UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

ROL DE LA INSULINA EN LA VÍA NEURAL

HIPOTÁLAMO-OVARIO EN UN MODELO DE OVARIO POLIQUÍSTICO INDUCIDO POR ESTRÉS CRÓNICO.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctor en Farmacología

Por

MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ

Directores de Tesis

Profesor Dr. Hernán Enrique Lara Peñaloza

Profesor Dr. Víctor Domingo Ramírez

Santiago – Chile 2008

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

TESIS DE DOCTORADO

Se informa a la comisión de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato

MAURICIO DANIEL DORFMAN PESSÓ

ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para el Grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa de Tesis rendido el ……….

Directores de Tesis:

- Dr. Hernán Lara P. ________________

- Dr. Víctor D. Ramírez ________________

Comisión Informante de Tesis:

- Dr. Javier Puente

________________

- Dr. Luis Núñez ________________

- Dra. Margarita Vega ________________

- Dra. Teresa Sir-Petermann ________________

- Dr. Luis Michea ________________

Dedicada a Isaac Pessó (Z.L.), cuyos consejos y ejemplos fueron

siempre de gran valor para las decisiones que he tomado a lo largo de este

camino.

AGRADECIMIENTOS:

Al Dr. Hernán Lara por la oportunidad que me dio de realizar la tesis de doctorado en su laboratorio y por toda la ayuda, consejos y enseñanzas que me ha entregado durante todos estos años.

Al Dr. Víctor Domingo Ramírez por darme el honor de tenerlo como director de tesis, por toda la entrega y dedicación en la gestación y desarrollo de este trabajo de tesis y por la motivación que me dio en los momentos difíciles.

A mis compañeros de laboratorio: Pablo Jara, Ramón Sotomayor, Alfonso Paredes, Mónika Greiner, Eric Acuña, Gonzalo Cruz, Claudio Araya, Sergio Hernández, Ariel Díaz, Guillermo Elorza, Gabriel Aravena, Nicolás Crisosto y Leticia Luna por su amistad, colaboración y excelente disposición.

Al grupo de investigación comandado por las Doctoras Margarita Vega y Carmen Romero por permitirme realizar los análisis de Western Blot en su laboratorio y enriquecer este trabajo mediante sus comentarios en los seminarios de grupo.

Al Dr. Luis Michea por facilitarme la infraestructura de su laboratorio para las determinaciones de mRNA por PCR en tiempo real.

A la Dra. Elisabet Stener-Victorin por acogerme durante un mes en su laboratorio de la Universidad de Gotemburgo, Suecia, en donde aprendí la técnica del clamp hiperinsulinémico-euglicémico.

A Alejandra De Calisto, Fernanda Schäufler (veterinarias encargadas del bioterio), Fredy y Juan Carlos (funcionarios del bioterio), por su ayuda en los procedimientos realizados con los animales.

A Don Francisco Cortés por su ayuda con los cortes y tinciones de los

tejidos.

A los miembros de la Comisión Evaluadora, Dra. Teresa Sir-Petermann, Dra.

Margarita Vega, Dr. Luis Michea, Dr. Javier Puente y Dr. Luis Núñez por aceptar participar de esta comisión y por sus comentarios y correcciones que enriquecieron este trabajo.

Un agradecimiento muy especial a mi familia: Araceli, mi novia, por su amor,

cariño, paciencia y gran sostén durante los últimos 10 años de mi vida. A mis

padres, abuelita, hermano y cuñada. A mis suegros y cuñados, gracias a

todos ustedes por su constante apoyo y preocupación.

FINANCIAMIENTO:

La realización de esta tesis fue financiada por proyectos de investigación, becas de mantenimiento, apoyo de tesis y de estadía en el extranjero de las siguientes instituciones:

Proyecto del Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT)

• Proyecto FONDECYT Nº 1050765 “Cambios en la actividad nerviosa simpática durante el desarrollo neonatal predispone al ovario poliquístico en la vida adulta”

Investigador Responsable: Dr. Hernán Lara P.

Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica (CONICYT):

• Beca de Mantención Estudiante de Doctorado(2004-2007)

• Beca de Apoyo a la Realización de Tesis Doctoral Nº 24060026 (2006- 2007)

• Beca de Termino de Tesis Doctoral (2008) Becario: Mauricio Dorfman Pessó

Programa de Mejoramiento de la Calidad y Equidad de la Educación Superior (MECESUP):

• Beca para estadía corta en el extranjero. Proyecto MECESUP UCH 0208 (2006)

Becario: Mauricio Dorfman Pessó

PUBLICACION:

Los resultados de esta tesis han dado origen a un artículo científico, aceptado para publicación en la revista internacional “Biology of Reproduction”.

Dorfman M, Ramirez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. “Chronic-Intermittent

cold stress in rats induce selective ovarian insulin resistance”. Biology of

Reproduction (In Press).

PRESENTACIONES A CONGRESOS:

Los resultados de esta tesis han sido presentados en los siguientes congresos científicos:

1. Dorfman M, Ramirez VD, Sotomayor R, Jara P, Lara HE. Rol de la insulina en la inervación simpática ovárica en un modelo de ovario poliquístico inducido por estrés crónico.

XVII Reunión Anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo.

Exposición de póster, Reñaca, Chile, 2006.

2. Dorfman M, Ramírez VD, Stener-Victorin E, Lara HE. Determinación de la resistencia a la insulina in vivo por el método del clamp hiperinsulinémico euglicémico en ratas.

XXVIII Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.

Exposición de póster Olmué, Chile, 2006.

3. Dorfman M, Ramírez VD, Lara HE. El estrés induce resistencia tejido específico a la insulina.

XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile.

Exposición oral. Trabajo incorporación a la sociedad de Farmacología de

Chile. Iquique, Chile, 2007.

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL ...1

ÍNDICE FIGURAS ...4

RESUMEN ...7

ABSTRACT ...9

INTRODUCCIÓN...10

1) Fisiología ovárica ...10

2) Regulación de las funciones ováricas ...11

2.1) Regulación endocrina:...11

2.2) Regulación nerviosa: ...12

3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico ...13

4) Estrés ...15

4.1) Definición de estrés: ...15

4.2) Clasificación de los estímulos estresores:...15

4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística ...16

4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico...17

5) Resistencia a la insulina...17

5.1) Definición:...17

5.2) Acciones de la insulina: ...19

5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP: ...19

HIPÓTESIS ...21

OBJETIVO GENERAL ...21

OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...21

Objetivo específico Nº1: ...21

Objetivo específico Nº2: ...21

Objetivo específico Nº3: ...21

MATERIALES Y MÉTODOS ...22

1) Animales y grupo experimentales ...22

2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente...22

3) Seguimiento de los animales ...23

3.1) Ciclicidad estral:...23

3.2) Peso corporal: ...23

3.3) Ingesta de alimento: ...23

4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés...24

4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa: ...24

4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico:...24

4.3) Liberación de noradrenalina ovárica:...26

4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico: ...26

4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K⁺ 80 mM:...27

4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas ...27

4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical...28

4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real ...28

4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot...30

5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés ...31

6) Procedimientos experimentales finalizada la administración ICV de insulina...32

6.1) Morfología ovárica ...32

6.2) Determinación de los niveles séricos de estradiol, androstenediona, progesterona, insulina y glucosa ...32

6.3) Determinación de catecolaminas en la médula adrenal ...33

6.4) Determinación del contenido de noradrenalina en ovario y ganglio celíaco mediante HPLC ...33

7) Análisis estadístico...34

RESULTADOS ...35

1) Caracterización del modelo de estrés por frío crónico intermitente ...35

1.1) Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral...35

1.2) Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento...36

1.3) Efecto del estrés sobre el grado de sensibilidad a la insulina ...38

1.4) Efecto del estrés sobre la tolerancia a la glucosa ...39

1.5) Efecto del estrés sobre la actividad nerviosa simpática ...40

2) Efecto local de la insulina sobre la actividad nerviosa simpática ovárica ...41

