Ciencia Unisalle
Ciencia Unisalle
Maestría en Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agropecuarias
1-1-2017
Estudio descriptivo de leptospira spp, dentro de una explotación
Estudio descriptivo de leptospira spp, dentro de una explotación
lechera con seropositividad previamente detectada, ubicada en
lechera con seropositividad previamente detectada, ubicada en
La Calera, Cundinamarca
La Calera, Cundinamarca
Laura Camila Nossa GonzálezUniversidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada
Nossa González, L. C. (2017). Estudio descriptivo de leptospira spp, dentro de una explotación lechera con seropositividad previamente detectada, ubicada en La Calera, Cundinamarca. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/maest_ciencias_veterinarias/60
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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS VETERINARIAS
ESTUDIO DESCRIPTIVO DE LEPTOSPIRA SPP. DENTRO DE UNA EXPLOTACIÓN LECHERA CON SEROPOSITIVIDAD PREVIAMENTE DETECTADA, UBICADA EN LA
CALERA, CUNDINAMARCA
Trabajo de Grado
LAURA CAMILA NOSSA GONZÁLEZ
Trabajo de grado como requisito para optar el título de: Magister en Ciencias Veterinarias
Bogotá, Colombia 2017
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS MAESTRÍA EN CIENCIAS VETERINARIAS
ESTUDIO DESCRIPTIVO DE LEPTOSPIRA SPP. DENTRO DE UNA EXPLOTACIÓN LECHERA CON SERPOSITIVIDAD PREVIAMENTE DETECTADA, UBICADA EN LA
CALERA, CUNDINAMARCA
Trabajo de Grado
LAURA CAMILA NOSSA GONZÁLEZ 76131213
Director
CESAR AUGUSTO DÍAZ ROJAS, M.V., M.Sc. Co-Director:
DIEGO SOLER-TOVAR, M.V., M.Sc.
Bogotá, Colombia 2017
Aprobación
DIRECTOR
______________________________________ Cesar Augusto Díaz Rojas M.V., M.Sc.
CODIRECTOR
______________________________________ Diego Soler-Tovar M.V., M.Sc.
JURADO
______________________________________ Luis Carlos Villamil Jiménez D.M.V., M.Sc., Ph.D.
JURADO
______________________________________ Nelson Cifuentes Ávila D.M.V. M.Sc.
JURADO
______________________________________ Victoria Eugenia Pereira Bengoa M.V. M.Sc.
Directivas de la Universidad de La Salle
Rector Hno. Alberto Prada Sanmiguel
Vicerrector Académico Dra. Carmen Amalia Camacho Sanabria
Vicerrector De Investigación
Y Transferencia Dr. Luis Fernando Ramírez Hernández
Vicerrector De Promoción y
Desarrollo Humano Hno. Diego Andrés Mora Arenas
Vicerrector Administrativo Dr. Eduardo Ángel Reyes
Decano Facultad de Ciencias
Agropecuarias Hno. Ariosto Ardila Silva
Secretario Académico Dr. Alejandro Tobón González
Compromiso
El trabajo de grado no contiene ideas que sean contrarias a la doctrina católica en asuntos de dogma y moral.
Ni la Universidad, ni el director, ni el jurado calificador son responsables de las ideas expuestas por el graduando.
Agradecimientos
Primeramente, a Dios y a mis padres por permitirme llegar a esta etapa de mi vida.
Al Doctor César Díaz por su apoyo incondicional, confianza y transmisión de conocimientos.
Al Doctor Diego Soler por su apoyo, formación académica y personal.
Al grupo de Investigación de Medicina y Sanidad Animal, tanto profesores como estudiantes, por su permanente apoyo en todo el proceso de la tesis. Los profesores: Dr. Carlos Trujillo, Dr. Carlos Venegas, Dr. Germán Rodríguez, Dr. Javier Piñeros y los estudiantes: Karol Gutiérrez, Natalia Mejía, Estefany López, Hanna Stern, Juan Felipe Parada, María Alexandra Dangond, Laura Jaramillo, Narda Constanza Farías, Natalia Materon y Juan David Cujar.
Al servicio de veterinaria del bioparque Wakata, del Parque Jaime Duque, especialmente el Dr. Leonardo Arias por su colaboración y entrenamiento en la manipulación, manejo y captura de animales silvestres.
Al Dr. Carlos Mario Jaramillo por su colaboración al prestar su finca como objeto de estudio.
Y, al centro de entrenamiento de alta montaña (Guasca), por su entrenamiento en captura de animales silvestres.
Resumen
Leptospirosis es una enfermedad re-emergente que ha cobrado gran importancia en salud pública a nivel mundial por su aumento de la incidencia en países desarrollados y subdesarrollados. La enfermedad es causada por las especies patógenas del género Leptospira spp., alojadas en los túbulos renales de los hospederos adaptados y susceptibles, siendo eliminadas al ecosistema donde pueden sobrevivir por semanas o meses, su probabilidad de infección aumenta en los casos que se presenta un estrecho contacto entre animales domésticos y silvestres. Por esta razón, el objetivo de este proyecto fue realizar un estudio descriptivo de Leptospira spp., dentro de una explotación lechera con seropositividad previamente detectada, ubicada en la Calera, Cundinamarca, determinando la eliminación de la bacteria en muestras de orina de animales silvestres y domésticos, en riñones de animales sinantrópicos y la presencia en muestras de agua, por medio de PCR del gen hap1, estableciendo el papel de las variables ambientales agua y temperatura en la finca, describiendo así, las posibles relaciones que pudieron ocurrir entre serovares y variables que contribuyeron al mantenimiento de la bacteria dentro del ecosistema del predio, esto, a razón de que en la Sabana de Bogotá, se ha venido evidenciado la presencia de Leptospira spp., en los diferentes reservorios y hospederos; además, la finca estudiada ha presentado condiciones ambientales que favorecen la sobrevivencia de la espiroqueta, como fuentes hídricas y áreas de reserva natural. Para llevar a cabo este proyecto, se muestrearon: bovinos (20), equinos (3), caninos (6), roedores (7) y zarigüeyas (5); el muestreo en humanos se realizó con el personal (4) que presentó contacto con la finca, y se desarrolló un cuestionario para establecer las variables asociadas a la presentación de Leptospira spp., finalmente se realizó muestreo de cinco puntos de las fuentes hídricas. Con las muestras serológicas, se realizó la prueba diagnóstica MAT y las muestras de orina y agua se analizaron por PCR, identificando el gen hap1. Dentro de los
resultados obtenidos, se logró evidenciar la presencia de genoma de leptospiras patógenas, en fuentes hídricas del predio, a pesar de que la finca se encuentra a 2755 msnm; en los animales domésticos se observó eliminación de la bacteria por orina, títulos a serovares de manutención y accidentales, permitiendo catalogar a los equinos, bovinos y caninos como posibles hospedadores de manutención; en bovinos, zarigüeyas y roedores se evidenció animales que eliminaban la bacteria, pero no presentaron títulos, lo que nos llevó a concluir que presentaban adaptabilidad a la bacteria, o estaba alojada en el riñón por lo que no generaron anticuerpos; se encontró que el serovar Icterohaemorrhagiae fue el de mayor presentación en caninos, equinos y bovinos, pudiendo relacionar a los roedores como principal variable que influencia la presencia de la bacteria dentro de la finca, ya que Icterohaemorrhagiae, es un serovar de mantenimiento en roedores, y accidental en las otras especies; el darse una sobreposición espacial entre la finca y las reservas, conllevó a compartir espacios entre animales silvestres y la finca, evidenciando que las zarigüeyas estuvieron involucradas en el ciclo de Leptospira spp., de la ganadería y posiblemente de las zonas aledañas, como hospedador de mantenimiento; en cuanto los humanos, según el cuestionario, las variables más relevantes fueron el contacto con animales domésticos, consumo de agua sin proceso de purificación, proveniente de la reserva natural y convivencia con roedores, reflejado en las titulaciones positivas; y finalmente se observó que el ciclo de Leptospira spp., dentro de la finca, estuvo influenciado por el macrosistema de temperatura, en donde se reportó en promedio 14,5°C para el primer muestreo y 15°C para el segundo, teniendo un efecto directamente proporcional sobre la temperatura del agua; además, las variaciones entre los límites máximos y mínimos del segundo muestreo pudo influir en los factores intrínsecos de los animales. Concluyendo que dentro de la finca, los animales domésticos, animales silvestres, animales sinantrópicos, actuaron como hospedadores de mantenimiento de la bacteria, posiblemente
contaminando el principal mecanismo de transmisión indirecta, el agua, la cual proviene de la reserva natural y tiene contacto con todo el predio, simultáneamente, es de consumo animal y humano, poniendo así, en evidencia una conexión entre las variables externas e internas de la finca.
Tabla de Contenido
Introducción ... 19
Marco Teórico ... 24
Cadena epidemiológica de Leptospira spp. ... 24
Factores asociados al agente. ... 25
Fuente de Infección o hospedadores de mantenimiento. ... 33
Puerta de Salida. ... 36 Transmisión. ... 36 Puerta de Entrada. ... 37 Hospedador Accidental. ... 37 Ambiente. ... 40 Diagnóstico... 41 Metodología ... 44 Marco Geográfico ... 44 Marco Demográfico ... 44
Toma de Muestra en Animales Silvestres. ... 44
Toma de muestra en animales sinantrópicos. ... 53
Toma de muestra en animales domésticos. ... 56
Toma de muestras de agua y ambiente. ... 57
Toma de muestra en humanos (serología). ... 60
Pruebas diagnósticas ... 61
Prueba de Microaglutinación (MAT). ... 61
Prueba Molecular. ... 63
Factores climatológicos ... 64 Animales domésticos... 67 Bovinos. ... 68 Equinos. ... 71 Caninos. ... 72 Animales sinantrópicos ... 73 Animales silvestres ... 76 Fuentes hídricas ... 79 Humanos... 80 Factores Climatológicos ... 85 Animales domésticos... 86 Bovinos. ... 87 Equinos. ... 90 Caninos. ... 90 Animales Sinantrópicos... 91 Animales Silvestres ... 92 Fuentes Hídricas ... 94 Humanos... 94
Posibles hipótesis de relaciones que se generan dentro de la finca ... 95
Animales silvestres – Humanos y Animales domésticos. ... 96
Humanos- Animales domésticos. ... 98
Humanos-Animales domésticos- Animales sinantrópicos. ... 99
Entre Animales Domésticos. ... 101
Animales silvestres- Animales sinantrópicos. ... 103
Recomendaciones ... 107 Lista de Referencias ... 108 Anexos ... 115
Lista de Tablas
Tabla 1.Serovares y sintomatología presente en animales hospederos de Leptospira spp. ... 33
Tabla 2. Secuencia de Cebadores hap1 y rrl ... 42
Tabla 3. Títulos y detección de Leptospira spp., en bovinos primer muestreo ... 69
Tabla 4. Títulos y detección de Leptospira spp., en bovinos segundo muestreo ... 70
Tabla 5. Títulos y detección de Leptospira spp., en bovinos muestreados en primero y segundo muestreo ... 71
Tabla 6. Títulos y detección de Leptospira spp., en equinos ... 72
Tabla 7. Títulos y detección de Leptospira spp., en caninos primer muestreo ... 72
Tabla 8. Títulos y detección de Leptospira spp., en caninos segundo muestreo ... 73
Tabla 9. Títulos y detección de Leptospira spp., en roedores I muestreo ... 75
Tabla 10. Títulos y detección de Leptospira spp., en roedores II muestreo ... 75
Tabla 11. Clasificación taxonómica de las zarigüeyas ... 76
Tabla 12. Hoja de vida zarigüeyas ... 77
Tabla 13. Promedios de temperatura de agua, temperatura ambiental y Ph en puntos positivos y negativos a Leptospira spp. ... 80
Tabla 14. Resultados de cuestionario implementado en la finca ... 81
Lista de Figuras
Figura 1. Distribución de tierras en la Calera, Cundinamarca. Adaptado de Castro (2009) ... 22
Figura 2. Cadena Epidemiológica. Tomado de OPS (2011) ... 25
Figura 3. Expresión clínica de Leptospirosis. Tomada de (Céspedes, 2005) ... 29
Figura 4. Interfaz de Leptospira spp. Adaptado de Lloyd-Smith et al., (2009) ... 30
Figura 5. Localización de los puntos donde se realizaron los transectos dentro de la finca. ... 45
Figura 6. Trampa tipo Tomahawk ubicada en un punto dentro del transecto ... 47
Figura 7. Algunos de los cebos implementados... 48
Figura 8. Quitando el forro de la trampa dentro de las instalaciones del zoológico del Parque Jaime Duque... 49
Figura 9. Pesaje del animal ... 50
Figura 10. Restricción física de la zarigüeya ... 50
Figura 11. Restricción química ... 51
Figura 12. Toma de muestra de sangre de la vena coccígea ... 52
Figura 13. Identificación del animal ... 52
Figura 14. Lugar de almacenamiento de comida de los animales ... 54
Figura 15. Inducción de anestesia en el Roedor ... 55
Figura 16. Toma de muestra Intracardiaca ... 55
Figura 17. Necropsia de Roedor ... 56
Figura 18. Localización de los puntos donde se realizó el muestreo de agua ... 58
Figura 19. Recolección de muestras de agua ... 58
Figura 20. Medición de pH ... 59
Figura 22. Medición de Temperatura ambiental ... 60
Figura 23. Identificación del punto de toma de muestra ... 60
Figura 24. Toma de muestra en Humanos ... 61
Figura 25. Desarrollo de titulaciones en caja de microtécnica. ... 62
Figura 26. Curva de temperatura del punto 1. Finca La Calera (Cundinamarca). 2-3 de Octubre del 2014 ... 64
Figura 27. Curva de temperatura del punto 2. Finca La Calera (Cundinamarca). 17-18 de octubre del 2014. ... 65
Figura 28. Curva de temperatura del punto 3. Finca La Calera (Cundinamarca) 17-18 de octubre del 2014 ... 66
Figura 29. Clasificación morfológica de los roedores capturados. Tomado de: Wildscreen Arkive (2016) ... 74
Figura 30. Distribución geográfica de las zarigüeyas capturadas dentro de la finca. ... 79
Figura 31. Esquema de los factores asociados a la presentación de Leptospira spp., en una finca de La Calera. ... 84
Figura 32. Fragmentación de las reservas naturales ... 92
Figura 33. Evidencia de nexos entre animales domésticos y reservas naturales ... 93
Figura 34. Posibles relaciones entre sistemas presentes en la finca ... 96
Figura 35. Posibles relaciones entre Animales silvestres – Humanos y Animales domésticos .... 97
Figura 36. Relación Humanos- Animales domésticos ... 99
Figura 37. Relación Humanos- Animales domésticos- Animales sinantrópicos ... 100
Figura 38. Relación entre animales domésticos primer muestreo ... 102
Lista de Anexos
Anexo 1. Dosificación anestésica animales silvestres ... 115 Anexo 2. Historia clínica de animales domésticos ... 116 Anexo 3. Consentimiento informado para la toma de muestras de sangre en humanos ... 119 Anexo 4. Cuestionario para determinar factores asociados a la presentación de leptospirosis .. 120
Lista de Siglas
Sigla
Sv. Serovar
ANLA Agencia Nacional de Licencias Ambientales CAR Corporación Autónoma Regional
EC Esfuerzo de captura ECT Éxito de captura total
hap 1 Proteína asociada a hemolisis 1
IDEAM Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios Ambientales MAT Prueba de Microaglutinación
PCR Reacción de la Cadena Polimerasa
rrl Gen del RNA ribosomal
SSAF Solución Salina Amortiguadora de Fosfatos CAAT Prueba de absorción por aglutinación cruzada
Tanto los animales domésticos como los silvestres y su ecosistema representan salud y bienestar para la población humana, porque suministran alimentos de alto contenido proteico, son utilizados como animales de trabajo, recreación o de compañía. Esta relación propicia un riesgo para la salud pública, que emerge de la interfaz humano – animal – ecosistema, la cual se puede describir como la exposición continua, directa o indirecta de los humanos con los animales, sus productos y subproductos, así como el ecosistema donde se desenvuelven (Flores, 2010). Leptospira spp. presenta un carácter altamente zoonótico, debido a que la específica asociación entre serovares con hospedadores de mantenimiento, como serovariedad (sv) Canicola (caninos), sv Hardjobovis (bovinos), sv Pomona y sv Bratislava (porcinos) y sv Copenhageni (ratas y roedores silvestres), no es definitiva (Adler et al., 2011), por eso, para que la interfaz de Leptospira spp. ocurra, es necesario presentar la interacción de los factores que hacen parte de la cadena epidemiológica dentro de un espacio determinado, siendo este, una finca de La Calera, lugar donde se evaluaron las variables.
