Efecto de la cerebrolisina sobre marcadores de plasticidad neuronal en un modelo animal de envejecimiento

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(1)BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA INSTITUTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS TÍTULO DE TESIS “EFECTO DE LA CEREBROLISINA SOBRE MARCADORES DE PLASTICIDAD NEURONAL EN UN MODELO ANIMAL DE ENVEJECIMIENTO”. TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE. Maestría en ciencias fisiológicas. PRESENTA BIO. LEONARDO AGUILAR HERNÁNDEZ. DIRECTOR DE TESIS Dr. Gonzalo Flores Álvarez. Noviembre, 2019.

(2) Índice 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Envejecimiento 1.1.1 Datos sobre el envejecimiento 1.1.2 Envejecimiento y salud mental 1.1.3 Alzheimer 1.2 Consideraciones del sistema nervioso central 1.2.1 Espinas dendríticas 1.2.2 Sistema límbico 1.3 Bases de la memoria 1.3.1 Plasticidad en espinas dendríticas 1.3.2 BDNF y plasticidad de espinas dendríticas 1.3.3 Sistema cortico-límbico y la memoria 1.4 Cerebrolisina 1.4.1 Mecanismo de acción de la cerebrolisina 2. ANTECEDENTES RELACIONADOS 3. JUSTIFICACIÓN 4. HIPÓTESIS 5. OBJETIVOS 5.1 General 5.2 Particulares 6. METODOLOGÍA 6.1 Pruebas de conducta 6.1.1 Actividad locomotora en ambiente novedoso 6.1.2 Prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR) 6.2 Análisis de espinas dendríticas 6.2.1 Tinción de tejidos 6.2.2 Densidad y tipificación de espinas dendríticas 6.3 Parafinado de tejidos para pruebas de inmunohistoquímica y estereología 6.3.1 Densidad neuronal 6.3.2 Inmunohistoquímica 6.4 Pruebas estadísticas 7. RESULTADOS 7.1 Conducta 7.1.1 Actividad locomotora 7.1.2 Reconocimiento de objetos novedosos 7.2 Densidad de espinas dendríticas 7.3 Tipificación de espinas dendríticas 7.4 Estereología 7.5 Inmunohistoquímica 7.5.1 BDNF 7.5.2 Óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) 7.5.3 Sinaptofisina 7.5.4 α-Sinucleína 8. DISCUSIÓN 9. CONCLUSIONES 10. BIBLIOGRAFÍA. 2.

(3) Índice de figuras Figura 1. Estimaciones del crecimiento de la población senil Figura 2. Desarrollo de las espinas dendríticas Figura 3. Vías y componentes del sistema límbico Figura 4. Componentes de una espina dendrítica madura Figura 5. Actina en el desarrollo y plasticidad de las espinas Figura 6. Transducción de señales vía neurotrofinas-TRKr Figura 7. BDNF en la plasticidad neuronal vía TrkB/PI3-K/Akt/Girdina Figura 8. Divisiones anatómico-funcionales del sistema Figura 9. Actividad de la cerebrolisina sobre la cinasa CDK5 Figura 10. Mecanismo general de acción de la cerebrolisina Figura 11. Diagrama de las diferentes fases de la prueba NOR Figura 12. Efecto de la CBL en la actividad locomotora Figura 13. Efecto de la edad en la actividad locomotora Figura 14. Efecto de la CBL en ratones seniles en la prueba NOR Figura 15. Efecto de la CBL en ratones juveniles en la prueba NOR Figura 16. Efecto de la edad en la prueba NOR Figura 17. Efecto de la CBL en la densidad de espinas dendritas. Figura 18. Efecto de la CBL en los tipos de espinas dendríticas. Figura 19. Efecto de la CBL en la densidad neuronal Figura 20. Efecto de la CBL en la presencia de BDNF Figura 21. Efecto de la CBL en la presencia de nNOS. Figura 22. Efecto de la CBL en la presencia de sinaptofisina Figura 23. Efecto de la CBL en la presencia de α-sinucleína. 3.

(4) Abreviaturas AMPA. Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico BDNF. Factor neurotrófico derivado del cerebro CBL. Cerebrolisina CNTF. Factor neurotrófico ciliar CPF. Corteza prefrontal DPS. Densidad post-sináptica GD. Giro dentado GDNF. Factor neurotrófico derivado de la glía INEGI. Instituto nacional de estadística y geografía IP. Intraperitoneal LTD. Depresión a largo plazo LTP. Potenciación a largo plazo NGF. Factor de crecimiento nervioso NMDA. Ácido N-metil-D-aspártico nNOS. Óxido nítrico sintasa NO. Óxido nítrico OMS. Organización mundial de la salud NOR. Reconocimiento de objetos novedosos SN. Sistema nervioso SNC. Sistema nervioso central. 4.

(5) Resumen El envejecimiento es un fenómeno de los seres vivos caracterizado por un declive funcional y anatómico dependiente del tiempo que involucra la acumulación de daños moleculares, celulares y sistémicos que lleva finalmente a la muerte del organismo. Según datos de la OMS la población de adultos mayores se incrementara a nivel global de un 12 a un 22% en las próximas décadas. Uno de los factores que impacta considerablemente la calidad de vida de esta población son los declives que ocurren a nivel cognitivo. Se sabe que aproximadamente un 20% de los adultos de mayores de 60 años sufren de algún trastorno mental siendo la demencia uno de los más comunes. Por lo anterior resulta importante contar con métodos de intervención terapéutica dirigida a estos factores. La Cerebrolisina (CBL) es un preparado de neuropéptidos derivados de cerebros porcinos que parece imitar la acción de los factores neurotróficos endógenos en lo que respecta a la protección y la reparación cerebral, lo cual podría suponer beneficios en cuanto al declive cognitivo que padece gran parte de la población senil. Para evaluar los efectos de la CBL en parámetros cognitivos en el envejecimiento se trabajaron con ratones C57BL6 de 18 meses de edad a los cuales se les sometió a un tratamiento de 2 meses con cerebrolisina (2ml/kg, i.p.). Posteriormente se les realizaron pruebas de actividad locomotora y la prueba NOR (Reconocimiento de objetos novedosos) para evaluar su memoria, se utilizó una parte de la población de ratones para evaluar la densidad y tipos de espinas dendríticas y otra para las mediciones de sinaptofisina, BDNF, α-sinucleina, nNOS y para estimar la densidad neuronal. Lo anterior se realizó en hipocampo región CA1, CA3, giro dentado, corteza prefrontal y amígdala, regiones que se ha visto tienen una importante participación en los procesos de memoria y aprendizaje. Los resultados muestran que los roedores tratados con cerebrolisina realizan un mejor desarrollo de las pruebas de actividad locomotora y NOR, muestran una mayor densidad neuronal en regiones límbico-corticales, un mayor número de espinas tipo hongo y menor número de espinas gruesas, presentan un mayor índice de BDNF y sinaptofisina, y cambios en los de nNOS, una tendencia hacia un incremento en la densidad neuronal en algunas regiones límbico-corticales. Lo anterior nos estaría indicando que la cerebrolisina estaría generando efectos neurotróficos en etapas seniles, lo cual podría catalogarla como una alternativa terapéutica adecuada y eficiente para mejorar la calidad de vida en la población senil.. 5.

(6) 6.

(7) 1. Introducción 1.1 Envejecimiento El envejecimiento se define como la pérdida progresiva e irreversible de las funciones corporales con un consecuente incremento de la mortalidad (Demetrius, 2006). Es la manifestación de un proceso subyacente denominado acumulación de daño celular. Algunas de las características del envejecimiento son: alteraciones en la comunicación intercelular, inestabilidad genómica, atrofia de los telómeros, alteraciones epigenéticas, pérdida de proteostasis (homeostasis proteínica), disminución en la detección de nutrientes, disfunción mitocondrial, senescencia celular y agotamiento de células madre (López-Otín, 2013). Con el tiempo, estos daños reducen gradualmente las reservas fisiológicas, aumentan el riesgo de muchas enfermedades y disminuyen en general la capacidad del individuo. A la larga, sobreviene la muerte (OMS, 2015). Por otro lado, hoy en día la mayoría de las personas puede aspirar a vivir más allá de los 60 años. En los países de ingresos bajos y medianos, esto se debe en gran parte a la notable reducción de la mortalidad en las primeras etapas de la vida y de la mortalidad por enfermedades infecciosas. En los países de ingresos altos, el aumento sostenido de la esperanza de vida actualmente y se debe sobre todo al descenso de la mortalidad entre las personas mayores (OMS, 2015). Lo anterior trae como consecuencia un incremento en la población de adultos seniles, y con ello el incremento de gastos en servicios necesarios para brindarles una calidad adecuada de vida. 1.1.1 Datos sobre envejecimiento Según datos de la OMS (2015) entre 2015 y 2050 el porcentaje de los habitantes del planeta mayores de 60 años se incrementara del 12 al 22%. En 2050 más de 1 de cada 5 personas será mayor de 60 años (OMS, 2015). Un estudio sobre la esperanza de vida de los últimos años, en comparación con décadas anteriores, prevé un incremento en la población con más de 60 años con respecto a grupos de otras edades en Polonia, Estados Unidos y Japón (figura 1 A-C) (Zielinski, 2014).. 7.

(8) Figura 1. Estimaciones del crecimiento de la población senil. A) Edades de Polonia en 2002 y su estimación para 2030. B) Edades de Japón en 1950, 2007 y su proyección para 2050. C) Edades para Estados Unidos en 1900, 1950, 2000 y su proyección para 2050. (Imágenes tomadas de Zielinski, 2014). D) Distribución porcentual de la población mexicana por grupos de edades, registros de 1970 a 2010 y sus proyecciones de 2020 a 2050 (Imagen tomada de INEGI, 2011).. Las predicciones para población mexicana no son muy diferentes, ya que en base a los datos del INEGI (2011), se ha observado una disminución en la proporción de la población de 0-14 años a partir de 1970, esperando que esta tendencia se mantenga hasta 2050. Por su parte se observa un incremento en los grupos de 15-64 años manteniéndose hasta 2020 a partir de donde empieza a descender. Finalmente el grupo de individuos de más de 65 años se proyecta con gran crecimiento en el presente siglo, indicando un futuro de envejecimiento poblacional (figura 1 D) (Consejo Nacional de Población, 2011). 1.1.2 Envejecimiento y salud mental El envejecimiento es un proceso fisiológico normal que ocasiona cambios en los circuitos neuronales en algunos casos puede generar déficits cognitivos, conductuales, en aprendizaje y en memoria (Frick, 1994; Dickstein, 2013). Se observa discapacidad cognitiva en el envejecimiento y este declive parece incrementarse progresivamente con la edad. En la población senil los trastornos neurodegenerativos afectan principalmente el sistema límbico, dedicado a la memoria como el hipocampo, la corteza parahipocampal y la corteza cingulada 8.

(9) (Markowitsch, 2000; Catani, 2013). Las manifestaciones comunes son aquellas que engloban amnesia, donde el paciente es incapaz de codificar, asociar y recuperar nueva información (amnesia anterógrada). Adicionalmente existe un grado de amnesia para eventos anteriores a el daño cerebral, pero temporalmente cercanos a este (amnesia retrograda) (Catani, 2013). Los trastornos neuropsiquiátricos representan el 6.6% de la discapacidad total en los adultos mayores de 60 años. Aproximadamente un 15% de los adultos de 60 años y más de un 20% de las personas que pasan de los 60 años de edad sufren algún trastorno mental. La demencia y la depresión son los trastornos neuropsiquiátricos más comunes en ese grupo de edad. La demencia es un síndrome que se caracteriza por la mengua de la memoria y la capacidad de pensar, trastornos del comportamiento e incapacidad para realizar las actividades de la vida cotidiana. Afecta principalmente a los ancianos, pero no es una parte normal de la vejez (OMS, 2016). La enfermedad de Alzheimer es el cuadro demencial más frecuente en los adultos mayores y es responsable del 50-60% de todos los casos de demencia. Generalmente este trastorno se presenta a partir de los 65 años y a partir de esa edad cada 5 años se va duplicando el riesgo de padecerla (INCMyNZ). A nivel estructural se ha visto que los ratones seniles presentan sinapsis más débiles y menos capaces de efectuar plasticidad a corto plazo, y por lo tanto, presentan circuitos menos eficientes (Mostany, 2013). También se ha encontrado una disminución en el número de espinas dendríticas en regiones como el hipocampo y la corteza prefrontal en el envejecimiento (Dickstein, 2013). Estudios en otras regiones como el cerebelo han mostrado que en el envejecimiento se presenta una retracción de las arborizaciones dendríticas y una disminución en el número de espinas, así como una reducción en el tamaño del soma y núcleo en células de Purkinje (Zhang, 2011). Desde un punto de vista más general, en una revisión dirigida por Escobar (2001) se menciona que las principales características observadas en un cerebro senil normal pueden ser; disminución del peso cerebral, aumento en el tamaño de los ventrículos, disminución del volumen cerebral, reducción del grosor de la substancia gris subcortical, disminución en la densidad neuronal, mayor proliferación glial y disminución del árbol dendrítico y número de espinas. Las alteraciones en la morfología dendrítica que surgen en relación a la edad pueden originar algunos de los trastornos cognitivos presentes en la vejez (Bloss, et al., 2011). 1.1.3 Alzheimer Es una enfermedad cerebral que ocasiona problemas relacionados con la memoria, el pensamiento y el comportamiento, es un trastorno que empeora con el paso del tiempo y sin embargo, no es una parte normal del envejecimiento (Alzheimer Association, 2016). Es la cuarta causa de muerte en países desarrollados y la primera causa de demencia presente entre 40 y 50% de todos 9.

(10) los casos. Actualmente existen más de 24 millones de personas con demencia y se estiman 4.6 millones de casos nuevos cada año. Debido al aumento de la esperanza de vida y del envejecimiento de la población se espera que estas cifras aumenten (Álvarez, 2008). La primera referencia de esta enfermedad es de 1906, descrita por el neurólogo y psiquiatra alemán Alois Alzheimer. El describió una mujer de 50 años que ingresó en marzo de 1901 en el hospital psiquiátrico de Frankfurt, le dio seguimiento después de que esta ingresara por paranoia, sueño progresivo y disturbios en su memoria, agresión y confusión, síntomas que mantuvo hasta el día de su muerte, 5 años después. Posterior al deceso de la paciente, el Dr. Alzheimer examinó su cerebro y descubrió varias masas anormales (actualmente conocidas como placas amiloideas) y bultos retorcidos de fibras (actualmente llamados marañas neurofibrilares) (INCMyNZ; Hippius, 2003). Esta enfermedad se caracteriza por la afectación del SNC, principalmente a nivel cortical. Se observa una disminución de la transparencia y fibrosis de las leptomeninges, con grandes lagunas subaracnoideas por los espacios dejados entre los surcos cerebrales, el cerebro se muestra pálido con disminución del peso, atrofia global, bilateral y simétrica de ambos hemisferios, con circunvoluciones atrofiadas y surcos aumentados, con un aumento en el volumen de los ventrículos, y con mayor afectación fronto-temporo-parietal (Álvarez, 2008). A nivel molecular se caracteriza por una neurodegeneración progresiva y formación de placas que contienen amiloide-β y marañas neurofibrilares compuestas de proteínas Tau hiperfosforiladas, provocando el daño neurodegenerativo por daño sináptico y pérdida neuronal (Crews, 2010). El evento clave que conduce a este trastorno parece ser la formación de un péptido conocido como amiloide-β, el cual se agrupa en placas amiloideas en los vasos sanguíneos y en la superficie exterior de las neuronas en el cerebro, evento que finalmente lleva a la muerte de las neuronas conduciendo finalmente a la demencia (BenBest). 1.2 Consideraciones del sistema nervioso central El sistema nervioso (SN) humano es considerado el más complejo y versátil de todo el organismo, se encarga de detectar cambios y estímulos en el ambiente interno y externo y generar la respuesta apropiada a ellos a través del control de músculos, órganos y glándulas. En animales más evolucionados, como los primates, surgió un aumento de capacidad en las funciones superiores como el aprendizaje, la memoria, la cognición, la autoconciencia, el intelecto y la personalidad (Crossman, 2007) 1.2.1Espinas dendríticas Las espinas dendríticas son diminutas protuberancias presentes en las dendritas de algunas neuronas y es donde se producen las sinapsis excitatorias. Cajal fue el 10.

