Informe caseina

(1)

UNIVERSIDAD DEL CAUCA UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FFACULACULTTAD DAD DE CIE CIENCIAS ENCIAS NATURNATURALES, ALES, EXACTAS Y DE EXACTAS Y DE LALA EDUCACIÓN

EDUCACIÓN DEPAR

DEPARTAMENTO DE TAMENTO DE QUÍMICAQUÍMICA

LABORATORIO DE BIOQUÍMCA I: BIOMOLECULAS LABORATORIO DE BIOQUÍMCA I: BIOMOLECULAS

Elaborado por: Brandon Rosero López ([email protected]) Elaborado por: Brandon Rosero López ([email protected])

Determinación cuantitativa de prot

Determinación cuantitativa de proteínas y determinación

eínas y determinación

cualitativa de Caseína.

1

1.. OObbjejetitivvoos.s.

Determinar la concentración de muestras problemas y muestras conocidas a partir Determinar la concentración de muestras problemas y muestras conocidas a partir de una curva de calibración

de una curva de calibración

Realizar el procedimiento de separación de la caseína se!n su punto isoel"ctrico. Realizar el procedimiento de separación de la caseína se!n su punto isoel"ctrico.

2.

2. Resultad Resultadosos C

Coonncceennttrraacciióónn AAbbssoorrbbaanncciia a 11 AbAbssoorrbbaanncciia a 22 AAbbssoorrbbaanncciia a 33

0 0 00,,000000 00,,0000 00,,0000 1 100 00,,001111 0,,00 00077 00,,001133 2 200 00,,001177 00,,001122 00,,001177 3 300 00,,002299 00,,0022 00,,001199 4 400 00,,0033 00,,002255 00,,002244 5 500 00,,003366 0,,00 03311 00,,003322 Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión sin Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión sin o!r", cada A

o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 2%0 nm&bsorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos a 2%0 nm&

C

0 0 00,,000000 00,,000000 00,,000000 1 100 00,,000099 00,,11%% 00,,000022 2 200 00,,001122 0,,00 000%% 00,,002233 3 300 00,,001155 00,,001166 00,,0099 4 400 00,,002244 00,,33 00,,001111 5 500 00,,002266 0,,00 05522 00,,003355 Tabla 2.

Tabla 2. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión con Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la primera sesión con o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erent o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erenteses

$rupos a 760 nm& $rupos a 760 nm&

(2)

C

Coonncceennttrraacciióónn AAbbssoorrbbaanncciia a 11 AAbbssoorrbbaanncciia a 22

0 0 00,,000000 00,,000000 1 100 00,,000033 00,,000044 2 200 00,,000066 00,,000077 3 300 00,,0000%% 00,,0000%% 4 400 00,,001111 00,,001111 5 500 00,,001122 00,,001133 Tabla 3.

Tabla 3. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión sin Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión sin o!r"& 'ada A

o!r"& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $ruposbsorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos

C

0 0 00,,000000 00,,000000 00,,000000 1 100 ))00,,002266 00,,000022 ))00,,002277 2 200 ))00,,002266 0,,00 00033 ))00,,0022%% 3 300 ))00,,001155 0,,00 00055 ))00,,0022%% 4 400 ))00,,0022%% 0,,00 01100 ))00,,0011%% 5 500 00,,001122 0,,00 04422 ))00,,001100 Tabla .

Tabla . Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión con Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la primera sesión con o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erent o!r" con un tiempo de reacción de 10 min& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erenteses

$rupos& $rupos&

C

0 0 00,,000000 00,,000000 5 500 00,,004499 00,,003333 1 10000 00,,00%%00 00,,007711 1 15500 00,,111155 00,,110044 2 20000 00,,114477 00,,113366 2 25500 00,,11%%33 00,,117700 Tabla !.

Tabla !. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión sin Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión sin o!r"& 'ada A

o!r"& 'ada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $ruposbsorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos

C

0 0 00,,000000 00,,000000 5 500 ))00,,000077 00,,005566 1 10000 00,,0055%% ))00,,00116 6 1 15500 00,,112211 00,,000022 2 20000 00,,1199%% 00,,0022%% 2 25500 00,,220022 00,,119966 Tabla ".

Tabla ". Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con o!r"

(3)

Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2 0 0,000 0,000 50 )0,004 0,050 100 0,074 )0,010 150 0,12% )0,002 200 0,217 0,047 250 0,23% 0,236

Tabla #. