ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS
3.1. AMINOÁCIDOS COMO CONSTITUYENTES DE LAS PROTEÍNAS
Las células vivas producen gran variedad de macromoléculas como son las proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos, entre otros. Estas macromoléculas son biopolíme- ros constituidos por unidades monoméricas o estructurales. Para los ácidos nucleicos, las unidades estructurales son los nucleóti- dos; para los polisacáridos son los monosa- cáridos.
En virtud de que las proteínas desempeñan una amplia variedad de funciones esenciales en los organismos, las cuales describiremos más adelante, es evidente que para conocer tanto el funcionamiento normal como pa- tológico de un organismo se requiere un conocimiento claro de la estructura y pro- piedades de las proteínas.
Aunque muchas proteínas contienen otras sustancias, además de los aminoácidos, la estructura y muchas de sus propiedades bio- lógicas están determinadas por las clases de aminoácidos presentes y el orden en el que están dispuestos en la cadena polipeptídica.
Es asombroso que en una célula existan millares de proteínas con estructura y fun-
ción diferentes, pero resulta aún más sor- prendente que todas ellas estén integradas por sólo 20 aminoácidos comunes. Los ami- noácidos comunes son aquéllos para los que existe un codón específico en el código ge- nético del DNA (ver el capítulo Ácidos nu- cleicos). Los aminoácidos derivados son generados después de su incorporación a la molécula proteínica.
Además de ser las unidades estructurales de las proteínas, los aminoácidos tienen otras funciones importantes como la trans- misión de impulsos en el sistema nervioso, como material energético, y otros.
3.1.1. Estructura general
Desde el descubrimiento del primer aminoá- cido, asparagina, en 1806, habrían de pasar más de 130 años para que le llegara el turno a la treonina, con la que se cerró la lista de los 20 aminoácidos.
Un aminoácido es un compuesto que con-
tiene dos grupos funcionales: un grupo amino
y uno carboxüo. Ambos grupos están unidos
al mismo átomo de carbono, designado car-
bono a. Al carbono a de cada aminoácido
también está unido un átomo de hidrógeno y
del espárrago, alanina de alantoides) o de al- guna propiedad característica (glicina por su sabor dulce). De la denominación trivial ha surgido una abreviatura de tres letras que, da- das las técnicas modernas de secuenciación, han obligado la anotación de los aminoáci- dos por una sola letra mayúscula (tabla 3.1.).
Los aminoácidos presentes en las proteí- nas pueden clasificarse en dos grandes gru- pos dependiendo de la polaridad relativa de sus grupos R (tabla 3.2).
3.1.4.1. Aminoácidos con grupo R no polar Los aminoácidos más hidrofóbicos (no pola- res) son la fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, alanina, metionina y triptofano.
Tabla 3.2.
Clasificación de los L-a-aminoácidos presentes
en las proteínas con base a las polaridades relati-
vas de sus grupos R. Un grupo no polar es aquel
que tiene poca o ninguna diferencia de car-
ga de una región a otra, en tanto que un grupo
polar tiene una diferencia de carga relativamen-
te grande en diferentes regiones.
La mayoría de las cadenas laterales de los ca, lejos del agua de solvatación de la super- aminoácidos más hidrofóbicos están orien- ficie.
tadas hacia el interior de la molécula protei-
En la prolina el grupo R es único ya que in- corpora el grupo amino en la cadena lateral. Re- almente la prolina es un iminoácido que tiene consecuencias estructurales importantes para las proteínas como veremos más adelante.
La glicina, el más pequeño de los aminoá- cidos, puede encajar en regiones de la es- tructura tridimensional de las proteínas inaccesibles para otros aminoácidos.
3.1.43. Aminoácidos con grupo R polar con carga negativa
En esta categoría se encuentran los ácidos aspártico y glutámico.
3.1.4.4. Aminoácidos con grupo R polar con carga positiva
3.1.4.2. Aminoácidos con grupo R polar sin carga
A este grupo pertenecen aminoácidos cuya cadena lateral tiene naturaleza polar (hidro- fi'licá) como son la serina, treonina, cisteína,
asparagina, glutamina y tirosina.
Los aminoácidos que pertenecen a este gru- po son la lisina, arginina e histidina.
Las cadenas laterales de los aminoácidos
polares sin carga se encuentran en propor-
ciones significativas tanto en el interior co-
mo en la interfase de la proteína con el
disolvente. Por el contrario, los aminoácidos
polares glutamina y asparagina y los que tie-
nen grupos cargados a pH 7.0 como Usina, arginina, histidina, glutamato y aspartato se hallan predominantemente en la superficie de las proteínas globulares donde la carga se encuentra estabilizada por el disolvente acuoso. La colocación poco usual de una ca- dena lateral cargada en el interior de una proteína globular se correlaciona con un pa- pel estructural o funcional esencial.
Los grupos R con carga de los aminoáci- dos básicos y acídicos, tienen un papel clave en la estabilización de la conformación pro- teínica a través de enlaces salinos. Además, funcionan en sistemas enzimáticos que re- quieren de transmisión de cargas. Ya se ha mencionado el lugar importante de la histi- dina en la catálisis enzimática en virtud de la carga de su grupo imidazol que le permite funcionar, a pH 7.0, como base o como áci- do catalítico.
3.1.5. Aminoácidos no proteínicos
Existen aminoácidos que no forman parte de las proteínas pero que realizan importantes funciones en el metabolismo intermediario, o bien, como hormonas, neurotransmisores y otras.
3.1.5.1. Ejemplos de importancia
La omitiría funciona como intermediario en el metabolismo de la treonina, aspartato y metionina; junto con la citrulina, es un inter- mediario en la biosíntesis de la urea.
La DOPA (dihidroxifenilalanina) es un
aminoácido neurotransmisor, precursor de
la melanina y se encuentra en la vía meta-
bólica biosintética de las aminas neuro-
transmisoras: d o p a m i n a , a d r e n a l i n a y
noradrenalina.
El ácido gama-aminobutírico (GABA) es un neurotransmisor derivado del glutamato.
H
2N-CH
2-CH
2-CH
2-COOH GABA
3.2. ENLACE PEPTÍDICO
La reacción más importante de los aminoá- cidos es el enlace peptídico. Este enlace de- termina la fuerza de unión primaria de una proteína; su estructuración corresponde a una polimerización de aminoácidos, es de- cir, una proteína es un polipéptido complejo.
3.2.1. Definición
El grupo a -carboxilo de un aminoácido (RO puede unirse covalentemente al grupo a ami- no de otro aminoácido (R
2) eliminando una
molécula de agua y formando un tipo de en- lace amida conocido como enlace peptídico (fig-3.8)
3.2.2. Formación
El enlace peptídico posee una serie de inte- resantes características estructurales. Dada la resonancia del grupo carbonilo (-C-), el
o II
enlace peptídico tiene naturaleza de doble enlace parcial.
3.2.3. Estructura del etano
Si recordamos la estructura del etano (un
enlace C-C) y del etileno (doble enlace
C=C) veremos que en el primer caso, los
átomos de carbono del etano giran libremen-
te teniendo como eje el enlace sencillo; en
cambio, el doble enlace del etileno repre-
senta una estructura rígida que impide la li-
bre rotación.
3.2.4 Estructura coplanar
El enlace peptídico con la característica de ser un doble enlace parcial, determina una estructura rígida entre carbono y nitrógeno y por lo tanto es un enlace coplanar. En un po- lipéptido, los carbonos a de aminoácidos cercanos están en situación trans respecto al enlace peptídico.
3.2.5. Rotación del enlace
Así como en el enlace peptídico no puede haber rotación, sí puede haberla en torno a los enlaces C-N y C-C determinando ángu- los de conformación (y y <fr) que, en las proteínas naturales, presentan poca variabi- lidad en sus valores. Esto trae como conse- cuencia que, en un péptido, los enlaces peptídicos presentan una alternancia que de- termina una secuencia en zig-zag (fig. 3.10).
