Efecto modulador ex vivo de los fármacos biológicos para la enfermedad inflamatoria intestinal sobre las células mononucleares de sangre periférica y la mucosa intestinal

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(1)UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS GRADO EN BIOTECNOLOGÍA FUNDACIÓN PARA LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE LA PRINCESA. Efecto modulador ex vivo de los fármacos biológicos para la enfermedad inflamatoria intestinal sobre las células mononucleares de sangre periférica y la mucosa intestinal. TRABAJO FIN DE GRADO Autor: Lucía Vicioso Gómez Tutor: Samuel Fernández Tomé Julio de 2019. ii.

(2) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS. GRADO DE BIOTECNOLOGÍA. EFECTO MODULADOR EX VIVO DE LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS PARA LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL SOBRE LAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA MUCOSA INTESTINAL. TRABAJO FIN DE GRADO. Lucía Vicioso Gómez. MADRID, 2019. Director: Samuel Fernández Tomé Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de La Princesa Profesor: José Manuel Palacios Dpto. de Biotecnología y Biología Vegetal. ii.

(3) TITULO DEL TFG- EFECTO MODULADOR EX VIVO DE LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS PARA LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL SOBRE LAS CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA MUCOSA INTESTINAL. Memoria presentada por Lucía Vicioso Gómez para la obtención del título de Graduado en Biotecnología por la Universidad Politécnica de Madrid. Fdo: Lucía Vicioso Gómez. VºBº Tutor Samuel Fernández Tomé Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de La Princesa VºBº Tutor UPM José Manuel Palacios Alberti Dpto. de Biotecnología y Biología Vegetal ETSIAAB - Universidad Politécnica de Madrid. Madrid, 25, junio, 2019 iii.

(4) ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS. v. ÍNDICE DE FIGURAS. v. LISTA DE SÍMBOLOS. vi. LISTA DE ABREVIATURAS. vii. RESUMEN. viii. CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. 1 1. 1.1. INTRODUCCIÓN 1.1.1.. LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. 1. 1.1.2.. LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS. 3. 1.1.3.. ANTECEDENTES DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN,. 8. PLANTEAMIENTO DE LA HIPÓTESIS Y APORTACIÓN DEL TFG. 10. 1.2. OBJETIVOS. 11. CAPÍTULO 2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. ASPECTOS ÉTICOS Y TOMA DE MUESTRAS HUMANAS. 11. 2.2. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS. 11. 2.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL. 11. 2.4. TINCIÓN EXTRACELULAR DE PBMCs. 13. 2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 14 15. CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS APCs EN BASE A. 15. MARCADORES DE MIGRACIÓN 3.2. ESTUDIO FUNCIONAL DE LA CAPACIDAD DE MIGRACIÓN. 18. DE LAS APCs CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN. 22. CONCLUSIONES. 24. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 25. APÉNDICES. 28. iv.

(5) ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Mecanismos de acción de los principales fármacos anti-TNF-α en la EII. 6. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Tratamiento farmacológico actual de la EII Figura 2. Caracterización fenotípica de las APCs en base a marcadores de. 3 16. migración Figura 3. Evaluación del efecto de los fármacos biológicos sobre el fenotipo de. 17. las APCs en base a marcadores de migración Figura 4. Influencia de ligandos quimioatrayentes sobre la migración de las. 18. APCs Figura 5. Influencia de fármacos biológicos sobre la migración de las APCs. 19. Figura 6. Influencia de ligandos quimioatrayentes y fármacos biológicos sobre. 20. la migración de las APCs. v.

(6) LISTA DE SÍMBOLOS ºC: grados Celsius h: horas µg: microgramos µL: microlitros mL: mililitros ng: nanogramos p: p-valor rpm: revoluciones por minuto. vi.

(7) LISTA DE ABREVIATURAS APCs: Células presentadoras de antígenos CCL: Ligando de quimiocinas CCR: Receptor de quimiocinas CU: Colitis ulcerosa DC: Células dendríticas EC: Enfermedad de Crohn EII: Enfermedad inflamatoria intestinal FACS-buffer: Tampón fosfato para citometría de flujo Ig: Inmunoglobulina IL: Interleucina LB: Linfocitos B LPMCs: Células mononucleares de lámina propia MAdCAM-1: Molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1 mDC: Células dendríticas mieloides Mo: Monocitos PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica pDC: Células dendríticas plasmacitoides RPMI: Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute Th: Linfocito T helper TNF-α: Factor de necrosis tumoral alfa VCAM-1: Molécula de adhesión vascular 1. vii.

(8) RESUMEN Inflammatory bowel disease comprises a group of chronic disorders of the gastrointestinal tract mainly classified into Crohn's disease and ulcerative colitis. It is a serious condition that affects millions of people worldwide and which precise etiology remains unknown. Despite the variety of pharmacological treatments available, such us the new biological drugs, there is no effective treatment to cure this pathology and the current goal is to induce and maintain remission to improve the quality of life of these patients. Biological drugs can act on different targets that have a key role in the disease, however their mechanisms of action are partly understood. This work aims to evaluate the ex vivo modulatory effect of biological drugs with different targets –infliximab, inflectra and adalimumab (anti-TNF-α), and vedolizumab (antiintegrin α4β7)– on the migration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to the intestinal mucosa in healthy patients. To this end, PBMCs were obtained and cultured in the absence/presence of biological drugs. Afterwards, migratory surface markers (beta7, CCR2, CCR5, CCR6 and CCR9) of the subpopulations of antigen presenting cells (APCs) were characterized by flow cytometry, as well as their capacity to migrate towards different intestinal chemoattractants (CCL2, CCL25 and MAdCAM1) on a transwell culture model. This study demonstrates the blockade that vedolizumab exerts on integrin α4β7, reducing the expression of beta7 on the surface of APCs. In contrast, anti-TNF-α drugs seem to increase the expression of this integrin in monocytes. Functional assays on transwell model show that ligand CCL2 induces the most potent effect over the spontaneous migration of APCs. Moreover, after culture with biological drugs, this study suggests that the ex vivo modulatory effect of biological drugs over the recruitment of APCs might be preferentially mediated through ligand CCL2. This work highlights the role of biological drugs over the migratory capacity of circulating APCs towards the intestinal mucosa in healthy individuals, setting the basis to further explore this mechanism of action in inflammatory bowel disease patients.. viii.

(9) CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. INTRODUCCIÓN 1.1.1. LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un grupo heterogéneo de enfermedades en las que ocurre una inflamación crónica del tracto digestivo. La EII se clasifica, principalmente, en la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), las cuales se diferencian por la zona del aparato digestivo que resulta afectada. La inflamación en la EC se puede observar en cualquier parte del tracto gastrointestinal, desde la boca hasta el ano, aunque normalmente suele afectar al íleon y colon proximal, mientras que en la CU las lesiones solo aparecen en el colon. Otra diferencia entre ambas patologías radica en las características de las lesiones, siendo de tipo transmural y con la aparición de granulomas en la EC, pero localizándose en la superficie de la mucosa en el caso de la CU (Chapel et al., 2014; Ananthakrishnan et al., 2017). Al igual que otras enfermedades autoinmunes, la EII alterna periodos de remisión con periodos de recurrencia o brotes (Gassull et al., 2007). La EII afecta considerablemente a la calidad de vida de los pacientes. Los síntomas más representativos incluyen dolor abdominal, diarrea, sangrado rectal, fiebre, cansancio, anemia, pérdida de peso y malnutrición ocasionada por la incapacidad del organismo para absorber los nutrientes adecuadamente (Rich et al., 2018). También pueden aparecer manifestaciones extraintestinales que suelen afectar a articulaciones, hígado, piel y ojos (Gassull et al., 2007). Este grupo de enfermedades afecta a un gran número de individuos. Se estima que 1,5 y 2 millones de personas padecen EII en América y Europa, respectivamente. Aunque su aparición se suele asociar a países occidentalizados e industrializados, en los últimos años la prevalencia está aumentando en Sudamérica, Asia y África (Ng et al., 2017; M'koma, 2013). Por otra parte, el diagnóstico de esta enfermedad se suele realizar en adultos con 20-40 años (Ananthakrishnan et al., 2017), pero los últimos estudios indican un aumento de casos pediátricos (Malmborg y Hildebrand, 2016). La causa de esta enfermedad no se conoce por completo por el momento, pero se sospecha que puede ser debida a una combinación de factores ambientales, genéticos y microbianos junto a una desregulación del funcionamiento del sistema inmune (Ananthakrishnan et 1.

