PASANTÍA EN EL LABORATORIO DE PROTEÓMICA EN EL ÁREA INSTRUMENTAL EN ESPECTROMETRÍA DE MASAS Y SÍNTESIS DE
PÉPTIDOS
LORENA REYES HEREDIA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUÌMICA BOGOTÁ D.C
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IMPLEMENTACIÓN DE UNA PASANTÍA EN EL ÁREA DE PROTEÓMICA E INGENIERÍA DE PÉPTIDOS
LORENA REYES HEREDIA
Proyecto de grado para optar al título de Licenciada en Química
Director
JULIO CESAR CALVO MOZO, QCO., DR. SC
Evaluador
ADIS AYALA, LIC. QUIM., M. BIOQUIM., DR. BIOTEC.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR LICENCIATURA EN QUIMICA BOGOTÁ D.C
3 RESUMEN
El desarrollo de la presente pasantía permite profundizar en la temática de la Investigación Científica, la cual procura dar solución a diversos problemas en el campo de la salud que aquejan a la sociedad actual. Teniendo en cuenta el enfoque de dicha pasantía en el área de Proteómica e Ingeniería de Péptidos e influenciados de acuerdo a la formación como docentes investigadores, se evidencia la importancia de implementar un adecuado reconocimiento de las bases teóricas de la Síntesis Peptídica y de las aplicaciones de la Espectrometría de Masas y de los protocolos para el correcto uso y empleo de los equipos TETRAS PEPTIDE SINTETIZER y nanoUPLC Q-Tof .Además de ello, el manejo de dichos equipos en la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, se encuentra limitado debido a la ausencia de procedimientos operativos estándar (POE), los cuales brindan beneficios como facilitar el acceso a investigadores interesados en su uso; de tal manera, que con la realización de los mismos sean desarrollados y representen una contribución como producto final al Grupo de Investigación.
INTRODUCCIÓN
Para situar la presente propuesta de trabajo de grado, planteamos la relación de la realidad tecnológica del entorno Químico del mundo actual y sus tendencias, con la Misión y la Visión de la Licenciatura en Química.
El Proyecto Curricular de Licenciatura en Química ha definido su Misión como “Formar integralmente docentes – investigadores con actitudes de liderazgo y competitividad que les permitan generar procesos de búsqueda constante de soluciones a problemas inherentes a la disciplina de la Química, sus métodos y su enseñanza, enmarcados dentro del concepto de equidad social”. Así mismo en su Visión, aunque sin una meta temporal definida, la Licenciatura en Química pretende “Formar docentes reflexivos y críticos de la realidad del país, capaces de generar aportes transformadores del entorno. Mujeres y hombres libres, éticos, autónomos y creativos que decidan y justifiquen su decisión; cuyo quehacer docente sea un verdadero compromiso profesional, laboral, familiar y sociocultural”.
En años recientes, la biotecnología y la investigación en salud y en campos que ataquen la crisis alimentaria ha suscitado un mayor interés a nivel mundial y el país no puede desvincularse de esta tendencia. Por esta razón ha aumentado el interés por las innovaciones y los avances tecnológicos. La investigación y la innovación han sido y serán cada vez más importantes para encontrar soluciones a amenazas para la seguridad humana, para aliviar la pobreza, acelerar el desarrollo y contribuir a la equidad social.
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Investigación; sin embargo, a veces hay limitaciones económicas y de tiempo que impiden cumplir los objetivos planteados, generando problemas al estudiante y al tutor.
Una vía alterna es el Trabajo de grado en la Modalidad Pasantía en un Grupo de Investigación, muy común en los países desarrollados para la formación de recurso humano (researchfellowship, postdoctoral fellowship, etc), pero sin la obligatoriedad de la producción científica, aunque su misma dinámica conlleva a esta.