(11) primero en descubrir y nombrar este tipo de estructuras en su primer artículo en que utilizó el método de Golgi para estudiar el cerebelo de las aves (Cajal, 1888), además propuso que las espinas dendríticas servían para conectar los axones con las dendritas. La función principal de las espinas dendríticas es compartimentar las vías de señalización sináptica y restringir la difusión de las moléculas en la región postsináptica (Martínez Pérez, 2014). A pesar de que son muy heterogéneas en tamaño y forma, generalmente consisten en una pequeña cabeza (≈1 µm de diámetro), conectada a la dendrita por un pequeño cuello (≈0.2 µm de diámetro y de 0.5 a varios micrómetros de largo). En la cabeza de la espina dendrítica se encuentran los elementos que componen las sinapsis; la terminal presináptica y la densidad postsináptica (DPS) (Yuste, 2010). Estas estructuras pueden encontrarse en neuronas como las piramidales de hipocampo y corteza, granulares, espinosas y de Purkinje, existiendo en esta última más de 200,000 espinas por neurona (Dunaevsky, 1999). Integralmente las espinas dendríticas están formadas por filamentos de actina, cuya morfología puede cambiar muy rápidamente ante cambios en los estímulos que recibe la neurona induciendo remodelación de su arquitectura. En trastornos del sistema nervioso, el mal funcionamiento de la plasticidad conduce a la morfología aberrante y/o a la alteración en el número de espinas dendríticas. Las sinapsis excitatorias se forman en las espinas en forma de hongo y contienen una importante DPS. Por el contrario, las sinapsis GABAérgicas inhibitorias están presentes en las dendritas sin espinas, el cuerpo de la neurona y los segmentos iniciales del axón, sin que se observe un engrosamiento postsináptico (Martínez Pérez, 2014). Una característica sobresaliente de las espinas dendríticas es su capacidad de cambiar de forma continuamente incluso en la edad adulta. La potenciación a largo plazo (LTP) es uno de los principales mecanismo que subyacen cambios más duraderos y eficientes en las espinas dendríticas y todo este conjunto de mecanismos parece ser la base de los procesos de aprendizaje y memoria. Las dendritas inmaduras o en desarrollo presentan pequeñas y finas protuberancias filamentosas sin cabeza de más de 3 µm de longitud denominados filopodios. Estas estructuras se caracterizan por presentar motilidad en busca de contactos sinápticos para posteriormente formar una espina dendrítica madura. Una vez que el filopodio realiza contacto con un elemento axonal su motilidad disminuye gradualmente y se estabiliza la estructura de la espina dendrítica, la cual inicialmente es delgada, larga y de cabeza pequeña (figura 2). Las respuestas de las espinas ante los estímulos que reciba, pueden ser un aumento o disminución de su número total, una redistribución a lo largo de las dendritas progenitoras o variaciones en su tamaño o forma geométrica (Soria Fregozo & Pérez Vega, 2012).. 11.

(12) F i g u r a 2 . D e sarrollo de las espinas dendríticas. a) Elongación del filopodio buscando contacto sinápticos. b) Al hacer una sinapsis el filopodio comienza a retraerse. c) Formación de la espina dendrítica madura (Imagen tomada de Harris, 1999).. 1.2.2 Sistema límbico El término “límbico” fue introducido por Thomas Willis (1664), para referirse a un borde cortical que se encuentra rodeando al tronco encefálico. Paul Broca (1878) identifico una estructura principalmente olfatoria, común en todos los mamíferos, pero, como argumentaba Broca, su función no se limita a la olfacción, a esta región le llamo “el gran lóbulo límbico”. Posteriormente James Papez (1929) mencionó que esta estructura se encargaba de representar los sentimientos. Más tarde, los avances anatómicos y fisiológicos llevaron a Papez (1937) a describir un circuito neuronal para unir la acción y la percepción con las emociones, “el circuito de Papez”, el cual consiste en el hipocampo conectándose a través del fornix con los cuerpos mamilares, los cuales se conectan, por medio del tracto mamilotalámico, con el núcleo anterior del tálamo y así de vuelta hacia la corteza cingulada. Papez sostuvo que “la corteza del giro cingular puede considerarse como la región receptiva para experimentar emociones como el resultado de impulsos procedentes de la región hipotalámica o de la formación hipocámpica” (Papez, 1937). Una década después, Paul Yakovlev (1948) propuso que la corteza orbitofrontal, ínsula, amígdala y el lóbulo temporal anterior forma una red que subyace la motivación y emociones. Finalmente, Paul MacLean incorporó el circuito de Papez y las ideas de Yakovlev en un modelo del “sistema límbico” que incluía partes del hipotálamo, el área septal, el núcleo accumbens, las áreas neocorticales y la amígdala (MacLean, 1949, 1952). El conjunto de núcleos cerebrales que regulan las emociones forman el sistema límbico y también participan en los procesos de memoria. Este incluye estructuras corticales como el hipocampo, corteza entorrinal, cingulada y olfatoria, y estructuras que se encuentran conectadas a ellas, tales como los cuerpos 12.

(13) mamilares (vía del fornix), el área septal (incluyendo el núcleo accumbens) y la amígdala. El hipotálamo y la corteza orbitofrontal están estrechamente conectadas con estructuras límbicas por lo que podrían considerarse dentro de ellas (Figura 3). El conjunto de estas estructuras se encuentra involucrado con emociones, motivación, memoria episódica y procesamiento espacial (Rolls, 2017). Este sistema junto con la corteza frontal procesa los estímulos emocionales y los integran a funciones complejas (Kandel 2000).. Figura 3. Vías y componentes del sistema límbico. (Imagen tomada de Catani, 2013).. 1.3 Bases de la memoria De manera general se le considera como aquel proceso mental que retiene y recuerda información y acontecimientos del pasado. Implica el registro, almacenamiento y recuperación para comprender y adaptarse al mundo, es una condición necesaria para desarrollar una vida independiente y productiva. El modo en que se adquiere, retiene y recupera esta información se da en respuesta a las demandas del ambiente, por lo que se podría inferir que la capacidad de adaptación de un individuo al medio es directamente proporcional a su capacidad de aprendizaje y de memoria (Varela, 2005). Con el paso del tiempo, al envejecer, se ha visto que una gran parte de las personas se quejan de una mayor frecuencia de olvidos cotidianos. Estos trastornos se vuelven graves cuando afectan de forma importante las actividades diarias de las personas. “La demencia es un síndrome caracterizado por la presencia de un deterioro de la memoria y de la actividad cognitiva” (Organización Panamericana de la Salud). Conociendo los procesos celulares que subyacen la memoria se podrían optimizar las intervenciones terapéuticas para mejorar la calidad de vida de aquella población que sufre estos declives en la memoria.. 13.

(14) 1.3.1 Plasticidad en espinas dendríticas Una hipótesis dominante sobre el mecanismo de aprendizaje es que las espinas implementan una plasticidad sináptica a largo plazo, que es específica de entrada, debido a su compartamentalización de calcio. El mecanismo celular subyacente del aprendizaje que ha sido más estudiado es la relación entre la plasticidad de espinas dendríticas y la potenciación a largo plazo (LTP). Un importante avance en este campo ocurrió en 1973, cuando se descubrió que una breve estimulación tetánica produce una plasticidad sináptica a largo-plazo que puede durar días en el hipocampo de mamíferos. Indicando que una breve y repetida estimulación de una vía sináptica produce una mejora persistente (Bliss and Lomo, 1973; Yuste, 2010). Los cambios en la morfología de las espinas dendríticas están basados en la dinámica de los filamentos de actina. Esta molécula, en las espinas de un cerebro adulto puede representar el citoesqueleto de apoyo de una estructura estable que, sin embargo, retiene el potencial para la plasticidad morfológica cuando los cambios adaptativos en la conectividad sináptica son apropiados. Durante la formación de la memoria las señales eléctricas transitorias que llevan información a través del circuito cerebral se convierten en archivos estables que están disponibles para recordarse durante muchos años. La actina es un buen candidato para mediar esta aparente transición instantánea desde una percepción fugaz a una memoria duradera (Matus, 2000). Esto debido a su habilidad para transitar entre estados dinámicos y estables de las estructuras celulares. El componente principal del citoesqueleto de una espina dendrítica es la actina, la cual se mantiene en equilibrio entre actina filamentosa (f-actina) y actina globular (gactina) (Okamoto, 2004) (Figura 4). La secuencia de eventos que ocurren durante la plasticidad en espinas dendríticas son 1) cambio de la actina en equilibrio hacia f-actina; 2) Acumulación de actina en la cabeza de la espina; 3) Expansión de espinas dendríticas. (Hayashi Yasunori & Majewska Ania, 2005). Otro elemento crucial en la plasticidad de las espinas dendríticas es la señalización intracelular mediada por calcio que junto con la estructura geométrica de la espina (como la longitud de su cuello) y la expresión de diferentes moléculas dentro de las espinas, pueden cambiar el tamaño y la duración de los flujos sinápticos de calcio regulando así la plasticidad sináptica. Se ha visto que durante la estimulación sináptica la principal fuente de entrada de calcio es a través de los canales NMDA (Sabatini, 2001). Existen tres tipos de plasticidad estructural en las espinas dendríticas; 1) generación de nuevas protuberancias; 2) expansión persistente de espinas existentes; 3) expansión transitoria de espinas existentes (Hayashi, 2005). Los receptores AMPA y NMDA son canales catiónicos no selectivos. NMDA es permeable principalmente a calcio. Generalmente la espina dendrítica es despolarizada al principio por la activación de los receptores AMPA, lo cual remueve el bloqueo por iones extracelulares de magnesio en los receptores. 14.