33. PÉPTIDOS 3.3.1. Definición
Cuando los grupos amino y carboxilo de los aminoácidos se combinan para formar un polipéptido. Los aminoácidos constituyen- tes se denominan residuos de aminoácidos.
Un péptido consta de dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.
En la figura 3.10 se muestra un tripéptido en el que hay que hacer notar que es aquel for- mado con tres residuos, no con tres enlaces peptídicos.
3.3.2. Clasificación
Por convención, las estructuras peptídicas se
describen a partir del residuo amino termi-
nal (grupo-NH
2libre), que se coloca a la iz-
quierda, y termina con el residuo carboxilo
terminal (grupo -COOH libre) que se coloca a la derecha. La repetición de este proceso secuencial genera un polipéptido con una secuencia de aminoácidos específica ( R
rR2-R3-R4... Rp).
Aunque existen discrepancias en la litera- tura, el término oligopéptido se reserva para moléculas con 2 a 20 residuos, polipéptido de 20 a 50 residuos y proteína a las que su- peran esta cifra.
3.3.3. Representación de estructuras Las estructuras polipeptídicas pueden repre- sentarse colocando el aminoácido inicial (el del extremo amino terminal) y a partir de és- te colocar en zig-zag los residuos en el orden secuencial correspondiente (fig. 3.11).
Como los polipétidos pueden contener un número de residuos muy elevado, es poco práctico usar las fórmulas estructurales con- vencionales. En cambio, puede utilizarse la abreviatura de tres letras (o incluso de una sola) para designar el péptido. En nuestro ejemplo (fig. 3.11) se podría escribir: Ala - Ser - Gli - Tre, o bien, A-S-G-T-.
3.3.4. Péptidos de importancia biológica En todos los seres vivos se han aislado pép- tidos de interés biológico. Uno de los más sencillos es el tripéptido glutatión (y-gluta- mil-cisteinil-glicina), en el cual el glutamo inicial está unido a la cisteína por medio del carboxilo gama (y) en lugar del alfa ( a ), co- mo ocurre con la gran mayoría de los péptidos.
Este tripéptido lleva a cabo funciones oxido- rreductoras por su grupo sulfhídrilo (-SH), se requiere para la actividad de varias enzimas y participa en el transporte de aminoácidos.
Un grupo importante es el de los péptidos cerebrales con actividad de neurotransmiso- res, como la sustancia P (decapéptido) o los analgésicos opiáceos como las endorfinas y encefalinas. Tir-Gli-Gli-Fen-Met Encefali- na (Metionina) Arg-Pro-Lis-Pro-Gln-Fen- Fen-Gli-Leu-Met Sustancia P.
La oxitocina y vasopresina son polipéti-
dos cíclicos. Los antibióticos polipeptídicos
a menudo contienen D y L-aminoácidos y
otros no presentes en proteínas, por ejemplo,
la tirocidina y gramicidina S, que contienen
D-fenilalanina y ornitina. Estos polipétidos
no son sintetizados en los ribosomas.
Otros polipéptidos importantes son las hormonas colecistocinina y gastrina, la insu- lina y glucagón, la hormona liberadora de ti- rotropina y otras.
3.4. PROTEÍNAS 3.4.1. Definición
Las proteínas constituyen sin duda uno de los grupos de moléculas de gran trascenden- cia en los seres vivos. Todas las proteínas son polipéptidos de peso molecular elevado.
Arbitrariamente, como se ha señalado antes, se ha establecido como línea divisoria entre polipétidos y proteínas un peso molecular de 8,000 y 10,000. Una proteína simple es aqué- lla que contiene sólo aminoácidos; una proteí- na compleja contiene, además, otras moléculas diferentes como el hemo (de la hemoglobi- na), vitaminas, lípidos, carbohidratos o ele- mentos minerales (metaloenzimas).
3.4.2. Importancia biomédica
Las proteínas desempeñan una amplia varie- dad de funciones que pueden agruparse en dos clases: dinámicas y estructurales. De las funciones dinámicas, la más importante es la función catalítica. De hecho, la mayor parte de las reacciones químicas celulares son catalizadas por enzimas, casi todas ellas de naturaleza proteica. En realidad, estas molé- culas son tan importantes que merecen un capítulo especial dentro de la bioquímica.
Otra función dinámica de las proteínas es el transporte, ejemplos de este grupo son la hemoglobina y mioglobina. Otras proteínas actúan como hormonas. Las proteínas tam- bién pueden funcionar con un papel protector como las inmunoglobulinas y el interferón.
Algunas participan en los mecanismos con- tráctiles como la miosina y actina. Otras tie- nen una función de reconocimiento, como es
el caso de los receptores hormonales situa- dos en la membrana celular o en el citosol.
Dentro de las proteínas estructurales se encuentran el colágeno, la elastina y la que- ratina.
Así pues, las proteínas son quizá las macro- moléculas más versátiles, que se responsabili- zan en gran parte de las funciones metabólicas y de la morfología de los seres vivos. No en vano el término proteína deriva del griego proteos que significa "primero", "primoridaT.
3.4.3. Clasificación
En la actualidad no existe un sistema de cla- sificación de las proteínas universalmente aceptado. Durante mucho tiempo se dividie- ron en simples y conjugadas. Sin embargo, en todas las proteínas, aun las más simples, casi siempre están asociadas otras moléculas llamadas grupo prostético. En esto se basa la clasificación propuesta en la tabla 3.3.
3.4.3.1. Basada en su solubilidad
Un sistema de clasificación basado en la so- lubilidad todavía está en uso, en particular en bioquímica clínica (tabla 3.4.).
Sin embargo en esta clasificación, no se puede hacer una distinción entre albúminas y globulinas únicamente en base a sus solu- bilidades en agua o en soluciones salinas.
Así, se subdividieron en seudoglobulinas (solubles al agua) y euglobulinas (insolubles en agua exenta de sales).
3.4.3.2. Basada en la forma
Otra clasificación se basa en la forma (rela-
ción entre longitud y amplitud) y en ésta se
consideran Xas proteínas globulares, de for-
ma esférica, solubles en agua, dentro de las
cuales se encuentran la insulina, albúmina y
Albúminas Solubles en agua y en soluciones salinas. Sin aminoácidos distintivos Globulinas Escasamente solubles en agua pero solubles en soluciones salinas.
Sin aminoácidos distintivos
Protaminas Solubles en etanol a 70-80% pero insolubles en agua y en alcohol etilíco absoluto. Ricas en arginina
Histonas Solubles en soluciones salinas
Escleroproteínas Insolubles en agua o en soluciones salinas. Ricas en glicina, alanina y prolina
globulinas plasmáticas y numerosas enzimas.
Las proteínas fibrosas, son de forma alarga- da, baja solubilidad en agua, resistentes a la tracción, dentro de las cuales tenemos la queratina, miosina, colágeno y fibrina.
3.43.3. Basada en sus funciones
Las proteínas se pueden clasificar de acuer- do a sus funciones en proteínas estructura- les, catalíticas ( e n z i m a s ) , reguladoras, protectoras (inmunoglobulinas), de trans- porte, etc. (tabla 3.5).
3.4.4. Importancia biológica de las proteínas, Genes y proteínas. Diversidad
Hemos mencionado el papel tan relevante y versátil de las proteínas con sus múltiples funciones. La diversidad de formas y fun- ciones proteicas que existen en una sola cé- lula, formadas a partir de 20 aminoácidos, nos indica que tal variabilidad depende de la combinación casi infinita de aminoácidos en cada una de las proteínas existentes en un ser vivo. ¿Qué determina tal variabilidad?