Inicialmente se tuvieron en cuenta los hospedadores de mantenimiento, que corresponden a animales sinantrópicos, silvestres y domésticos, entre ellos roedores, pequeños marsupiales, bovinos, caninos y equinos, que al presentar una estrecha proximidad con el humano, se convirtieron en la más importante fuente de infección (Yalin et al., 2011).
Los soportes que evidenciaron la necesidad de realizar este estudio se presentan a continuación:
Al hacer referencia a bovinos, estudios realizados en la Sabana de Bogotá, reportaron de 200 bovinos, 83 (41,5%) positivos con títulos ≥ 1:50 para los serovares Hardjobovis, Pomona,
Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa y Bratislava, 81 (40,5%) positivos con títulos ≥ 1:100, 66 (33%), positivos con títulos ≥ 1:200 y el 37% de las muestras (74 de 200), positivas a PCR (Hernández-Rodríguez et al., 2011). También, Caicedo y Suárez (2006), encontraron alta seroreactividad para el serovar Icterohaemorrhagiae y Laiceca y García, (2006) evidenciaron una prevalencia de 31.74%, con mayor prevalencia para los serovares L. sv. Hardjo 12.7%, L. sv. Icterohaemorrhagiae 10.6% y L. sv. Pomona 7%.
En cuanto a caninos, en Bogotá D.C., Medrano, Díaz y Dalmau, (2011) realizaron un estudio en caninos con enfermedad renal, encontrando el 33,3% de los animales muestreados, positivos a MAT para los serovares Icterohaemorrhagiae, Canicola y Grippotyphosa principalmente.
Al referirse a equinos, Valencia y Silva (2007) identificaron una prevalencia para los serovares Hardjobovis de 23.1%, Pomona de 8.8%, Canicola de 27.7%, Icterohaemorrhagiae de 39.9%, Bratislava de 26.9%, Grippotyphosa de 26.7% y una prevalencia significativa de 40,4%.
En lo que corresponde a animales silvestres Arbeláez y Ruiz (2008) realizaron el estudio en reservas alrededor del Parque Jaime Duque, reportando una positividad del 69,56%.
Al tener en cuenta la susceptibilidad del hospedador, Ortiz et al., 2009 citado por Pulido-Villamarín, (2014), realizaron un estudio epidemiológico transversal entre agosto del 2006 y marzo del 2007, luego de procesar 1.307 sueros de humanos, en donde se realizó MAT para 13
serovares, de los cuales resultaron positivos 165 sueros (230 reacciones positivas) y negativos resultaron 1.142 sueros, reportando una prevalencia de 12,6%.
Y con respecto al modo de transmisión, que se da por aguas con orina contaminada de
Leptospira spp. (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010), en la bibliografía consultada no se ha
realizado un estudio sobre la presencia de esta espiroqueta en este recurso hídrico de la Sabana de Bogotá, siendo esta una variable de importancia a tener en cuenta, especialmente en la finca, ya que presenta un nacimiento en la reserva natural que finalmente se utiliza para consumo de los animales domésticos.
Por otro lado, la finca se ha caracterizado por una previa positividad en bovinos, a L.
borgpetersenii serovar Hardjobovis, L. interrogans serovares Pomona, Grippotyphosa, Canicola e
Icterohaemorraghiae y positividad por PCR del gen hap 1 y rrl (Briñez, 2014), posiblemente por:
La permanente presencia de animales con afecciones reproductivas y serologías positivas, a pesar de la implementación de medidas de control como saneamiento y vacunación.
Cuenta con un nacimiento de agua dentro de la reserva natural que se usa como suministro hídrico en los animales domésticos y consumo de los humanos.
La ubicación de la finca, ya que, el municipio cubre un área de 31640 hectáreas, de las cuales 20492 hectáreas son dedicadas a actividades productivas. De esa área productiva 4172 hectáreas son dedicadas específicamente a la agricultura y 16319 hectáreas a la ganadería, los bosques y pantanos ocupan 9297 hectáreas y las 1852 hectáreas sobrantes son destinadas a usos urbanos, suburbanos aguas y afloramientos entre otros. Las áreas de pastos
se utilizan en la cría de ganado doble propósito. Este escenario, muestra que, la producción principal es a base de ganadería, y que gran parte del terreno del municipio corresponde a reservas naturales que cuentan con un alto porcentaje de fuentes hídricas, (Figura 1), influyendo en la producción de la finca, ya que, de las 88 fanegadas de la finca 22 eran utilizadas con fines agropecuarios, el resto correspondía a reservas naturales. Al ubicar la finca en este contexto, se puede deducir que los factores que favorecen la sobrevivencia de
Leptospira spp. se pueden estar replicando dentro de la Calera por la similitud y
homogeneidad en el uso de suelos (Castro et al., 2009). Cabe anotar que, la Calera, de sur a norte está rodeado por la cordillera oriental que presenta numerosas ramificaciones, entre ellas la de Cruz Verde que lo cobija por los costados oriental y occidental, dando un aspecto bastante quebrado, alternando valles, colinas y elevaciones boscosas, condiciones que permitieron la proliferación de roedores y animales silvestres que interactuaron con los animales domésticos y habitantes de la zona rural (CAR, 2013).
Figura 1. Distribución de tierras en la Calera, Cundinamarca. Adaptado de Castro (2009)
13%
52% 29%
6%
Distribución de tierras en la Calera,
Cundinamarca
Agricultura Ganadería
Bosques y Pantanos Urbanos, sub urbanos y aguas
Por estas razones, se evidenció la necesidad de realizar un estudio descriptivo de Leptospira spp., dentro de una explotación lechera con seropositividad previamente detectada, ubicada en la Calera, Cundinamarca; determinando la eliminación de la bacteria en muestras de orina de animales silvestres y domésticos, en riñones de animales sinantrópicos y la presencia en muestras de agua, por medio de PCR del gen hap1; identificando las posibles relaciones que puedan estar ocurriendo entre serovares en esta población y de esta forma estén contribuyendo en el mantenimiento de la enfermedad; estableciendo el papel de las variables ambientales agua y temperatura en la finca, describiendo así, las posibles relaciones que pudieron ocurrir entre serovares y variables que contribuyen el mantenimiento de la bacteria dentro del ecosistema de la finca.
Marco Teórico
Leptospirosis es una enfermedad de carácter zoonótico, considerada como un problema de salud pública a nivel mundial, particularmente en áreas tropicales y subtropicales de países en vías de desarrollo. La enfermedad es causada por las especies patógenas del género Leptospira spp. que se alojan en los túbulos renales de los hospedadores adaptados y susceptibles, siendo arrojadas al ecosistema donde pueden sobrevivir por semanas o meses. Esta zoonosis ocasiona pérdidas económicas en la producción pecuaria mundial, principalmente de ganado porcino y bovino, al causar fallas reproductivas en los hospedadores crónicos o de mantenimiento, pero también afecta en forma severa a más de un millón de personas anualmente en el mundo, quienes se consideran huéspedes susceptibles de Leptospira spp. (Yusti, Arboleda & Agudelo-Flórez, 2013).
Cadena epidemiológica de Leptospira spp.
Para entender el mecanismo de acción de Leptospira spp., se hace necesario conocer la cadena epidemiológica (Figura 2), entendiendo que corresponde a las relaciones entre los diferentes factores que conducen a la aparición de una enfermedad transmisible. El esquema busca ordenar los llamados eslabones que identifican los puntos principales de la secuencia continua de interacción entre el agente, el hospedador y el ecosistema (OPS, 2011).
Figura 2. Cadena Epidemiológica. Tomado de OPS (2011)
Factores asociados al agente.
Determinantes del agente.