(15) NMDA, esto lleva a una despolarización y entrada de calcio mayor (Bloodgood, Sabatini, 2007) (Figura 5). Finalmente, la inducción de un LTP está asociada con la adición de más receptores AMPA en la membrana plasmática mientras que un LTD (Long-term depression) se asocia con una diminución en la presencia de estos receptores (Kessels & Malinow R, 2009).. Figura 4. Componentes de una espina dendrítica madura. La plasticidad en estas estructuras se basa principalmente en las cascadas de señalización inducidas por la entrada de calcio a través de los receptores AMPA y NMDA. Estas vías de señalización estarían regulando, entre otros procesos, la arquitectura de la actina y así modificando la estructura de la espina dendrítica (Imagen tomada de Rochefort & Konnerth, 2012).. Se ha visto que durante la primera semana postnatal más del 70% de las sinapsis ocurren directamente en el eje dendrítico o en la base del filopodio. Aproximadamente el 25% de las sinapsis se encuentran en ese momento en los filopodios y muchas de estas estructuras no presentan sinapsis. Durante la segunda semana postnatal las sinapsis se duplican y la mayoría ocurre en las espinas tipo stubby o gruesas. Y durante la maduración hay otra duplicación de las sinapsis, la mayoría de las sinapsis en el eje y en espinas tipo stubby desaparecen 15.

(16) y emergen las espinas dendríticas como el sitio predominante para las sinapsis de tipo excitatorias (Harris, 1999). Los mecanismos involucrados en la iniciación de los filopodios aún son desconocidos. Los cambios en la forma y tamaño de las espinas dendríticas están correlacionados con la fuerza de las conexiones sinápticas excitatorias y estos cambios dependen fuertemente de su esqueleto de actina (Hotulainen & Hoogeraad, 2010).. Figura 5. Actina en el desarrollo y plasticidad de las espinas. A) el desarrollo de la espina comienza con la iniciación y elongación del filopodio. VASP podría inducir la elongación del filopodio desde los filamentos de actina. B) mDia2 promueve la polimerización de los filamentos de actina en el filopodio. Ena/VASP y Miosina X participan en la elongación del filopodio. C) en la punta del filopodio ocurre una extensa ramificación de actina y se empieza a formar la cabeza de la espina. D) las espinas maduras aún son dinámicas pero mantienen su morfología (Imagen tomada de Hotulainen & Hoogeraad, 2010).. La neuronas de la neocorteza presentan una estructura dinámica y sus principales componentes como dendritas y estructuras sinápticas parecen tener estabilidad, sin embargo se ha visto en ciertas regiones corticales una plasticidad de circuitos específicos dependientes de la experiencia y se expresa como una plasticidad estructural neuronal, pueden surgir nuevos botones sinápticos o espinas dendríticas para formar nuevas sinapsis, o pueden desaparecer algunas estructuras similares para la eliminación de sinapsis (Holtmaat & Svoboda, 2009). 1.3.2 BDNF y plasticidad de espinas dendríticas Otro elemento que se encuentra involucrado con los procesos de consolidación de la memoria son los factores neurotróficos, de estos el que parece tener el papel principal es el BDNF. Este fue el primer factor neurotrófico purificado después del NGF, se obtuvo por primera vez de un cerebro porcino. Se observó que este era capaz de mejorar la supervivencia neuronal y el crecimiento de fibras nerviosas en cultivos de neuronas sensoriales de pollo (Yves-Alain, 1982).. 16.

(17) El BDNF contiene aproximadamente un 50% de identidad en aminoácidos con las demás neurotrófinas. Esta neurotrofina tiene una gran importancia en el desarrollo y supervivencia neuronal y participa en los mecanismos moleculares de plasticidad sináptica, principalmente en el hipocampo y la neocorteza. Debido a estos efectos que caracterizan al BDNF, podría ser una opción terapéutica en enfermedades neurodegenerativas y trastornos psiquiátricos (Binder & Scharfman, 2004).. Figura 6. Transducción de señales vía neurotrofinas-TRKr. & Reichardt, 2001).. (Imagen tomada de Patapoutian. Las neurotrofinas son consideradas como importantes mediadores moleculares en los procesos de plasticidad sináptica. El BDNF ha sido el más estudiado y se le ha asociado un rol crucial en la plasticidad dentro del hipocampo a través de la vía BDNF/TrkB/Akt donde la enzima Akt (proteína serina-treonina cinasa asociada con el crecimiento y supervivencia celular) tendría como uno de sus blancos a la proteína de unión a actina llamada Girdina, la cual está involucrada en el remodelado del citoesqueleto de actina y la migración celular. La Girdina está altamente expresada en el hipocampo y participa en la migración de la zona subgranular del giro dentado y en la zona subventricular hacia el bulbo olfatorio. Además, la Girdina interactúa con Src y la subunidad NR2B de los receptores 17.

(18) NMDA, llevando a la activación de estos receptores, proceso asociado con la plasticidad neuronal como el LTP, lo que subyace la formación de la memoria en el hipocampo. Así, BDNF incrementa la fosforilación de Girdina a través de la vía Trkb/PI3-K/Akt lo cual estaría mejorando los procesos de plasticidad neuronal (Nakai, 2014) (Figura 6 y 7).. Figura 7. BDNF en la plasticidad neuronal vía TrkB/PI3-K/Akt/Girdina. Estudios en monos han mostrado que durante el envejecimiento ocurre una disminución en la expresión de BDNF en varias regiones del cerebro como el hipocampo y la corteza frontal (Hayashi, 1997). Sin embargo, un estudio más reciente en cerebros humanos mostró que no existen diferencias significativas con respecto a la edad en los niveles del mRNA en el hipocampo, pero los niveles de expresión de su receptor especifico (trkB) disminuyen a lo largo de la vida (Webster, 2006). En estudios con ratas se ha visto que los niveles de expresión de BDNF no cambian durante la vida en el hipocampo, pero si lo hacen algunos de sus receptores específicos (Silhol, 2005). 1.3.3 Sistema cortico-límbico y la memoria A nivel anatómico, las principales regiones involucradas en los procesos de memoria y aprendizaje son las estructuras del sistema cortico-límbico. La cognición es un conjunto de procesos que nos permiten procesar la información percibida a través de los sentidos, que la almacenemos, manipulemos, recuperemos y usemos para interactuar con el mundo. Ejemplos de estos procesos son el pensamiento, la atención, la memoria, el lenguaje y el pensamiento, y son resultado de la interacción de áreas cerebrales a través de 18.

(19) circuitos neuronales del sistema cortico-límbico como corteza prefrontal, corteza cingulada, amígdala, tálamo límbico, hipocampo, núcleo accumbens, hipotálamo y los núcleos del rafe (Morgane, 2005). En humanos, la memoria episódica, memoria de un episodio en particular, requiere la habilidad para recordar eventos particulares y para distinguirlos de otros eventos. Un evento consiste de un conjunto de ítems que ocurren juntos, tal como ver un objeto particular o el rostro de una persona en un lugar particular. El contexto espacial es muy importante para la memoria episódica (Dere, 2008). El hipocampo y sus estructuras conectadas participan en la memoria episódica. El hipocampo en primates recibe proyecciones vía corteza entorrinal y giro parahipocamal, así como de la corteza perirrinal desde las terminales de muchas corrientes de procesamiento de cortezas de asociación, incluyendo áreas visuales y auditivas, la corteza prefrontal y la corteza parietal. El hipocampo es por lo tanto, potencialmente capaz de asociar representaciones de objetos juntos y representaciones espaciales. La primer eferencia del hipocampo hacia la neocorteza se origina en CA1, proyecta hacia el subiculum, la corteza entorrinal y estructuras parahipocampales, así como a la corteza prefrontal. Estas son las vías que parecen estar involucradas en el proceso de recuperar (recordar) información desde el hipocampo (Rolls, 2017). Funcionalmente, las áreas paralímbicas contribuyen a la actividad de 3 redes distintas, una de ella, la vía hipocampaldiencefálica y parahipocampal-retrosplenial, la cual está dedicada a la memoria y orientación espacial (figura 8) (Aggleton, 2008; Vann, 2009; revisado en Catani, 2013). Interesantemente, las estructuras relacionadas con los procesos de memoria y aprendizaje sufren cambios con el envejecimiento. También se ha visto que la interacción dentro de un circuito de estructuras tales como la corteza perirrinal, hipocampo, corteza media prefrontal y el tálamo medial dorsal son importantes para la memoria de reconocimiento asociada a objetos y lugares novedosos (Warburton, 2015).. Figura 8. Divisiones anatómico-funcionales del sistema (Imagen tomada de Catani, 2013).. 19.