1. PLANTEAMIENTO
1.1 PROBLEMA
Debido a la ausencia de Procedimientos Operativos Estándar (POE) para el correcto manejo de los equipos con los que cuenta el Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de Péptidos de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, sede de Laboratorios Macarena B; es necesario llevar a cabo el desarrollo de dichos procedimientos específicos, de tal manera que sea una contribución para la Institución, no solo para beneficiar el correcto desempeño y eficacia en el manejo de la maquinaria, sino además para la solicitud de futuras certificaciones necesarias para el laboratorio.
1.2. JUSTIFICACIÓN
Las pasantías permiten poner en práctica todos los conocimientos teóricos-prácticos adquiridos a lo largo de la carrera, lo que le hace que ésta sea fundamental para el desarrollo profesional del estudiante, además permite conocer cómo se desarrolla la vida en el área práctica, así como también para el aprendizaje de técnicas nuevas y actualizadas en el área biotecnológica.
1.2.1. INTERÉS ACADÉMICO PARA EL APRENDIZAJE DEL ESTUDIANTE:
Especialización en diferentes áreas correspondientes a la carrera como el manejo de los equipos y software empleados en la síntesis de péptidos. En la actualidad es muy importante tener conocimiento como profesional de todas las ramas que tiene esta carrera para tener un espectro más amplio de las aplicaciones del conocimiento adquirido durante el proceso académico que desembocara en la búsqueda de empleo.
1.2.3. INTERÉS Y APORTE PARA LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS GRUPO DE INVESTIGACION PROTEOMA:
5 enlace amida, o enlace peptídico. Son insolubles en disolventes no polares, pero sí lo son en agua. Existen 20 tipos diferentes de aminoácidos, los cuales, estructuralmente llevan unido un grupo carboxílico (-COOH) y un grupo amino (-NH2) al mismo átomo de carbono tetraédrico (denominado carbono α) al cual, a su vez, se encuentra unido un átomo de hidrógeno y una cadena lateral (R) (Lira Navarrete, 2007)
1.3.1.2. Enlace peptídico
Es una reacción de unión que se lleva a cabo entre dos aminoácidos que se da entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del otro, de tal manera que se forma una amida mediante la pérdida de una molécula de agua (Lira Navarrete, 2007).
1.3.2. Definición de Proteómica
Es la nueva etapa en la Investigación biológica, que caracteriza la expresión de las proteínas codificadas por un genoma y el establecimiento de sus propiedades funcionales y estructurales (Mojica, Sánchez, & Bobadilla, S.A).
El proteoma (Término que fue acuñado en el año 1995 por Wasinger) de una célula o de sus orgánulos permite obtener información sobre el conjunto de proteínas que se expresan en dicha célula u orgánulo de acuerdo a unas condiciones fisiológicas que lo caractericen en un momento determinado. El estudio comparativo del proteoma en distintos estados patológicos, con sus estados saludables, permite la identificación de cambios moleculares que pueden ser los causantes de dichos procesos patológicos. Así la combinación de los aportes de la genómica y la proteómica, permiten el avance en la industria farmacológica, minimizando los efectos secundarios (Cristobo Luaces, 2008).
1.3.3. Síntesis peptídica
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Figura 1. Equipo TETRAS. Síntesis de Péptidos con el que cuenta el Laboratorio de
Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
1.3.3.1. Grupos protectores
En la síntesis de péptidos, en indispensable contar con ciertos reactivos que por su especificidad molecular, impedirán que el proceso de como resultado polimerizaciones o contaminantes, que serán finalmente interferentes para la elucidación.
1.3.3.1.1. t-Butoxicarbonil (Boc)
Es uno de los grupos protectores que se emplea con gran frecuencia (ver Figura 2).
Figura 2. Grupo protector Boc, tomado de “Síntesis de péptidos” de E. Lira Navarrete,
2007, p. 7.
La forma común de desproteger el aminoácido Boc, es mediante una dilución con ácido trifluoroacético (TFA) a temperatura ambiente (Lira Navarrete, 2007).