Patogénesis.
La penetración de la bacteria, se puede producir por las mucosas sobre todo la ocular o mucosa nasal. No muy frecuentemente la piel íntegra puede servir como puerta de entrada, salvo que la exposición del agua sea prolongada por la movilidad que el microorganismo posee, la hialuronidasa lo capacitan para penetrar en los tejidos (Gamarra, 2008).
Después de la fase de incubación, el microorganismo entra en el torrente sanguíneo a través de los vasos linfáticos o directamente en los vasos. La leptospiremia da lugar a una diseminación por todo el cuerpo y a la infección de múltiples órganos. Esta fase bacterémica dura de 4 a 7 días. Posteriormente las lesiones por los componentes tóxicos celulares aparecen, la primera lesión es el daño del endotelio de los vasos sanguíneos, que al localizarse generan isquemia en los órganos,
resultando en necrosis tubular renal, hepatocelular y pulmonar, meningitis, miositis y placentitis. También se presenta con hemorragias y disminución de plaquetas. Una vez los anticuerpos aparecen, Leptospira spp., es removida de la circulación y tejidos por fagocitosis (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
A menudo hay fiebre y otros signos sistémicos en los animales con afectación clínica. Pueden afectarse anticuerpos humorales al final de la fase bacteriémica. Se generan anticuerpos opsonizadores que ayudan a eliminar la infección de la mayoría de los tejidos en el huésped.
Durante la fase de convalecencia, las leptospiras pueden localizarse en la glándula mamaria, el riñón o el aparato genital, donde parece estar protegida de la respuesta inmunitaria.
Leptospira spp. coloniza las superficies de las células epiteliales del túbulo renal proximal. La base
molecular de la asociación célula – bacteria es desconocida. Se han descrito factores específicos de adhesión a las células, pero no se ha especificado su acción en la enfermedad, por ejemplo, la fibronectina-ligando LigB, no es necesaria para presentar la virulencia, mientras la mayor proteína de superficie LipL 32 realiza la unión con las células del hospedador, pero no se requiere para adquirir la enfermedad aguda o la colonización del riñón (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010)
Dependiendo de la virulencia de la serovariedad implicada, la infección renal crónica puede crear algunos cambios fisiológicos, una nefritis intersticial leve o una nefritis intersticial difusa, intensa y linfocitaria acompañada de fibrosis. La nefritis puede persistir mucho tiempo después de que el hospedero haya eliminado el microorganismo. La infección crónica del riñón o del aparato reproductor permite la transmisión del microorganismo por la orina, las secreciones uterinas y vaginales, la placenta, los tejidos fetales y el semen. La bacteria reside en la luz de los túbulos renales proximales, donde está protegida de los fagocitos y los anticuerpos humorales. La bacteria no estimula ninguna respuesta inmunitaria mientras está localizada en la luz del túbulo proximal,
y por ello los títulos de anticuerpos séricos pueden disminuir y desaparecer, aunque el riñón esté afectado y liberando bacterias (Bradford, 2010).
Virulencia y Patogenicidad.
Los agentes infecciosos varían en su habilidad de infectar y de inducir la enfermedad en los animales. La habilidad para infectar es relacionada con la susceptibilidad inherente del hospedador, y de si éste es inmune o no. Virulencia es la capacidad de un agente infeccioso para producir la enfermedad, en un hospedador determinado, en términos de frecuencia y gravedad. La patogenicidad es generalmente usada de manera incorrecta como sinónimo de virulencia, está última se refiere a la variación en el potencial de inducción de la enfermedad por las diferentes cepas que presentan organismos similares. Sin embargo, patogenicidad se refiere a la cualidad de la inducción de la enfermedad (Stedman, 1989 citado por Thrusfield, 1990) y no debería utilizarse de forma semicuantitativa para indicar el grado en que se induce la enfermedad.
La patogenicidad y la virulencia están determinadas por numerosas características del hospedador y del agente. El agente infeccioso debe ser capaz de multiplicarse en el hospedador y de resistir los mecanismos de eliminación y defensa del mismo. La multiplicación y la difusión de las bacterias se ve favorecida por la liberación de toxinas. Un agente puede lograr la patogenicidad, o aumentar su virulencia, mediante una modificación de su composición antigénica que eluda la resistencia genética o inmunológica del hospedador (Bradford, 2010).
Leptospira spp. es un género diverso de espiroquetas móviles, aeróbicas obligadas, en
forma de espiral de unos 0,11 a 0,3 µm de diámetro y 6 a 20 µm de longitud. (Bradford, 2010). Presenta una doble membrana, en donde la membrana citoplasmática y la pared de peptidoglicano están estrechamente asociadas, esta unión es cubierta por otra membrana conformada por el
lipopolisacárido que le da la caracterización antigénica a Leptospira spp., por eso se le concede una clasificación de Gram (-) (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Múltiples factores de virulencia pueden contribuir a la leptospirosis. Se cree que el lipopolisacárido (LPS) de Leptospira spp. y las proteínas de la membrana externa contribuyen al desarrollo de la nefritis intersticial. Pero el LPS de la Leptospira spp. tiene diferentes propiedades bioquímicas que le hacen menos tóxicos que los LPS de otros Gram negativos. La motilidad es un importante mecanismo patogénico y contribuye a la invasión y diseminación de la bacteria.
Hasta 50 genes se relacionan con la motilidad de la Leptospira spp. Las cepas patógenas de Leptospira spp. producen proteínas quimiotácticas, y algunas cepas muestran quimiotaxis hacia la hemoglobina. La adherencia a las células la confiere en parte la proteína ligadora de fibronectina presente en la superficie de las cepas patógenas, pero no en las cepas no patógenas. La proteína A de Leptospira spp. de tipo inmunoglobulínico (Lig A) también puede participar en la unión e invasión. Otras proteínas que pueden contribuir a la virulencia son las hemolisinas, las esfingomielinasa C, la esfingomielinasa H y la proteína 1 asociada a hemólisis (hap 1) (Bradford, 2010).
En cuanto a la patogenicidad de Leptospira spp., varía ampliamente, con oscilaciones que van desde procesos totalmente asintomáticos, que son los más frecuentes, pasando por las formas de evolución generalmente benignas, hasta el desarrollo de cuadros graves ictero-hemorrágicos con colapso vascular y serio compromiso de funcionamiento hepático-renal, que pude ser de evolución fatal (enfermedad de Weil). De las formas clínicas sintomáticas de la enfermedad, el 80-90% evoluciona en una forma anictérica benigna y 10-20% como leptospirosis grave con ictericia e insuficiencia renal (Figura 3) (Céspedes, 2005)
Figura 3. Expresión clínica de Leptospirosis. Tomada de (Céspedes, 2005)
Clasificación de zoonosis según los mecanismos de difusión del agente dentro de la cadena epidemiológica.
La clasificación de la forma en cómo actúan los agentes patógenos zoonóticos, delineando 5 estados de diseminación, iniciando con la infección exclusivamente en animales (estado I) hasta a la infección de solo humanos (estado V). El componente zoonótico de este esquema (estados II al IV) puede ser dividido en las fases que constituyen la transmisión y asociado con mecanismos epidemiológicos. En el estado II los patógenos pueden ser transmitidos de animales a humanos como causa “primaria” de infección, pero no exhibe de humano a humano (transmisión
desde reservorios animales a la población de humanos, pero no se mantiene en esta última. Estado IV el patógeno se origina y persiste en los animales reservorios, pero puede mantenerse en las cadenas de transmisión en la población humana (Figura 4) (Lloyd-Smith et al., 2009). Leptospira spp. no se transmite entre la población humana ya que solo sobrevive en orina alcalina originaria de animales herbívoros o animales con dieta que producen este tipo de orina (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Figura 4. Interfaz de Leptospira spp. Adaptado de Lloyd-Smith et al., (2009)
La dinámica de todas las zoonosis involucra múltiples fases, incluyendo la transmisión en el animal reservorio, el salto entre especies a humanos y la posibilidad de mantenerlo, este tipo de transmisión compartida es la que define las características de una zoonosis. Los factores que influencian la potencia de la infección desde animales a humanos presentan tres componentes:
La prevalencia de infección en el animal reservorio, el grado en que esos humanos entran en contacto con esos animales, y la probabilidad en que inicie la infección en el humano cuando ocurra el contacto. Estos componentes son influenciados por diversas propiedades de la naturaleza, agricultura y sistemas humanos con importantes diferencias en el manejo del modo de transmisión del patógeno (Lloyd-Smith et al., 2009).
Una Interfaz se produce cuando ocurre un potencial de transmisión del patógeno desde animales domésticos a animales silvestres, o desde animales domésticos a animales silvestres. En general son las enfermedades de animales que ocurren en un país o región por fallas en una o más de las tres categorías básicas nombradas a continuación:
Enfermedades mantenidas por animales silvestres: La cual es endémica en un país o región y es mantenida generalmente por el ganado y población de vida silvestre. El factor más importante responsable de producir la enfermedad es el contacto directo o indirecto (vector) de hospederos infectados silvestres o poblaciones de animales domésticos susceptibles a la interfaz por sus pastizales, o recursos compartidos como el agua (Greger, 2007), la deforestación y consecuente pérdida del hábitat de los animales silvestres, incrementa la posibilidad de transmisión de las zoonosis, como leptospirosis, causada por el movimiento de los animales entra ecosistemas selváticos y domésticos (Costa da Silva, 2008).
Estas enfermedades, presentan la mayor distribución en el mundo, son generalmente cíclicas en la naturaleza y los ciclos epidémicos aparecen relacionados con densidades poblacionales de una o más especies, como también con los factores climáticos (Greger, 2007).
La transmisión de estas enfermedades depende de los factores temporal y espacial, estos pueden variar, dependiendo del agente infeccioso y/o la presencia o necesidad de un vector mecánico o biológico en el ciclo epidemiológico (Greger, 2007).
El potencial de transmisión también incluye aerosoles, contaminación de suelo, agua y pastos, o aquellos relacionados con ciclos climáticos/estacionales y fluctuaciones en el número de animales y distribución en la cantidad de vectores.
Enfermedades Exóticas: las cuales han sido introducidas en un país o región, usualmente por la importación de animales infectados o sus productos (Greger, 2007)
Emergente o Re-emergente o enfermedades verdaderamente novedosas (Greger, 2007).
Taxonomía.
Antes de 1989, Leptospira se dividía en dos especies: patógenas (L. interrogans), y saprofitas (L. biflexa). La taxonomía y clasificación actual de Leptospira usa un sistema complejo de características serológicas y genéticas. La clasificación serológica se basa en el agrupamiento antigénico del lipopolisacárido (LPS) y otros antígenos de superficie (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010) usando la prueba de absorción por aglutinación cruzada (CAAT). Se consideran que dos serovares son diferentes si, después de la absorción cruzada con la totalidad de antígenos heterólogos, por lo menos 10% de los antígenos heterólogos permanecen asociados con uno o dos anticuerpos (Cerqueira y Picardeau, 2009). Se han caracterizado más de 250 serovariedades. Las serovariedades con una relación antigénica se combinan en serogrupos mayores, y las serovariedades también pueden caracterizarse en serotipos. Se han identificado 17
especies genómicas de la heterogeneidad de la secuencia de ADN (Badford, 2010), encontrando como especies patógenas L. interrogans, L. kirschneri y L. noguchi, L. fainei, L. borgpeterseneii.
L. santarosai L. weilii, L. inadai, y L. alexanderi. Dentro de las no patógenas están L. biflexa, L. meyeri y L. wolbachi. (Stanchi et al., 2007).
En el 2007 se realizó el Subcomité en Taxonomía de Leptospirosis en Quito, Ecuador, en donde se decidió el status de las especies previamente descritas como genomoespecies 1, 3, 4 y 5, resultando en una familia que comprende 13 especies de Leptospira patógenas: L. alexanderi, L.
alstonii, (genomospecies 1) L. borgpeterseneii. L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae (genomoespecie 3), L. weilli, L.wolffii, con
más de 260 serovares. Las especies saprofitas de Leptospira incluye L. biflexa, L. meyeri, L.
yanagawae (genomoespecie 5), L. kmetyi, L. vanthielii (genomoespecie 4) y L. wolbachii contiene
más de 60 serovares (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Fuente de Infección o hospedadores de mantenimiento.
Los serovares y la forma de presentación de la enfermedad en los animales que sirven como hospedadores intermediarios responsables del mantenimiento de Leptospira spp. se presenta en la tabla 1.
Tabla 1.Serovares y sintomatología presente en animales hospederos de Leptospira spp.
HUÉSPED SEROVAR SINTOMATOLOGÍA
Bovinos Hardjobovis, Pomona, Grippotyphosa
Terneros: Fiebre,
hemoglobinuria, ictericia, anemia.
(Vijayachari, Sugunan & Shriram, 2008).
Adultos: disminución de producción Láctea (coágulos, sangre, color amarillo anormal), aborto, Momias fetales, Mortalidad 5-15% (Adler y De La Peña-Moctezuma, 2010). Caninos Canicola, Icterohaemorrhagiae (Vijayachari, Sugunan y Shriram, 2008). Enfermedad de Weil´s: Ictericia, hemorragias, fiebre, uremia, vómito, diarrea, coagulación intravascular diseminada, fallas reproductivas (abortos, nacimientos prematuros)
Porcinos Pomona, Tarassovi,
Grippotyphosa, Bratislava, Sejroe, Icterohaemorrhagiae y Canicola (Faine, 1994 citado en Vijayachari, Sugunan&Shriram, 2008). Adultos: asintomática convirtiéndose en portadores crónicos. Lechones: septicemia acompañada de ictericia y hemorragias (Chung, 1994). Hembras: aborto, esterilidad, muerte fetal, momificación fetal y agalactia (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Equinos Bratislava (Ellis, 1999). Fiebre, ligera ictericia y aborto (Chung, 1994). Uveítis recurrente (Rohrbach et al., 2005 citado
en Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010) Animales Silvestres Tayassu pecari Armadillos Icterohaemorrhagiae y Autumnalis (Tavares et al., 2010) Autumnalis, Grippotyphosa, Hardjobovis y Patoc
(Costa da Silva et al., 2008) Animales Sinantrópicos
Ratones (Mus musculus)
Ratas (Rattus norvegicus y
R. rattus) Ballum e Icterohaemorrhagiae (Vijayachari, Sugunan y Shriram, 2008) Icterohaemorragiae y Grippotyphosa (Asenga et al., 2015)
Generalmente cada serovar tiende a mantenerse en hospedadores de mantenimiento específicos, sin embargo, en una región, una especie animal puede ser infectada por otros serovares mantenidos en otras especies presentes en el área, generando una infección incidental que está determinada por variables sociales, de manejo y ambientales que conllevan al contacto y transmisión de leptospiras a otras especies (Ellis, 2015). La infección incidental está asociada con enfermedad clínica aguda y la excreción renal de duración limitada.
Los hospedadores de mantenimiento se caracterizan por presentar manifestaciones clínicas leves y un daño patológico mínimo, excepto bajo ciertas circunstancias por ejemplo: animales inmuno-comprometidos como las hembras preñadas y los neonatos. También en donde se presenta una infección concurrente con Diarrea Viral Bovina o circovirus en cerdos, persistiendo la excreción renal (Ellis, 2015).
Puerta de Salida.
La infección crónica del riñón o del aparato reproductor permite la transmisión del microorganismo por la orina, las secreciones uterinas y vaginales, la placenta, los tejidos fetales y el semen. (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Transmisión.
La transmisión puede ser directa o indirecta. La transmisión directa ocurre cuando
Leptospira spp., entra en contacto con tejidos, fluidos corporales u orina originaria de animales
infectados u hospedadores asintomáticos. La transmisión directa entre animales puede ocurrir transplacental, por contacto sexual o por consumo de calostro, pudiendo persistir anticuerpos en los terneros por cerca de 3 meses (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010). La transmisión directa de animales a humanos se hace más representativa en carniceros, veterinarios, productores de porcinos, bovinos y trabajadores en control de roedores. La transmisión indirecta ocurre cuando un animal o un humano adquieren Leptospira spp., del medio ambiente contaminado originado por la orina de un animal de un excretor (Ellis et al., 1978, 1985, 1986 citado por Vijayachari, Sugunan & Shiriram, 2008).