(20) 1.4 Cerebrolisina La Cerebrolisina (CBL) es un preparado de neuropéptidos derivados de cerebros porcinos que parece imitar la acción de los factores neurotróficos endógenos en lo que respecta a la protección y la reparación cerebral. Se obtiene mediante una degradación enzimática normalizada de proteínas cerebrales purificadas y contiene péptidos de bajo peso molecular (<10 kDa) y aminoácidos libres. Este fármaco, a diferencia de los factores naturales, atraviesa la barrera hematoencefálica y ejerce efectos pleótropos de neuroprotección y neurorregeneración después de su administración periférica (Masliah, 2012). La solución se comercializa, lista para su inyección o infusión en varios países de todo el mundo y contiene 215,2 mg de concentrado del ingrediente farmacéutico activo por mililitro (EVER Neuro Pharma GmbH, 2017). Los efectos farmacológicos que produce la cerebrolisina en el SNC fueron analizados en una extensa revisión por parte de Álvarez y Fuentes (2011) quienes encontraron que este fármaco reduce los depósitos de beta amiloide, la hiperfosforilación de la proteína tau y las alteraciones neurohistológicas relacionadas con el Alzheimer. Asimismo, modula la neuroinflamación al contrarrestar la activación de la microglía y la liberación de citosinas proinflamatorias. También imita la acción de los factores neurotróficos siguientes; factor de crecimiento neural (NGF), factor de crecimiento insulínico (IGF-I) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), entre otros. Protege frente al daño oxidativo y excitotóxico, aumenta la actividad de la catalasa y de la SOD, enzimas antioxidantes. Aumenta el aporte, actividad bioeléctrica y captación de glucosa al cerebro, al modular la expresión en la barrera hematoencefálica del gen SLC2A1. Posee propiedades antiapoptóticas, estimula la neurogénesis, mejora la plasticidad neuronal y evita la pérdida dendrítica y sináptica, aumenta la supervivencia neuronal al proteger contra la apoptosis y degeneración y mejora el aprendizaje y memoria, esto al imitar la acción de factores neurotrópicos (Álvarez y Fuentes, 2011; Masliah, 2012; Plosker, 2009). En general, la cerebrolisina ha sido bien tolerada en estudios clínicos, las reacciones adversas más frecuentemente reportadas son: mareo, dolor de cabeza, transpiración y náuseas, efectos secundarios similares a los de la mayoría de fármacos (EVER Neuro Pharma GmbH, 2017). La dosis más apropiada de cerebrolisina (para tratar Alzheimer) es de 10 ml/día y se puede administrar hasta 30 ml/día en pacientes graves. El tratamiento más recomendado es de 20 infusiones intravenosas (5 días/semana durante 4 semanas) con periodos sin tratamiento entre los ciclos (Álvarez y Fuentes, 2011).. 20.

(21) 1.4.1 Mecanismo de acción de la cerebrolisina Los mecanismos bioquímicos por los cuales la cerebrolisina ejercen sus efectos neurotróficos aún no han sido completamente aclarados. Parece imitar la función de algunos factores neurotróficos tales como el NGF, BDNF, GDNF, CNTF. Los factores neurotróficos ejecutan sus acciones al unirse con sus receptores, lo cual activa cascadas de señalización intracelulares que culmina con la promoción de la supervivencia, el bloqueo o inducción de la apoptosis, y la diferenciación celular en el sistema nervioso central y periférico (Figura 9 y10) (Luna-Muñoz, 2010).. Figura 9. Actividad de la cerebrolisina sobre la cinasa CDK5. CDK5: Cinasa 5 dependiente de ciclina; GSK3β: Glicógeno sintetasa 3 β; MNF: Marañas neurofibrilares; PPA: Precursora del amiloide β (Imagen de Luna-Muñoz, 2010).. 21.

(22) La actividad pleiotrófica de la cerebrolisina podría ser también en parte a la activación de la vía de señalización intracelular PI3K/Akt/GSK-3β, la cual regula funciones neuronales a través de los factores neurotróficos. Con la estimulación de los receptores neurotróficos, la PI3K se activa y fosforila a la Akt activándola, lo que a su vez inhibe la actividad de la GSK-3β y CDK-5 por medio de su fosforilación. Los factores neurotróficos y la GSK-3β podrían intervenir en el control de los efectos farmacológicos de la cerebrolisina (figura 9 y 10) (Álvarez y Fuentes, 2011).. Figura 10. Mecanismo general de acción de la cerebrolisina (Imagen tomada de Álvarez et al, 2011).. 2. ANTECEDENTES RELACIONADOS Durante el envejecimiento ocurre un declive en ciertas funciones cognitivas, se ha visto un declive en conductas como la consolidación de memoria y la adquisición de habilidades motoras, también se observa una disminución en la actividad exploratoria lo cual podría ser un factor que subyace la reducción de ciertas funciones cognitivas (Fahlström, et al., 2011). También ocurre un declive en ciertas funciones cognitivas, se ha visto un declive en conductas como la consolidación de memoria y la adquisición de habilidades motoras, también se observa una disminución en la actividad exploratoria, lo cual podría ser un factor que subyace la reducción de ciertas funciones cognitivas (Fahlström, et al., 2011). La primera relación entre los trastornos del neurodesarrollo y las espinas aberrantes fue establecida por Purpura (1974), quien encontró un aumento significativo de espinas delgadas y anormalmente largas sobre las dendritas de las neuronas corticales en niños con discapacidad intelectual (Revisado en Martínez Pérez, 2014). Posteriormente, se observó que en el proceso normal de envejecimiento hay una disminución progresiva en la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales corticales en ratas de 12-29.5 meses en comparación con ratas de 3 meses (Feldman, 1975). Asimismo, al evaluar la densidad de espinas dendríticas en ratas jóvenes en comparación con ratas seniles se ha observado una reducción relacionada con la edad, encontrando una 22.

(23) disminución de hasta el 30 %. También se observó que la mayor parte de las espinas susceptibles al envejecimiento son las tipo gruesas (stubby) y las delgadas (thin), mientras que las más resistentes fueron las espinas tipo hongo (Bloss, 2011). En estudios con ratones se ha visto que la densidad de espinas en neuronas piramidales se incrementa durante el transcurso de la vida adulta y permanece estable en la madures y la vejez. Además la retención a largo plazo de espinas estables es menor en ratones seniles. En promedio son espinas más pequeñas pero mantiene su capacidad de hacer conexiones sinápticas. En este trabajo se concluyó que los déficit cognitivos observados durante el envejecimiento no parecen estar asociados con una pérdida de sinapsis, sino más bien podría deberse a alteraciones en el tamaño y estabilidad de las espinas dendríticas y botones sinápticos (Mostany, 2013). Por otro lado, se ha visto que la actividad en ciertas regiones de la corteza es significativamente mejor en individuos adultos jóvenes en comparación con adultos seniles, dando evidencia clara de cambios a nivel neuronal como resultado de la edad (Park, 2004). Se ha observado también que la edad influye mucho en la conducta produciendo cambios considerables entre periodos relativamente cortos de edad, indicando que la edad es un factor crítico a considerar durante las pruebas de conducta (Shoji, 2016). También se ha demostrado que la cerebrolisina produce cambios en la morfología dendrítica de neuronas de la corteza prefrontal, hipocampo dorsal y giro dentado en roedores seniles. Estos cambios se vieron como un incremento en la longitud dendrítica total y densidad de espinas (Alcántara-González, 2012; Juárez, 2011). Se ha visto también que funciona como un tratamiento eficaz en la enfermedad de Alzheimer, trastorno neurodegenerativo más presente en la población senil, al observarse una reducción en la producción de la proteína amiloide-β en un modelo animal de Alzheimer, lo que muestra su potencial en brindar protección a la memoria de poblaciones seniles (Rockenstein, 2006). También se observó en un estudio llevado a cabo en un modelo animal de envejecimiento inducido por Dgalactosa que un tratamiento con cerebrolisina produce mejoras en la respuesta contra estrés oxidativo en el cerebro, disminuye la apoptosis y tiene un efecto positivo en la memoria, el aprendizaje y la actividad locomotora (Pourmemar, 2017). Se ha visto que la cerebrolisina es capaz de reducir los productos de peroxidación lipídica, limitar la disminución de glutatión, disminuir los niveles de óxido nítrico y caspasa 3, prevenir el declive de BCL-2, disminuir la presencia de quimiocinas, restaurar la actividad de la acetilcolineterasa, disminuir la expresión de TNF-α (Tumor Necrosis Factor) y prevenir la pérdida de tirosina hidroxilasa, en un modelo animal de estrés oxidativo (Abdel-Salam, 2014).. 23.