1.3.3.1.2. Fluorenil-9-metoxicarbonil (Fmoc)
Los aminoácidos Fmoc (ver Figura 3), se obtienen a partir de su respectivo cloruro de acilo o alternativamente utilizando un éter de succinimida. Éste es muy estable en presencia de ácidos, pero puede ser removido en condiciones básicas, empleando 20% de piperidina en dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente.
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Figura 3. Grupo protector de los aminoácidos Fmoc, tomado de “Síntesis de péptidos” de E. Lira Navarrete, 2007, p. 8.
1.3.3.2. Síntesis de péptidos en fase sólida 1.3.3.2.1. Técnica de Merrifield
Bruce Merrifield empleó en el área de la síntesis de péptidos una técnica que consistía en ensamblar en un soporte líquido insoluble el residuo C-terminal del péptido a sintetizar, con lo cual la cadena de aminoácidos iría creciendo anclada al soporte sólido mediante una estrategia de elongación gradual. Posteriormente, el producto es desprendido del soporte, y su purificación y caracterización se llevan a cabo en solución. Aunque las reacciones se llevan a cabo en solventes orgánicos, el nombre de síntesis de péptidos en fase sólida, fue dado por el hecho de que el péptido va creciendo anclado a un soporte (Figura 4) (Lira Navarrete, 2007).
Figura 4. Proceso de la síntesis de péptidos en fase sólida, tomado de “Síntesis de
péptidos” de E. Lira Navarrete, 2007, p. 28.
8 1.3.4. Métodos de purificación de los péptidos
1.3.4.1. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
Esta técnica es útil para la determinación para la purificación y caracterización de los péptidos, es capaz de separar el péptido de interés, de una mezcla formada durante la SPPS, incluso si el péptido esperado se encuentra contaminado con otras formaciones dadas por el mismo proceso. Las principales técnicas HPLC empleadas para la separación de estas moléculas son:
1.3.4.1.1. Cromatografía por exclusión de tamaño
Este tipo de cromatografía se conoce como filtración en gel, aunque no es una técnica efectiva para separar péptidos contaminantes del péptido de interés, a menos que haya una diferencia importante en el tamaño. Pese a ser menos efectiva de las cromatografías utilizadas, puede ser implementada en las primeras etapas del proceso de purificación cuando se hace necesario deshacerse de reactivos como grupos protectores y reactivos de acople.
1.3.4.1.2. Cromatografía de intercambio iónico
Es muy útil para separar mezclas de péptidos, particularmente cuando especies cargadas han sido removidas de la secuencia esperada. Puede ser capaz de separar especies que se diferencien por solo una carga neta. Para purificación de péptidos es usualmente utilizada una columna de intercambio catiónico.
1.3.4.1.3. Cromatografía en fase reversa
Es el más utilizado para separar péptidos debido a que es generalmente superior a los otros dos en velocidad y eficiencia. Ofrece un amplio rango de manipulación de las características de la fase móvil y estacionaria para mejorar las separaciones peptídicas. En primera medida la variación de los grupos funcionales de la fase estacionaria ya que los ligandos funcionales que usualmente se encuentran en la fase estacionaria de RP-HPLC con cadenas hidrocarbonadas de 8 o 18 carbonos; sin embargo, algunos contaminantes como grupos protectores, agentes acoplantes no son exitosamente separados. Péptidos muy hidrofóbicos también presentan problemas para purificarse, ya que las interacciones con los compuestos acoplados a la fase estacionaria son muy fuertes. Para solucionar ambos problemas mencionados, se ha optado por sustituir los hidrocarburos de 8 átomos de carbono por cianopropil, el cual ha resultado muy eficiente para la purificación de los casos expuestos.