2.1) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo eléctrico ...41

2.2) Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con estímulo depolarizante con K⁺ 80 mM ...43

2.4) Efecto de la insulina sobre la secreción de esteroides ováricos ...46

3) Determinación de la expresión de IRS-1, IRS-2, GLUT-1 y GLUT-4 ...48

3.1) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis .48 3.2) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario y músculo tibialis...50 3.3) Nivel de mRNA para Irs-1 y Glut-4 en células de granulosa y teca-intersticial52

3.4) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en células de granulosa y teca-intersticial 54

4) Administración de insulina intracerebroventricular...56

4.1) Control del implante de la cánula ...56

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre aspectos metabólicos ...57

4.2) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la concentración plasmática de P, ∆₄ y E₂...59

4.3) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la actividad nerviosa simpática ovárica...60

4.3.1) Contenido de noradrenalina en el ganglio celíaco:...60

4.3.2) Contenido de noradrenalina en el ovario:...61

4.4) Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica...62

DISCUSIÓN ...65

1) Cambios metabólicos en el modelo de estrés crónico por frío...65

2) Efectos de la insulina aplicada localmente sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío...67

3) Efectos de la insulina aplicada ICV sobre la actividad nerviosa ovárica en el modelo de estrés por frío...71

ESQUEMA FINAL ...75

CONCLUSIONES...76

REFERENCIAS...77

ÍNDICE FIGURAS

Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario... 13 Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en

células de músculo esquelético... 18 Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la

hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes. Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárica... 20 Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina y glucosa durante el

clamp... 25 Figura 5: Efecto del estrés sobre la ciclicidad estral... 35 Figura 6: Efecto del estrés sobre el crecimiento e ingesta de alimento... 37 Figura 7: Efecto del estrés sobre la velocidad de infusión de glucosa, determinada

mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico... 38 Figura 8: Prueba de tolerancia a la glucosa en ratas control y estresadas... 39 Figura 9: Efecto del estés por frío crónico sobre la actividad nerviosa simpática... 40 Figura 10: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo

depolarizante eléctrico, de [³H]NA ovárica en ratas control y ratas

sometidas a estrés por frío... 42 Figura 11: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con

estímulo depolarizante eléctrico... 42 Figura 12: Efecto de la insulina sobre la liberación, inducida con estímulo

depolarizante de alta concentración de potasio, de [³H]NA ovárica en ratas control y ratas sometidas a estrés por frío... 44 Figura 13: Efecto de la insulina sobre la liberación de NA ovárica inducida con

estímulo depolarizante K⁺ 80 mM... 44 Figura 14: Efecto de la insulina sobre la liberación basal de NA ovárica... 45 Figura 15: Efecto de la insulina sobre la secreción de hormonas esteroidales

ováricas... 47 Figura 16: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en ovario y músculo tibialis de

ratas control y estresadas... 48 Figura 17: Cambios en el mRNA para Irs-2 y Glut-1 en ovario y músculo tibialis de

ratas control y estresadas... 49 Figura 18: Efecto del estrés frío sobre el nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 en ovario

y músculo... 51 Figura 19: Concentración relativa del mRNA de Fshr en células de granulosa y teca-

intersticial... 52 Figura 20: Cambios en el mRNA para Irs-1 y Glut-4 en fracción de células de

granulosa y teca-intersticial de ratas control y estresadas... 53 Figura 21: Cambios en el nivel de para IRS-1 y GLUT-4 en fracción de células teca-

intersticial y granulosas de ratas control y estresadas... 55

Figura 22: Control del implante de la cánula colocada en el tercer ventrículo... 56 Figura 23: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la ganancia de peso y

consumo de alimento en animales control y sometidos a estrés por frío.. 58 Figura 24: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la insulina y glucosa

plasmática en animales control y sometidos a estrés por frío... 58 Figura 25: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el

ganglio celíaco de ratas control y sometidos... 60 Figura 26: Efecto de la insulina administrada ICV sobre el contenido de NA en el

ovario de ratas control y sometidos a estrés por frío... 61 Figura 27: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfometría ovárica... 63 Figura 28: Efecto de la insulina administrada ICV sobre la morfología ovárica... 64 Figura 29: Esquema del efecto propuesto para la insulina sobre la actividad nerviosa

ovárica……….70 Figura 30: Esquema de los resultados obtenidos………... 75

ABREVIATURAS

A : Adrenalina

ANOVA : Análisis de varianza DTT : Ditiotreitol

E₂ : Estradiol

ELISA : Inmunoensayo unido a enzima EV : Estradiol valerato

FAA : Folículo antral atrésico FAN : Folículo antral normal FPAA : Folículo preantral atrésico FPAN : Folículo preantral normal FSH : Hormona folículo estimulante FSHR : Receptor de FSH

FTIII : Folículo tipo III

GLUT : Transportador de glucosa

GnRH : Factor liberador de gonadotropinas hCG : Gonadotropina coriónica humana HHO : Hipotálamo-hipófisis-ovario

HPLC : Cromatografía líquida de alta resolución ICV : Intracerebroventricular

Ins : Insulina

IRS : Sustrato del receptor de insulina LH : Hormona luteinizante

NA : Noradrenalina NPV : Núcleo paraventricular

P : Progesterona

PI3K : Fosfoinositol-3 quinasa PKB : Proteína quinasa B

PMSF : Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

PQ : Prequiste

PTG : Prueba de tolerancia a la glucosa

Q : Quiste

RT-PCR : Reacción en cadena de la polimerasa acoplada a transcripción reversa SNA : Sistema nervioso autonómico

SON : Nervio ovárico superior

SOP : Síndrome de ovario poliquístico Vehic : Vehículo

∆₄ : Androstenediona

RESUMEN

El estrés crónico, en combinación con la sobrealimentación y la falta de ejercicio, contribuye al desarrollo del síndrome metabólico, aumentando el riesgo de enfermedades cardiovasculares y diabetes tipo 2. Se ha demostrado que el estrés afecta a cada componente del síndrome metabólico y entre ellos, al síndrome de ovario poliquístico (SOP), principal causa de infertilidad en mujeres en edad fértil.

Hemos descrito que el estrés por frío crónico en ratas provoca cambios morfológicos en los folículos ováricos similares a los encontrados en el SOP. Para conocer si este modelo de estrés está asociado a cambios metabólicos, determinamos la sensibilidad a insulina y el efecto de esta hormona sobre la actividad nerviosa ovárica (factor involucrado en la génesis y mantención del SOP) y por ende, si el estrés es un factor potencial en el desarrollo del SOP.

A nivel metabólico, los animales sometido a estrés por frío crónico aumentaron la sensibilidad a la insulina, determinada mediante el clamp hiperinsulinémico euglicémico. Al mismo tiempo, estos animales aumentaron su ingesta alimenticia, manteniendo la misma ganancia de peso que sus respectivos controles. La actividad nerviosa simpática ovárica aumentó cuando los ovarios de animales control fueron incubados con insulina, sin embargo, no hubo cambio en los ovarios de ratas estresadas. Estos resultados sugirieron una resistencia a la insulina tejido específico, la cual fue apoyada al determinar el nivel de mRNA y proteína IRS-1 y GLUT-4. Ambas moléculas de la ruta de señalización intracelular de insulina, disminuyeron en los ovarios de las ratas sometidas a estrés, siendo las células de la teca-intersticial en las que se observó preferencialmente esta disminución. Al administrar insulina intracerebroventricular (ICV), la actividad nerviosa ovárica no fue modificada, ni ocurrieron cambios en el desarrollo folicular, sin embargo, las ratas estresadas infundidas con insulina ICV no disminuyeron la ganancia de peso, la glicemia ni la insulinemia, como lo hicieron sus respectivos controles, apoyando una pérdida de sensibilidad a insulina hipotalámica inducida por el estrés.

Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que el estrés por frío crónico intermitente provoca una resistencia a la insulina que es tejido específica, y que la insulina tiene un efecto estimulador de la actividad nerviosa simpática ovárica.

Probablemente, la resistencia insulínica en ovario e hipotálamo son en parte responsables de los cambios en la función reproductiva y metabólica de la condición poliquística inducida por estrés crónico.

ABSTRACT

The chronic stress in combination with overfeeding and lack of exercise contributes to health problems known as metabolic syndrome, increasing the risk of cardiovascular disease and type 2 diabetes. It has been shown that stress affects each component of metabolic syndrome, including the polycystic ovary syndrome (PCOS), the major cause of infertility in women of reproductive age.

We have previously described that rats exposed to chronic cold stress show follicular changes similar to those found in PCOS patients. To find out if this model of stress is associated with metabolic changes, we determined insulin sensitivity and the effect of this hormone on the ovarian nervous activity (a factor involved in the genesis and maintenance of PCOS).

The animals exposed to chronic cold stress increased the insulin sensitivity, measured by hyperinsulinemic euglycemic clamp. These animals increased their food intake and they maintained the same gain weight than their respective controls. The ovarian sympathetic nerve activity was increased when the ovaries from control rats were incubated with insulin, however it was not change in the ovaries of stressed rats.

These results suggested the presence of specific tissue insulin resistance, which was supported by determining the IRS-1 and GLUT-4 level of mRNA and protein. Both molecules, involved in the intracellular insulin signaling, were decreased in the stress rats ovaries, preferentially in theca-interstitial cells. When we administrated insulin intracerebroventricular (ICV), the ovarian nerve activity and the follicular development were not changed. However, stressed rats infused with insulin ICV did not decrease the gain weight, glycaemia and plasmatic insulin, as did their respective controls. These results supporting a loss of hypothalamic insulin sensitivity induced by stress.

The results of this study show that chronic intermittent cold stress produce specific-tissue insulin resistance. Indeed, the insulin has a stimulating effect of the ovarian sympathetic nervous activity. Probably the ovarian and hypothalamus insulin resistance are in part responsible for the changes in metabolic and reproductive function of the polycystic condition induced by chronic stress.

INTRODUCCIÓN 1) Fisiología ovárica

El ovario es la gónada femenina, cuyas principales funciones son la esteroidogénesis y la ovulación. Los folículos son la unidad funcional del ovario de mamíferos y la función de cada uno de ellos es proveer todo el apoyo necesario a la célula germinal femenina (ovocito), para alcanzar su máximo potencial, ser liberados del ovario y tener el potencial de ser fecundados por un espermatozoide para producir un embrión. El ovario está formado, además de los folículos en diferentes etapas de maduración, por tejido conectivo laxo, vasos sanguíneos y nervios, cuyos terminales nerviosos se proyectan hacia la corteza ovárica (región en la cual se encuentran ubicados los folículos) (1).

Las células foliculares somáticas (granulosa y teca) contribuyen de diversas formas al cumplimiento de la ovulación, esencial para la reproducción y sobrevida de las especies. Ellas proveen los requerimientos nutritivos para el crecimiento y maduración de los ovocitos contenidos en los folículos seleccionados para la ovulación.

Al mismo tiempo que contribuyen a la atresia y destrucción de los ovocitos de folículos no seleccionados (1).

Las células de la granulosa rodean e interaccionan directamente con el ovocito, mientras que las células de la teca se encuentran en la periferia de los folículos, separadas de las células de la granulosa por la lámina basal. A medida que los folículos son reclutados, desde folículos primordiales hasta su máximo desarrollo (folículos preovulatorios), estos aumentan en número de células de granulosa y teca y se incrementa el tamaño del ovocito. Una vez que el o los ovocitos (dependiendo de la especie) son liberados desde los folículos preovulatorios, estos últimos forman cuerpos lúteos, fundamentales para que ocurra la implantación del embrión en el caso que hubiese ocurrido la fecundación (1).

Además de la ovulación, la secreción de hormonas esteroidales por parte de las células que forman parte del ovario, es otra función principal de la gónada femenina.

Las células de la teca sintetizan y secretan principalmente andrógenos, las células de la granulosa estrógenos y las células lúteas progesterona. Estas hormonas actúan sobre una amplia variedad de tejidos blanco y órganos que no sólo comprenden el

sistema reproductivo, sino que incluyen variados otros órganos y sistemas, como el sistema nervioso central, músculo esquelético, sistema cardiovascular, hígado, tejido adiposo, etc. Complementario al efecto hormonal sobre estructuras lejanas al ovario, los esteroides producidos por las células foliculares actúan localmente sobre los propios folículos, de forma autocrina (sobre las mismas células que los secretan) y/o paracrina (sobre células vecinas). Estos efectos hormonales contribuyen al correcto funcionamiento del sistema reproductivo femenino (1).

2) Regulación de las funciones ováricas

Las funciones ováricas, principalmente la ovulación y la secreción de hormonas esteroidales, son finamente reguladas tanto por señales sistémicas como locales. En este contexto el eje endocrino hipotálamo-hipófisis-ovario (HHO) y el eje neural hipotálamo-ovario participan de forma coordinada para mantener la homeostasis del ovario (fig. 1).

2.1) Regulación endocrina:

El eje endocrino HHO es comandado por neuronas GnRHérgicas, ubicadas en el hipotálamo, las cuales liberan en forma de pulsos el Factor Liberador de Gonadotropinas (GnRH) a la circulación portal hipofisiaria. Este factor estimula la liberación de las gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante (FSH) desde la hipófisis anterior. Estas últimas actúan sobre receptores específicos localizados en las células ováricas, controlando de esta forma la ovulación y la secreción de hormonas esteroidales (1). Los receptores de LH se ubican en las células de la teca, de la granulosa y de células intersticiales, mientras que los receptores de FSH se ubican en las células de la granulosa. La hormona FSH es responsable del reclutamiento y crecimiento folicular y de la síntesis de estrógenos durante la fase folicular del ciclo ovárico. Por su parte, la hormona LH es responsable de la ovulación y la formación de los cuerpos lúteos. Finalmente, los esteroides ováricos, producidos como consecuencia de la acción de las gonadotropinas sobre sus respectivos receptores, tienen la capacidad de actuar sobre el hipotálamo e hipófisis, produciendo un control del eje endocrino a través de retroalimentación negativa y positiva (1).

2.2) Regulación nerviosa:

Muchas evidencias han permitido postular que las funciones ováricas, además de la regulación hormonal clásica, está controlada a través de mecanismos neuronales de origen cerebral (2, 3). Kawakami y col. fueron, sin embargo, los primeros que presentaron evidencias sobre la existencia de una vía de control neural directa desde el hipotálamo al ovario (4). Aunque estos autores no entregaron evidencias neuroanatómicas directas sobre esta vía, este hallazgo permitió el desarrollo de estudios neuroquímicos sobre la relación funcional entre el sistema nervioso autonómico (SNA) y el ovario. El uso de la técnica de trazado viral transneuronal, permitió a Gerendai y col., definir al núcleo paraventricular (NPV) del hipotálamo como la región del cerebro desde donde se proyectan las neuronas, que hacen su último relevo sináptico en el ganglio celíaco y finalmente inervan al ovario (5).

El ovario recibe principalmente inervación simpática y sensorial, con una pequeña contingencia de fibras parasimpáticas (6). Los nervios simpáticos liberan desde sus terminales nerviosos principalmente el neurotransmisor noradrenalina (NA).

La inervación llega al ovario por dos rutas: a) el plexo nervioso, que viaja junto a los vasos sanguíneos y b) el nervio ovárico superior (SON), el cual está asociado al ligamento suspensorio y lleva la mayoría de las fibras noradrenérgicas que inervan los folículos (7). Los nervios simpáticos ováricos participan en el desarrollo folicular, secreción de esteroides y ovulación (8, 9). Por lo tanto, cambios en la actividad nerviosa del ovario pueden alterar la correcta fisiología ovárica y desencadenar eventos que lleven a patologías ováricas.