(24) 3. JUSTIFICACIÓN El envejecimiento es una etapa de la vida que provoca un declive anatómico y fisiológico que provoca una mayor susceptibilidad a enfermedades y una menor calidad de vida. Se ha predicho que a nivel mundial entre 2015 y 2050 el porcentaje de los habitantes mayores de 60 años se incrementara del 12 al 22%. Tan solo en 2020, el número de personas de 60 años o más será superior al de niños menores de 5 años y en 2050 más de 1 de cada 5 personas será mayor de 60 años. El panorama en México no es muy diferente, ya que se observa una disminución en la proporción de la población en edades de 0-14 años a partir de 1970 esperando que la tendencia se mantenga hasta 2050. Por su parte, el grupo de individuos de más de 65 años que estaba muy poco presente en el siglo pasado se proyecta con gran crecimiento en el presente siglo. Por otro lado, se ha visto que más de un 20% de las personas que pasan de los 60 años de edad sufren algún trastorno mental, principalmente la demencia, síndrome que se caracteriza por la mengua de la memoria y la capacidad de pensar, trastornos del comportamiento e incapacidad para realizar las actividades de la vida cotidiana. La cerebrolisina es un fármaco que parece imitar la acción de los factores neurotróficos endógenos que dan protección y reparación al sistema nervioso central. Diversos estudios han demostrado su eficacia en pacientes con algún tipo de demencia, sin embargo aún no se han realizado estudios de los cambios que este produce a nivel de espinas dendríticas en regiones límbicas, factores esenciales para la memoria y aprendizaje, entre otras funciones.. 24.

(25) 4. HIPÓTESIS La cerebrolisina, al ser un fármaco que parece mimetizar la acción de los factores neurotróficos endógenos del cerebro tendrá un efecto positivo en marcadores de plasticidad neuronal a nivel de sistema nervioso central en un modelo animal de envejecimiento.. 5. OBJETIVOS 5.1 General Analizar el efecto que ejerce un tratamiento con cerebrolisina sobre marcadores de plasticidad neuronal en un modelo animal de envejecimiento.. 5.2 Particulares  . . . Evaluar el efecto de la cerebrolisina en un modelo animal de envejecimiento sobre la actividad locomotora y la memoria. Analizar el efecto de la cerebrolisina en un modelo animal de envejecimiento sobre la densidad y tipos de espinas dendríticas en regiones límbico-corticales. Examinar el efecto de la cerebrolisina en un modelo animal de envejecimiento sobre la inmunoreactividad a sinaptofisina, nNOS, αsinucleína y BDNF en regiones límbico-corticales en un modelo animal de envejecimiento. Estimar la densidad neuronal en regiones límbico-corticales de un modelo animal de envejecimiento tratados con cerebrolisina. 25.

(26) 6. METODOLOGÍA Se utilizaron ratones machos de la cepa C57BL6 de 18 meses de edad los cuales fueron mantenidos en condiciones de temperatura (24°C) y humedad (30-70%) constantes, un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con libre acceso a agua y alimento. Todas las actividades de manejo y cuidado de los animales se realizaron bajo los lineamientos que establece la norma oficial Mexicana NOM-062-ZOO (1999). Los roedores fueron divididos de forma aleatoria para integrar los dos grupos de trabajo; un grupo fue tratado con cerebrolisina (2ml/1000gr de peso; Ever Neuro Pharma GmbH, Unterach, Austria) y el otro grupo se administró con un volumen equivalente de solución salina (solución Hartmann, PiSA Farmaceutica, México). La administración se realizó vía intraperitoneal durante 5 días a la semana en un horario de 9:00 am – 12:00 pm por un periodo de 2 meses. Antes de darse inicio al tratamiento respectivo los animales fueron sometidos a pruebas de actividad locomotora y memoria, mismas pruebas que repitieron una vez terminado el tratamiento. Finalizadas las pruebas de conducta post-tratamiento se procedió a practicar la eutanasia a los animales utilizando una sobredosis de pentobarbital sódico (75 mg/kg ip) para su posterior perfusión y obtención de cerebros en base a los protocolos que se describen más adelante. 6.1 Pruebas de conducta Estas pruebas se realizaron entre las 9:00 am y las 12:00 pm antes y después de los respectivos tratamientos. Para estas pruebas se utilizó una caja de 40 cm3 dividida en 16 cuadrantes iguales. Cada actividad fue grabada con una videocámara marca Sony modelo DCR-SX21 para su posterior análisis. 6.1.1 Actividad locomotora en un ambiente novedoso La prueba se realizara entre las 9:00 y las 12 horas. Antes de iniciarse la prueba, los animales se colocaron durante 30 minutos en el sitio donde se llevaron a cabo las pruebas con la finalidad de que se aclimataran. Posteriormente cada ratón fue colocado en la caja de pruebas durante diez minutos para cuantificar su actividad locomotora en un ambiente novedoso. Todos los roedores fueron colocados en el centro de la caja al inicio de cada prueba tal como se muestra en la figura 11a. En esta prueba se cuantificó el número de cuadrantes recorridos durante los 10 minutos de la prueba y este número se multiplicó por 10 que son los centímetros que mide cada cuadrante. De este modo se obtuvo una estimación de la distancia recorrida en centímetros durante 10 minutos.. 26.

(27) 6.1.2 Prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR) Se ha visto que los roedores gastan más tiempo explorando un estímulo novedoso que un estímulo al que han podido explorar previamente y gastaran menos tiempo en explorar el estímulo novedoso cuando se lo encuentren una segunda vez (Berlyne, 1950). Se ha hecho uso de esta característica conductual para estudiar el aprendizaje y la memoria en estos roedores e inferir así el estado en que se encuentran los procesos cerebrales que subyacen dicha conducta. La prueba de NOR permite el estudio de estos parámetros y se encuentra dividida en 3 fases: Fase 1) (Familiarización) Se coloca al animal en la caja de pruebas la cual contendrá en su interior 2 objetos iguales (objetos familiares) y se le permitirá explorarlos durante 6 minutos (Figura 11a). Fase 2) (Memoria a corto plazo) Se realiza aproximadamente 2 horas después de la fase 1. En esta se cambia uno de los objetos familiares por un objeto novedoso y posteriormente se vuelve a introducir al roedor y se le permite la exploración durante 6 minutos (Figura 11b). Fase 3) (Memoria a largo plazo) Se realiza aproximadamente 24 horas después de la fase 2. En esta fase el objeto novedoso es cambiado por otro objeto diferente (nuevo objeto novedoso) y nuevamente se introduce al ratón y se le permite la exploración de los objetos durante 6 minutos (Figura 11c). En todas las fases, los animales se colocaron en una de las esquinas de la caja al inicio de la prueba de tal modo que se encontraran a la misma distancia de los dos objetos (Figura 11). Los objetos se colocaron de tal forma que la distancia que exista entre ambos objetos y la pared de la caja fuera la misma. Todas las fases fueron videograbadas para su posterior análisis, en el cual se cuantificó el tiempo que el roedor le dedica a cada objeto mediante conductas exploratorias. Previo a que se iniciara la prueba, con cada ratón tanto la caja como los objetos fueron debidamente limpiados para eliminar algún sesgo derivado de la percepción olfativa de los roedores anteriores.. 27.

(28) Figura 11. Diagrama de las diferentes fases de la prueba NOR. Fase 1 de la prueba de reconocimiento de objetos (a) en donde ambos objetos son igual; la fase 2 en donde se coloca un objeto novedoso y se retira uno familiar (b); y la fase 3 en la cual el objeto novedoso se reemplaza por otro nuevo objeto novedoso diferente al anterior (c). Puede observarse que el roedor se coloca en la misma región de la caja en todas las fases.. Una vez terminadas las pruebas de conducta post-tratamiento se procedió al sacrificio de los animales para las pruebas correspondientes las cuales se describen a continuación.. 6.2 Análisis de espinas dendríticas 6.2.1 Tinción de los tejidos Para este análisis se utilizó la tinción de Golgi-Cox, la cual se fundamenta en el uso de metales pesados, los cuales sufren un proceso de redución lo cual tiñe de negro en su totalidad (incluso espinas dendríticas) a todas aquellas neuronas que hayan incorporado la tinción. Esta técnica tiene la característica de teñir aproximadamente solo el 1% de toda la población neuronal, lo que permite el estudio más personalizado de una neurona completa (Das, 2013). Para esta tinción los animales que fueron destinados para el este análisis fueron perfundidos con 60-80 ml de solución salina (Hartmann, PISA Farmacéutica, México) a través del ventrículo izquierdo. Posterior a la perfusión se obtuvieron los cerebros y fueron colocados en la solución Golgi-Cox por 30-40 días. Posteriormente se colocaron en una solución de sacarosa al 30% durante 6-8 días, para que el tejido adquiriera una consistencia más suave de modo que fuera posible obtener cortes histológicos. De esta forma, una vez que los cerebros salieron de la solución de sacarosa se procedió a realizar cortes coronales de 200 μm de grosor usando un vibratomó marca Leica. Los cortes obtenidos se colocaron en laminillas tratadas previamente con gelatina al 4%, durante este procedimiento los cortes se mantuvieron en una cámara húmeda, para evitar su deshidratación hasta realizar la siguiente parte del protocolo, la cual consistió en revelar la tinción. Para este procedimiento las laminillas con los cortes fueron sumergidas en las siguientes soluciones de forma consecutiva. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.. Agua destilada, 1-3 minutos. Hidróxido de amonio, 30 minutos. Agua destilada, 1-3 minutos. Fijador rápido de Kodak para película fotográfica, 30 minutos Agua destilada, 1-3 minutos. Alcohol al 50%, 5 minutos. Alcohol al 70%, 5 minutos. Alcohol al 90%, 5 minutos. Alcohol al 100%, 10 minutos. 28.

(29) 10. Alcohol al 100%, 10 minutos. 11. Xileno, 15 minutos. Finalmente a las laminillas se les colocó resina sintética y un cubreobjetos sobre la resina en los cortes ya revelados, estas laminillas fueron conservadas en oscuridad hasta el secado de la resina. 6.2.2 Densidad y tipificación de espinas dendríticas Se utilizó un microscopio óptico adaptado con una cámara translucida (Leica modelo DMSL) con un objetivo de 100X para realizar la densidad de espinas dendríticas. Para el análisis de tipos de espinas dendríticas se usó un microscopio similar pero con un magnificador 2X integrado y un objetivo de 100X. La localización de las regiones de interés se hizo en base al atlas estereotáxico de Paxinos y Watson (1998) y al BRAIN MAPS: Structure of the Rat Brain de Swanson (2004). Para realizar la cuantificación de espinas dendríticas se localizó la dendrita más distal al soma neuronal y se dibujaron todas las espinas dendríticas presentes en las 30 µm de dendrita más distal para después calcular el promedio de espinas dendríticas en 10µm. Posteriormente esa misma dendrita se enfocó a 200X para proceder a realizar la tipificación de las 100 espinas dendríticas más distales en base a los siguientes parámetros: 1. Espinas delgadas. Aquellas que presentaban una cabeza pequeña y un cuello largo 2. Espinas hongo. Aquellas que presentaban una cabeza de gran tamaño y un cuello pequeño 3. Espinas gruesas. Aquellas que no presentan una distinción entre cabeza y cuello, además de ser de pequeño tamaño 4. Espinas bifurcadas. Aquellas que se encuentren bifurcadas 5. Espinas sin clasificación. Aquellas que no entren en las clasificaciones anteriores. Se analizó un segmento dendrítico por cada neurona seleccionada, en total se tomaron 5 neuronas por hemisferio cerebral por cada muestra para un total de 10 segmentos dendríticos por cerebro.. 6.3 Parafinado de los tejidos para inmunohistoquímica y estereología Una vez terminadas las pruebas de conducta postratamiento a los roedores que serían utilizados para las pruebas de estereología e inmunohistoquímica se les aplicó la eutanasia utilizando pentobarbital sódico. Posteriormente fueron perfundidos con parafomaldehído al 4%, se obtuvieron sus cerebros y fueron colocados también en paraformaldehido 4% por 4-30 días. Posteriormente los 29.

(30) cerebros fueron seccionados en 2 y fueron parafinados, este proceso se realizó en la Facultad de Ciencias Químicas de la BUAP mediante el uso de un histokinec para parafinar tejidos. Posteriormente se realizaron cortes de 10 y 50 µm de grosor con ayuda de un micrótomo marca Leica modelo 2000. Los cortes se colocaron en laminillas tratadas con polilisina 10%.. 6.3.1 Densidad neuronal Las laminillas con cortes de 50 µm se utilizaron para cuantificar el número de neuronas por región de interés, para lo cual se les aplicó la tinción de Nissl siguiendo el procedimiento siguiente:. 1. Desparafinar cortes -Xileno, 10 minutos -Xileno, 10 minutos 2. Hidratar cortes -Agua destilada, 5-10 minutos 3. Teñir los cortes -Violeta de cresilo %5, 2 minutos 4. Deshidratar cortes -Alcohol etílico al 70 %, 10 minutos -Alcohol etílico al 96 o 100%, 10 minutos 5. Aclarar cortes -Xileno, 10 minutos 6. Montar los cubreobjetos con resina sintética. Una vez secas las laminillas con los tejidos se procedió a realizar el análisis de densidad neuronal, esto se logró a través de un análisis de estereología. Para este propósito se utilizó un microscopio marca Olympus BH2 con una cámara digital ajustada a un sistema de análisis de imágenes para estereología asistido por computadora (Stereo Investigator System; MicroBrightField, Williston, VT). Los datos obtenidos se expresaron como población neuronal estimada en base al grosor del tejido.. 6.3.2 Inmunohistoquímica Las laminillas con cortes de 10µm se utilizaron para las pruebas de inmunohistoquímica. Para llevar a cabo estas pruebas se procedió a aplicar los anticuerpos respectivos sobre los tejidos aplicando el siguiente protocolo. 1) Desparafinar 30.

(31) -Xileno 10 minutos -Xileno 10 minutos 2) Rehidratar cortes -Alcohol 100% por 10 minutos -Alcohol 100% por 3 minutos -Alcohol 96% por 10 minutos -Alcohol 70% por 10 minutos -Agua destilada (máximo 5 minutos) 3) Enjuague con buffer de fosfatos, pH 7.4 (PBS) por 5 minutos 3 lavados en PBS de 10 minutos 4) Recuperación antigénica *Colocar en Köplin de plástico con laminillas, 50mL de buffer de citratos (Amortiguador de citratos 10mM, pH 6) -En el horno de microondas se colocó el Köplin abierto dentro de un recipiente con agua -Se dejó hervir durante 3.5 minutos -Se dejó enfriar a temperatura ambiente por 5 minutos 5) Enjuague con PBS (0.1M) por 5 minutos 6) Inmersión en solución de albúmina libre de IgG 2% (en PBS)- Para eliminar la tinción inespecífica -Se secaron las laminillas en especial alrededor del corte -Se marcaron con plumón hidrofóbico alrededor de la muestra -Se colocaron dentro de la cámara húmeda -Se añadieron 150 µL de albúmina a cada corte, cubriendo la muestra hasta los bordes internos del marcador -Se dejó 20 minutos mínimo en la cámara húmeda cerrada a temperatura ambiente 7) Enjuague con PBS por 5 minutos 8) Inmersión en solución de Tritón X-100 0.2% - Para incrementar la penetración del anticuerpo a las células -Se colocó Triton 0.2% sobre los cortes durante 30 minutos 9) Enjuague con PBS por 5 minutos 10) Incubar con el anticuerpo primario por 24 horas a 4°C -Las laminillas se sacudieron y secaron -Se les colocó 150 µL de anticuerpo por cada corte o lo necesario para cubrir el tejido en su totalidad -Se dejaron en una cámara húmeda cerrada Los anticuerpos usados fueron: -Sinaptofisina -BDNF -α-sinucleína -nNOS 11) Enjuagar con PBS simple por 5 minutos 31.

(32) 12) Incubación durante 2 horas el anticuerpo secundario diluido en PBS 1X con 1% de BSA libre de IgG Los anticuerpos usados en esta sección fueron: -Anti-mouse  para sinaptofisina -Anti-goat  para BDNF -Anti-mouse  para α-sinucleína -Anti-rabbit  para nNOS 13) Enjuagar con PBS por 5 minutos 14) Montaje con VectaShield-DAPI, ≈15 μL/laminilla a oscuras 15) Sellado con barniz de uñas alrededor del cubre-objetos (Las concentraciones de los anticuerpos varían en función a las especificaciones del productor) Para la obtención de las microfotografías se utilizó un microscopio de fluorescencia (Olymus BX41) con una cámara de video acoplada y se obtuvieron usando el programaImagePro Premier. Se utilizaron 3 cortes consecutivos de cada cerebro y se analizaron 4 campos por cada región de interés utilizando un zoom de 40X, para el análisis del BDNF, α-sinucleína y nNOS se cuantificó el número de células inmunoreactivas; para analizar la sinaptofisina y la actina se cuantifico la intensidad de pixeles. Estos análisis se realizaron utilizando el programa ImageJ.. 6.4 Pruebas estadísticas Todos los resultados se expresan como la media ± el error estándar. Los datos obtenidos de las prueba de conducta se analizaron con un ANOVA de dos vías usando como factores independientes el tratamiento y la edad, cuando se encontraron diferencias significativas se utilizó la prueba post hoc de Bonferroni para las comparaciones múltiples. Para el resto de las pruebas se utilizó una prueba t-student, se consideró como diferencias significativas aquellas con una P<0.05. Las gráficas y resultados que se muestran fueron obtenidas en el programa GraphPad Prism versión 7.00.. 32.