(10) al., 2017; Rich et al., 2018). En la EII ocurren defectos en el sistema inmune innato como cambios en la morfología del epitelio intestinal y una acumulación de especies reactivas, lo que se relaciona con una respuesta inmune alterada de la mucosa intestinal hacia la microbiota comensal. Asimismo, dentro de la inmunidad adaptativa, tradicionalmente se ha descrito en la EC una respuesta exacerbada mediada por linfocitos T helper 1 y 17 (Th1 y Th17), mientras que en la CU la respuesta inmune es de tipo Th2. En ambas enfermedades se acompaña de un aumento de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interferón gamma, entre otras citocinas proinflamatorias. También se produce un aumento intestinal de células T reguladoras, un descenso de inmunoglobulina (Ig) A y un aumento en la producción de IgG e IgM (Abbas et al., 2012; Ananthakrishnan et al., 2017). La EII supone un gran coste para el sistema sanitario debido a la alta frecuencia de consultas médicas y hospitalizaciones por brotes, así como por el elevado coste de las pruebas diagnósticas y de los tratamientos empleados. Actualmente la EII no tiene cura, pero los tratamientos disponibles permiten controlar la enfermedad, aminorar la gravedad de sus síntomas y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Los tratamientos actuales incluyen estrategias nutricionales, quirúrgicas y farmacológicas (Gomollón, 2014). Como se muestra en la Figura 1, los tratamientos farmacológicos más usados para el manejo de la EII incluyen las siguientes opciones: i) 5-aminosalicilatos, fármacos antiinflamatorios de acción localizada en la mucosa intestinal que, sin embargo, pueden producir efectos secundarios en el 30-50% de los pacientes (Casellas y Oltra, 2016; Ananthakrishnan et al., 2017); ii) corticosteroides, fármacos anti-inflamatorios que inducen la remisión de la EII pero no sirven para el mantenimiento de ésta, ya que presentan diversos problemas asociados a su uso como la corticodependencia, la falta de eficacia o corticorresistencia y sus numerosos efectos adversos (Casellas y Oltra, 2016); iii) inmunomoduladores, usados cuando fracasa el tratamiento con corticosteroides, son agentes que modifican las respuestas inmunes sistémicas por diferentes mecanismos de acción, pero que pueden aumentar el riesgo de infecciones oportunistas y neoplasias (Ananthakrishnan et al., 2017); iv) antibióticos, se usan junto a otros tratamientos aunque su eficacia no ha sido plenamente demostrada (Ananthakrishnan et al., 2017); y v) fármacos biológicos, que han supuesto una revolución no solo en el tratamiento de la EII, sino también en otras enfermedades inflamatorias derivadas de alteraciones en el correcto. 2.

(11) Figura 1. Tratamiento farmacológico actual de la EII. (Adaptado de Casellas y Oltra, 2016).. funcionamiento del sistema inmune, como la artritis reumatoide o la psoriasis (Boehncke y Radeke, 2007). 1.1.2. LOS FÁRMACOS BIOLÓGICOS Los fármacos biológicos son proteínas o moléculas derivadas de las mismas que se producen por técnicas biotecnológicas y que imitan el mecanismo de acción de procesos que ocurren naturalmente en el organismo. Por lo tanto, los fármacos biológicos pueden modular las respuestas del sistema inmune (Boehncke y Radeke, 2007). Hasta hace poco, los tratamientos disponibles para la EII resultaban insuficientes. Sin embargo, la reciente aparición de los fármacos biológicos ha conseguido mejorar la inducción de la remisión en brotes graves, disminuir las intervenciones quirúrgicas y mejorar la calidad de vida de los pacientes. Una de las dianas a las que se dirigen los fármacos biológicos en la EII es el TNF-α. El TNF-α es una molécula efectora en varios procesos inflamatorios del organismo y una de las principales citocinas implicadas en la fisiopatogenia de la EII. Se han detectado altos niveles de TNF-α en el suero de estos pacientes, así como un alto número de células secretoras de TNF-α en la mucosa intestinal inflamada (Billmeier et al., 2016). Debido a ello, una terapia eficaz consiste en la administración de anticuerpos anti-TNF-α para conseguir la neutralización de esta citocina. Dentro de los fármacos anti-TNF-α, cabe destacar el uso de infliximab, adalimumab, inflectra, certolizumab pegol y golimumab para la EII. 3.

(12) Infliximab fue el primer anticuerpo anti-TNF-α aprobado para el tratamiento de la EII. Es un anticuerpo IgG1 monoclonal bivalente y quimérico (25% murino que constituye la región variable y 75% humano que forma la región constante), cuya administración es por vía intravenosa. Induce la remisión en la EC y la CU y permite un menor uso de corticosteroides y la cicatrización de la mucosa (Billmeier et al., 2016; Slevin y Egan, 2015). Al igual que infliximab, adalimumab induce la remisión y su mantenimiento en la EC y la CU. Adalimumab es un anticuerpo IgG1 monoclonal humano recombinante que se administra por vía subcutánea. (Billmeier et al., 2016; Slevin y Egan, 2015). Inflectra es un biosimilar de infliximab. Un biosimilar es un fármaco biológico similar en estructura y, por tanto, en eficacia a otro fármaco biológico ya aprobado por la Food and Drug Administration (Neurath, 2017). Certolizumab pegol y golimumab son fármacos anti-TNF-α usados con menor frecuencia. Certolizumab pegol es un anticuerpo humanizado carente de la región constante, aun no aprobado por la Agencia Europea de Medicamentos. Se administra por vía subcutánea (Billmeier et al., 2016). Golimumab es un anticuerpo monoclonal humano aprobado para el tratamiento de la CU que también se administra por vía subcutánea (Billmeier et al., 2016). Una terapia alternativa a la neutralización de citocinas, como TNF-α, es el bloqueo de la circulación de células del sistema inmune periférico hacia la mucosa intestinal inflamada. Esta migración celular se encuentra mediada por la interacción entre las integrinas de los linfocitos T y las moléculas de adhesión específicas de tejido localizadas en las células endoteliales de los vasos sanguíneos (Coskun et al., 2017). Por lo tanto, una de las dianas terapéuticas de estos fármacos biológicos son también las integrinas. Dos fármacos dirigidos a estas integrinas son vedolizumab y natalizumab. Vedolizumab es un anticuerpo IgG1 monoclonal humanizado anti-integrina α4β7 que induce la remisión en pacientes con CU y EC. Bloquea selectivamente la interacción entre la integrina α4β7 y la molécula de adhesión celular adresina de la mucosa-1 (MAdCAM-1) localizada en el intestino, lo que hace que tenga un buen perfil de seguridad (Coskun et al., 2017; Neurath, 2017). Por el contrario, natalizumab, un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado y recombinante anti-integrina α4, actúa bloqueando la interacción de las integrinas α4β1 y α4β7 con las moléculas de adhesión endoteliales denominadas molécula de adhesión vascular (VCAM-1) y MAdCAM-1, respectivamente. VCAM-1 no tiene una 4.