Puerta de Entrada.
Los alimentos y el agua de superficie, la vida salvaje, los roedores y los animales domésticos contaminados son posibles fuentes de serovariedades patógenas para el ganado bovino (Gamarra, 2008). Las leptospiras atraviesan las superficies mucosas externas y piel laceradas. Las bacterias se multiplican en la zona de entrada durante un período de incubación que puede durar 2 a 20 días (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Hospedador Accidental.
Dentro de este grupo entran los animales domésticos, silvestres y sinantrópicos (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010), al ser afectados por serovares que no son específicos de la especie.
Humano.
El humano se comporta como hospedero accidental ya que es sensible a todos los serotipos, presentándose con cuadros de fiebre, ictericia, dolores musculares, erupciones y meningitis no supuradas, síntomas que varían según el serotipo implicado (Chung, 1994), pero no elimina
Leptospira spp., al ambiente al presentar orinas acidas (Haake y Levett, 2015).
Para los humanos, la leptospirosis es una enfermedad potencialmente mortal pero susceptible al tratamiento con antibióticos; su espectro clínico va desde la enfermedad asintomática, pasando incluso por síntomas leves similares a una influenza, o asemejar hepatitis, salmonelosis, dengue, fiebres hemorrágicas virales, rickettsiosis y meningitis. Puede cursar en su
forma severa como un síndrome icterohemorrágico con compromiso renal y multisistémico en ocasiones fatal, o como un cuadro de hemorragia pulmonar (Yusti, Arboleda & Agudelo-Flórez, 2013).
Cuadro clínico.
.
Leptospirosis asintomática.
La existencia de formas subclínicas se hace evidente cuando se realizan encuestas seroepidemiológicas, donde el 16-40% de personas expuestas a la fuente de infección presentan títulos serológicos de anticuerpos específicos detectables; sin embargo, no recuerdan haber tenido manifestaciones clínicas sugestivas de la enfermedad (Céspedes, 2005).
Leptospirosis sintomática.
Leptospirosis es típicamente una enfermedad bifásica, presentándose una fase inicial o de leptospiremia con una duración de cuatro a siete días, caracterizada por la presencia de las
Leptospira en sangre y una segunda fase inmune o leptospiruria con una duración de 8 a 30 días
donde se puede detectar anticuerpos específicos en circulación. Ambas fases son comunes a las dos formas clínicas de presentación: anictérica e ictérica (Céspedes, 2005).
Leptospirosis anictérica: Comienza de forma abrupta, con cefalea intensa y persistente, mialgias en la región lumbar y gemelar, inyección conjuntival, escalofríos y dolor abdominal que puede llegar a confundirse con abdomen agudo quirúrgico. Se presentan náuseas, vómitos y un
acentuado malestar general con postración. La fiebre es de carácter remitente alcanzando 40 ºC o más. Con cierta frecuencia se observa un exantema macular de pocas horas de duración, en el tronco. Se puede presentar confusión mental, tos, dolor toráxico o hemoptisis y exantema petequial en el paladar. La evolución de estos casos es usualmente satisfactoria en un periodo de cuatro a diez días (Céspedes, 2005).
Son muy pocos los pacientes que pasan a la segunda fase (fase inmune), donde sólo hay fiebre ligera, la cefalea es intensa, señal de meningitis sin signos neurológicos, y con dolor retro-ocular. Hay mialgias acentuadas en los músculos de las pantorrillas, en los paravertebrales y el cuello, por lo cual existe la posibilidad de confusión con una meningitis viral. Raramente se desarrollan signos neurológicos focales o de encefalitis.
A partir de la segunda semana puede desarrollarse uveítis en uno o ambos ojos, que puede seguir un curso crónico o recurrente. Se han descrito compromisos pulmonares graves como hemoptisis franca, hipoxemia e insuficiencia respiratoria aguda.
Leptospirosis ictérica (Síndrome de Weil): Es la forma más grave de la enfermedad, se caracteriza por las alteraciones de la función hepática y renal, desarrollo de hemorragias, colapso vascular, alteraciones graves de la conciencia y una mortalidad aproximadamente de 5 - 40%.
El inicio de la enfermedad es similar a la forma anictérica, pero al cabo de tres a seis días de evolución, los síntomas alcanzan su máxima intensidad. La ictericia es una manifestación constante y está asociada con daño hepatocelular, con predominancia de la bilirrubina directa.
Con la instalación de la insuficiencia renal, puede desarrollarse delirio y convulsiones, junto con la aparición de manifestaciones hemorrágicas diversas y acentuación de la ictericia. Puede aparecer esplenomegalia acompañada de una hepatomegalia dolorosa. Algunos de los
pacientes pueden desarrollar frotes pericárdicos sin evidencia de derrames, y en los casos graves, puede desarrollarse insuficiencia cardiaca congestiva y shock cardiogénico (Céspedes, 2005).
Estudios de vigilancia prospectiva sugieren que infecciones de Leptospira spp., en humanos, en áreas endémicas es de presentación suave y asintomática (Haake y Levett, 2015).
El desarrollo de los brotes más graves depende de tres factores: condiciones epidemiológicas, susceptibilidad del hospedero y la virulencia del patógeno (Haake y Levett, 2015).
La magnitud del riesgo depende de la prevalencia de la bacteria en el reservorio y el grado de frecuencia de exposición. En muchas ocasiones leptospirosis es prevenible con el uso apropiado de protección personal (botas, guantes, gafas, ropa de protección) (Haake y Levett, 2015).
Ambiente.
Puede sobrevivir en el ambiente hasta 6 meses. Las especies de Leptospira spp., prefieren un ecosistema húmedo y caliente con un pH de 7,2 a 8. La supervivencia es corta en condiciones de sequedad o en temperaturas inferiores a 10°C. No sobrevive congelada en el ecosistema. (Vijayachari, Sugunan & Shiriram, 2008). Puede permanecer en suelos y camas de pajas húmedos cerca de 138 días, pero solo 30 minutos cuando estos se secan con aire. El microorganismo sobrevive por más tiempo al señalado cuando se encuentra preferentemente en aguas estancadas más que en las de corriente. La fuente de infección es casi siempre el animal mismo, el que contamina potreros, aguas, suelos y comida mediante sus secreciones como orina, secreciones
uterinas post aborto o fetos abortados (Ganoza et al., 2006). Leptospira spp., no sobrevive en orinas acidas, su viabilidad se da en orinas alcalinas por lo que animales herbívoros y que producen orinas de alto pH son los encargados de transmitir la enfermedad (Adler & De La Peña-Moctezuma, 2010).
Para la transmisión de la enfermedad la mayoría de los serotipos se valen de los roedores que conviven con el ganado o se alojan en bodegas donde se guardan alimentos de variados tipos (transmisión urinaria).
En zonas urbanas se ha relacionado con un deteriorado sistema básico de saneamiento ambiental que favorece la proliferación de roedores donde el hombre crea el medio ambiente ideal para estas plagas brindándoles constantemente fuentes de refugio, agua y alimentación (Saad, 2006).
Diagnóstico
El diagnóstico basado en los signos clínicos es difícil de establecer porque no son patognomónicos. El diagnóstico es un hecho complejo, en el que deben considerarse la epidemiología, los factores de riesgo, los signos clínicos, las lesiones y los hallazgos de laboratorio (Stanchi et al., 2007).
La eliminación de Leptospira spp., en la orina y el semen puede detectarse mediante múltiples pruebas, como el cultivo de orina, la microscopia con contraste de fases, la microscopia de campo oscuro, PCR, la hibridación de ácidos nucleicos y la inmunotransferencia. Los cultivos de orina no suelen dar resultado por la naturaleza delicada del microorganismo, y no pueden obtenerse resultados concluyentes al menos durante 6 meses (Stanchi et al., 2007).