(33) 7. RESULTADOS. 7.1 Conducta 7.1.1 Actividad locomotora En esta sección se estudiaron los cambios en la actividad locomotora producidos por el tratamiento con cerebrolisina y los cambios debidos a la edad en ratones C57BL6, los resultados se expresan como la distancia recorrida en centímetros durante 10 minutos y se analizaron usando una prueba t-student. Esta parte del estudio nos permitió confirmar que el fármaco realmente produjo algún efecto en los roedores tratados con él.. *. 2500. VH 2000. CBL. 1500. 1000. 500. u. e S. v. e. n. n. il. il. e. e. s. s. 0. J. D is ta n c ia r e c o r r id a (c m ). Al evaluar el efecto de la cerebrolisina en roedores seniles de 20 meses de edad (figura 12) se encontró que el grupo de roedores tratados con este fármaco presentaron una actividad locomotora mayor (2140 ± 166.4 cm) en comparación con el grupo control (1294 ± 141.9 cm), el análisis estadístico muestra que esta diferencia resultó ser significativa obteniéndose un valor de P menor a 0.01 (p=0.0094). Al realizar este mismo estudio en ratones juveniles de 5 meses de edad no se encontraron diferencias significativas (p=0.5586) en cuanto a la distancia recorrida (figura 12). Se observa solo una ligera tendencia de los ratones tratados con el fármaco hacia un incremento en la distancia recorrida (1883 ± 318.2 cm) en comparación con los roedores del grupo A c t iv id a d lo c o m o t o r a s e n ile s /ju v e n ile s C B L control (1715 ± 87.82 cm).. Figura 12. Efecto de la CBL en la actividad locomotora. Los resultados muestran que la cerebrolisina produce un incremento significativo en la actividad locomotora en lo ratones seniles pero no así en los juveniles.. 33.

(34) Finalmente se evaluó el impacto de la edad en la actividad locomotora entre roedores seniles (18 meses) contra juveniles (3 meses). Se observó que el grupo senil presenta un declive (1301 ± 256.5 cm) estadísticamente significativo (p=0.0145) en la distancia recorrida durante 10 minutos en comparación con los ratones juveniles (2153 ± 195.7 cm) (figura13). Comparando con los resultados obtenidos previamente se observa que el grupo de roedores seniles tratados con cerebrolisina realizaron un recorrido de 2140 ± 166.4 cm durante 10 minutos, resultado muy similar a aquellos roedores en etapa juvenil que recorrieron 2153 ± 195.7 cm.. D is ta n c ia r e c o r r id a (c m ). A c t iv id a d lo c o m o t o r a. *. 2500. 2000. 1500. Figura 13. Efecto de la edad en la actividad locomotora. Los resultados indican que hay un declive significativo en la distancia recorrida en los ratones seniles en comparación con lo juveniles.. 1000. 500. 0 J u v e n ile s. S e n ile s. 7.1.2 Reconocimiento de objetos novedosos Para tener un índice sobre el efecto de la cerebrolisina y de la edad en el estado de la memoria a corto y largo plazo se evaluó el desarrollo de la prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR) por parte de ratones C57BL6, en los resultados se muestra el índice de reconocimiento, el cual se obtiene al dividir el tiempo que pasa el roedor interactuando con el objeto novedoso entre el tiempo que pasa interactuando con el objeto familiar y el novedoso. En los gráficos se expone el índice de reconocimiento para cada una de las 3 fases de la prueba. Los resultados obtenidos se analizaron usando un ANOVA de medidas repetidas. 34.

(35) La prueba NOR aplicada a los ratones seniles tratados con cerebrolisina mostraron que en la memoria a largo plazo es en la que se presentó la mayor diferencia observándose que la cerebrolisina tiene un efecto positivo en este parámetro analizado, sin embargo las pruebas estadísticas revelan que no es un cambio significativo. Tampoco se encontraron cambios significativos entre la memoria a largo plazo con la memoria a corto plazo (Figura 14). Figura 14. Efecto de la CBL en ratones seniles en la prueba NOR. Los ratones tratados con cerebrolisina muestran un incremento nosignificativo en la memoria a largo plazo, pero no parece afectar la memoria a corto plazo.. Los resultados de la prueba NOR aplicada a los roedores juveniles tratados con cerebrolisina mostraron que la cerebrolisina parece tener un mayor efecto en la memoria a largo plazo, sin embargo es solo una tendencia ya que el análisis estadístico no mostró diferencias significativas para ninguna de las fases. De igual manera no se encontraron diferencias significativas entre la memoria a corto plazo en comparación con la memoria a largo plazo (Figura 15). Figura 15. Efecto de la CBL en ratones juveniles en la prueba NOR. El tratamiento no produjo ningún cambio entre los grupos analizados.. 35.

(36) Finalmente se hizo uso de la prueba NOR en ratones de 3 y 18 meses para conocer el impacto de la edad en la memoria a corto y largo plazo. El análisis estadístico de los resultados obtenidos muestra que en el caso de la retención de memoria a largo plazo los roedores seniles muestran una disminución significativa en comparación con los roedores juveniles (**p=0.0128), así mismo se observa que la memoria a largo resulta más afectada que la memoria a corto plazo en el caso de los roedores seniles (*p=0.0119) (Figura 16).. NO R Edades. Ín d ic e d e d is c r im in a c ió n. 1 .0. J u v e n ile s. ** 0 .8. *. 0 .6. 0 .4. S e n ile s. Figura 16. Efecto de la edad en la prueba NOR. Se observa que hay una disminución significativa en el índice de memoria a largo plazo en los ratones seniles y que este tipo de memoria se ve significativamente más afectada que a memoria a corto plazo.. 0 .2. 0 .0 F a m ilia riz a c ió n. M e m o ria. M e m o ria. c o r to p l a z o. la rg o p la z o. 7.2 Densidad de espinas dendríticas Para analizar el impacto de la cerebrolisina en la densidad de espinas se cuantificó el número de estas en 10 µm de la dendrita más distal en las regiones de interés. Este análisis permite inferir es estado de la transmisión sináptica en estas regiones, ya que es a través de las espinas dendríticas por donde se realiza la mayor cantidad de contactos sinápticos de tipo excitatorios. El análisis estadístico mostró que la cerebrolisina tiene un efecto positivo significativo en la densidad de espinas dendríticas en todas las regiones analizadas (Prueba TStudent no-pareada *P=0.0475; **P=0.022; #P=0.0001; ##P=0.0128; &P= 0.0001) (Figura 17).. 36.

(37) N ú m e r o d e e s p in a s /1 0 µ m. D e n s id a d d e e s p in a s d e n d r ític a s &. 20. ##. #. VH CBL. 15. *. **. 10. 5. 0. C. P. F. C. 3 C. P. F. C. 5 C. A. 1 C. A. 3. G. D. Figura 17. Efecto de la CBL en la densidad de espinas dendritas. El tratamiento con cerebrolisina produjo un incremento significativo en todas las regiones analizadas.. 7.3 Tipificación de espinas dendríticas Dentro de las espinas dendríticas se encuentran varios tipos de morfologías diferentes y se ha observado que la eficiencia de la transmisión sináptica que se efectúa en cada tipo de espina es diferente en función de su morfología. En consideración de este punto se cuantificaron los diferentes tipos de espinas que se encuentran en las 100 espinas dendríticas más distales. Las espinas fueron clasificadas según su morfología en tipo hongo, delgadas, gruesas, bifurcadas y sin clasificación a como se mencionó en la metodología. El análisis estadístico mostró que la cerebrolisina causa un incremento significativo en las espinas tipo hongo, para todas las regiones analizadas excepto para el giro dentado y produce una disminución de forma significativa las espinas de tipo gruesas en todas las regiones analizadas. Además se observó que el grupo tratado con cerebrolisina mostró un incremento de las espinas delgadas en el giro dentado y también un incremento de las espinas bifurcadas en las neuronas del hipocampo región CA1.. 37.