(13) expresión específica en el tejido intestinal, pues también se localiza en el sistema nervioso central, lo que hace que natalizumab pueda aumentar el riesgo de sufrir efectos secundarios muy graves en el sistema nervioso (Coskun et al., 2017). Debido a ello, natalizumab solo se usa en casos excepcionales. En la actualidad, se están desarrollando varios fármacos biológicos dirigidos a bloquear otras citocinas proinflamatorias y sus vías de señalización (Neurath, 2017). Un ejemplo sería ustekinumab, un anticuerpo anti-p40, que es una subunidad compartida por las interleucinas IL-12 e IL-23 que inducen respuestas Th1 y Th17, respectivamente (Coskun et al., 2017). A pesar de que los fármacos anti-TNF-α son hoy en día considerados como una de las terapias más eficaces para la EII, solo un tercio de los pacientes experimenta remisión a largo plazo; otro tercio, a pesar de tener una mejoría al inicio del tratamiento, pierde la capacidad del mantenimiento de la remisión a medio-largo plazo; mientras que el otro tercio no responde al tratamiento desde el inicio (Chaparro et al., 2012a; Neurath, 2017). Se ha observado que el uso concomitante de inmunomoduladores reduce de forma significativa la pérdida de respuesta al anti-TNF-α infliximab, mientras que el tabaco la aumenta. En el caso de adalimumab, la pérdida de respuesta es mayor en aquellos pacientes que no han tomado anti-TNF-α previamente o que presentan manifestaciones extraintestinales (Chaparro et al., 2011; Chaparro et al., 2012b). Ante la falta o pérdida de respuesta a los anti-TNF-α, los clínicos optan por un incremento en la dosis administrada, por el cambio a otro agente anti-TNF-α, o por el cambio a otro fármaco biológico que tenga otra diana alternativa al TNF-α (Chaparro et al., 2011). Asimismo, se han observado diferencias en la respuesta inducida por fármacos dirigidos a una misma diana terapéutica, lo que ha llevado a pensar que su efecto no está basado únicamente en el bloqueo de su diana específica. Como se muestra en la Tabla 1, diversos estudios han demostrado que los anti-TNF-α, además del bloqueo de citocinas proinflamatorias, pueden actuar a otros niveles como en la barrera intestinal, la apoptosis celular, inducir efectos inmunomoduladores o actuar sobre la migración de células sanguíneas a la mucosa intestinal.. 5.

(14) Tabla 1. Mecanismos de acción de los principales fármacos anti-TNF-α en la EII.. FÁRMACO. TIPO DE ESTUDIO. MUESTRA#. MECANISMO DE ACCIÓN. BIBLIOGRAFÍA. Células Jurkat. Inducción de la apoptosis en células Jurkat T CD3/CD28 activas. Células Jurkat. Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente de complemento. Ueda et al. (2013). Reducción del número de Mo circulantes. Slevin et al. (2016). In vitro Mo de sangre periférica (VS y EC). ten Hove et al. (2002). +. Ex vivo. LPMCs (VS, CU, EC) Fibroblastos de intestino (VS, EC) Íleon terminal y colon (VS, EC) Íleon terminal*. Infliximab. In vivo. Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2 cocultivados con macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII Reducción de la producción y migración del factor de angiogénesis VEGF-A Inducción de la producción de IL-22 por parte de linfocitos T CD4+ Inhibición de la disminución de uniones interepiteliales (ocludinas, claudina-2) inducida por TNF-α entre los enterocitos ileales. LPMCs (VS, EC). Inducción de la apoptosis de linfocitos T. LPMCs (VS, EC). Inducción de la apoptosis de linfocitos T CD3+ activos. Células epiteliales intestinales*. Reducción de la apoptosis, disminuyendo a su vez la expresión del marcador Fas Reducción de los niveles de proteína C reactiva en pacientes respondedores y no respondedores a infliximab Aumento de la circulación de células T reguladoras CD4+ CD25+Foxp3+ y CD4+ CD25-Foxp3+, y menor expresión de Foxp3 en la mucosa intestinal Inducción de la expresión de macrófagos regulatorios (CD206+/CD68+) solo en pacientes en los que se da cicatrización de la mucosa. LPMCs (VS, EC) Sangre periférica y colon (VS, CU, EC) PBMCs (VS, CU, EC) Colon transversal y recto (VS, EC). Inhibición de la producción de GM-CSF. Atreya et al. (2011) Rutella et al. (2011) Fang et al. (2018) Fries et al. (2008) Van den Brande et al. (2007) ten Hove et al. (2002) Marini et al. (2003) Van den Brande et al. (2007) Li et al. (2010). Vos et al. (2012) Agnholt et al. (2004). +. Colon (EC). Reducción de células endoteliales CD31 relacionadas con el nivel de angiogénesis. 6. Eder et al. (2016).

(15) Colon (VS, CU, EC) PBMCs (VS, EC) PBMCs (VS, EC) LPMCs* y suero* Colon proximal (CU, EC). Adalimumab. Golimumab Certolizumab pegol. In vitro. Células Jurkat. Ex vivo. LPMCs (VS, CU, EC). In vivo. Colon (EC). In vitro. Células Jurkat. In vitro. Células Jurkat. Ex vivo. LPMCs (VS, CU, EC). Reducción del porcentaje de neutrófilos CD66b+ y disminución de la producción de IL-6 e IL-8 Normalización de la función de los canales de calcio en linfocitos Th2 en pacientes pediátricos Normalización de la función de los canales de potasio en linfocitos T CD8+ en pacientes pediátricos Reducción de la expresión del factor inflamatorio alográfico Aumento de la expresión de β-catenina en células caliciformes y activación de p38 en células epiteliales Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente de complemento Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2+ cocultivados con macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII Reducción de células endoteliales CD31+ relacionadas con el nivel de angiogénesis Inducción de citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente de complemento Inducción de muerte celular no apoptótica Inducción de la apoptosis de linfocitos T TNFR2+ cocultivados con macrófagos CD14+ que expresan mTNF en pacientes con EII. Zhang et al. (2018) Orbán et al. (2016) Orbán et al. (2017) Román et al. (2017) Román et al. (2017) Ueda et al. (2013) Atreya et al. (2011) Eder et al. (2016) Ueda et al. (2013) Ueda et al. (2013) Atreya et al. (2011). #. Todas las muestras son de origen humano, a excepción de aquellos estudios que se indican con (*): modelo murino (Mus musculus). Entre paréntesis se indica si las muestras humanas proceden de voluntarios sanos (VS) o de pacientes con enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU). EII: enfermedad inflamatoria intestinal; IL: interleucina; LPMC: lamina propria mononuclear cells o células mononucleares de lámina propia; Mo: monocitos; PBMCs: peripheral blood mononuclear cells o células mononucleares de sangre periférica; TNF-α: tumor necrosis factor α o factor de necrosis tumoral α. 7.

(16) Por ejemplo, Román et al. (2017) demostraron que infliximab remodela la arquitectura de la barrera intestinal que se encuentra alterada en pacientes con EII, ya que el fármaco reduce la expresión de biomarcadores proinflamatorios mientras que aumenta la expresión de los factores de remodelamiento β-catenina y p38. Por otro lado, Fries et al. (2008) descubrieron que infliximab también recupera la estructura de las uniones interepiteliales de enterocitos ileales de ratón alterada por la citocina TNF-α, favoreciendo, por tanto, la integridad de la barrera intestinal. Asimismo, los fármacos anti-TNF-α (entre ellos infliximab, adalimumab y certolizumab pegol) pueden estimular la apoptosis de linfocitos T en modelos in vitro, ex vivo e in vivo de la mucosa intestinal (Atreya et al., 2011; ten Hove et al., 2002). En la misma línea, se observó que infliximab, adalimumab y golimumab pueden inducir in vitro la citotoxicidad mediada por anticuerpos y dependiente de complemento en células que expresan TNF-α en su membrana (Ueda et al., 2013). Respecto a su efecto inmunomodulador, Fang et al. (2018) determinaron que infliximab estimula la producción de la citocina anti-inflamatoria IL-22, mientras que Li et al. (2010) observaron que este fármaco también puede inducir el aumento de poblaciones T reguladoras en sangre periférica. De la misma manera, se ha observado un mayor número de macrófagos reguladores periféricos en pacientes tras el tratamiento con infliximab (Vos et al., 2012). 1.1.3.. ANTECEDENTES. DEL. GRUPO. DE. INVESTIGACIÓN,. PLANTEAMIENTO DE LA HIPÓTESIS Y APORTACIÓN DEL TFG El sistema inmune juega un papel determinante en la fisiopatogenia de la EII y es, por tanto, un campo esencial para el estudio y la identificación de posibles dianas terapéuticas. Dentro del sistema inmune, las células presentadoras de antígenos (APCs) son poblaciones celulares clave para el mantenimiento de la homeostasis intestinal. Las APCs son un grupo de células encargado de secretar citocinas y presentar moléculas coestimuladoras en su superficie con el fin de conseguir una respuesta T efectora. Entre las APCs se incluyen las células dendríticas (DC), los linfocitos B (LB), macrófagos, células del endotelio vascular y varias células epiteliales y mesenquimales (Abbas et al., 2012). Las DC son las APCs por excelencia, siendo la mayoría de linaje mieloide hematopoyético (las células dendríticas mieloides (mDC)), aunque existe una subpoblación plasmacitoide (las células dendríticas plasmacitoides (pDC)) que responde 8.

(17) ante las infecciones virales. Por otra parte, los macrófagos y monocitos (Mo) son fagocitos mononucleares. Los Mo circulan por la sangre, para después migrar a los tejidos, donde se diferencian a macrófagos. Por último, los LB participan en la respuesta inmune humoral mediante la secreción de anticuerpos y la internalización y presentación de antígenos proteicos a los linfocitos Th (Abbas et al., 2012). El grupo de investigación de acogida ha demostrado recientemente que la mucosa de pacientes con EII tiene un mayor número de macrófagos CD11chigh, con características similares a los Mo circulatorios pro-inflamatorios, mostrando a su vez esta mucosa inflamada una mayor capacidad para reclutar Mo CD14+ circulantes de forma dependiente del receptor 2 de quimiocinas (CCR2) (Bernardo et al., 2018). También han demostrado que las DC CD103+SIRPα+ de fenotipo tolerogénico están disminuidas en el colon inflamado de pacientes con CU, pero no con EC (Bernardo et al., 2019). Ante la hipótesis de que los fármacos biológicos empleados en la EII pueden actuar sobre la migración de células circulantes hacia la mucosa intestinal, este proyecto pretende estudiar la capacidad de migración ex vivo de LB, Mo, pDC y mDC de sangre periférica, así como evaluar el efecto modulador de fármacos biológicos con distintas dianas terapéuticas, anti-TNF-α (infliximab, adalimumab e inflectra) y anti-integrina α4β7 (vedolizumab), sobre el perfil de quimiocinas relacionadas con la migración intestinal en controles sanos. Esta parte del proyecto resulta esencial para comparar con los efectos que se encuentren en pacientes con EII, cuya realización está siendo actualmente evaluada por el grupo de acogida. El conocimiento en mayor profundidad de los mecanismos patogénicos implicados en la EII, así como el efecto que tienen los fármacos biológicos sobre ellos, contribuirá a la comprensión de la heterogeneidad de esta enfermedad, así como al desarrollo y aplicación de actuales y futuras estrategias terapéuticas.. 9.

(18) 1.2. OBJETIVOS El principal objetivo de este proyecto consiste en evaluar el efecto modulador ex vivo de fármacos biológicos con distintas dianas terapéuticas –infliximab, inflectra y adalimumab (anti-TNF-α) y vedolizumab (anti-integrina α4β7)– sobre la capacidad de migración de subpoblaciones circulantes de APCs en voluntarios sanos. Para cumplir este objetivo se plantearon los siguientes objetivos parciales:. I.. Caracterización fenotípica de los marcadores de migración celular beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 de APCs en condiciones basales y tras cultivo con dichos fármacos biológicos.. II.. Estudio funcional del reclutamiento de APCs inducido por los quimioatrayentes intestinales CCL2, CCL25 y MAdCAM1.. III.. Análisis del efecto de los fármacos biológicos sobre la capacidad de migración que presentan las APCs de forma espontánea e inducida por dichos quimioatrayentes intestinales.. 10.

(19) CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. ASPECTOS ÉTICOS Y TOMA DE MUESTRAS HUMANAS El procedimiento para la obtención de sangre y biopsias intestinales fue aprobado por el Comité de Ética de la Investigación con medicamentos del Hospital Universitario de La Princesa. El código del protocolo es GIS-INH-2015. Las muestras de este estudio se obtuvieron de voluntarios sanos que acudieron a realizarse una colonoscopia para el despistaje, seguimiento y/o diagnóstico de una alteración intestinal. Se reclutaron aquellos sujetos que cumplían los criterios de inclusión/exclusión del estudio y que no padecían una enfermedad crónica avanzada o cualquier patología con importancia clínica. Previamente a la realización de la colonoscopia, se informó a los voluntarios sobre el estudio, el procedimiento de obtención de las muestras y sus posibles riesgos. Tanto el paciente como el clínico a cargo de la colonoscopia firmaron un consentimiento para la recolección y manejo de las muestras. De cada sujeto se obtuvieron, aprovechando la vía de sedación, 20 mL de sangre en dos tubos de heparina - litio (Vacuette, Greiner Bio-One) y 10 mL de sangre en un tubo de gelosa (SST II Advance, BD Vacutainer). Además, durante la colonoscopia, se recogieron 4 biopsias dobles de colon izquierdo, colon derecho e íleon terminal, que se transfirieron a viales estériles con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640, SigmaAldrich). Estos viales se almacenaron en hielo hasta su inmediato procesamiento en el laboratorio. 2.2. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS En este estudio se obtuvieron muestras de un total de 11 voluntarios sanos, distribuidos en 3 varones con una edad comprendida entre los 51 y los 63 años y 8 mujeres de entre 44 y 69 años. La edad media de todos los voluntarios del estudio es de 58 años. 2.3. PROTOCOLO EXPERIMENTAL A. SANGRE Desde la sangre obtenida en los tubos de heparina – litio, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) usando el medio de gradiente de densidad Ficoll-PaqueTM Plus (GE Healthcare). Una vez obtenida la suspensión celular, las PBMCs se lavaron dos veces con RPMI-1640, y se cuantificó su concentración con el analizador de hematología Nihon Kohden (Celltac α). 11.

(20) A continuación, se sembró 1 × 106 de PBMCs en tubos de citometría (Falcon, Corning) y las células se cultivaron ex vivo durante 18 h a 37 ºC en ausencia (condición basal) y presencia de cada uno de los fármacos biológicos objeto del estudio. Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: •. Condición basal: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo [RPMI-1640, 10% suero fetal bovino, 1% L-glutamina, 1% solución antibiótica penicilina-estreptomicina y 0,1% gentamicina (Sigma-Aldrich)].. •. Condición infliximab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo suplementado con infliximab (10 µg/mL).. •. Condición inflectra: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo suplementado con inflectra (10 µg/mL).. •. Condición adalimumab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo suplementado con adalimumab (10 µg/mL).. •. Condición vedolizumab: Las PBMCs fueron incubadas con medio de cultivo completo suplementado con vedolizumab (100 µg/mL).. Los fármacos de este proyecto fueron donados por las compañías farmacéuticas respectivas (MSD, Hospira, AbbVie y Takeda). Además, 1 × 106 de PBMCs se añadieron a tubos de citometría para realizar una tinción extracelular a tiempo cero con paneles de anticuerpos a los que llamaremos “FACSCanto” (las células teñidas con este panel se analizaron con el citómetro BD FACSCANTOTM II) y “Fortessa” (las células teñidas con este panel se analizaron con el citómetro BD LSRFortessaTM, servicio prestado por el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares). El protocolo de tinción para citometría de flujo se detalla en el apartado 2.4. Una vez transcurridas las 18 h de cultivo en las distintas condiciones experimentales, las PBMCs se centrifugaron (1500 rpm, 5 minutos, 4 ºC) y se recogió el sobrenadante de cultivo en criotubos que se almacenaron a -80 ºC para futuros estudios “ómicos” del grupo. Las células obtenidas tras la centrifugación se utilizaron para dos abordajes experimentales: a) Tinción Fortessa: Las PBMCs tras cultivo fueron teñidas (apartado 2.4.) para ser analizadas por el citómetro BD LSRFortessaTM.. 12.