En los siguientes subcapítulos hablare-
mos de los niveles de organización de la es-
una cadena lateral, designada R que es dife- rente para cada uno de los 20 aminoácidos comunes excepto para la glicina (fig. 3.1).
3.1.2. Propiedades generales 3.1.2.1. Asimetría. Estereoisomería Con excepción de la glicina, para la cual R-H, los cuatro grupos unidos al carbono a de los aminoácidos son diferentes. Esta orientación tetraédrica con cuatro grupos di- ferentes alrededor del carbono a confiere actividad óptica (capacidad de rotar el plano de luz polarizada) a los aminoácidos. En la configuración absoluta, utilizando la pro- yección de Fisher, el COOH está dirigido hacia arriba y atrás del plano de la página, el grupo R de la cadena lateral se dirige hacia abajo y atrás del mismo plano, el grupo H y el grupo -NH2»
en el carbono a están dirigidos hacia el lector, si por convención el grupo ex- amino está proyectado hacia la izquierda, el aminoácido tiene la configuración absoluta. Su enantiómero óptico, con el grupo a-amino hacia la derecha tiene la configuración abso- luta denominada D, como en el D-gliceralde- hído (fig. 3.2). En las proteínas de mamífero sólo se encuentran L-a-aminoácidos.
La dificultad surgida de intentar denominar familias de isómeros ópticos con dos o más centros asimétricos ha dado lugar al estable- cimiento de un método más general de desig¿
nación estereoquímica, el sistema RS, donde los grupos unidos a un orden basado en el nú- mero atómico: SH>OH>NH
2>CDOH>CH3>H.
En todos los casos el grupo H se encuentra debajo del plano. Si los otros tres grupos se ordenan de mayor a menor prioridad en el sentido de las manecillas del reloj, el centro asimétrico es R (RECTUS en latín) y S (si- nisterenel opuesto) (ver fig. 3.3.).
Dado que los aminoácidos de las proteí- nas son asimétricos, las proteínas también tienen propiedades asimétricas.
3.1.22. Formas iónicas de los aminoácidos Los grupos amino y carboxilo de un ami- noácido pueden ionizarse. El pK del grupo amino es 9.8 y el del grupo carboxilo es 2.1.
Por tanto, dentro de los límites fisiológicos del pH, ambos grupos están cargados (fig. 3.4), constituyendo un ion dipolar o switterion (en alemán, ion híbrido).
Cabe aclarar que la estructura sin carga de un aminoácido indicada en la fig. 3.1 no puede existir a ningún pH, pero es posible usarlo por conveniencia, al describir la quí- mica de los aminoácidos.
Los aminoácidos tienen carácter anfótero,
por comportarse como ácidos o bases debi-
do a sus grupos ionizables. En los aminoáci-
dos neutros, que existen como ion dipolar,
es decir, aquella forma en la que la carga po-
sitiva es igual a la carga negativa (carga neta
tructura proteica. El primer nivel, o estructu- ra primaria, se refiere al orden de los ami- noácidos en la cadena polipeptídica. Es decir, cada proteína posee un ordenamiento o secuencia de aminoácidos bien definido pe- r o . . . ¿qué determina ese ordenamiento?
Aquí debemos detenernos y, quizá adelan- tando un poco, hablar de ese factor particular en cada célula u organismo que determina ese ordenamiento y, por ende, la gran diver- sidad de estructuras y funciones proteicas.
Ese elemento dictador de la secuencia po- lipeptídica es la unidad transmisora de los caracteres hereditarios, el gene o gen; bio- químicamente, el DNA. La información ge- nética contenida en cada célula o individuo se expresa a través de una proteína, muy fre- cuentemente de una enzima. En este sentido, las proteínas vienen a ser las ejecutoras de las ordenes dictadas por los genes. Sobre es- to se tratará más ampliamente en el capítulo de ácidos nucleicos.
3.4.5. Niveles estructurales de una proteína*
3.4.5.1. E s t r u c t u r a p r i m a r i a
La estructura primaria, ya familiar desdé la descripción de los péptidos, se refiere al or- den de los aminoácidos en la cadena poli- peptídica. La fuerza estabilizadora de esta estructura es el enlace covalente (peptídico).
En esta estructura se incluye, además de la secuencia de aminoácidos, la localización de los puentes disulfuro (cistina).
La determinación de la estructura prima- ria de una proteína es actualmente una técnica accesible a la mayor parte de los laborato- rios de bioquímica. Esto ha sido posible gra- cias a los esfuerzos de Sanger, quien en 1953 fue el primero en estudiar y determinar la estructura primaria de una proteína, la insu- lina. Ahora se conoce la secuencia completa de más de 2,000 proteínas, gracias a los méto-
dos automáticos en el análisis de aminoáci- dos introducidos por Moore y Stein en 1964.
El analizador automático de aminoácidos (secuenciador) está cediendo lugar actual- mente a sistemas basados en métodos cro- matográficos de alta eficacia, que utilizan la técnica de degradación de Edman, y los mé- todos secuenciales del gen que codifica a la proteína en estudio.
La importancia de la estructura primaria es tal que una variación en un solo aminoá- cido de una cadena polipeptídica puede de- terminar una falta letal en la proteína completa. El ejemplo clásico es el de la he- moglobina S (HbS) que tiene la sexta posi- ción de la cadena P ocupada por valina en lugar de glutámico como la hemoglobina normal (HbAí). Los individuos que tienen este defecto padecen anemia de células fal- ciformes, con una elevada hemolisis y obs- trucción de capilares por los eritrocitos anormales.
3.4.5.2. E s t r u c t u r a secundaria
Si una proteína estuviera constituida por só- lo una disposición polipeptídica lineal, su única conformación posible, fuera la fibrosa.
Sin embargo, en virtud de la estructura co-
planar del enlace peptídico y los ángulos de
rotación § y vy que regularmente toman va-
lores de 132 y 123° respectivamente, surge
una estructura particularmente estable que
es la a-hélice. En este tipo de estructura se-
cundaria, la cadena polipeptídica se pliega
adoptando una forma helicoidal con giro a la
derecha que contiene 3.6 residuos de ami-
noácidos por vuelta. Esta estructura fue pro-
puesta inicialmente por Pauling y Corey. La
máxima estabilidad de la hélice está deter-
minada por puentes de hidrógeno que se es-
tablecen entre el grupo carbonilo (C-0) de
un enlace peptídico y el amino (N-H) pre-
sente cuatro residuos más adelante en la ca-
dena (fig. 3.12).
Figura 3.12. Representación de un polipéptido en conformación de a-hélice
En la conformación de a-hélice las cadenas laterales R se proyectan en forma perpendi- cular al eje de la hélice y hacia el exterior de la estructura en espiral generada por la cade- na peptídica. Si estos grupos R están próxi- mos y tienen carga del mismo signo o están ramificados (valina, isoleucina), sus interac- ciones desestabilizan la estructura helicoi- dal. Otro factor que rompe la conformación a-helicoidal es la presencia de prolina, ya que el anillo pirrolidina de su cadena lateral interacciona estéricamente con la cadena la- teral del aminoácido precedente y, además,
porque no puede ocurrir rotación del enlace N-C. La presencia de prolina entre dos cade- nas en a-hélice produce una acodadura de la dirección general de la molécula, lo cual es de gran importancia en la configuración general de una proteína. Otro aminoácido que tiende a desestabilizar la a-hélice es la glicina, por tener un grupo R muy pequeño.
Pauling y Corey también propusieron otra
estructura secundaria que es la estructura P
(P porque fue una segunda estructura, sien-
do la a-hélice la primera). La conformación p
está formada por dos o más cadenas polipep-
tídicas que pueden ser paralelas (en el mismo sentido) o antiparalelas (en direcciones opues- tas) y se estabilizan también por puentes de hidrógeno (fig. 3.13). En tanto que la hélice es una cadena polipeptídica enrollada, la tira plegada p está extendida y se dispone a la manera de un acordeón con los grupos R pro- yectados por encima y por debajo de los planos generados por las cadenas polipeptídicas. La estabilidad es mayor en la conformación an- tiparalela, la más frecuente en las proteínas naturales, incluso más que la a-hélice.
