajas de Petri, estas se envuelven con papel.
Cuando esterilizamos con calor seco es preferible colocar las pipetas y las cajas en cilindros de metal con aberturas que permitan el paso de aire caliente.
3. MATERIAL
Matraces Erlenmeyer de 250 mL Tubos de ensaye Pipetas
Cajas Petri de vidrio Gradilla
Algodón y papel de envoltura
4. MÉTODO
A) Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con agua destilada.
1. Colocar 9 mL de agua destilada en cada uno de 10 tubos
2. Tapar cada tubo con tapón de algodón o tapón de baquelita, siguiendo las instrucciones del profesor.
3. Colocar los tubos en un bote y protegerlos con papel.
4. Anotar los datos necesarios para la identificación del material. B) Pipetas
1. Poner en la boquilla un filtro de algodón, de tal manera que el aire pase libremente a través de él.
2. Flamear el extremo de la pipeta para quemar el exceso de algodón
3. Envolver con papel cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor.
4. Marcar el volumen de cada pipeta en la envoltura. C) Cajas de Petri
1. Colocar las cajas de Petri en grupo de 5, con la tapa hacia abajo.
2. Envolverlas con papel siguiendo las instrucciones del profesor.
3. Anotar los datos necesarios para la identificación del material. D) Matraces.
1. Colocar a cada matraz un tapón de algodón.
2. Cubrir el tapón de algodón con un gorro de papel.
3. Etiquetar los matraces con los datos necesarios para la identificación del material.
5. CUESTIONARIO
1.- ¿Con que finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?
2. Mencione Ud. Las condiciones de esterilización por calor húmedo y diga cuál es su mecanismo de acción.
3. Mencione Ud. Las condiciones de esterilización por calor seco y diga cuál es su mecanismo de acción.
4. ¿Con qué método esterilizaría el siguiente material?.
Sangre:____________________________ Talco:_____________________________ Aceite mineral:_____________________
Instrumental de cirugía:________________________ Ropa contaminada:____________________________ Cubículo de siembra:__________________________
PRÁCTICA 2. USO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO
1. OJETIVO
El alumno aprenderá a utilizar en forma adecuada el material del laboratorio.
1. INTRODUCCIÓN
Una parte importante del entrenamiento que recibe el estudiante de Microbiología en el manejo de los microorganismos, lo constituye el uso adecuado del material del laboratorio, como tubos, pipetas y matraces. Así, de la habilidad adquirida en el manejo adecuado de este material dependerá el resultado de los experimentos realizados y su reproducibilidad.
Para el aislamiento de los microorganismos a partir de diversas muestras, se recurre al método de las diluciones para obtener suspensiones, en las cuales la concentración de los microorganismos es inversamente proporcional a la dilución efectuada en cada caso. En esta técnica es importante manejar la pipeta adecuadamente (ver figura 1) ya que cada dilución sucesiva “amplifica” los errores previos, de modo que cualquier medición volumétrica debe hacerse con exactitud.
Al hacer las diluciones, se debe succionar y soplar fuertemente en cada tubo, por lo menos cinco veces antes de transferir la dilución al siguiente tubo, siempre el mismo número de veces.
Al usar las pipetas, siempre se debe medir el volumen desplazando desde el cero de la pipeta; lo que sobre del líquido debe regresarse al tubo del que se tomó, soplando para eliminar la mayor cantidad de líquido de la pipeta.
Nunca debe de tener en su mano dos tubos al mismo tiempo mientras hace las diluciones. Cuando utilice tubos con tapón debe quitar el tapón con el dedo meñique de la mano que sujeta la pipeta.
Cuando succione el líquido de un tubo, debe hacer llegar la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo (a menos que el profesor indique lo contrario) y al soplar, deberá sacar la pipeta del líquido para evitar que al salir el aire el líquido se derrame.
Cada alumno debe hacer las diluciones sin ayuda de sus compañeros.
3. MATERIAL
a) Por mesa
agua destilada
3 mL de solución de azul de metileno al 1%
3 mL de solución de fenolftaleina al 0.01%
b) Por equipo
5 tubos de 15 x 150 mm
5 tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca 3 pipetas de 5 mL
3 pipetas de 1 mL
4. PROCEDIMIENTO
1. Manejo de diluciones
Preparación de diluciones decimales utilizando como diluyente cristal violeta. con una pipeta agregar a una serie de 8 tubos con 9 mL de agua destilada.
Al primer tubo, adicionar 1 mL de cristal violeta y hacer diluciones 1:10 hasta el N0. 8 y anotar observaciones.
2. Manejo de cajas petri y tubos de ensaye
Colocar 10 mL de HCl 0.1 N en el fondo de una caja petri, añadir dos gotas de fenolftaleina y titular con NaOH 0.1 N, agitando cuidadosamente.
En un tubo de ensaye de 16 x 150, colocar 2 mL de azul de metileno y agregar lentamente resbalando por las paredes del tubo, 6 mL de agua destilada, agite cuidadosamente sin mojar el tapón.
5. CUESTIONARIO
1.- Diga a partir de que dilución ya no se observa el azul de metileno 2.- Diga a partir de que dilución vira la fenolftaleina
3. ¿Qué significa una dilución 1:2, 1:9, 1:10?
4. Si Ud mezcla 1 mL de soluto más 4 mL de solvente. ¿Qué dilución realizó? Y si mezcla 0.3 mL de soluto más 2.7 de diluyente. ¿Qué dilución realizó?