(21) b) Tinción FACSCanto: Las PBMCs tras cultivo se resuspendieron en medio de cultivo completo y se sembraron (200.000 células) en la cámara apical (superior) de una placa de cultivo de 96 pocillos con insertos de tipo transwell (Corning HTS Transwell). En la cámara basal (inferior) de la placa se añadió medio de cultivo completo (como condición basal) o los siguientes quimioatrayentes: ligando de quimiocinas 2 (CCL2) (100 ng/mL) (R&D Systems), ligando de quimiocinas 25 (CCL25) (500 ng/mL) (R&D Systems), y MAdCAM-1 (1000 ng/mL) (R&D Systems). La placa de cultivo transwell se incubó a 37 ºC durante 4 h. A continuación, se recogió el medio de la cámara basal (inferior) para obtener las PBMCs que migraron desde la cámara apical (superior) a través del inserto. Estas células se tiñeron con el panel “FACSCanto” (apartado 2.4.) y se analizaron en el citómetro BD FACSCANTOTM II. Por otro lado, la sangre extraída en el tubo de gelosa se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos. El suero (sobrenadante) se almacenó en crioviales y se preservó a -80 ºC para futuros estudios “ómicos” del grupo. B. INTESTINO Las biopsias de cada región intestinal (colon izquierdo, colon derecho e íleon terminal) se lavaron de forma separada con medio Hanks’ Balanced Salt Solution (Gibco). A continuación, se incubó una biopsia por pocillo en placas de 24 pocillos (Thermo Scientific) durante 18 h a 37 ºC. Las biopsias de cada región intestinal se incubaron en 0,5 mL siguiendo las mismas condiciones de cultivo a las descritas en el caso de las PBMCs (basal, infliximab, inflectra, adalimumab y vedolizumab). Tras el cultivo, se recogieron los sobrenadantes de los pocillos y se centrifugaron (1500 rpm, 5 minutos, 4 ºC). El sobrenadante de cultivo libre de células se preservó en criotubos a -80 ºC. El precipitado celular se resuspendió con RNAlaterTM (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) y se llevó a un criotubo junto con la biopsia del pocillo correspondiente. Ambos criotubos se preservaron a -80 ºC para futuros estudios “ómicos” del grupo. 2.4. TINCIÓN EXTRACELULAR DE PBMCs Después de los distintos protocolos experimentales indicados anteriormente con las PBMCs, para realizar su tinción extracelular, las células se lavaron en 1 mL de tampón fosfato para citometría de flujo (FACS-buffer) [Tampón fosfato salino, 2% suero fetal bovino, 0,01% azida de sodio y 0,04% EDTA (Sigma-Aldrich)] y se centrifugaron (1500 13.

(22) rpm, 5 minutos, 4 ºC). Tras el lavado, las células fueron resuspendidas en 100 μL de FACS-buffer y 20 μL de suero fetal bovino para bloquear las uniones inespecíficas. A continuación, las células se tiñeron (20 minutos, 4 ºC, en oscuridad) con los anticuerpos específicos de superficie de los paneles “FACSCanto” y “Fortessa” que se detallan en el Apéndice A. Tras la tinción, las células se lavaron (centrifugación 5 minutos, 1500 rpm, 4 ºC) y se fijaron (10 minutos, 4 ºC, en oscuridad) con 250 µL de paraformaldehído 2% (Santa Cruz Biotechnology). Finalmente, las células se volvieron a lavar (centrifugación 5 minutos, 1500 rpm, 4 ºC), se resuspendieron en 250 µL de FACS buffer y se mantuvieron en refrigeración hasta su adquisición. Así, las células teñidas con el panel “FACSCanto” se analizaron con el citómetro de flujo BD FACSCANTOTM II, y las células teñidas con el panel “Fortessa” se analizaron con el citómetro de flujo BD LSRFortessaTM. En el Apéndice B se muestra un ejemplo de la estrategia de identificación celular empleada para el análisis de citometría. Las PBMCs se identificaron dentro de las células sencillas (no dobletes) y viables (> 95% de viabilidad). Dentro de las PBMCs, las distintas subpoblaciones de APCs (LB, Mo, pDC y mDC) se identificaron en base a los marcadores HLA-DR, CD19, CD14, CD123, CD11c, CD141 y CD1c. El análisis de los datos de citometría se llevó a cabo con el software FlowJo V10 (FlowJo LCC, Ashland, Oregon, USA). 2.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Las comparaciones se realizaron mediante análisis t-test para muestras pareadas o no pareadas según se indique en el pie de figura. En todos los casos se consideró una diferencia significativa (*) un p-valor (p) inferior a 0,05; (**) p < 0,01; (***) p < 0,001 y (****) p < 0,0001.. 14.

(23) CAPÍTULO 3. RESULTADOS 3.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LAS APCs EN BASE A MARCADORES DE MIGRACIÓN El análisis del perfil fenotípico de las APCs según los niveles de expresión de beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en estado basal y tras cultivo se muestra en la Figura 2. Se observó un descenso significativo en la expresión del marcador beta7 en todas las subpoblaciones de APCs tras el cultivo, a excepción de los Mo. No obstante, estas células mostraron también una notable tendencia en la reducción de este marcador (p = 0,1103). De una forma similar, el marcador de migración CCR2 tendió a disminuir sus niveles tras cultivo en todas las subpoblaciones de APCs siendo este descenso estadísticamente significativo en el caso de los Mo, pDC y CD1c mDC. En cambio, la expresión de los marcadores CCR5 y CCR6 no se vio modificada notablemente durante el cultivo o bien experimentó un aumento. Este aumento fue significativo en el caso de los LB y las CD141 mDC para CCR5, y de los Mo y CD1c mDC para CCR6. Sin embargo, el marcador CCR9 tuvo un bajo nivel de expresión en todas las poblaciones celulares y no se observaron diferencias significativas tras el cultivo (Figura 2). Una vez caracterizado el perfil fenotípico de las APCs en estado basal y tras cultivo, se evaluó el efecto modulador de los fármacos biológicos sobre dichos marcadores de migración. Como se muestra en la figura 3, cabe destacar que el cultivo ex vivo con el fármaco vedolizumab disminuyó notablemente la expresión de beta7 en todas las subpoblaciones celulares. Este descenso fue estadísticamente significativo en LB (p < 0,0001), pDC (p < 0,01) y CD1c mDC (p < 0,05), pero no en Mo (cultivo: 1,055 ± 0,466; vedolizumab: 0,211 ± 0,075; p = 0,0766) y CD141 mDC (cultivo: 6,680 ± 3,189; vedolizumab: 0,441 ± 0,279; p = 0,0620). Sin embargo, tras el cultivo con los fármacos anti-TNF-α los niveles celulares de beta7 se vieron aumentados generalmente, siendo este aumento significativo en el caso de los Mo tratados con los anti-TNF-α inflectra (p < 0,05) y adalimumab (p < 0,05), pero no con infliximab (p = 0,1131) debido a la variabilidad observada. Con respecto a la expresión del resto de marcadores de migración, los niveles de CCR2, CCR5 y CCR6 se mantuvieron constantes tras el cultivo con todos los fármacos, con la excepción de una leve disminución de CCR2 en LB inducida por adalimumab, así como un moderado aumento de este marcador en Mo inducido por inflectra y adalimumab y del. 15.

(24) CCR2. beta7. 20. 60. 40. 20. 40. iv lt C. u. B. o. l. iv. a s. lt. a. C. u. B. lt u C. % CCR9. o. l. iv lt u. C. C. u. B. lt. a. s. iv. a. o. l a s a. % CCR9. o. l. iv lt u. C. C. u. B. lt. a. s. iv. a. o. l a s a B. % CCR9. 20. 60. 40. 20. o iv. a s. u. lt. a. C. u. lt. a. s. iv. a. o. l. l. 0. B. % CCR6. 40. iv lt u C. o. l a a. s. iv lt iv. s a B. B. % CCR6 iv lt u. 60. o. l a s a B. 5. 80. 80. 0. iv lt u C. o. l a. iv iv lt u C. % CCR5. 50. o. l a s a. 10. 0. C. C. % CCR2. 50. 100. *. 0. B. iv lt u. 5. 15. *. o. l B. u. B. lt. a. s. iv. a. o. l a a. s. iv lt u C. 50. 10. 0. 0. 100. o. l a s. C. 50. 150. 0. 0. 20. o. l a s a B. % CCR5. % CCR2 o. l a s a 20. 40. 100. 0. 100. 40. a. % CCR6. % CCR5 iv. lt u C. C. 50. 150. ***. 60. 150. 100. 0. 0. B. u C. C. o. l. u. B. lt. a. s. iv. a. o. l a s a B 50. 10. 15. 80. 0. 150. **. 100. B. 50. 0. 150. ****. 60. lt. a B. lt u. B. % CCR2. 50. 20. 0. 100. 100. 0. 100. 20. o. l a s. o. s a. lt u C. 20. 150. % b e ta 7. iv. a. iv. l. o. l a s a B. % b e ta 7. ***. 100. 40. 40. 0. 150. 150. ****. % CCR9. 50. 70. **. 60. C. 80. 0. 60. u C. C. % CCR6. 5. 90. 30. 80. 100. B. 10. 0. % b e ta 7. 0 .5. o. l a s a B. lt u. B. % CCR5. % CCR2. 15. 80. CD141 mDC. 1 .0. 0 .0. o. s a. lt u C. C. iv. a. iv. l. o. l a. u. B. lt. a. iv. s. o. l a s a B. 100. 60. CD1c mDC. 80. 1 .5. 20. 150. **. 20. 0. pDC. 90. 70. 110. % b e ta 7. 60. 2 .0. 0. 25. Mo. 100. 80. 0. 0. CCR9 2 .5. % CCR9. 40. **. % CCR6. 60. % CCR5. ***. CCR6 110. 100. % CCR2. % b e ta 7. LB. CCR5. 80. 80. Figura 2. Caracterización fenotípica de las APCs en base a marcadores de migración. Se analizó la expresión de los marcadores de migración beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) a tiempo cero y tras cultivo en medio de cultivo completo durante 18h (n=11). Los datos se analizaron estadísticamente con un t-test pareado y se consideraron diferencias significativas: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.. 16.