En general, estas estructuras laminares se dan en las proteínas fibrosas como la quera- tina del pelo y la piel, la fibroma de la seda;
la sustancia amiloide que se deposita en condiciones patológicas, es un depósito de proteína en forma de tira plegada.
Es común que en numerosas proteínas ocurran simultáneamente ambas estructuras, la a-hélice y la hoja plegada p, como se ilustra en la fig. 3.14.
Finalmente, dentro de la estructura secun- daria, pueden existir algunas regiones de las proteínas que no son a-hélice ni tira plega- da, sino que son conformaciones enrolladas al azar. En términos de su función biológi- ca, las regiones de enrollamiento aleatorio son de igual importancia que las de a-hélice o tira plegada.
3.4.5.3. Estructura terciaria
Existen razones sobradas para pensar que gran parte de las proteínas tienden a adoptar forma esférica, globular. Esto sólo puede ocurrir si suponemos que, además del plega- miento secundario, existe un superplega- miento de la proteína que da lugar a una estructura compacta. Es la que se conoce co- mo estructura terciaria de las proteínas. Se trata de un arreglo tridimensional que forma diversos repliegues específicos.
Los tipos de enlaces que estabilizan la es- tructura terciaria son: a) atracción electros-
tática de tipo salino entre un grupo carboxi- lato (-COO
-) y un grupo amino (-NH
3+) de residuos glutamato o aspartato con Usina o arginina; b) puentes de hidrógeno, entre gru- pos carboxilato, oxhidrilo (-OH) o los pro- pios grupos carbonilo ( - C = 0 ) de las uniones peptídicas; c) interacción de cade- nas polares, como los grupos aromáticos de la fenilalanina o los no aromáticos de alani- na e isoleucina, etc; d) fuerzas de Van der Waals, cuando los residuos son idénticos como dos metilos de la alanina, hidroximeti- los de la serina, etc; e) puentes disulfuro, que se establecen entre los grupos sulfhidri- lo (-SH) de la cisteína para dar el enlace co- valente disulfuro (-S-S-) entre cadenas vecinas (fig. 3.15).
El resultado de las distintas uniones des- critas es una estructura terciaria de gran es- tabilidad. El estudio de la estructura terciaria ha sido posible gracias a la cristalografía de rayos X desarrollada por la escuela de Bragg en Cambridge y a la labor pionera de Ken- drew sobre la mioglobina y de Perutz sobre la hemoglobina.
Las estructuras terciarias de las proteínas permiten agruparlas en familias y subfami- lias; por ejemplo, proteínas fibrosas de for- ma alargada y proteínas globulares de forma esferoidal.
3.4.5.4. Estructura cuaternaria
Cuando una proteína se compone de más de una cadena polipeptídica, se dice que posee estructura cuaternaria. Las proteínas que po- seen este grado de organización estructurai se denominan oligoméricas y las cadenas polipep- tídicas individuales que la integran se denomi- nan monómeros, protómeros o subunidades.
Cuando una proteína oligomérica contiene dos
o cuatro monómeros o subunidades se deno-
mina dímero o tetrámero, respectivamente. El
mejor ejemplo estudiado es la hemoglobina
que es una proteína tetramérica (fig. 3.16).
Figura 3.13. Conformación p de una proteína con disposición paralela (a) antiparalela (b).
Figura 3.14. Representación esquemática del plegamiento de la cadena principal de la ribonucleasa bovina.
La región de a-hélice está encerrada en un óvalo y la región p está sombreada. Otras porciones constituyen un enrollamiento al azar.
Figura 3.15. Tipo de uniones que estabilizan el plegamiento de las proteínas. 1. interacción electrostática; 2
puentes de hidrógeno, entre treonina y serina; 3 interacción dipolo-dipolo entre dos serinas; 4 unión de disul-
furo, convalente, entre dos cisternas, y 5. interacción hidrofóbica entre leucina e isoleucina.
Figura 3.16. Estructura cuaternaria de ias proteínas. Esquema de la disposición de cuatro subunidades de una molécula de hemoglobina, formada por dos cadenas a en la parte inferior de la figura y dos cadenas p en la parte superior.
Los enlaces que mantienen la estructura cuaternaria son del mismo tipo que los que mantienen la estructura terciaria, excepto enlaces covalentes. Por ejemplo, la ot-qui- motripsina contiene tres cadenas polipeptí- dicas unidas por enlaces disulfuro y no se considera estructura cuaternaria. La mioglo- bina está compuesta por una sola cadena polipeptídica y no posee estructura cuater- naria. Sin embargo, la hemoglobina contie- ne 4 subunidades unidas no covalentemente y, por tanto, tiene estructura cuaternaria. La enzima aspartato transcarbamilasa tiene una estructura cuaternaria formada por 12 subu- nidades. Otros ejemplos incluyen la sintetasa de ácidos grasos, la piruvato deshidrogena- sa, a las cuales se les conoce como complejos multier>zimáticos o estructuras supramole- culares.
La estructura cuaternaria está íntimamen- te ligada a las propiedades reguladoras de las proteínas, particularmente en los siste- mas llamados alostéricos. En estos siste- mas, la respuesta puede estar afectada por la presencia de efectores (inhibidores o activa- dores) que modulan la acción primaria de la proteína (ver capítulo de Enzimas).
Las estructuras secundaria y terciaria de una proteína están determinadas por la es- tructura primaria. Por lo tanto, no es necesario postular un control genético independiente para los niveles de estructuración superiores al nivel primario, puesto que la estructura primaria determina la secundaria, terciaria y (cuando está presente) la cuaternaria.
3.5. RELACIÓN ENTRE
ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
La actividad biológica de una proteína de- pende del ordenamiento tridimensional apropiado de sus grupos funcionales. De es- te modo, las proteínas sólo funcionan cuan- do están plegadas en su estructura original o conformación nativa. Debido a que las con-
formaciones nativas de la mayor parte de las proteínas están estabilizadas sólo por enla- ces no covalentes, el plegamiento puede ser alterado por condiciones como alta tempera- tura, pH extremo o presencia de solventes orgánicos que debilitan las interacciones no covalentes.
3.5. L Desnaturalización
La alteración de una proteína que modifique su conformación nativa se denomina desna- turalización; este cambio provoca la consi- guiente alteración o desaparición de sus funciones. En una proteína se produce la desnaturalización al perder su estructura se- cundaria, terciaria y cuaternaria, conserván- dose la primaria (covalente). En el estado desnaturalizado los niveles de estructura- ción superior de la conformación nativa se encuentran al azar, es decir la proteína alta- mente ordenada queda reducida a un poli- mero estadístico formado por una cadena de aminoácidos (fig. 3.17). La existencia de en- laces disulfuro en una proteína aumenta su resistencia a la desnaturalización.
3.5.1.1. Agentes desnaturalizantes Todos aquellos agentes capaces de romper o alterar los enlaces que mantienen las estruc- turas de orden superior de una proteína pue- den desnaturalizarla.
Un agente desnaturalizante muy común es
el calor, esto tiene aplicación cotidiana en el
laboratorio de bioquímica. Otros agentes fí-
sicos (radiaciones, tensoactividad, altas
presiones) o químicos (ácidos, álcalis, urea,
detergentes) capaces de alterar las interac-
ciones débiles pueden llegar a desnaturalizar
las proteínas. En proteínas cuya estructura
tridimensional está determinada por enlaces
disulfuro, pueden ser desnaturalizadas por
agentes reductores como el mercaptoetanol
o el ditiotreitol. En ocasiones esta alteración es reversible cuando se elimina el agente agresivo. En otros casos la desnaturaliza- ción es irreversible.