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Finalmente el efecto de la elevación de la temperatura en la purificación pues los tiempos de retención del péptido en la columna cromatográfica decrecen cuando se incrementa la temperatura, mejorando la resolución del péptido. Aumentar la temperatura previene posibles agregados del péptido y lo hace más soluble, lo que facilita su elución, especialmente si el péptido a purificar es altamente hidrofóbica. Una desventaja del incremento de la temperatura es que reduce el tiempo de vida de la columna. Combinaciones entre las cromatografías antes descritas, pueden ofrecer una purificación más eficiente. (MANT Colin T, 2007)
Figura 5. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC Merck Hitachi), con
el que cuenta el Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
1.3.5. Espectrometría de masas
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Las técnicas de ionización utilizadas para el análisis de péptidos son el bombardeo rápido de átomos (FAB por sus siglas en inglés), electrospray (ESI) y desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI).
1.3.5.1. FAB
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masas en tándem, en donde un ión producido previamente por una de las técnicas antes mencionadas, es disociado por colisiones con un gas. Los iones fragmentados son obtenidos a partir del rompimiento de los enlaces de la cadena peptídica, generando iones con el N-terminal y con el C-terminal, y a partir de una serie completa de los iones fragmentados la secuencia de aminoácidos puede ser deducida. (MOORE W.T, 1997)
Figura 6. Equipo de Espectrometría de Masas (Nano UPLC-Q-Tof), con el que cuenta el
Laboratorio de Proteómica e Ingeniería de Péptidos. Universidad Distrital Francisco José de Caldas.
1.3.5.1. Shotgun proteomics
Es el uso de técnicas para la identificación de proteínas en mezclas complejas usando una combinación de cromatografía liquida de alta resolución y espectrometría de masas. El enfoque de este estudio es evaluar cada parte de la proteína, desde sus partes fundamentales, tomando la muestra, cortándola por proteólisis con alguna enzima de reconocimiento de aminoácidos específicos (tripsina) y finalmente realizando un análisis de la mezcla de péptidos usando espectrometría de masas, que implica romper en fragmentos más pequeños el péptido para poder realizar con éxito la medición. (Marcott E. 2007)
1.3.6. Programa de cálculo de la estructura de proteínas I-TASSER
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1.3.6.1. Como predice la estructura y función
En primera medida cuando se introduce la secuencia de la proteína, el servidor intenta hacer una comparación con respecto a pliegues similares o estructuras supersecundarias, de la base de datos, con un servicio llamado LOMETS.
Los LOMETS (local Meta-Threading-Server) son un método (meta-servidor) instalado de manera local para la predicción de la estructura de la proteína. Genera estos modelos de clasificación a partir de 9 programas de roscado. Las restricciones espaciales se combinan teniendo en cuenta el consenso de las 20 mejores alineaciones de roscado. (S. Wu, Y. Zhang 2007).
En la segunda etapa los fragmentos continuos sacados de las plantillas de AP se vuelven a montar en los modelos de larga duración por réplica de intercambio de simulaciones de Monte Carlo con las regiones no alineados de roscado (bucles principalmente) construidos por modelización ab initio. En los casos en que hay una plantilla adecuada se identifica por LOMETS, I-TASSER construirá el conjunto de estructuras de modelización ab initio. Los estados de baja energía libre se identifican por SPICKER a través de la agrupación de los señuelos de simulación.
SPIKER es un algoritmo de agrupamiento para identificar los modelos de un grupo de proteínas señuelo, es decir que tiene por objeto la selección del mejor pliegue de baja energía libre de la agrupación de señuelos generada por I-TASSER. (Y Zhang, J Skolnick 2004).
En el tercer paso, la simulación del fragmento del montaje se realiza de nuevo a partir de los centroides del racimo de Spicker, donde los LOMETS y las estructuras de AP por TM-ALIGN se utilizan para guiar las simulaciones. El propósito de la segunda interacción es eliminar el choque estérico, así como refinar la topología global de los centroides del racimo. Los señuelos generados en los segundos simulaciones se agrupan a continuación, y las estructuras de energía más baja son seleccionadas. Los modelos finales se obtienen por REMO que construye los detalles atómicos de los señuelos I-TASSER seleccionados a través de la optimización de la red de enlaces de hidrógeno.