Figura 1: Esquema de la regulación endocrina y nerviosa del ovario. GnRH: hormona liberadora de gonadotroipinas; LH: hormona luteinizante; FSH: hormona folículo estimulante; P: progesterona; A:

androgenos; E: estrógenos; SON: nervio ovárico superior; NA: noradrenalina.

3) Inervación simpática y síndrome de ovario poliquístico

El síndrome de ovario poliquístico (SOP) es ampliamente reconocido como la causa más común de infertilidad en mujeres y afecta entre el 5-10% de las mujeres en edad reproductiva (10). Los criterios de diagnóstico de este síndrome fueron redefinidos en el Congreso de Rotterdam (Holanda, 2003), en el cual se acordó que para diagnosticar SOP debe coexistir a lo menos dos de los tres criterios siguientes: 1) irregularidades menstruales, 2) signos bioquímicos o clínicos de exceso de andrógenos y 3) morfología de ovario poliquístico. Además, este síndrome está fuertemente asociado a desordenes metabólicos, en los que destacan defectos en la acción y secreción de insulina, lo cual le sitúa como un importante factor de riesgo de diabetes mellitus tipo 2 (11).

Si bien la etiología del SOP aún es desconocida, esta parece ser multifactorial, en la cual estarían involucrados componentes genéticos y ambientales. Este síndrome

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fue considerado por mucho tiempo un desorden principalmente reproductivo, sin embargo, en la actualidad variados descubrimientos le han otorgado implicaciones metabólicas.

Existen diversas investigaciones que apuntan a que cambios locales que alteren la esteroidogénesis podrían ser los eventos iniciales del síndrome. El grupo de investigación de nuestro laboratorio ha obtenido importantes evidencias de que cambios en la actividad nerviosa simpática del ovario participan en el desarrollo y mantención del ovario poliquístico en la rata (12-14). En el modelo animal de ovario poliquístico inducido mediante la administración de una dosis única de valerato de estradiol (EV), estrógeno de vida media larga, se producen cambios profundos en la homeostasis de las catecolaminas ováricas. Estos cambios se iniciaron antes del desarrollo de quistes ováricos y se mantuvieron incluso después de que los quistes se formaran. Las alteraciones involucraron un aumento en el contenido de NA ovárica, aumento en la liberación de NA desde los terminales nerviosos que llegan al ovario y un “down-regulation” de los receptores β-adrenérgicos en las células de la teca y el intersticio del ovario (12). Otro modelo animal de ovario poliquístico, que evita el estradiol como evento primario, es el inducido con estrés por frío crónico intermitente, en el cual se ha demostrado la activación de los nervios simpáticos ováricos y la aparición de estructuras quísticas (15-17). Finalmente, la administración del agonista β- adrenérgico isoproterenol durante 10 días, como forma de remedar una activación simpática, provocó la aparición de quistes ováricos después de 30 días de finalizado el tratamiento (13). Estas alteraciones encontradas en la inervación simpática del ovario de rata, parecen tener relevancia clínica, ya que un estudio realizado recientemente en Suecia, demostró por primera vez, con un registro intraneural de la actividad nerviosa simpática, un aumento del tono nervioso simpático en mujeres con SOP (18), concordante con el mayor nivel de estrés demostrado en estas pacientes (19).

La variedad de evidencias presentadas claramente apoyan la participación de la actividad nerviosa simpática ovárica en el desarrollo y/o mantención de la condición poliquística.

4) Estrés

4.1) Definición de estrés:

El término estrés fue introducido por Selye, quien lo definió como una respuesta no específica del cuerpo frente a cualquier demanda que éste tuviera (20).

Años más tarde Weiner, Chrousos, Gold, Goldstein y McEwen hicieron importantes contribuciones al concepto de estrés. Específicamente, Weiner introdujo el concepto de especificidad de la respuesta al estrés, mediante la descripción del estrés como presiones selectivas físicas y sociales del medio ambiente que rodea al organismo (agentes estresores). Estos estímulos amenazan o presentan un desafío al organismo, el cual reacciona con un patrón de respuestas compensatorias (21). En esta misma línea, Chrousos y Gold definieron el estrés como un estado de falta de armonía o amenaza de la homeostasis, que evocan respuestas tanto específicas como inespecíficas (22). Por último, McEwen agregó el término “alostasis” a lo que a estrés se refiere. Este concepto se refiere a los procesos de adaptación del organismo, mediante la producción de diversos mediadores como esteroides adrenales, catecolaminas, citoquinas, mediadores tisulares y genes de respuesta temprana (23).

Sin duda que las adaptaciones fisiológicas son un elemento fundamental para mantener la homeostasis de un organismo cuando éste es sometido a condiciones ambientales adversas.

4.2) Clasificación de los estímulos estresores:

Un estímulo estresor puede considerarse como un agente que interrumpe la homeostasis. En general, los estresores pueden dividirse en cuatro categorías: a) estresores físicos, b) estresores psicológicos, c) estresores sociales y d) estresores que alteran la homeostasis cardiovascular y metabólica. Entre los estresores físicos se incluyen el frío, el calor, la radiación intensa, el ruido, la vibración, entre otros. Por otra parte, los estresores psicológicos afectan profundamente los procesos emocionales y pueden resultar en cambios de comportamiento, como ansiedad, miedo, o frustración.

El estrés de tipo social para un animal corresponde a la colocación de éste en el territorio de un animal dominante, y en los seres humanos, al desempleo y la separación matrimonial, entre otros. Los estresores que perturban la homeostasis cardiovascular o metabólica incluyen el ejercicio, la inclinación vertical, la exposición de

calor, la hipoglucemia, y la hemorragia (24). Muchos de los factores estresantes que se han descrito, se utilizan en animales investigación, como modelos de activación de diferentes vías neuroendocrinas.

En términos de duración, el estrés puede dividirse en dos categorías principales: agudo y crónico. El estrés agudo corresponde a un estímulo único con tiempo de duración limitado, en cambio el crónico puede ser una exposición única pero prolongada o varias exposiciones al agente estresor (estrés crónico intermitente) (24).

4.3) Efecto del estrés crónico sobre la condición poliquística

El estrés es una característica que prevalece en las mujeres con SOP (19), lo cual sugiere que podría jugar un rol importante en la etiología de este desorden endocrino-metabólico. En nuestro grupo de trabajo, hemos demostrado la capacidad del estrés de activar la inervación simpática ovárica e inducir cambios en el desarrollo folicular y la formación de quistes en ratas (16, 17). Los tipos de estrés que se han utilizado han sido crónicos, con un mínimo de 3 semanas de duración. Ésto debido principalmente a la cinética de crecimiento folicular en los roedores, la cual ha mostrado que desde que entran al pool de folículos en crecimiento hasta que alcanzan el estado preovulatorio transcurren aproximadamente 20 días (25). Uno de los modelos de estrés usados fue el estrés combinado de restricción de movimiento y frío, sin embargo, después de 11 semanas de tratamiento los cambios ováricos encontrados a las 3 semanas fueron revertidos (17). El estrés por restricción de movimiento induce una fuerte respuesta del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, aumentando los corticoides plasmáticos. Estos últimos inhiben la actividad nerviosa simpática (26, 27), lo cual podría explicar la reversión de los cambios ováricos en el modelo de estrés combinado.

Por otra parte, el estrés por frío crónico de 4 semanas no afecta el nivel de corticoides plasmáticos (28), lo cual fue corroborado por nuestro grupo de trabajo (16), e hizo de éste un buen modelo de estrés para inducir cambios en la actividad nerviosa simpática ovárica. Los cambios ováricos observados en el modelo de estrés por frío crónico dan cuenta de un retardo en el desarrollo folicular y muestran la aparición de folículos con hipertrofia tecal, similar a lo observado en ovarios de mujeres con SOP (29).