Una consecuencia de la desnaturalización es la pérdida drástica de solubilidad. Otras alteraciones incluyen disminución de la vis- cosidad, velocidad de difusión y facilidad con que cristalizan.
Siendo la conformación de la molécula proteínica la base principal de su función, al desnaturalizarse la proteína, se altera su acti- vidad fisiológica. Por ejemplo, las globuli- nas plasmáticas desnaturalizadas pierden sus funciones de anticuerpos.
3.5.2. Complementarte dad y capacidad de reconocimiento
Existen proteínas capaces de reconocer de- terminado tipo de moléculas que serán objeto de su actividad. Ese sitio de reconocimiento se debe a la presencia en la proteína de una estructura complementaria a la de la molé- cula (llámese sustrato, hormona, antígeno, efector, grupo prostético), que permite a la proteína (sea enzima, anticuerpo, receptor
membranal) reconocer a la molécula en cuestión y asociarse con ella en forma espe- cífica. Para explicar el fenómeno de la espe- cificidad, Emil Fisher propuso en 1894 una analogía similar a la que existe entre llave y cerradura.
En las proteínas donde más se ha ejempli- ficado el fenómeno de la especificidad de reconocimiento molecular es entre las enzi- mas y su sustrato; de ellas nos ocuparemos más adelante. Otro ejemplo es el de la globi- na que se une específicamente a su grupo prostético, el grupo hemo, debido a que la proteína tiene un hueco molecular con la forma precisa para el hemo y dado que las cadenas laterales de los aminoácidos en con- tacto con el anillo son no polares.
Clásico ejemplo de reconocimiento es la unión de sustancias llamadas antígenos con su anticuerpo específico. El anticuerpo es una molécula proteínica especial pertene- ciente al grupo de las inmunoglobulinas.
Los receptores membranales de reconoci- miento de las hormonas, que representan el primer sitio de acción hormonal, son tam- bién proteínas de reconocimiento.
Como regla general, un sitio fijador (de
reconocimiento) en una proteína se ajusta al
compuesto que se va a unir en forma, tama- ño y polaridad.
3.5.3. Alosterismo
En algunas enzimas y en la hemoglobina se encuentra, además del sitio activo (para el sustrato), otro sitio de reconocimiento para moléculas llamadas efectores alostéricos; la ocupación de este otro sitio determina una inhibición o una activación de la reacción, mecanismo conocido como alostérico. Un mecanismo alostérico es un proceso común en moléculas proteicas en el que la asocia- ción del sustrato está influenciada por la fi- jación de otras moléculas que no son
sustratos directos de la proteína. En un pro- ceso alostérico debe haber en la proteína centros separados de fijación para el sustrato (por ejemplo, O2 en el caso de la hemoglobi- na) y el efector (inhibidor o activador) que ejerce el control alostérico.
3.6. MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y ANÁLISIS
3.6.1. Cromatografía
Las experiencias en cromatografía se re- montan a 1850, cuando Runge describió un método para el análisis de mezclas de colo- rantes, aplicando gotas de colorantes en pa- pel y notando la separación en diferentes colores. Sin embargo, el crédito del descu- brimiento de'la cromatografía se le dá al bo- tánico Tswett, quien en 1906 efectuó la separación de mezclas de pigmentos vegeta- les en un tubo conteniendo material adsor- b e n t e s ó l i d o f i n a m e n t e d i v i d i d o . L a separación cromatográfica se basa en el coe- ficiente de partición líquido-líquido de los compuestos.
La cromatografía en papel, como todas las técnicas simples, ha revolucionado la se-
paración y detección de productos de reac- ción y la determinación e identificación de compuestos. Desarrollada en 1944 por Mar- tin en Inglaterra, consiste en colocar en tiras de papel como soporte de una fase estacio- naria acuosa mientras una fase móvil orgá- nica se desplaza en la tira, gotas de la sustancia a separar cerca del punto donde partirá el desplazamiento de la fase orgánica (fig. 3.18).
La relación de la distancia recorrida por el compuesto entre la distancia que recorre el frente del solvente desde el sitio de aplica- ción se conoce como valor Rf (relación de frentes) del compuesto. Bajo condiciones estrictamente controladas el Rf es una cons- tante importante para propósitos de identifi- cación.
El método descrito es cromatografía uni- dimensional. La cromatografía bidimensio- nal es una variante de considerable poder de separación, ya que se emplean dos diferen- tes solventes aplicados secuencialmente pa- ra desplazar un solo compuesto (fig. 3.19).
La gota del compuesto (generalmente un aminoácido o un péptido) se "revela" como una mancha en el papel. El material usado como revelador es usualmente la ninhidrina mencionada antes.
La cromatografía en capa fina utiliza el mismo principio de la cromatografía en pa- pel (cromatografía de adsorción); el soporte utilizado es sílica gel o celulosa colocadas en una hoja de vidrio o plástico en forma de capas muy finas. En este proceso, la separa- ción cromatográfica es muy rápida (fig.
3.20).
Las dos primeras técnicas descritas se uti- lizan generalmente para separar e identificar aminoácidos o péptidos pequeños. A conti- nuación se describirán técnicas para la sepa- ración e identificación de proteínas.
También utilizando una separación en co-
lumna, pero aprovechando las cargas resi-
duales de las proteínas c o m o carácter
diferencial, se describe la cromatografía de
Figura 3.18 Cromatografía en papel.
intercambio iónico. Las resinas de intercam- bio iónico para preparar la columna croma- tográfica, se preparan a partir de materiales insolubles (agarosa, poliacrilamina, celulosa, etc.) que contienen ligandos cargados negati- vamente (R-CH3-COO--SO5) o ligandos cargados positivamente (dietilamino) uni- dos a la resina insoluole.
Las resinas cargadas negativamente fijan cationes conociéndose como resinas de in- tercambio catiónico. Igualmente, las resinas cargadas positivamente fijan aniones y se denominan resinas de intercambio aniónico.
El grado de retención o retardo de una pro- teína (o aminoácido) por una resina depen- derá del número de cargas (positivas o negativas) de la proteína al pH del experi- mento (revisar pl de una proteína). Aquellas moléculas proteicas con la misma carga que la resina se eliminarán primero, seguidas por proteínas de carga opuesta, que por atrac- ción de cargas, se retendrán más tiempo en la columna. Cuando es difícil eliminar una molécula fuertemente atraída por la resina, se utilizan cambios de pH o fuerza iónica para debilitar la interacción.
Los derivados de celulosa como carboxi-
metil celulosa (CMC) y dietilaminoetil celu-
cero), no se desplazan ni hacia el cátodo ni hacia el ánodo en un campo eléctrico. El punto isoeléctrico (pl) de un aminoácido se define como el pH en el cual no tiene carga eléctrica neta; en el caso de los aminoácidos con sólo un grupo amino y uno carboxilo co- rresponde a la siguiente ecuación:
pl = | (
PK
1+pK
2)
Si consideramos la curva de titulación de un aminoácido sencillo como la glicina, su equilibrio de ionización corresponde a:
A pH de 1 la forma iónica predominante tiene una carga de +1 (forma catiónica) y se desplazará hacia el cátodo en un campo eléctrico. La adición de base hasta alcanzar la forma de zwitterión, corresponde al punto isoeléctrico (pl=5.97).
La adición de base a la forma dipolar de la glicina, completa la titulación del grupo - NH 3, el pH de la solución es superior a 11.5 y la especie predominante tiene una carga formal de -1 (forma aniónica).