Figura 7. Protocolo del servidor I-TASSER para la predicción estructural de una proteína
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Para la predicción biológica, el programa toma los modelos 3D y los compara con 3 bibliotecas independientes, en donde las proteínas están clasificadas como: (EC) enzima conocida, (GO) vocabulario y sitios de unión al ligando. Los resultados finales de las predicciones de la función se deducen del consenso de los principales modelos estructurales con las puntuaciones de la función calculados en base a la puntuación de confianza de los modelos estructurales I-TASSER, la similitud estructural entre el modelo y las plantillas evaluadas por TM-score , y la secuencia identidad en las regiones estructuralmente alineadas.
TM-SCORE es una forma de medir la similitud estructural de dos modelos de proteínas. También mide la similitud del pliegue global y es menos sensible a las variaciones de estructura locales. Este parámetro muestra valores de 0 a 1, en donde 1 indica la combinación perfecta entre dos estructuras, mientras que las que se encuentra por debajo de 0,17 indican que no existe una relación entre la proteínas elegidas al azar. (Y. Zhang, J. correcto uso del equipo TETRAS PETIDE SINTESIZER.
Realizar un debido entrenamiento en el manejo del equipo TETRAS de síntesis automática de péptidos.
Reconocer las bases teóricas y la aplicación de la Espectrometría de masas en Proteómica.
Realizar un debido entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de proteínas para desarrollar una cartilla (POE) del equipo.
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Programas para análisis de estructura de proteínas (1). Liofilizador (1).
Sintetizador de péptidos TETRAS de AdvanceChemtech-Creosalus (1). Sistema nanoUPLC Q-Tof MS de Waters (1).
2.1.2. Reactivos.
Fmoc-AA-OH
Reactivos de Acople (DIC, HDBT, TBTU, etc.) Reactivos de acción solvente (DMF, piperidina) Resina (HMBA)
2.2. UBICACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
2.2.1. Universidad Distrital Francisco José de Caldas Área de laboratorios.
Los laboratorios de Biología y Química son una dependencia adscrita a la Facultad de Ciencias y Educación, lo cual se reglamenta por el Acuerdo 001 de Abril de 1997. Estos laboratorios se encuentran ubicados en el ala occidental del Edificio de Laboratorios de Biología y Química, Macarena B.
Los Laboratorios de Biología surgen del seno del programa de Licenciatura en Biología en 1973, dentro de una amplia dinámica organizacional tanto administrativa como académica, respondiendo a las exigencias sociales y educativas del país. Una de estas exigencias ha sido el proceso de Acreditación previa en el segundo semestre de 2000. Mediante el acuerdo 001 de Abril 04 de 1997 se reglamentan los laboratorios de la Facultad de Ciencias y Educación de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, donde se define que es un laboratorio, adscripción, personal de laboratorios, funciones del personal de laboratorios, usuarios, etc. (Universidad Distrital, 2009).
2.3. PROCEDIMIENTOS
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2.3.1 Fase No 1. Teoría de la Síntesis de Péptidos y las aplicaciones en salud y otros campos.
Las sesiones teóricas se llevaron a cabo por el profesor Julio Cesar Calvo, utilizando la revisión bibliográfica de la síntesis de péptidos, y artículos relacionados con el trabajo del grupo de investigación, en donde se hace énfasis en la creación de péptidos para la acción inmunológica contra virus que atacan especies de arroz de gran importancia para la asociación arrocera quien investiga de manera conjunta estos procesos biológicos con el fin de mitigar problemáticas de los cultivos.