Las alteraciones metabólicas, como la resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa, que acompañan al ovario poliquístico en un gran número de pacientes, han

sido relacionadas con un alto grado de estrés. Sin embargo, en nuestro modelo experimental aún se desconoce si existen cambios a nivel metabólico.

4.4) Efecto del estrés sobre el síndrome metabólico

El síndrome metabólico es un conjunto de factores de riesgo que aumentan el riesgo de enfermedad cardiaca y diabetes tipo 2. Las características del síndrome metabólico son obesidad abdominal, dislipidemia (triglicéridos aumentados, alta concentración de lipoproteínas de baja densidad y baja concentración de lipoproteínas de alta densidad), presión sanguínea elevada y resistencia a la insulina (con o sin intolerancia a la glucosa) (30). Varios autores han discutido el posible efecto del estrés sobre los componentes del síndrome metabólico, por ejemplo, Taran Chandola y cols., mostraron evidencias clínicas de una relación entre estresores psicológicos y enfermedad cardiaca (31); Rosmond R., demostró que alteraciones psicológicas y socioeconómicas pueden relacionarse con resistencia a la insulina y obesidad visceral (32). Por otra parte, investigaciones en animales han demostrado que diferentes tipos de estresores, tales como estrés acústico y restricción de movimiento, alteran el control de la glicemia, pudiendo desencadenar resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa y/o diabetes tipo 2 (33, 34).

5) Resistencia a la insulina 5.1) Definición:

La resistencia a la insulina, uno de los aspectos del síndrome metabólico, se caracteriza por una respuesta defectuosa o anómala de la insulina en tejidos periféricos: músculo esquelético, hígado y tejido adiposo, donde no ejerce de forma adecuada sus acciones biológicas, condicionando como mecanismo de compensación un incremento en la secreción de insulina (35). Los defectos moleculares de la actividad insulínica varían dependiendo del tejido estudiado. La cascada de transducción normal de la insulina se inicia con la unión a su receptor de membrana, el cual corresponde a un heterotetrámero compuesto de dos subunidades α y dos β unidos por puentes disúlfuro. Este receptor del tipo tirosina quinasa autofosforila residuos de tirosina en su subunidad intracelular β, cuando las moléculas de insulina se unen al receptor. Posteriormente, se fosforila el sustrato del receptor de insulina (IRS),

el cual se une transitoriamente al receptor de insulina activado y sirve como molécula de anclaje para otras proteínas que poseen dominios de unión, tal como la fosfoinositol-3 quinasa (PI3K). La PI3K a su vez fosforila a la proteína quinasa B (PKB o AKT), la cual fosforila a la glicógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3). Esta última inhibe la síntesis de glicógeno al inhibir la glicógeno sintasa. La activación de la PI3-K conduce también a la traslocación del transportador de glucosa dependiente de insulina (GLUT- 4) a la superficie celular, lo cual induce la captación de glucosa por parte de las células (figura 2) (36). Algunos de los cambios que ocurren en los tejidos cuando se está en presencia de resistencia a la insulina son la disminución de la activación de la PI3K y la expresión de IRS-1 y GLUT-4 (37)

PI3-K IRS p85 p110

PKB

PKC

Figura 2: Representación esquemática de la transducción de señal de la insulina en células de músculo esquelético.

5.2) Acciones de la insulina:

La acción clásica de la insulina es el control del metabolismo de la glucosa a través de una retroalimentación dual que une a la insulina plasmática con la glicemia.

Es decir, cuando aumenta la concentración de glucosa plasmática se induce la secreción de insulina desde las células beta pancreáticas, lo cual inhibe la gluconeogénesis hepática. Sin embargo, un gran número de acciones nuevas de la insulina se han propuesto a partir de estudios in vivo e in vitro (38). A nivel de sistema nervioso autonómico y central se ha demostrado que la insulina sistémica tiene un efecto excitatorio de las ramas simpáticas del sistema nervioso autonómico, aún cuando se prevenga la hipoglicemia (39). En estudios de liberación de noradrenalina desde tejido aórtico in vitro se ha demostrado un aumento de la liberación del neurotransmisor cuando éste se incuba en presencia de insulina (40), lo que hace posible un efecto de la insulina sobre neuronas simpáticas ováricas.

Por otra parte, existe variada evidencia que indica que la insulina actúa en el cerebro. La insulina atraviesa la barrera hematoencefálica y alcanza diferentes zonas del cerebro. En algunas regiones, especialmente en áreas periventriculares, la barrera hematoencefálica está incompleta, y precisamente en esas brechas la insulina puede difundir hacia el núcleo arcuato y paraventricular, en donde se une a receptores específicos que están expresados abundantemente en sus neuronas (41). Las funciones de la insulina sobre estos núcleos no son del todo claras, sin embargo, existen estudios que demuestran un efecto sobre el control de la ingesta de alimento, el crecimiento neuronal, el gasto energético y la reproducción (42, 43).

Cabe mencionar que la transducción de señal de la insulina en diferentes tejidos puede sufrir modificaciones distintas. En esta línea, se han descrito en la literatura, tanto en humanos como en modelos animales, cambios en la sensibilidad a la insulina tejido y/o función específica (44, 45).

5.3) Resistencia a la insulina e hiperinsulinemia compensatoria en el SOP:

La hiperinsulinemia y la resistencia a la insulina juegan un importante papel en la patogénesis del SOP y el síndrome metabólico. Estos últimos son considerados factores de riesgo para diabetes mellitus tipo 2. Las mujeres con SOP presentan

resistencia a la insulina en un porcentaje mayor al 50 %, la cual es independiente del grado de obesidad de las pacientes (46).

La relación propuesta entre la hiperinsulinemia compensatoria a la resistencia a la insulina y el SOP, corresponde al efecto de la insulina sobre el eje endocrino hipotálamo-hipófisis-ovario. Específicamente, la insulina actuaría a nivel hipotalámico e hipofisiario cambiando el patrón de secreción de las gonadotropinas y a nivel ovárico aumentaría la secreción de andrógenos (47, 48). Estas alteraciones en el eje de regulación endocrino de la función ovárica, podrían ser en parte responsables de la patología poliquística. Sin embargo, hasta el momento se desconoce el efecto que pudiera tener la insulina sobre el eje de regulación neural de la función ovárica, ya sea actuando directamente sobre terminales nerviosos simpáticos ováricos o centralmente en donde está el origen de la vía nerviosa que inerva el ovario (ver figura 3). Tampoco se sabe si el estrés por frío crónico intermitente, descrito previamente como un modelo de ovario poliquístico (16), pudiera tener cambios en la sensibilidad a la insulina en diferentes órganos blanco.

Estrés

Figura 3: Representación esquemática de la relación entre la hiperinsulinemia y la hiperandrogenemia en mujeres SOP insulina resistentes (derecha). Posible rol de la insulina sobre el eje de regulación nervioso ovárico (izquierda) con probables cambios en la sensibilidad a la insulina en un modelo de estrés crónico.

GnRH

LH

A

∆4

Ovario

∆4

E2 y ∆4

Resistencia a insulina

Hiperinsulinemia

G.G. CCeelliiaacoco

SO S ON N

?

?

A

E2

Ovario

Los antecedentes mencionados anteriormente apoyan la hipótesis de que la insulina puede regular la homeostasis de la función reproductiva, alterando la actividad nerviosa simpática ovárica, ya sea a nivel de sistema nervioso central y/o a nivel local, directamente sobre los terminales nerviosos ováricos.