Como puede verse en la fíg. 3.5, la glicina y otros aminoácidos con cadena lateral no ionizable y valores de pKi próximos a 2.5 y de pK
2próximos a 9.5, pueden actuar como amortiguadores en dos zonas de pH, donde ninguna les permite actuar como amortigua- dores al pH fisiológico del plasma.
Precisamente, el pH de 7.4 es un valor cercano al pl de dichos aminoácidos, y éste es el punto de menor solubilidad de aminoá- cidos y proteínas.
Un caso más complejo lo constituyen los
aminoácidos con un grupo ionizable en su
cadena lateral. Tal es el caso del ácido glutá-
mico y del aspártico que poseen un grupo
losa (DEAE) se han utilizado con éxito en la identificar se pasa a través de una columna
purificación de proteínas. empaquetada con pequeñas esferas de resina
En la cromatografía líquida de alta reso- insoluble. Como en esta técnica la resina es-
lución, la mezcla de proteínas a separar e tá tan densamente empaquetada se requiere
de bombeo a elevada presión para forzar el paso de la proteína. En esta técnica la co- lumna es metálica y no de vidrio como la cromatografía a presión normal. Las esferas de resina pueden cubrirse con grupos carga- dos, como en la cromatografía de intercam- bio iónico, o con residuos hidrofóbicos con lo que las moléculas no polares se retrasarán al paso por la resina. Las esferas pueden ser porosas y actuar con el mismo principio de la cromatografía de exclusión molecular, se- parando moléculas grandes de las pequeñas.
La cromatografía de afinidad se basa en la alta afinidad que tienen las proteínas por sus sustratos, grupos prostéticos, receptores de membrana, inhibidores no covalentes es- pecíficos y anticuerpos específicos. Estos compuestos de alta afinidad se pueden unir en forma covalente a una resina insoluble y utilizarse para purificar una proteína me- diante cromatografía en columna.
3.6.2. Filtración en gel
La separación de proteínas de diferente ta- maño haciéndolas pasar a través de una co- lumna empaquetada con un gel poroso en forma de pequeñas esferas insoluoles se de- nomina filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular. El polisacárido dextra- na es tratado químicamente para que se for- men enlaces cruzados que den un retículo o malla por la cual pueden pasar moléculas pequeñas. Esta sustancia queda como pe- queñas esferas hidrofílicas, pero insolubles, que al colocarlas en agua se hinchan para formar un gel insoluble. El nombre comer- cial de este gel es sephadex.
Las proteínas pequeñas pueden penetrar por los poros del gel, por lo que tendrán que desplazarse por espacios sinuosos y viajar más a través de la columna, que las proteí- nas grandes, las cuales, al no poder penetrar por el retículo del gel, son excluidas por mo- tivos estéticos. En consecuencia, una mez-
cla de proteínas se separa en función del ta- maño saliendo primero las proteínas más grandes y a continuación las más pequeñas, las cuales se retardan por tener que viajar por el retículo del gel (fig. 3.21).
Figura 3.21 Filtración en gel o cromatografía de exclusión molecular en columna
El bioquímico tiene para elegir varios ti- pos de sephadex para preparar columnas.
Así, el sephadex G-25 excluye compuestos de peso molecular de 3,500-4,500, sephadex G-50 para PM de 8-10,000 y sephadex G-75 para 40-50,000 de PM. Los geles de sepha- dex G-100 y G-200 se utilizan para separar proteínas de alto peso molecular.
3.6.3. Electroforesis
El movimiento de una partícula cargada en
un campo eléctrico externo, hacia el electro-
do de carga opuesta se denomina electrofo-
resis. La electroforesis de proteínas se ha
llevado a cabo de acuerdo al principio desa-
rrollado por el sueco Tiselius en 1937. Se-
gún esta técnica, se hace pasar durante un
cierto tiempo, una corriente eléctrica a tra-
vés de un tubo en U (un electrodo en cada extremo) lleno con una proteína disuelta en un amortiguador con la misma fuerza ióni- ca, pH y conductividad. Durante la electro- foresis, las diferentes proteínas migran hacia el electrodo de carga opuesta. El grado de migración depende de las cargas de la pro- teínas, del P.M. y de la forma. El sitio donde se concentra la proteína en el tubo puede ser determinado por un proceso óptico. La luz refractada nos da un patrón de picos, cada pico representa la separación entre la molé- cula proteica y el amortiguador (fig. 3.22).
El aparato de Tiselius se utilizó para de- terminar el punto isoeléctrico y la movilidad electroforética de las proteínas. Una modifi- cación altamente simplificada de la técnica electroforética de Tiselius es la llamada eléctroforesis de zona. En ésta, la separa- ción electroforética se realiza sobre un so- porte inerte como papel, almidón, agar, acetato de celulosa y, el más reciente gel de poliacrilamida. La medida de la concentra- ción de cada proteína separada se hace por revelado y lectura en un densitómetro.
Variantes más desarrolladas de la eléctro- foresis simple son la inmunoelectroforesis y el isoelectroenfoque. La primera combina la separación electroforética con la especifici- dad de las reacciones inmunológicas. Es es- pecialmente útil para separar proteínas y otras sustancias antigénicas con carga, particularmente las proteínas plasmáticas (fig. 3.23). El isoelectroenfoque ofrece una resolución sumamente elevada. En esta téc- nica se utilizan mezclas de anfolitos formados por ácidos poliamino-policarboxílicos con un intervalo de pl definido para establecer un gradiente de pH a través del campo eléctrico aplicado. Una proteína cargada se desplaza- rá a través del gradiente de pH en el campo eléctrico hasta que alcance una región de pH en el gradiente igual al valor de su pl. En es- te punto la proteína se mantiene estacionaria en el campo eléctrico y puede visualizarse o eliminarse de la columna (fig. 3.24).
3.7. PROTEÍNAS DE IMPORTANCIA MÉDICA
En esta sección, se estudiarán algunas pro- teínas con importantes funciones biomédi- cas. Se han escogido las proteínas de transporte, hemoglobina y mioglobina, pro- teínas protectoras como las inmunoglobuli- nas, las proteínas plasmáticas, proteínas estructurales como el colágeno y proteínas contráctiles como la tropomiosina, como ejemplo de proteínas cuya estructura y fun- ción es esencial estudiar para una correcta comprensión de sus procesos bioquímicos normales y de su mal funcionamiento en las enfermedades.
3.7.1. Hemoglobina y mioglobina-
Las hemoglobinas son proteínas globulares, presentes en los glóbulos rojos, que fijan oxígeno en los pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos; al volver a los pulmones desde los capilares, actúan como transporte de CO2 y de iones hidrógeno.
La hemoglobina (Hb) está formada por la proteína globina (una histona) y el grupo prostético hemo. La proteína globina desde el punto de vista de su estructura cuaternaria es un tetrámero, es decir, la constituyen 4 subunidades, cada una de ellas formada por cadenas polipeptídicas con dos estructuras primarias diferentes y cada subunidad con su grupo hemo. En la forma más común de hemoglobina humana adulta, HbAí, las dos subunidades de una clase se denominan ca- denas a y los otros dos monómeros de la misma clase se designan como cadenas p.
Así, la fórmula tetramérica de la HbAí es 0 ^ 2 - La hemoglobina fetal (HbF) es 0,272»
la hemoglobina de las células falciformes
(HbS) es ct2£2 y la hemoglobina menor del
adulto (HbA2) es a
252- Se conoce la secuen-
cia completa de aminoácidos de las cadenas
a(141 aminoácidos) y de las cadenas p , y y 6
(146) aminoácidos). El PM de la hemoglobi- na, incluyendo el grupo hemo, es de aproxi- madamente 67,000. La hemoglobina fue la primera proteína analizada por difracción de rayos X, identificada como una molécula ca- si esférica con un diámetro de 5.5 nm (fig.
3.25). Su concentración en la sangre huma- na es de 16 g por 100 mi.