Además se desarrolló un estudio detallado del manual de funcionamiento del equipo, en donde se trabajó de manera puntual en el método de calibración, partes fundamentales del equipo, grupos protectores, tipos de aminoácidos, y el software de operaciones, que es el que permite ajustar y evaluar los procesos.
2.3.2 Fase No 2. Entrenamiento en el manejo del equipo TETRAS de síntesis
TAQVSAAAQQTN” de la especie de hoja blanca de arroz de “orysa sativa” trabajada por la
profesora Nubia adscrita al proyecto de la federación arrocera. Este se realizó por la forma química Fmoc como se describe a continuación:
Inicialmente se prepararon los aminoácidos en solución diluyéndolos en los mismos solventes con los que se trabaja la resina que corresponde a la dimetil formamida o dimetil acetamina. Se pesó la cantidad de resina (RINK) y luego dentro del sintetizador se hincha con DMF durante 15 minutos en tres ciclos. Siguiendo con el proceso se realiza el primer lavado con DMF en 10 ciclos de 2 ml por 10 minutos.
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por 3 ciclos de 2 min, finalmente se Inyecta 2 ml metanol para secar la resina por 3 ciclos de 2 min. Para el clivaje se toma el protocolo dependiendo la secuencia de aminoácidos (figura 8).
2.3.2.1. Protocolo de clivaje
Se manejó el siguiente protocolo de clivaje propio para la secuencia de aminoácidos trabajado.
Figura 8. Protocolo de clivaje en la síntesis de péptidos
2.3.3 Fase No 3. Desarrollo de las bases teóricas de Espectrometría de masas y Desarrollo de las bases teóricas de Proteómica.
Las bases teóricas se obtuvieron a partir del estudio de los diferentes trabajos que realizo el grupo de investigación, además de ponencias a cargo del director del grupo Julio Cesar Calvo. Para el reconocimiento del equipo en primera medida se desarrolló un estudio detallado del manual del equipo, para explorar las generalidades de su funcionamiento, luego se estudió en más profundidad el capítulo 8 del manual titulado Protein Lynx Global Server (PLGS) para calcular los datos de la muestra, sus respectivos espectros y realizar una comparación con la base de datos incorporada en el nanoUPLC Q-Tof.
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2.3.4 Fase No 4. Entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de proteínas.
Es importante resaltar que una de las limitaciones del trabajo fue la inhabilitación del sistema de refrigeración con el cual opera correctamente el aparato, por lo que solo se trabajó en el conocimiento real del software del equipo, con muestras pasadas con anterioridad de la misma especie sintetizada previamente en el TETRAS.
De acuerdo a lo anterior lo inicial fue realizar una búsqueda de las bases de datos que se encontraban en la siguiente dirección My computer/C/PLGS 2,4/Demodbs/sprot.fas_def/, y de las que posiblemente estaban en óptimas condiciones para la operación. Luego se realizó la búsqueda de los datos tomados de la especie de hoja blanca (oryza sativa) para organizar todo el conjunto en una carpeta definida en el siguiente enlace My computer/D/RHBVrice.PRO/Data/ que sirva para posteriores trabajos. Una vez establecidas con claridad las ubicaciones de los datos y las bases, se empezó con el trabajo en el software del equipo que se conoce como PROTEIN LYNX GLOBAL SERVER. Aquí se inició abriendo el comando de Project Manager el primer pluging que se debe configurar. Luego se creó un proyecto, y se especificó el sitio donde se guardaran los datos dándole click al comando automation setup, en este punto se coloca la ubicación de las carpetas que previamente se habían reconocido. Luego de esto se crea el método para el pre procesamiento de los datos en otro pluging llamado Data Preparación aquí se especifica el método a realizar en nuestro caso Electrospray MSE, y las condiciones bajo las cuales se trabaja, que están dadas por el equipo, calibradas por default. Finalmente se guardan los cambios. Otro de los plugings utilizados corresponde al Data Bank Admintool, aquí se especifica la base de datos con la cual se trabajara y la ubicación de la misma, también se realiza un proceso de randomizacion, necesario para que el software reconozca correctamente la base de datos de interés. El último pluging corresponde a Workflow Designer, en este se crea el trabajo a realizar con las especificaciones dadas por el equipo que fueron seleccionadas por default, en este paso es fundamental incluir la base de datos randomizada, con la cual se trabajaran todas las muestras, se guardan cambios y se finaliza esa sección.