HIPÓTESIS

“En el ovario poliquístico inducido mediante estrés crónico por frío, la insulina activa la inervación simpática ovárica y modifica la esteroidogénesis mediante un efecto central y/o periférico, alterando el desarrollo folicular”

OBJETIVO GENERAL

Estudiar el efecto de la insulina, aplicada central y localmente, sobre la actividad simpática del ovario de rata, en un modelo de ovario poliquístico inducido por estrés crónico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Objetivo específico Nº1:

“Determinar los cambios en la acción y secreción de insulina en el modelo de ovario poliquístico inducido por estrés frío crónico”

• Objetivo específico Nº2:

“Estudiar el efecto in vitro de la insulina sobre la actividad simpática ovárica y la secreción de hormonas esteroidales del ovario en el modelo de ovario poliquístico inducido por estrés crónico”

• Objetivo específico Nº3:

“Estudiar el efecto de la insulina aplicada centralmente sobre la actividad simpática del ovario en el modelo de ovario poliquístico inducido por estrés crónico”

MATERIALES Y MÉTODOS

1) Animales y grupo experimentales

Se usaron ratas hembras, adultas, de aproximadamente 200 gramos, de la cepa Sprague-Dawley, provenientes del bioterio de animales de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Los animales se mantuvieron en cajas individuales a 23º C en un régimen de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (luz apagada de 7 p.m. a 7 a.m.), con alimento y agua ad libitum. Un total de 81 ratas fueron utilizadas en esta tesis, de las cuales 15 se usaron en el experimento del clamp hiperinsulinémico euglicémico, 10 en la prueba de tolerancia a la glucosa, 18 en los experimentos de liberación de NA, 10 en la cuantificación del nivel de mRNA, 10 en los análisis del nivel de proteína, 8 en la secreción in vitro de hormonas esteroidales y 20 en los experimentos de administración de insulina intracerebroventricular. Todos los procedimientos con animales fueron previamente aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas y Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.

Para el desarrollo de los objetivos 1 y 2 los animales fueron divididos al azar en 2 grupos experimentales: 1) grupo control (mantenidos a 23º C) y 2) grupo estrés por frío (4º C por 3 horas/día, de lunes a viernes, por 4 semanas). En el caso del objetivo número 3 los animales fueron separados en 4 grupos experimentales: 1) grupo control infundido con vehículo (Control Vehic), 2) grupo control infundido con insulina (Control Ins), 3) grupo estresado infundido con vehículo (Estrés Vehíc) y 4) grupo estresado infundido con insulina (Estrés Ins).

2) Protocolo de estrés por frío crónico intermitente

Para los experimentos de esta tesis, solamente se utilizaron las ratas que tuvieron ciclos estrales regulares de 4 días. El procedimiento de estrés utilizado ha sido previamente descrito por nuestro grupo de trabajo (16). Este consiste en colocar las ratas a 4 ºC por 3 horas cada día, de lunes a viernes, durante 4 semanas. Tanto los animales control como los estresados fueron manipulados diariamente por el mismo operador y mantenidos en la misma habitación. Una vez terminado el procedimiento de

estrés, los animales fueron eutanasiados 24 horas después. Durante el protocolo de estrés, se siguió la ciclicidad estral, peso corporal e ingesta de alimento.

3) Seguimiento de los animales 3.1) Ciclicidad estral:

Las etapas del ciclo se determinaron mediante el análisis microscópico del tipo de células predominantes en un frotis vaginal obtenido diariamente (lunes a viernes), tanto en el grupo de ratas control, como en el de ratas estresadas. Las etapas son:

Proestro: se caracteriza citológicamente por la presencia de células epiteliales nucleadas, bien redondeadas. La duración de esta etapa es de 12 a 24 horas

Estro: citológicamente se caracteriza por la presencia de células escamosas agrupadas y con formas irregulares. Esta etapa tiene una duración entre 24 y 48 horas y corresponde al periodo de receptividad sexual de la hembra.

Metaestro o Diestro 1: el frotis vaginal se caracteriza por la presencia de leucocitos y células escamosas. La duración es entre 12 y 24 horas.

Diestro 2: se caracteriza por una gran presencia de leucocitos en el frotis vaginal. La duración de esta etapa es de aproximadamente 48 horas.

3.2) Peso corporal:

Los animales fueron pesados en una balanza granataria diariamente, de lunes a viernes, durante las cuatro semanas de duración del protocolo de estrés.

3.3) Ingesta de alimento:

Para determinar el consumo de alimento, se determinó la diferencia de peso entre el alimento colocado a cada animal y el alimento sobrante después de dos días.

Este procedimiento se repitió durante todo el tratamiento, tanto para los animales control, como para los estresados.

Una vez finalizado el último evento de estrés, se esperó 24 horas para hacer los experimentos correspondientes.

4) Procedimientos experimentales finalizado el protocolo de estrés 4.1) Prueba de tolerancia a la glucosa:

Mediante esta prueba se determinó la capacidad de los animales de secretar insulina en respuesta a un secretagogo (glucosa) y de regular la glicemia. Los animales de ambos grupos experimentales (control y estrés) se mantuvieron en ayuna por 12 horas antes de comenzar la prueba. Las ratas fueron anestesiadas con 120 mg/kg de tiopental sódico vía i.p. Posteriormente a los animales se les insertó una cánula en la arteria carótida y se administró 2 g/kg de glucosa vía i.p. La colección de sangre, desde la cánula implantada en la arteria, se realizó a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la carga de glucosa. Los tiempos de colección nos permitieron observar en la curva de glucosa plasmática versus tiempo, la capacidad del animal de regular la glicemia. La determinación de insulina sérica se realizó en los mismos sueros, lo cual nos permitió conocer la capacidad del páncreas de responder frente a un secretagogo como la glucosa. La insulina se midió con un kit de ELISA específico para rata (Alpco Diagnostics, Windham,NH). Por su parte, la glucosa se determinó mediante un ensayo enzimático colorimétrico (Human, Weisbaden, Germany).

4.2) Clamp hiperinsulinémico euglicémico:

Existen diversos métodos para determinar el grado de resistencia a la insulina, sin embargo el procedimiento más válido para este fin corresponde al clamp hiperinsulinémico euglicémico (49). Después de 24 horas de finalizado el procedimiento de estrés crónico, se procedió a realizar el siguiente protocolo experimental, similar a lo descrito anteriormente (50): las ratas se mantuvieron anestesiadas durante todo el experimento, aproximadamente 90 minutos desde la administración del anestésico (tiopental sódico 120 mg/kg i.p.). Los animales se colocaron sobre una manta temperada con el fin de mantener la temperatura corporal.

Se insertaron dos catéteres, uno en la arteria carótida izquierda y el otro en la vena yugular derecha, utilizados para la colección de sangre e infusiones de glucosa e insulina respectivamente. Además se colocó un catéter en la tráquea para permitir al

animal una mejor respiración. Posteriormente, se tomó una muestra de sangre basal en la cual se midió inmediatamente la glicemia con un Accucheck Comfort Glucometer™. Una mezcla de insulina (100 U/ml; Humalog, Eli Lilly, West Ryde, Australia) con 0.2 ml de albúmina y 0.9 % de NaCl se infundió a un flujo de 24, 16 y 12 mU/kg/min al minuto 1, 2 y 3 respectivamente. Inmediatamente después se cambió el flujo a 8 mU/kg/min y se administró a esta velocidad por todo el experimento. La euglicemia se mantuvo mediante la infusión de una solución de glucosa al 30 % p/v en 0.9 % de NaCl. Cada 5 minutos se midió la glicemia del animal en una gota de sangre obtenida desde la arteria carótida y se varió el flujo de glucosa con la finalidad de mantener una glicemia cercana a 6 mmol/l (ver figura 4). Al terminar el experimento se colectó una muestra de sangre para medir la concentración de insulina. La velocidad de infusión de glucosa se calculó con el promedio de al menos los últimos 3 valores en el estado estacionario (cuando la glucosa en la sangre es estable a 6.0 mmol/l, aproximadamente a los 60 minutos) y fue corregida por el peso corporal del animal.