La mioglobina (Mb) es una proteína que almacena 0
2en el tejido muscular rojo. A diferencia de la hemoglobina, la mioglobina está compuesta por una sola cadena polipep- tídica (monómero) y un solo centro de fija- ción de 0
2(hemo). La cadena polipeptídica consta de 153 aminoácidos y tiene un PM de 17,000. El polipéptido P de la Hb es muy se- mejante a la mioglobina. Su distribución es- pecial es el de una superficie polar y el interior no polar, patrón característico de las proteínas globulares.
El grupo prostético hemo es una molécula de porfirina, un tetrapirrol cíclico, que con- tiene un átomo de hierro en su centro. El tipo de porfirina de la hemoglobina y la mioglo- bina corresponde a la protoporfirina IX con dos propionilos, dos vinilos y cuatro metilos como cadenas laterales unidos a los grupos pirrólicos (fig. 3.26). El átomo de hierro, tanto en la hemoglobina como en la mioglo- bina, se encuentra en estado ferroso (Fe
2*).
El quinto enlace de coordinación del áto-
mo ferroso de los hemos es con el nitrógeno
imidazólico de una histidina {histidina pro-
ximal de la apoproteína). En las cadenas po-
lipeptídicas con 0
2ligado, esta molécula
Figura 3.25 Estructura cuaternaria de la hemoglobina.
forma un sexto enlace coordinado con el Fe
2 +y el segundo imidazol de una histidina distal de la globina. El hemo se sitúa dentro de un espacio hidrofóbico en cada una de las subunidades de globina. De esta manera, las 4 subunidades se disponen en un arreglo es- pacial tetraédrico preciso, con las cadenas en contacto con las P; los grupos hemo se lo- calizan en la periferia.
Cinética de oxigenación de hemoglobina y mioglobina
La hemoglobina se combina con el oxígeno y se transforma en oxihemoglobina (Hb0
2);
en realidad fija ocho átomos de oxígeno por
tetrámero (dos por cada subunidad). Esta
combinación se lleva a cabo sin alterar la va-
lencia del hierro que sigue como ferroso, es
decir, no es una oxidación sino una oxigena- ción. Cuando la hemoglobina se oxida quí- micamente, el hierro pasa de ferroso a férrico (Fe
2+—• Fe
3+) y se denomina me- tahemoglobina (MHb); en estas condiciones no transporta oxígeno. Normalmente se forma menos del 1 % de MHb, pero puede produ- cirse un exceso si se ingieren sulfonamidas, nitritos, fenacetina u otros oxidantes.
La curva de saturación de oxígeno con he- moglobina es sigmoidea. Esto se debe a que una vez fijado el primer átomo de 0
2facilita la unión del siguiente. Así, la hemoglobina muestra una cinética cooperativa de fija- ción. En cambio, la mioglobina muestra una curva de saturación de oxígeno de tipo hi- perbólica (fig. 3.27), lo que indica que la
mioglobina tiene mayor afinidad por el 0
2que la hemoglobina y es una molécula ina- decuada como transportadora de 0
2pero efi- caz para almacenarlo. Bajo condiciones de escasez de oxígeno (como en el ejercicio in- tenso), la p 0
2del tejido muscular puede dis- minuir hasta 5 mm Hg. A esta presión, la mioglobina cede con facilidad su oxígeno para apoyar la síntesis oxidativa de ATP en las mitocondrias musculares.
La cooperatividad positiva de la hemo- globina depende de la integridad de la es- tructura cuaternaria; si el tetrámero se disgrega en monómeros, la cooperatividad desaparece y la curva de saturación de oxí- geno adquiere forma hiperbólica. Los datos de cristalografía con rayos X indican que la hemoglobina tiene dos estructuras cuaterna- rias. Las dos formas son de conformación desoxi, llamada "tensa" o estado conforma- cional T; al fijarse el oxígeno a las subunida- des, la conformación pasa del estado T al R ("relajado"). La constante de afinidad del 0
2es mayor en el estado R que en el estado T (fig. 3.28). T y R se emplean también para describir las estructuras cuaternarias de las enzimas alostéricas, donde el estado T tiene afinidad menor por el sustrato. En la unidad II, sobre equilibrio ácido base, ya habíamos señalado la influencia del oxígeno sobre el pKa de la hemoglobina:
H H b + 4 0
2— Hb(0
2)
4+H
+; es decir, la forma T es más acida. Por tanto, cuando la Hb oxigenada se encuentra a pH bajo (ácido) y C 0
2alto, tiende a liberar su oxígeno y repre- senta un aumento de oxigenación en tejidos metabólicamente activos. La reducción de la afinidad oxígeno-hemoglobina en un pH ba- jo se denomina efecto Bohr (fig. 3.29).
El efecto Bohr puede encajar en la defini- ción de un mecanismo alostérico, según el cual, en la proteína existe un sitio de fijación para el sustrato y otro para el efector alosté- rico (positivo o negativo). La fijación del efector en el sitio alostérico influye sobre la conformación del sitio del sustrato (sitio ac- tivo). En la hemoglobina el sitio activo es ocupado por el oxígeno y el sitio alostérico es ocupado por el hidrogenión. Al ocupar su sitio el ion H, desplaza a la Hb a la forma T, de afinidad más baja por el oxígeno.
El efecto Bohr, por lo tanto, tiene conse-
cuencias fisiológicas importantes. Las células
con metabolismo rápido y con requerimien-
tos elevados de 0
2, producen ácido carbónico
y ácido láctico que incrementan la concen-
tración de H
+en la célula. Dado que el H
+fuerza alostéricamente hacia la conforma- ción T de la hemoglobina, disminuye la afi- nidad C>2-Hb y se disocia una mayor cantidad de O2 hacia los tejidos. En los pul- mones, la concentración de H
+disminuye, el pH sube, los protones son liberados de la hemoglobina favoreciendo la forma R y la captación de oxígeno. La mioglobina no presenta efecto Bohr.
En resumen, un incremento de hidroge- niones provoca liberación de oxígeno, en tanto que un incremento en el oxígeno causa la liberación de hidrogeniones.
La hemoglobina fetal (HbF) tiene mayor afinidad por el oxígeno que la adulta (Hb A) lo que le permite extraer O2 de la HbA de la sangre placentaria. Después del parto, la HbF es inadecuada, ya que su elevada afini- dad por el oxígeno la haría ceder menos O2 a los tejidos.
En los tejidos periféricos, una disminu- ción de O2 hace que se acumule el 2, 3-di- fosfoglicerato (2,3-DPG), el cual es un efector alostérico de la hemoglobina cuando ésta se encuentra en la forma T. Cuando la liberación de oxígeno está alterada como en
el ascenso a grandes alturas o en la enferme-
dad pulmonar crónica, el eritrocito aumenta
la producción de 2,3-DPG el cual se une a la
forma T de Hb, la estabiliza, y reduce su afi-
nidad por el oxígeno. Por lo tanto, un au-
mento en el contenido de 2,3-DPG de los
eritrocitos hace que la hemoglobina ceda
una porción mayor de su oxígeno a los teji-
dos.
La hemoglobina se combina con el monó- xido de carbono (CO) para formar carboxi- hemoglobina. En virtud de la mayor afinidad de la hemoglobina por el CO (210 veces), a tensiones iguales de O2 y CO, la fi- jación del CO a la Hb excede con mucho a la del oxígeno. La carboxihemoglobina (Hb- C0) tiene un color rojo brillante característi- co. Para desplazar el CO de la Hb-CO en las personas intoxicadas con este gas se requie- re el uso de la oxigenoterapia hiperbárica (O2 puro a 3 o más atmósferas de presión) para forzar la expulsión del monóxido de carbono.