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2.3.4 Fase No 5.Teoría y entrenamiento en el programa I-TASSER para el cálculo de estructuras de proteínas.
Se trabajó a partir del servidor I-TASSER evaluando el comportamiento de una proteína de arroz de la cual se conocía el péptido lineal de secuencia SPLIHKEIKKRTK, se introdujo la secuencia en la base de datos BLAST para determinar a qué proteína correspondía, luego se introdujo en el servidor para la correcta predicción de la estructura.
3. RESULTADOS Y DISCUSION
3.1. Manejo del equipo TETRAS de síntesis automática de péptidos
Se realizó de forma correcta el péptido lineal según el protocolo del sintetizador TETRAS conociendo el fundamento teórico del proceso y determinando la importancia de cada compuesto en el adecuado procedimiento, aquí es clave resaltar que los aminoácidos deben estar a una concentración de 0.3M para garantizar el éxito del acople de los mismos a la resina, ya que es así como el equipo avala ese proceso, también deben estar disueltos en un solvente apròtico, ya que estos permiten que la molécula se solvate con cargas positivas sin interaccionar fuertemente creando puentes de hidrógeno.
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Figura 9. Protocolo de manejo del equipo TETRAS PEPTIDE SINTETIZER.
3.2. Manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de proteínas.
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Figura 10. Datos obtenidos para la muestra cMT1_RAT.
También es necesario entender el funcionamiento bajo el cual opera el equipo que hace referencia a la shotgun proteòmica, para la interpretación de los fragmentos B y Y que proporciona el espectro.
El equipo hace toda la secuenciación de la proteína desde el extracto en bruto, lo que dificulta su análisis y como la masa de un péptido no es única, es decir dos péptidos con el mismo aminoácido compartirán la misma masa, es necesaria la información sobre la secuencia del mismo. Por lo tanto, el péptido es aislado en el espectrómetro de masas, por lo general por colisión con moléculas de gas inerte (argón), para romperlo en fragmentos más pequeños. Las relaciones de masa/ carga de los fragmentos se miden y la resultante proporciona una huella dactilar referente a su secuencia peptídica especifica. Las rupturas se hacen al azar bajo la lógica de fraccionar los aminoácidos adyacentes creando una escalera de secuenciación en donde los péptidos difieren en tamaño por eliminación sucesiva. Dependiendo de la forma en que se dé el rompimiento en el péptido se considera que es Y o B ya que si la ruptura es entre el carbono del carbonilo y el nitrógeno de la amida produce fragmentos de serie Y-B la diferencia es que uno queda con el carbono terminal y el otro con la amina terminal. (Figura 10) (Marcott E. 2007)
Figura 11. Fragmentos correspondientes a series Y y B (Marcott E. 2007).
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Figura 12. Espectro de masas de la muestra cMT1_RAT.
3.3. Manejo del programa I-TASSER para el cálculo de estructuras de proteínas.
Inicialmente se determinó la secuencia de la proteína de interés, a partir del péptido obtenido con el programa BLAST, este encuentra las regiones de similitud local entre las secuencias, comparando nucleótidos o secuencias de proteínas en las bases de datos (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman 1997). A partir de esto se estableció que la proteína correspondía al dominio FHA, que se encuentra en la especie orysa sativa japonesa. Este dominio está asociado a una proteína de la cual se ha demostrado que reconoce epítopos de fosfoferrina. Está presente en una amplia gama de proteínas en células eucariotas, tales como quinasas, fosfatasas, factores de transcripción, proteínas de unión a ARN, y las enzimas metabólicas. También se encuentra en un número de proteínas bacterianas. Lo anterior sugiere que el conjunto de FHA es una medida fosfo-dependiente para complejos de proteínas como mecanismo de regulación antigua y generalizada. (Durocher D, Jackson SP 2002)
Figura 13. Datos arrojados por la base de datos BLAST de la proteína correspondiente al
péptido de interés
22 comparación con los demás es el más cercano al dato ideal.