Para la identificación por PCR del genero de Leptospira spp., se utiliza el gen rrl, correspondiente a la fracción 23S de rRNA y para leptospiras patógenas se identifica el gen hap 1 que codifica para la proteína asociada a hemolisis (Tabla 2)
Tabla 2. Secuencia de Cebadores hap1 y rrl
PCR ensayo Especificidad Gene secuencia del primer (5´3´) Pares de bases(pb)
Hap 1 PCR Patógeno hap1 5´GACCCGAAGCCTGTCGAG 3´ 262
Leptospira spp 5´GCAAGCATTACCGCTTGTGG3´
23S rRNA PCR Género rrl 5´GCAAGCATTACCGCTTGTGG3´ 482 Leptospira 5´TGTTGGGGAAATCATACGAAC3´
Adaptado de León et al., 2006. Secuencia de Primers hap1 y rrl
Las muestras de biopsia o necropsia de tejido renal pueden tratarse con tinciones argénicas de Warthin – Starry o Levaditi para el estudio microscópico. La tinción con inmunoperoxidasa se ha mostrado más sensible para identificar especies de Leptospira spp., en el riñón y el hígado del ganado bovino con una infección espontánea que la tinción argéntica de Levaditi. (Bradford, 2010).
La prueba de aglutinación microscópica (MAT) es la prueba serológica más utilizada en el diagnóstico de la leptospirosis en el ganado bovino. La prueba de MAT detecta anticuerpos frente a serovariedades específicas, pero hay reactividad cruzada entre serovariedades relacionadas, en particular dentro del mismo serogrupo. De este modo, una infección por una cepa puede aumentar el título de MAT frente a múltiples serovariedades (Bradford, 2010).
La prueba MAT presenta una sensibilidad del 41% durante la primera semana y pasa al 82% en el transcurso de la segunda a la cuarta semana y 96% los días posteriores en que se presenta la enfermedad. Varios de los pacientes que habían obtenido resultados negativos a MAT durante la segunda a cuarta semana, se volvieron positivos al obtener la muestra 30 días después de haber iniciado la enfermedad (Sehgal et al., 1999, citado en Vijayachari, Sugunan & Shiriram, 2008).
Metodología
Marco Geográfico
La explotación estudiada se encuentra en las coordenadas N 4º 45.508’, W 73º 59.964’, a una altura de 2755 msnm.
Marco Demográfico
Se realizó dos muestreos de animales domésticos, sinantrópicos y aguas, el primero se ejecutó en el segundo semestre del 2014 y el segundo a finales del primer semestre del 2015. En este último, se realizó la toma de muestras de los animales silvestres, durante un mes y del personal que tiene contacto con la finca.
Toma de Muestra en Animales Silvestres.
Se realizó un entrenamiento, con la visita al Centro de Rehabilitación de Alta Montaña, ubicado en Guasca (Cundinamarca), donde se hizo un intento de captura y capacitación en el manejo de animales silvestres. Dentro de la finca se realizaron visitas previas buscando rastros de animales silvestres y dejando cebos para evaluar la efectividad de estos. También se visitó el zoológico del Parque Jaime Duque (Bioparque Wakatá), para reconocer la materia fecal de los posibles animales silvestres (perro de agua, ardilla, guatín, comadreja) a capturar y planeación de transectos.
Para la captura de los animales silvestres se contó con previa autorización del propietario de la finca y el permiso de estudio para la recolección de especímenes de especies silvestres de la
diversidad biológica con fines de investigación científica no comercial, 1473 del 3 de diciembre del 2014 del ANLA.
Se ubicaron con anticipación, los puntos donde se iban a desarrollar los transectos, acordando con la ayuda de los biólogos, Catalina Rodríguez y Julio González de la Universidad de La Salle y los médicos veterinarios especialistas en el tema, Dr. Leonardo Arias y Dr. Diego Basa, que la mejor forma de asignarlos era rodeando las reservas, colocando 8 puntos para la reserva 1 y 8 puntos para la reserva 2, en total fueron 16 (Figura 5).
Figura 5. Localización de los puntos donde se realizaron los transectos dentro de la finca.
Previamente a la captura se realizaron visitas a la finca donde se dejaba cebo en los diferentes transectos, encontrando la ausencia de estos al otro día.
Se realizó procesamiento de la materia fecal y suelo de la reserva, recogidos en el pre-entrenamiento, para identificación del gen rrl
El tiempo de captura fue de 1 mes, dando inicio en Mayo/2015 y terminando en Junio/2015, colocando seis trampas tipo Tomahawk por transecto durante tres días, los diámetros de las trampas correspondían en centímetros, en dos de ellas, de 66 de largo * 23 de ancho * 23 de alto y en las otras cuatro, de 81 de largo * 25 de ancho * 30 de alto. Cada transecto constaba de 50 metros, en donde, las trampas se ubicaban cada 10 metros, en lugares planos que permitieran estabilidad a la trampa, donde se observaba caminos, presencia de cuevas y algún rastro de algún animal como materia fecal (Figura 6)
El esfuerzo de captura (EC), se calculó teniendo en cuenta:
NTC: Número de trampas colocadas
NM: Noches muestreo
La formula establecida fue:
EC= NTC*NM
Para calcular el éxito de captura total (ECT), se necesitó:
NTCap: Número total de capturas
NM: Noches muestreo
NTC: Número trampas colocadas
Desarrollando la ecuación: ECT= ((NTCap/NM))/NTC *100 (Sanchez, 1999, citado por Arbelaez y Ruiz, 2008)
Figura 6. Trampa tipo Tomahawk ubicada en un punto dentro del transecto
Se evaluaron y utilizaron los siguientes cebos: (Figura 7):
Hígados de pollo
Salchichón
Sardinas
Mezcla de mantequilla de maní, sardinas, esencia de vainilla y avena
Plátanos
Manzanas
Figura 7. Algunos de los cebos implementados
La puesta de las trampas se llevó a cabo en las horas de la tarde y en horas de la mañana del siguiente día, se revisaron, este proceso se realizó diariamente durante un mes.
Cada vez que se capturaba un animal, se transportaba al zoológico del Parque Jaime Duque, la trampa era cubierta con un forro negro se llevaban en una camioneta cerrada tipo furgón (Figura 8).
Figura 8. Quitando el forro de la trampa dentro de las instalaciones del zoológico del Parque Jaime Duque
Se identificó presencia de chip en los animales para evitar recaptura. Se procedió con la restricción física usando una lona y utilizando guantes de carnaza como medida de bioseguridad, posteriormente se pesó el animal para la administración de los agentes anestésicos suministrados por vía intramuscular (Figura 9 y 10).
Figura 9. Pesaje del animal
Figura 10. Restricción física de la zarigüeya
Se manejó un protocolo anestésico con Ketamina (Ketamina 50®, Holliday Lab) (20 mg/kg) y Xilacina (10 mg/kg) (Rompun®, Bayer Lab), intramuscular (Figura 11) (Carpenter, 2006) (Anexo 1).
Figura 11. Restricción química
Una vez anestesiado el animal se realizó monitoreo de los signos vitales con el uso del fisiógrafo, con monitoreo de frecuencia cardiaca, respiratoria y temperatura, para garantizar la integridad del animal.
Se tomó muestra de sangre (máximo el 1% del peso corporal) de la vena femoral y/o coccígea en tubos vacutainer tapa roja, se introdujeron en la cava de poliestireno que contenía geles de hielo y se transportó a el laboratorio de Cultivos Celulares (LabCell) de La Universidad de La Salle para la obtención del suero (Figura 12).
Figura 12. Toma de muestra de sangre de la vena coccígea
Después de tomada la muestra se prosiguió a identificar el animal con microchip marca AVID® (Figura 13)
La orina fue recolectada en las toallas de papel que se colocaron entre la trampa y el forro utilizado para su transporte, se cortó la zona humedecida, se introdujo en un tubo cónico falcón® de 50 ml con 25 ml de SSAF y se almacenó en la cava de poliestireno que contenía geles de hielo, posteriormente se realizó el transporte al laboratorio de Cultivos Celulares (LabCell) de La Universidad de La Salle (Figura 10), y así se procedió a la identificación del gen rrl y hap 1 por medio de PCR.
Se esperó a que el animal se recuperara de la anestesia y se liberó en el mismo lugar de la captura.
Toma de muestra en animales sinantrópicos.
Se identificaron los posibles puntos donde se evidenciará mayor tránsito de roedores dentro de la finca, encontrando en el lugar donde almacenaban la comida y una gaveta que mantenían encerrada, el mayor porcentaje de materia fecal de estos animales (Figura 14), colocando allí las trampas. Se realizaron dos muestreos, el primero en un período de 8 días y el segundo por 15 días, con trampas tipo Tomahawk de 41 cm de largo*13 cm de ancho*13 cm de alto.