Figura 4: Representación gráfica de la concentración de insulina (gráfico izquierda) y glucosa (gráfico derecha) durante el clamp. El minuto cero corresponde al momento en que comienza la infusión de insulina y glucosa. En el gráfico de concentración de glucosa plasmática se muestra la curva de velocidad de infusión de glucosa, la cual es la variable que se utiliza finalmente para determinar el grado de sensibilidad a la insulina.

Glucosa(mmol/L)

Min

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 25 20

15 10

5 0 Velocidad de infusión de Glucosa (mg/kg/min)

Glucosa(mmol/L)

Min

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 25 20

15 10

5

0 Velocidad de infusión de Glucosa (mg/kg/min) -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70

150 250

50 100 200

0

Min

liU)

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 150

250

/mlInsuna(µ

50 100 200

0

Min

-20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 150

250

50 100 200

0

Min

liU)/mlna(µInsu

4.3) Liberación de noradrenalina ovárica:

La liberación de neurotransmisores es una prueba funcional de la actividad nerviosa. En el caso particular de la liberación de NA ovárica, esta representa la actividad de los nervios simpáticos que inervan el ovario. Después de 24 horas de finalizado el procedimiento de estrés los animales se eutanasiaron y los ovarios rápidamente se disectaron e incubaron en buffer Krebs (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM, KH₂PO₄ 1.2 mM, MgSO₄ 1.2mM, NaHCO₃ 250 mM, CaCl₂ 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml, ácido ascórbico 0.1 mg/ml) pH 7.4, en presencia de mezcla O₂/CO₂ (95:5) por 20 minutos y luego se incubaron con 2 µCi [³H]-NA (specific activity 74.9 Ci/mmol, Perkin Elmer, Boston, MA) por 30 minutos a 37º C. La radioactividad no retenida por el tejido fue lavada mediante la incubación de los ovarios con buffer Krebs sin [³H]-NA durante 60 minutos (6 lavados continuos de 10 minutos cada uno). Dependiendo del tipo de estímulo aplicado, para simular un potencial de acción e inducir liberación de NA, es como se procedió a continuación.

4.3.1) Liberación inducida con estímulo eléctrico:

Los ovarios se transfirieron a una cámara de superfusión termoregulada y se perfundieron con buffer Krebs a un flujo de 2.5 ml/min. Simultáneamente se utilizaron dos cámaras de superfusión, colocándose un ovario en cada una de ellas. Se tomaron 3 fracciones de 1 minuto como secreción basal (B), luego ambos ovarios se sometieron a un estímulo eléctrico (80V, 10Hz, 2ms, 1 minuto) en ausencia de insulina (estímulo control) y se tomó una fracción de 1 minuto correspondiente al estímulo (E).

Finalmente, se tomaron 4 fracciones de 1 minutos correspondientes a los post- estímulos (PE). Posteriormente, en una de las cámaras de superfusión se cambió el buffer por Krebs con insulina (10 UI/l). Luego de 10 minutos de lavado del tejido, es decir, con flujo de buffer en ambas cámaras de superfusión, se repitió el protocolo de estimulación. La finalidad de realizar dos estímulos en cada ovario es expresar los resultados como razón entre ambos estímulos (E2/E1), de tal forma de independizarse de variables del tejido o de la cámara de superfusión, que hicieran obtener errores en las comparaciones de ambos ovarios.

Una vez terminado ambos estímulos, los ovarios se homogeneizaron en ácido perclórico 0.4 M, se centrifugó a 15.000 g por 10 minutos y se determinó el remanente de [³H]-NA en el tejido y la [³H]-NA de las fracciones con un contador de centelleo (Packard Liquid Scintillation Analyzer 1600TR con un 72.5 % de eficiencia para tritio).

El eflujo de NA se calculó y expresó como el porcentaje de liberación fraccional (porcentaje del total de radioactividad presente en el ovario en cualquier momento). La cantidad total de NA liberada se calculó como el área bajo la curva después de la estimulación menos el eflujo basal.

4.3.2) Liberación inducida con estímulo de K⁺ 80 mM:

Cada par de ovarios, proveniente de cada rata, se separaron al azar e incubaron en pocillos (placas de 24 pocillos), que contienen 1.5 ml de buffer Krebs. Los ovarios se cambiaron al siguiente pocillo cada 2 minutos. Después de 3 incubaciones de 2 minutos cada una (basales), los ovarios se estimularon por despolarización con un medio isotónico que contenía KCl 80 mM y NaCl 43.3 mM (buffer Krebs K⁺). Los ovarios posteriormente fueron lavados por 30 minutos antes de ser sometidos a un segundo periodo de estimulación. Esta vez uno de los ovarios se incubó con buffer Krebs suplementado con insulina (10 UI/l) y el otro se mantuvo en las mismas condiciones utilizadas en el primer periodo de estimulación. El motivo de la realización de dos estímulos consecutivos en cada ovario y la forma de expresar los resultados es la misma descrita anteriormente para la estimulación inducida con estímulo eléctrico.

4.4) Secreción de hormonas esteroidales ováricas

Una vez finalizada las 4 semanas de estrés, se esperó 24 horas para eutanasiar a los animales y se disecó los ovarios. Estos se dividieron en dos partes y se incubaron en 2 ml de buffer Krebs-Ringer (NaCl 118.6 mM, KCl 4.7 mM, KH₂PO₄ 1.2 mM, MgSO₄ 1.2mM, NaHCO3 250 mM, CaCl2 2.5 mM, glucosa 4.5 mg/ml, ácido ascórbico 0.1 mg/ml, EDTA 0.11 mg/ml, albúmina 0.1 mg/ml) pH 7.4, a 37 ºC en presencia de mezcla O2/CO2 (95:5) durante 3 horas. Cada mitad de ovario (en total 4 por cada rata) fue incubada en un pocillo distinto que contenía: 1) buffer Krebs-Ringer; 2) Krebs-Ringer más hCG (2.5 UI/ml); 3) Krebs-Ringer más insulina (10 UI/l); 4) Krebs-Ringer más hCG (2.5 UI/ml) e insulina (10 UI/l). El diseño experimental fue tal que permitió utilizar las 4

mitades simultaneamente. Una vez cumplida las 3 horas de incubación se recuperó el sobrenadante y se determinó en este último la progesterona (P), androstenediona (∆₄) y estradiol (E₂) secretado al medio por el ovario mediante un inmunoensayo (EIA, Alpco Diagnostics, Windham, NH) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las variaciones intra e inter ensayo fueron menos de 11 %, 7 % y 10 % para P, ∆₄ y E₂ respectivamente. El valor mímino detectable para P fue de 2.5 pg; para ∆₄ 1.25 pg; y para E₂ 0.5 pg.

4.5) Separación de células de granulosa y teca-interstical

La obtención de una fracción enriquecida de células de la granulosa a partir de ovarios completo ha sido descrita previamente en la literatura (51). Una vez disectados e incubados los ovarios en 50 µl de buffer Krebs, estos se pincharon con una aguja y se colectó la suspensión de células en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. Este procedimiento se repitió tres veces, colectando finalmente un volumen de 150 µl de suspensión de células de granulosa. La suspensión fue centrifugada a 250 g y lavada tres veces con buffer Krebs. Tanto de la suspensión de células de granulosa como del resto del ovario (principalmente células tecales-intersticiales) se extrajo el RNA total y las proteínas para los análisis de PCR en tiempo real y western blot respectivamente.

Para comprobar la pureza de la preparación, se midió el nivel de mRNA para el receptor de FSH en ambas fracciones, ya que este sólo se expresa en células de la granulosa (52).