Figura 13. Modelo del dominio FHA con c-score de -3,46 valor más cercano al dato de confiabilidad.
3.3.1. Determinación de sitios de unión al ligando
Los sitios de unión al ligando, forman interacciones que pueden modular la actividad biológica de la proteína, en muchos casos los ligando se pueden fiar en más de un sitio sobre la proteína. En el caso del dominio FHA se determinaron los siguientes sitios de unión a ligando como se muestra en la figura 14.
Figura 14. Proteína expresando los sitios de unión al ligando.
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grande ADP y GLN carbamoil-fosfato sintetasa cadena grande L-glutamina. Cada ligando está ubicado en distintas zonas de la proteína como se muestra en la tabla 1. (Jianyi Yang, Ambrish Roy y Yang Zhang. 2013) (Figura 14).
Tabla 1. Resultados arrojados por el servidor I-TASSER para los posibles sitios de unión al
ligando
Complejo Ligando vinculante Residuos del sitio
1 0.21 13 3unnAPÉPTIDO Rep , Mult 172.173.185.186.187.188.189.209.210
2 0.05 3 2jqiA PÉPTIDO N / A 172.185.186.187.188.189.209.210.250.251 3 0.05 3 1lgpA WO4 Rep , Mult 172.173.188.189.209
Figura 15. Sitios activos de la proteína dominio FHA
En este caso el servidor, arrojo 5 sitios activos correspondientes a las enzimas: 3aboA, etanolamina amoniaco-liasa, 1aorB aldehído ferroxina oxidorreductasa, 1e6yA metil coenzima M reductasa subunidad alfa, 3fn9c putativos beta-galactosidasa y 1e1yA glucógeno fosforilasa, algunos datos relevantes, se observan en la siguiente tabla.
Tabla 2. Resultados arrojados por el servidor I-TASSER para los posibles sitios activos.
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Tanto los sitios de unión al ligando como los sitios activos en la proteína, son de alta importancia para determinar la actividad biológica y establecer su uso específico. Además que las bases de datos aplicadas, que sugieren una comparación proteínica, corresponden a datos globales de gran cantidad de especies, y no solo de la especie en cuestión.
4. CONCLUSIONES
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26
Jianyi Yang, Ambrish Roy y Yang Zhang. BioLiP: una base de datos comisariada semi-manual de
las interacciones proteína-ligando biológicamente relevantes , Nucleic Acids Research, 41:
27 ANEXO A
33
95
ANEXO A Cronograma
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ACTIVIDADES INDICADOR (ES) DE
CUMPLIMIENTO
Reconocer las bases Teóricas de la Síntesis Peptídica y protocolos estandarizados para el correcto uso
96 Objetivo 3.
Identificar algunas aplicaciones de la síntesis peptídica en salud y resultados proteomicos de al menos un spot de la electroforesis bidimensional del trabajo de investigación “Aproximación Proteómica al estudio de la respuesta a la infección por el virus de la hoja blanca en dos variedades en Oryza sativa” de la Profesora Nubia F. Barrera, Lic.Quim., M.Bioquim., c. Dr.Biotec .
Capacidad de interpretación de resultados proteomicos a partir de espectrometría de
Realizar un debido entrenamiento en el manejo del sistema nanoUPLC Q-Tof y su aplicación en la identificación de proteínas.