(25) 40. % CCR9. 50. c. O. A. D. D V. E. A. X. e. IF. u C. V. fl. o iv. O D E. lt. c. A D A. X. e. IF. In. u C. 10. 40. 100. 60. fl. o iv. O D E. V. C 80. 0 .5. 0 .0. lt. c. A D A. X. u. V. e. IF. o iv. O D E. lt. c. D A. 0. 1 .0. 8. % CCR9. 1. 20. % CCR6. 2. 40. 150. *. % CCR5. *. % CCR2. % b e ta 7. A. X. e. IF. In. u. E V. fl. o iv. O D. D A. lt. c. A. X. e In. IF. fl. iv lt u C. C. **. 100. *. 3. 60. 0. 4. Mo. 20. 0. o. 0. 40. 1 .5. 80. % CCR6. 10. 60. fl. 20. 20. CCR9. 100. In. ****. % CCR5. 40. CCR6. 80. *. % CCR2. % b e ta 7. LB. CCR5. 30. In. CCR2. beta7 60. 30. 20. 10. 6. 4. 2. 20. 0. 0. 0. 0. V. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. In. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c. X. e. IF. In. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c e. X. u. In. IF. iv lt. fl. o. V. C. E. A. D. D. O. A. c. X. e. IF. C. u. In. fl. o iv lt. V. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. fl. C. u. In. lt. iv. o. 0. % CCR9. 20. % CCR9. V. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. In. V. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. 10. D E V. A. D. O. A. c e. X IF. C. u. fl. o iv lt. D E V. A. D. O. A. c. X. e. IF. iv. fl In. o. 0. lt C. u. E V. In. 20. In. % CCR6. *. 40. D. D A. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c. X. e. IF. In. fl. o iv lt. V. C. 30. * 60. O. A. c e. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c. X. e. IF. In. % CCR9. % CCR6. 1. 0. u. E. A. D. D. O. A. c e. C o iv C. u. 2. 0. lt. D E V. A. D. O. A. c. X. e. IF. fl In. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. In X IF. In. fl. o iv u. E. lt. D. D A. V. % CCR5. % CCR2. o iv u C. 20. 0. lt. D E V. A. D. O. A. c e. X IF. fl In. o iv. 40. 3. 80. 50. 0. 1. 0. 100. 20. 2. 4. 60. 150. 40. 0. lt. fl. o 50. O. A. c. X. e. IF. In. fl. o iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. In. fl. o iv lt u 5. 3. 0. 80. 0. 60. 10. u. iv lt C. V. u. E. A. D. D. O. A. c. X. e. IF. 20. 0. C. % b e ta 7. In. 40. 15. 20. 100. 100. X. *. 10. 60. 4. 0. 150. % CCR5. 20. % CCR2. % b e ta 7. 30. C. fl. o iv lt C. V. 80. 40. 0. CD141 mDC. 20. 5. 40. 0. u. E. A. D. D. O. A. c e. X IF. In. fl. o iv lt u C 50. CD1c mDC. 40. 0. 0. % CCR6. 20. 60. IF. 5. 40. 60. 80. fl. **. 100. 60. In. 10. % CCR2. % b e ta 7. pDC. 15. % CCR5. 80. 20. Figura 3. Evaluación del efecto de los fármacos biológicos sobre el fenotipo de las APCs en base a marcadores de migración. Se analizó la expresión de los marcadores de migración beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9 en linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC), comparando su expresión tras el cultivo durante 18h en medio de cultivo completo con respecto al cultivo con los fármacos infliximab (IFX), inflectra (Inflec), adalimumab (ADA) y vedolizumab (VEDO), respectivamente (n=11). Los datos se analizaron estadísticamente con un t-test pareado y se representa la media ± el error estándar de la media: *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001.. 17.

(26) marcador CCR6 en CD141 mDC tras el tratamiento con infliximab y vedolizumab. Como observamos en el anterior caso (Figura 2), los niveles de CCR9 no fueron muy elevados y presentaron una alta variabilidad, aunque merece la pena mencionar que el cultivo con los tres fármacos anti-TNF-α tendió a reducir su expresión, en mayor medida que lo observado para vedolizumab (Figura 3). 3.2. ESTUDIO FUNCIONAL DE LA CAPACIDAD DE MIGRACIÓN DE LAS APCs El estudio de la capacidad de migración de las APCs se realizó mediante un modelo in vitro basado en una placa de cultivo de tipo transwell. En este estudio se analizaron, además de las subpoblaciones de LB, Mo, pDC, CD1c mDC y CD141 mDC, las células totales y las mDC totales (total mDC) (Apéndice B). En la figura 4 se presentan los porcentajes de migración de las APCs inducidos por los ligandos quimioatrayentes CCL2, CCL25 y MAdCAM1. Se vio un aumento significativo en la migración de Mo (125,0 ± 12,4 %), pDC (334,8 ± 49,3 %) y CD1c mDC (153,9 ± 16,6 %) hacia el medio suplementado con CCL2, con respecto al basal (100 %). Sin embargo, este ligando indujo una disminución en la capacidad de migración de las CD141 (58,7 ± 3,6 %). Por otro lado, ninguna subpoblación de APCs se vio afectada en su migración espontánea por los ligandos quimioatrayentes CCL25 y MAdCAM1 (Figura 4). LB. 150. 100. 50. M A. L M. A. d. C. C. C. C. 1. 5 2. 2 L. 1 M A C. **** 100. 1. 5. A. L. M. 2. 2 C. M. A. d. C. C. C. M. A. d. C. C. C. A. L. M. L. 1. 5 2. 2 L C C. A C d A M. 200. 0. 1 M. 2 L C C. 5 A M. 200. 0. 5. 0. C D 141 m D C. C. 50. 200. 300. % m ig r a c ió n. 100. 2. d. C. A M. 150. L. 2. 2 C. A. C. M. L. 1. 5 d. C. % m ig r a c ió n. 200. ***. 400. 0. C D 1c m D C. **. 250. C. 50. C. C. C. C. L. L. 2. 2. 1 M A C A M. to ta l m D C 250. C. 100. 0. d. C. C. C. C. L. L. 2. 2. 5. 0. % m ig r a c ió n. 50. *. 150. L. 50. 100. pDC 600. C. 100. 200. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 150. 0. % m ig r a c ió n. Mo. 150. C. T o ta l 200. Figura 4. Influencia de ligandos quimioatrayentes sobre la migración de las APCs. Se representa el porcentaje de migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) inducido por el ligando de quimiocinas 2 (CCL2), ligando de quimiocinas 25 (CCL25) y la molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1 (MAdCAM1), con respecto a la migración basal espontanea representada por una línea discontinua (100%) en un modelo in vitro de cultivo en placa transwell. Los datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de valores con la media: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.. 18.