Además de transportar el oxígeno de los pulmones a los tejidos, la hemoglobina faci- lita el transporte de CO2 de los tejidos a los pulmones. Aproximadamente el 15% del CO2 es transportado como carbodioxihemo- globina o carbaminohemoglobina (Hb- CO2). La interacción del CO2 con la hemoglobina afecta también la transición del estado T al R. El CO2 forma radicales carbamilados reversiblemente con los extre- mos amino de las cadenas polipeptídicas de hemoglobina cuando ésta cede su O2.
Hb-NH
2+C0
2-* Hb-NH-COO-+H
+Cuando están carbamilados, los extremos tienen carga negativa y pueden formar enla- ces iónicos que estabilizan la estructura cua- ternaria. Los H
+son captados por la Hb que actúa como amortiguadora.
En los pulmones el proceso descrito se in- vierte y conforme el oxígeno se une a la he- moglobina, los H
+se liberan y se unen al HCO3 para formar H2CO3. Por tanto, la fija- ción del O2 obliga a la expulsión del CO2 de acuerdo al efecto de Bohr que ya revisamos.
Hemoglobinas humanas mulantes
Las mutaciones en los genes que codifican las cadenas a y P pueden afectar la función
transportadora de la hemoglobina; cuando esto ocurre, el trastorno se conoce como una hemoglobinopatía. Muchas de las imitantes pueden ser asignadas a una de las cuatro cla- ses siguientes:
Hemoglobina M. Hemos mencionado que en la hemoglobina normal, el grupo hemo funciona con Fe
2+pero pequeñas cantidades se oxidan a férrico (Fe
3+)y se transforma en metahemoglobina. En las variantes de he- moglobina M, los residuos His proximal y distal son reemplazados por Tir la cual esta- biliza el Fe en forma oxidada, férrica. En consecuencia se presenta metahemoglobine- mia, la afinidad por el oxígeno está dismi- nuida y puede faltar el efecto Bohr.
Hemoglobinas mutantes con afinidad ma- yor de lo normal por el oxígeno. En estas mutantes se favorece la forma R, por tanto, no cederá suficiente oxígeno a los tejidos.
La hipoxia producida conduce a policitemia.
Las proteínas mutantes no muestran coope- ratividad en la fijación del oxígeno ni efecto Bohr.
Hemoglobina S (hemoglobina falcifor- me). La sustitución de un solo aminoácido de la cadena P (Glu por Val) produce una hemoglobina que, al cambiar un aminoácido polar (Glu) por uno no polar (Val) se genera en la superficie de la cadena p una zona ad- herente. Esta zona, que se presenta en la HbS desoxigenada, tiene una zona comple- mentaria en la forma oxigenada de la HbA.
La unión de zonas complementarias y adhe- rentes hace que la HbS desoxigenada se po- limerice y forme precipitados fibrosos largos que distorsionan mecánica y física- mente al eritrocito, causando lisís. Los eri- trocitos deformados se denominan células falciformes (forma de hoz) y su lisis al pasar
por las sinuosidades esplénicas produce
anemia. Así, esta enfermedad hereditaria se
conoce también como anemia de células fal-
ciformes. Los individuos homocígotos (ge-
notipo S/S) presentan anemia pero los
heterocigotos (genotipo A/S) tienen el rasgo
En el caso de la histidina, las formas iónicas posibles son las observadas en la fig. 3.7.
Obsérvese que la histidina con un pK
R= 6.0, muy próximo al pH fisiológico, es el único aminoácido que puede actuar como amorti- guador en los líquidos corporales. Precisa- mente, la hemoglobina contiene una elevada proporción de histidina y posee así un alto po- der amortiguador en los eritrocitos. Por otro lado, este comportamiento excepcional de la histidina le confiere un papel único en las pro- teínas enzimáticas como activador fisiológico.
Por ejemplo, una enzima puede requerir un imidazol de una histidina que es esencial en su forma básica para que exista actividad catalíti- ca. A pH 6.0, la mitad de las enzimas estarán en forma básica (imidazol) activa y la mitad en forma acida (imidazolio) inactiva.
A pH 7.0 , el pH es una unidad (10 veces) por encima del pK del imidazolio y el co- ciente imidazol/imidazolio es 10:1; debido a esta proporción la enzima mostrará el 91%
de su actividad potencial máxima.
aunque en general no están anémicos. El gene para la HbS manifiesta elevada incidencia en poblaciones expuestas endémicamente al paludismo; esto proporciona cierta protec- ción contra el parásito, que se desarrolla dentro del eritrocito, debido a que las células infectadas requieren más oxígeno que las no infectadas y al adquirir la forma semilunar (de hoz) son eliminadas de la circulación.
Hemoglobinas inestables. En estas mu- tantes, la sustitución de un aminoácido den- tro del espacio para el hemo reduce la afinidad de la subunidad con el grupo pros- tético. Las hemoglobinas mutantes son ines- tables y destruidas porque el hemo que normalmente estabiliza la conformación proteínica no puede unirse a la apoproteína.
Talasemias
Normalmente, las cadenas a y p se produ- cen en una proporción de 1:1. En estas en- fermedades, la síntesis de las cadenas a-o las p de la hemoglobina está disminuida. En consecuencia, se presenta aumento de pro- ducción de la cadena complementaria que precipita intracelularmente y da lugar a la destrucción prematura del eritrocito; esto conduce a formas severas de anemia.
3.7.2. Estructura y función de los anticuerpos
La inmunología estudia todos los fenóme- nos bioquímicos y fisiológicos de defensa gracias a los cuales el organismos distingue lo propio (nuestros tejidos y células) de lo no propio (bacterias, virus, hongos, parási- tos, células tumorales, trasplantes, etc.) y es capaz de destruir a las sustancias extrañas.
Todas las acciones de respuesta a material extraño se denominan respuesta inmune.
Esta respuesta puede ser de tipo celular y de tipo humoral. En la respuesta celular inter-
vienen células sanguíneas denominadas lin- focitos T (que maduran en el timo), que ac- túan directamente o bien a través de sustancias por ellas liberadas llamadas linfo- cinas. En la respuesta humoral intervienen los linfocitos B (de bursa o bolsa de Fabricio de las aves), y su acción se ejerce a través de los anticuerpos (inmunoglobulinas) que cé- lulas derivadas de estos linfocitos B segre- gan.
Las moléculas de anticuerpos (Ab) son proteínas que pertenecen a las inmunoglo- bulinas. Cuando se introduce al organismo una sustancia extraña como una proteína, un polisacárido o un ácido nucleico, las células plasmáticas, derivadas de un linfocito B, producen anticuerpos. La molécula de anti- cuerpo se asocia de forma no covalente con la sustancia extraña y la elimina del organis- mo. Las sustancias que inducen la produc- ción de anticuerpos en un organismo se denominan antígenos (Ag).
Para que una sustancia actúe como antíge- no en un organismo debe poseer una estruc- tura química distinta de los constituyentes propios de ese organismo. Por ejemplo, la albúmina de cualquier mamífero, excepto la humana, es antigénica para el hombre cuando se la introduce parenteralmente. Un antíge- no puede contener múltiples determinantes antige'nicos, que son pequeñas regiones de la molécula de antígeno que inducen especí- ficamente la producción de un anticuerpo.
En las proteínas, por ejemplo, un determi- nante antigénico puede comprender sólo seis o siete aminoácidos en total de la proteí- na. Un antígeno puede poseer decenas o mi- les de estos grupos determinantes, de tal manera que inducirán múltiples tipos de an- ticuerpos, cada uno de ellos capaz de reco- n o c e r y u n i r s e a c a d a u n o de los determinantes (fig. 3.30).
En general, un determinante antigénico
solo o una molécula pequeña, no determinan
la formación de anticuerpos pero, al unirse
covalentemente a moléculas grandes, facili-
Cada anticuerpo se une al determinante antigénico frente al que se ha formado.
ANTICUERPOS (Igs)