Figura 14. Lugar de almacenamiento de comida de los animales
Los cebos que se utilizaron fueron:
Manzana
Galletas con chips de chocolate
Salchichón
Maní
El esfuerzo de captura y el éxito de captura total se determino con las mismas ecuasiones explicadas en animales silvestres.
Una vez capturados, se trasladaron a la Universidad de La Salle, en donde se les aplicó un protocolo pre-anestésico dentro de una cava de poliestireno, colocando la trampa con el roedor capturado y una gasa bañada en Éter ® (2-5%) (Figura 15). Posteriormente se aplicó la combinación de ketamina (80 mg/kg ® IM) y la xilacina (16 mg/kg ® IM) para poder realizar la toma de sangre intracardiaca (Carpenter, 2006) (Figura 16).
Figura 15. Inducción de anestesia en el Roedor
Figura 16. Toma de muestra Intracardiaca
Posteriormente se le aplicó, al roedor, una dosis letal de ketamina, 200 mg/kg IM® y xilacina, 16 mg/kg IM® (De Segura, 2017), al observar desaparición de los signos vitales, se procedió a realizar la necropsia para obtener los riñones (Figura 17) y así desarrollar la identificación de Leptospira spp., por PCR.
Figura 17. Necropsia de Roedor
Se colocaron los riñones en solución SAAF en un tubo plástico cónico de 50 ml y el pulmón en formalina tamponada al 10%.
Toma de muestra en animales domésticos.
Se realizó examen clínico de los animales (Anexo 2), posterior a esto se tomó las muestras de orina en bovinos, por micción espontánea o estimuladas, en equinos y caninos, con la ayuda de un catéter. Las muestras de sangre se tomaron de la vena coccígea en bovinos, yugular en equinos y femoral en caninos. El muestreo fue del 10% de los grupos etarios (Vacas, novillas y terneras) en bovinos, ya que han sido diagnosticados y se les ha realizado monitoreo con anterioridad, (Briñez 2014). Las muestras de orina se almacenaron en tubos cónico falcón® de 50 ml con 25 ml de SSAF y estos se introdujeron en la cava de poliestireno que contenía geles de hielo, junto con las muestras de sangre, para transportarlas al laboratorio de Cultivos Celulares (LabCell) de
La Universidad de La Salle, con el fin de lograr la identificación del gen rrl y hap 1 por medio de PCR.
Toma de muestras de agua y ambiente.
Previo a los muestreos de agua, se realizaron las curvas de temperatura de ambiente y agua durante 24 horas de los días 2, 17 y 18 de octubre del 2014, con el uso de un termocupla. Aquí se determinó las horas donde el agua mantenía las temperaturas más altas, que se tuvieron en cuenta en el segundo muestreo.
Se identificaron los puntos de toma de muestra de agua, teniendo en cuenta los siguientes criterios de inclusión: lugares que coincidieran con el inicio del transecto, tuvieran cercanía con los animales domésticos y humanos y aguas de movimiento lento o nulo (Figura 18)
La toma de muestras de agua se realizó en tubos cónico de plástico de 50 ml (Figura 19), para determinar la presencia de Leptospira spp., se introdujeron en la cava de poliestireno que contenía geles de hielo y se transportó a el laboratorio de Cultivos Celulares (LabCell) de La Universidad de La Salle.
Figura 18. Localización de los puntos donde se realizó el muestreo de agua
Figura 19. Recolección de muestras de agua
Posteriormente se realizó medición de pH (Figura 20), curva de temperatura del agua (Figura 21) y ambiental (Figura 22) con el uso de termocupla.
Reserva 2
Figura 20. Medición de pH
Figura 22. Medición de Temperatura ambiental
Y finalmente se identificó cada punto con una bandera roja (Figura 23)
Figura 23. Identificación del punto de toma de muestra
Toma de muestra en humanos (serología).
Un profesional de la salud tomó las muestras de sangre del personal presente en la finca con previo consentimiento informado (Figura 24) (Anexo 3), se introdujeron en la cava de poliestireno que contenía geles de hielo y se transportó a el laboratorio de Cultivos Celulares (LabCell) de La Universidad de La Salle. Junto a este procedimiento, se realizó un breve cuestionario relacionado con los posibles factores asociados a la exposición de la enfermedad. (Anexo 4).
Figura 24. Toma de muestra en Humanos
Pruebas diagnósticas
Prueba de Microaglutinación (MAT).
En la prueba se utilizaron los serovares de Leptospira interrrogans: sv Canicola, Icterohaemorrhagiae, y Bratislava: Leptospira borgpetersenii sv Hardjobovis, Pomona y Grippotyphosa; mantenidos en medio EMJH®. Se realizó con la técnica de Myers 1988 modificada así (Medrano, Díaz y Dalmau, 2011):
- En una caja de microtécnica fondo en U de 96 pozuelos se agregó 50 µl de la solución madre y 50 µl de antígeno consistente en cultivos puros de Leptospira libres de aglutinación y con crecimiento de media unidad de Mc Farland.
- Se incubó por 60 minutos a 37°C en cámara húmeda.
- Se leyó en Microscopio de campo oscuro a 100X., se dio como positivo la presencia de aglutinación en más del 50% de las leptospiras
- Los sueros positivos se llevaron a titulación por series dobles desde 1:100 hasta 1:1600. El título se dio como la reciproca de la dilución mayor donde aglutiné el 50% de las leptospiras (Figura 25).
Prueba Molecular.
Se recogió 15 ml de orina, se diluyó en 15 ml de SSAF, posteriormente se centrifugó, después se descartó el sobrenadante y se adicionó 1 ml de SSAF, se agitó vigorosamente y se transfirió a un vial de 2 ml, esto se centrifugó a 20000 g., se descartó 900 µL de sobrenadante y el pellet que quedó fue usado para la extracción de ADN. Se usaron las cadenas ATCC L. interrogans (23581), L.biflexa (23582) como control positivo.
Extracción de DNA.
Para este procedimiento se utilizó el kit Genejet® (Thermo Diagnostics, USA), bajo las indicaciones del fabricante, en donde se garantizó el aislamiento de DNA de alta pureza y calidad.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Se realizó la amplificación del gen que codifica para la proteína asociada a hemolisis (hap1) relacionado con leptospiras patógenas y el gen que codifica para la porción 23SrRNA (rrl), relacionado con el género de Leptospira spp., es decir, patógenas y saprofitas.
Para evaluar la prueba de PCR se utilizó electroforesis con agarosa gel del 1% y teñido con colorante no radiactivo de EZ – Vision®. Finalmente, este proceso se observó en luz ultravioleta (Hernández-Rodríguez et al., 2011)
Resultados Factores climatológicos
El primer muestreo se realizó en octubre del 2014, con las siguientes curvas de temperatura ambiental y agua, medidas en un lapso de 24 horas, los días 2-3 de octubre/2014 (Figura 26) y 17-18 de octubre (Figura 27 y 28), en 3 diferentes puntos de la finca, donde se tomaron la muestras de agua.
Figura 26. Curva de temperatura del punto 1. Finca La Calera (Cundinamarca). 2-3 de Octubre del 2014
Los días 2-3 de octubre se registró la temperatura ambiental máxima en un intervalo de 14,1-15,4°C entre las 9:00 am hasta las 2:00 pm, este rango de tiempo coincidió con el intervalo de temperatura máxima del agua que fue de 12-15,3°C. En cuanto a la temperatura mínima ambiental fue de 8,7-9°C desde las 11:00 pm hasta las 3:00 am, a pesar de estas temperaturas bajas, la temperatura del agua mínima fue de 10,5°C.
10,7 10,6 10,5 10,8 10,710,7 10,8 10,8 10,8 12 12 12,212,513,2 15,3 13,2 13,1 12,912,111,811,511,611,511,1 8,7 8,8 9 9 10,2 10,3 10,3 10,412,4 14,1 15 14,9 14,516,1 15,413,1 13,5 13,9 12,511,711,811,911,8 9 Temper atu ra (° C) Tiempo (Hora)