(27) Se analizó también el efecto de los distintos fármacos biológicos sobre la migración espontanea de las APCs hacia medio de cultivo completo libre de quimioatrayentes (Figura 5). Aunque se observaron algunas diferencias, el porcentaje de migración de todas las poblaciones celulares fue similar al de las células que habían sido cultivadas en medio de cultivo completo libre de fármacos y no se encontraron efectos estadísticamente significativos. LB. O D E. e. A. c A. D V. V. In. E. D. D. O. A. c. 100. 50. V. E. D. D. O. A. c. X IF. V. In. E. D. D. O. A. c e fl. A. X IF. D E V. 150. 0. In. O. A D. e fl. A. X IF. In. e In. 100. 0. c. 0. 200. 200. e. 50. 300. A. 100. 250. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 150. 100. C D 141 m D C. 400. 200. A. X IF. O D V. C D 1c m D C. 250. 200. 0. E. e. D A. In. fl. IF. D V. to ta l m D C. A. c. 0. X. O. A E. e. D A. fl In. IF. X. c. 0. 100. 300. X. 50. 200. fl. 100. % m ig r a c ió n. 150. fl. 50. 200. 400. fl. 100. pDC. 300. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 150. 0. % m ig r a c ió n. Mo. 250. IF. T o ta l 200. Figura 5. Influencia de fármacos biológicos sobre la migración de las APCs. Se representa el porcentaje de migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) tras cultivo durante 18h con los fármacos infliximab (IFX), inflectra (Inflec), adalimumab (ADA) y vedolizumab (VEDO), con respecto a la condición control cultivada en ausencia de fármacos y representada con una línea discontinua (100%) en un modelo in vitro de cultivo en placa transwell. Los datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de valores con la media.. Por último, se evaluó la capacidad de migración hacia los distintos quimioatrayentes de las APCs que habían sido cultivadas con los fármacos (Figura 6). Como se muestra en la Figura 6A, la migración de las pDC hacia CCL2 se redujo cuando estas células habían sido cultivadas con fármacos anti-TNF-α, siendo significativo en el caso de infliximab e inflectra, pero no para adalimumab (p = 0,0789). Sin embargo, considerando el recuento de las mDC totales, el cultivo con infliximab, inflectra y vedolizumab supuso un incremento estadísticamente significativo en su migración hacia CCL2; mientras que en el caso de la subpoblación CD141 de las mDC, todos los fármacos aumentaron su porcentaje de migración, aunque solo fue significativo en las que se habían cultivado con vedolizumab (174,6 ± 30,9 %). Cabe mencionar que también la migración hacia CCL2 de los Mo que habían sido cultivados con inflectra aumentó en un 138,0 ± 15,1 %.. 19.

(28) M IG R A C IÓ N - C C L 2 LB. O D. D. E V. V. In. E. A. c. X. D. IF. O. A. c. D. 200. 100. O. A. c e. D V. E. X. V. In. E. D. IF. O. A. c A. fl In. V. D. e. X IF. D. D. E. A. *. 300. 0. O. A. c e. X. fl In. A. In. 50. 0. IF. e. X IF. O. 100. M IG R A C IÓ N - C C L 2 5 LB. Mo. 100. O D E V. In. E V. A. c e. X IF. O. A. D. D. 100. D E V. In. O. A. c. X IF. O. A E. D. D V. V. In. A. fl. e. X. D E. A. In. IF. O. A D. e. X. fl. IF. c). 200. 0. c. 0. c. 0. 50. 300. e. 50. 150. fl. 100. A. In. C D 141 m D C 400. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 150. c. X. D E V. C D 1c m D C 200. 200. 100. 0. IF. O. A. c In. A. D. e fl. IF. D. X. O. A D. E. to ta l m D C 250. 200. 0. V. In. A. fl. IF. e. X. c. 0. D. 0. 100. 300. D. 50. % m ig r a c ió n. 100. 200. A. 50. 150. e. 100. 200. 400. fl. 150. pDC. 300. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 250. A. T o ta l 200. fl. b). M IG R A C IÓ N - M A d C A M 1 LB. Mo. 150. 100. 50. O. A. c. D E. A. D V. V. In. fl. e. X. O. A E. D. D. 400. 200. O D E V. In. A. c. X IF. O. A. D E V. e fl. D. X IF. D E. In. O. A A. D V. fl. e. X IF. 600. 0. c. 0. c. 0. 200. D. 50. c In. C D 141 m D C. A. 100. 100. 800. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 150. A. X. D E V. C D 1c m D C 250. 200. 200. 0. IF. O. A. c e. D A. In. fl. IF. D E V. to ta l m D C 250. In. 100. 0. X. O. A D A. e fl In. IF. X. c. 0. % m ig r a c ió n. 50. 200. e. 0. 100. fl. 50. 150. e. 100. 300. fl. 150. pDC. 300. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 200. IF. T o ta l 200. A. % m ig r a c ió n. D. 150. 0. % m ig r a c ió n. E V. 200. fl. 50. 400. % m ig r a c ió n. 100. % m ig r a c ió n. A. c A. In. 150. 50. C D 141 m D C. 250. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. *. *. 100. 0. C D 1c m D C. **. ****. 200. D. X. e fl. IF. D E V. to ta l m D C 250. 50. **. 150. 0. O. A D. In. A. fl. IF. e. X. c. 0. 100. 200. e. 50. 0. 150. A. 100. 200. D. 50. 150. A. 100. 200. pDC 250. **. fl. 150. 250. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. % m ig r a c ió n. 200. % m ig r a c ió n. Mo. 250. fl. T o ta l 250. % m ig r a c ió n. a). Figura 6. Influencia de ligandos quimioatrayentes y fármacos biológicos sobre la migración de las APCs. Se representa el porcentaje de migración de las células totales (Total), linfocitos B (LB), monocitos (Mo), células dendríticas plasmacitoides (pDC), el total de las células dendríticas mieloides (total mDC), células dendríticas mieloides CD1c (CD1c mDC) y células dendríticas mieloides CD141 (CD141 mDC) tras cultivo durante 18h con los fármacos infliximab (IFX), inflectra (Inflec), adalimumab (ADA) y vedolizumab (VEDO), con respecto a la condición control cultivada en ausencia de fármacos, representada con una línea discontinua (100%) y utilizando un modelo in vitro de cultivo en placa transwell que tenía suplementado el compartimento basal con a) ligando de quimiocinas 2 (CCL2), b) ligando de quimiocinas 25 (CCL25) y c) molécula de adhesión celular adresina de la mucosa 1 (MAdCAM1). Los datos (n=11) se analizaron estadísticamente con un t-test no pareado y se representa el conjunto de valores con la media; *p<0,05; **p<0,01; ****p<0,0001.. 20.

(29) No obstante, y de forma similar a la descrita en el estudio en ausencia de fármacos (Figura 4), ninguna población celular mostró una variación significativa en su capacidad de migración hacia los ligandos CCL25 o MAdCAM1 con independencia del tratamiento con los fármacos biológicos (Figura 6B y Figura 6C).. 21.

(30) CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN Las APCs juegan un papel fundamental en la EII manteniendo un delicado balance entre tolerancia e inmunidad. De hecho, las DC y los macrófagos son abundantes en el sistema inmune gastrointestinal. Estas células extienden sus prolongaciones entre los enterocitos hacia el lumen y se encargan de inducir una respuesta T protectora, así como de estimular la función de las células T reguladoras ante la microbiota comensal y los alimentos ingeridos. No obstante, en la EII, esta capacidad de protección se ve alterada y resulta en una respuesta inmune exacerbada hacia las bacterias comensales (Abbas et al., 2012; Ananthakrishnan et al., 2017). Además, los tratamientos utilizados en el manejo de la EII resultan insuficientes y todavía no se conoce en profundidad los mecanismos de acción que median su efecto terapéutico (Billmeier et al., 2016). Por ello, resulta de vital importancia profundizar en los mecanismos patogénicos inmunes implicados en esta enfermedad, como la migración celular, así como comprender el efecto modulador de los fármacos biológicos actualmente utilizados en la EII. En el análisis del fenotipo y la función de las APCs de nuestro estudio observamos que la expresión de la integrina beta7 disminuyó tras el cultivo con vedolizumab en todas las APCs. Esto resulta evidente ya que la diana molecular de este fármaco biológico es la integrina α4β7 y, por tanto, interfiere selectivamente en su interacción con MAdCAM-1 y el consecuente reclutamiento celular (Coskun et al., 2017; Neurath, 2017). Sin embargo, resultó llamativo el aumento en la expresión de esta integrina en los Mo tras el cultivo con inflectra y adalimumab, lo que conduce a la hipótesis de que los fármacos anti-TNFα podrían inducir un incremento en la expresión de beta7 en las APCs, mecanismo no descrito en la bibliografía actual, hasta nuestro conocimiento. La expresión del receptor de quimiocinas CCR9, cuyo principal ligando es CCL25 (White et al., 2013), fue bastante reducida en todas las APCs tanto a nivel basal como tras cultivo en las condiciones ensayadas (ausencia y presencia de fármacos). Este resultado fenotípico en las APCs se puede trasladar a su capacidad funcional de migración hacia el ligando de quimiocinas CCL25, el cual no indujo variaciones significativas en el reclutamiento celular, con independencia del tratamiento con los fármacos de nuestro estudio. El ligando de quimiocinas CCL2, cuyo receptor es CCR2, es también conocido como la proteína quimioatrayente de Mo (White et al., 2013; Deshmane et al., 2009). Acorde a 22.