4.6) Nivel de mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr por PCR en tiempo real El RNA total se extrajo del músculo tibialis, ovario completo, células de granulosa y teca-intersticial, mediante el método descrito por Chomczynski and Sacchi (53). Se tomó 5 µg del total de RNA extraído de cada una de las muestras y se sometieron a la reacción de transcripción reversa para obtener cDNA. La reacción se llevó a cabo en presencia de dNTPs 1.6 mM, DTT 10 mM, partidores randomizados 176 nM (Invitrogen, Carlsbad, CA), RNasaOUT 25 U (Invitrogen, Carlsbad, CA) y transcriptasa reversa SuperScript II 125 U (Invitrogen, Carlsbad, CA). El volumen final de reacción fue de 30 µl y la reacción se llevó a cabo a 42 ºC por 60 minutos, deteniéndose por calentamiento de las muestras a 75 ºC durante 10 minutos.

Posteriormente, los cDNA obtenidos se amplificaron mediante la reacción de PCR en tiempo real, en presencia de partidores específicos para cada uno de los genes de interés. El volumen final de esta reacción fue de 25 µl, de los cuales 12.5 µl correspondieron a 2X Brilliant^® Platinum SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene®, 1834 State Hwy. 71 West), 9.5 µl a agua estéril nanopura, 0.5 µl a cada uno de los partidores y 2 µl a cDNA.

El perfil de temperatura utilizado en el termociclador para la reacción de PCR en tiempo real fue el siguiente:

1) 10 minutos a 95 ºC (ciclo único)

2) 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 60 ºC, 30 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 78 ºC (40 ciclos)

3) 1 minuto a 95 ºC, 7 segundos a 72 ºC, 7 segundos a 95 ºC (ciclo único)

La intensidad de fluorescencia de la doble hebra formada unida al reactivo SYBR-Green I, medida al final de cada ciclo de elongación (etapa 2), refleja la cantidad de producto PCR formado. Para determinar la especificidad del producto formado se realizó una “curva de melting” entre 72-95 ºC, bajo continua medición de fluorescencia (etapa 3). Cada amplicón o producto PCR formado tiene una temperatura de desapareamiento específica (melting point). La cantidad de mRNA inicial de cada gen de interés se calculó, determinando el ciclo en el cual comenzó el aumento lineal del producto PCR. El valor de ciclo se interpoló en una curva estándar obtenida por diluciones seriadas de una muestra de concentración conocida.

Los partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1 y Glut-4 se diseñaron a partir de las secuencias del Genebank y los partidores para Fshr se obtuvieron de la literatura (54) (ver tabla 1). Para normalizar la cuantificación de los mRNA para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4 y Fshr, se midió en cada uno de los tejidos el gen de expresión constitutiva subunidad ribosomal 18s y los resultados se expresaron como la razón entre el gen de interés y el constitutivo. La medición del mRNA 18s se realizó utilizando partidores disponibles comercialmente (Ambion, Austin, TX, USA) y se llevó a cabo en tubos de PCR independientes para evitar interferencia con la amplificación de los genes de interés.

Tabla 1: Partidores para Irs-1, Irs-2, Glut-1, Glut-4, Fshr y 18s de rata.

Nombre Secuencia (5'-3') Código de acceso al

GenBank Irs-1

Sentido GGA AGC CAT GGA CAA ACG GAG TAG Antisentido TCT GGG CCA TAG TAG CAT TCT CAG

NM_012969

Irs-2

Sentido CCC TGT ACT TGC GGT GGT GGA G Antisentido CTG AGT GAT GAG GCT GGG TAT GAC

XM_001076309

Glut-1

Sentido CCT ACC GCC AGC CCA TCC TCA T Antisentido CCA CGA CGA ACA GCG ACA CCA C

NM_138827

Glut-4

Sentido CGT CCT CCT GCT TGG CTT CTT CAT Antisentido CCA CCA TTT TGC CCC TCA GTC ATT

NM_012751 Fshr

Sentido CAT CAC TGT GTC CAA GGC CA Antisentido TGC GGA AGT TCT TGG TGA AAA

BC 137991

18s

Sentido TCA AGA ACG AAA GTC GGA GG Antisentido GGA CAT CTA AGG GCA TCA CA

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4.7) Nivel de proteína IRS-1 y GLUT-4 por Wetern Blot

La proteínas se extrajeron de ovarios, músculo tibialis, fracción de células de granulosa y de teca-intersticial, mediante la homogeneización de los tejidos en un homogenizador vidrio-vidrio con 200 µl de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, Triton 1 %; pH 7.4) suplementado con un cocktail inhibidor de proteasas (SIGMA, St. Louis, Missouri, USA), PMSF y DTT. El homogenizado se centrifugó a 16500 g por 10 minutos a 4 ºC y se procedió a recuperar el sobrenadante en el cual se encuentran las proteínas. La determinación de proteínas totales se realizó mediante el método de Lowry (55), el cual se basa en la formación de un complejo entre las proteínas y el cobre en medio alcalino, el cual reacciona con el reactivo de Folin (mezcla entre ácido fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico) y finalmente la reducción de este compuesto es detectado colorimétricamente a una absorbancia de 660 nm. La separación de las proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida con SDS al 8 %, en el cual se cargaron 50 µg de proteína de cada muestra. La electroforesis se realizó con una diferencia de potencial constante de 100 V y una duración de aproximadamente 1 hora. Posteriormente las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en una cámara electroforética de transferencia, con intensidad de corriente constante a 300 mA durante 3 horas. Finalizada la

transferencia, la nitrocelulosa fue bloqueada con leche en polvo al 5 % en TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0. % Tween-20, pH 7.6) por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La membrana fue incubada toda la noche a 4 ºC con el anticuerpo primario correspondiente diluido en TBST: anti-IRS-1 (C-20, Santa Cruz, Biotechnology, Inc., USA; dilución 1:100), anti-GLUT-4 (H-61, Santa Cruz, Biotechnology; dilución 1:100) o anti-β-tubulin (3F3-G2, Santa Cruz, Biotechnology;

dilución 1:1000). Al día siguiente las membranas fueron lavadas tres veces (7 minutos cada vez) con TBST e incubadas con el anticuerpo secundario anti-rabbit (IRS-1 y GLUT-4) o anti-mouse (β-tubulin), por 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La detección se realizó mediante quimioluminiscencia con el sistema de detección de western blot ECL plus (Amersham Biosciences). Las películas fotográficas se escanearon y la intensidad de las bandas se midió con el programa UN-SCAN-IT (Silk Scientific, Orem, Utah). Los resultados se expresaron como la razón entre la intensidad de banda de la proteína de interés y la proteína de expresión constitutiva β-tubulina (utilizada también como control de carga).

5) Administración de insulina intracerebroventricular durante el protocolo de estrés

Una semana antes de comenzar el procedimiento de estrés los animales fueron canulados en el tercer ventrículo. Para ello, las ratas se anestesiaron con una mezcla de ketamina (60mg/Kg) y xilacina (10mg/Kg) administrada vía i.p. Posteriormente, se implantaron cánulas de acero inoxidable de 24 G con diámetro externo de 0.5 mm en el tercer ventrículo (3V) de acuerdo a las siguientes coordenadas respecto a Bregma: (-) 0.28 mm antero-posterior, 0,0 mm medio-lateral y (-) 0,81 mm dorso-ventral desde el cráneo del animal, según el Atlas de coordenadas estereotáxicas de cerebro de rata de Paxinos & Watson (56) y de acuerdo a lo publicado anteriormente (3). Luego de la cirugía los animales permanecieron en recuperación y antes de comenzar el protocolo de estrés se dividieron en 4 grupos: 1) control vehículo, 2) control insulina, 3) estrés vehículo y 4) estrés insulina. La administración de vehículo (solución fisiológica, NaCl 0.9 %) o insulina (1 UI/kg) se realizó durante 7 días (última semana de estrés). La forma de administración fue mediante infusión continua con bomba de perfusión a un flujo de 1 µl/minuto. Posteriormente, se procedió a eutanasiar los animales y disecar