(31) ello, se observó un aumento de la migración espontánea de los Mo hacia el medio enriquecido con el ligando CCL2 tanto en ausencia de un tratamiento previo como tras el cultivo con el fármaco inflectra. Siguiendo esta observación, encontramos un aumento fenotípico en la expresión del receptor de quimiocinas CCR2 tras el cultivo de Mo con inflectra y adalimumab. Con respecto al resto de subpoblaciones celulares, CCL2 también ejerció un efecto sobre la migración de las DC, encontrándose diferencias entre la migración basal y la inducida tras el cultivo con fármacos. Las mDC aumentaron su porcentaje de migración hacia este ligando de quimiocinas tras haber sido cultivadas con los fármacos anti-TNF-α y antiα4β7. Sin embargo, las pDC migraron en menor medida hacia el medio con CCL2 tras haber sido cultivadas con los fármacos anti-TNF-α. Estos hallazgos concuerdan con el trabajo de Penna et al. (2002), que indica la diferente capacidad de los subtipos de DC a la hora de migrar en respuesta a distintos ligandos de quimiocinas, aunque la expresión de los receptores de quimiocinas sea equiparable en ambos subtipos celulares. En conjunto estos resultados sugieren que los fármacos biológicos podrían modular el reclutamiento de precursores sanguíneos hacia la mucosa intestinal preferentemente a través del ligando CCL2. Este proyecto llevado a cabo con controles sanos sienta las bases y sirve de referencia de futuras investigaciones que estudien el efecto de los fármacos biológicos sobre la migración de APCs en pacientes con EII.. 23.

(32) CONCLUSIONES Las conclusiones que se pueden extraer de este trabajo son: 1) Las distintas subpoblaciones de APCs (LB, Mo y DC) presentan diferentes niveles de expresión de los marcadores de migración beta7, CCR2, CCR5, CCR6 y CCR9, tanto en condiciones basales como tras su cultivo celular. 2) El fármaco biológico vedolizumab bloquea la expresión de beta7 en todas las APCs, mientras que los fármacos biológicos anti-TNF-α aumentan la expresión de esta integrina particularmente durante el cultivo de los Mo. 3) En comparación con los quimioatrayentes intestinales CCL25 y MAdCAM1, el ligando CCL2 posee el mayor efecto inductor del reclutamiento de APCs circulantes hacia la mucosa intestinal. 4) Los fármacos biológicos anti-TNF-α y anti-integrina α4β7 del estudio no modifican la actividad migratoria espontánea de las subpoblaciones de APCs. 5) El efecto modulador de los fármacos biológicos sobre el reclutamiento intestinal de APCs circulantes podría estar preferentemente mediado a través del ligando CCL2. En un futuro, este trabajo se podría ampliar con un mayor número de muestras de controles sanos. Asimismo, es de gran interés tomar como referencia los datos obtenidos en este estudio en proyectos que evalúen el efecto modulador de los fármacos biológicos sobre la migración de las APCs en pacientes con EII.. 24.

(33) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas, AK., Lichtman, AH., Pillai, S. “Cellular and Molecular Immunology”. 8ª edición. Editorial Elsevier Saunders. Filadelfia, 2012. Páginas consultadas: 13-24, 108-110, 292-303 Agnholt, J., Kelsen, J., Brandsborg, B., Jakobsen, NO., Dahlerup, JF. (2004). “Increased production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in Crohn’s disease--a possible target for infliximab treatment”. Eur J Gastroenterol Hepatol. 16(7): 649-655 Ananthakrishnan, AN., Xavier, EJ., Podolsky, DK. “Inflammatory Bowel Diseases: A Clinician’s Guide”. 1ª edición. Editorial John Wiley & Sons. Estados Unidos, 2017. Páginas consultadas: 33-40, 6569, 85-93, 123-125, 1364-1375. Atreya, R., Zimmer, M., Bartsch, B., Waldner, MJ., Atreya, I., Neumann, I., et al. (2011). “Antibodies against tumor necrosis factor (TNF) induce T-cell apoptosis in patients with inflammatory bowel diseases via TNF receptor 2 and intestinal CD14 macrophages”. Gastroenterology. 141(6): 2026–2038. Bernardo, D., Marin, AC., Fernández-Tomé, S., Montalban-Arques, A., Carrasco, A., Tristán, E, et al. (2018). “Human intestinal pro-inflammatory CD11chighCCR2+CX3CR1+ macrophages, but not their tolerogenic CD11c-CCR2-CX3CR1- counterparts, are expanded in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 11(4): 114-1126 Bernardo, D., Fernández-Tomé, S., Marin, AC., Ortega-Moreno, L., Montalbán-Arques, A., MoraGutierrez, I. et al. (2019). “P054 CD103+SIRPα+ DC are specifically decreased in the inflamed colon from patients with ulcerative colitis but not with Crohn’s disease”. J Crohns Colitis. 13(1): S113 Billmeier, U., Dieterich, W., Neurath, MF., Atreya, R. (2016). “Molecular mechanism of action of antitumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases” World J Gastroenterol. 22(42): 93009313 Boehncke, WH., Radeke, HH. “Biologics in General Medicine”. 1ª edición. Editorial Springer. Frankfurt, 2007. Páginas consultadas: 1-2, 124-138 Casellas, F., Oltra, L. “Enfermedad inflamatoria intestinal para enfermería”. 1ª edición. Editorial Elsevier. Madrid, 2016. Páginas consultadas: 3-15, 17-23, 29-34 Chaparro, M., Panés, J., García, V., Mañosa, M., Esteve, M., Merino, O., et al. (2011). “Long-term Durability of Infliximab Treatment in Crohnʼs Disease and Efficacy of Dose “Escalation” in Patients Losing Response”. J Clin Gastroenterol. 45(2): 113-118 Chaparro, M., Guerra, I., Múñoz-Linares, P., Gisbert, JP. (2012a). “Systematic review: antibodies and anti-TNF-alpha levels in inflammatory bowel disease”. Aliment Pharmacol Ther. 35(9): 971-986 Chaparro, M., Panés, J., Merino, O., Nos, P., Domènech, E., Peñalva, M., et al. (2012b). “Long-term durability of response to adalimumab in Crohn’s disease”. Inflamm Bowel Dis. 18(4): 685-690 Chapel, H., Haeney, M., Misbah, S., Snowden, N. “Essentials of Clinical Immunology”. 6ª edición. Editorial John Wiley & Sons. Reino Unido, 2014. Páginas consultadas: 275-277. 25.

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(36) APÉNDICES •. Apéndice A. Anticuerpos y canales empleados en la citometría de flujo.. Canal BV421 BV510 BV570 BV605 BV711 BV786 FITC PE PECF594 PC5 PC7 APC Alexa700. •. Panel “FORTESSA” Anticuerpo Marca CD141 Miltenyi Biotec HLA-DR Biolegend CCR2 Biolegend CCR5 BD Biosciences CCR6 Biolegend CD123 BD Biosciences Beta7 BD Biosciences CD14 BD Biosciences CD19 BD Biosciences CD1c Miltenyi Biotec CCR9 BD Biosciences CD11c Biolegend. Panel “FACSCanto” Anticuerpo Marca CD141 Miltenyi Biotec HLA-DR BD Biosciences CD11c Miltenyi Biotec CD19 BD Biosciences CD14 Miltenyi Biotec CD1c BD Biosciences CD123 BD Biosciences -. Apéndice B. Estrategia de identificación celular. Se muestra una figura representativa de la estrategia utilizada mediante citometría de flujo para el estudio de las subpoblaciones celulares. Las células singletes y viables son las referidas como células totales en el estudio funcional de migración celular transwell. El software empleado es FlowJo V10.. 28.

(37)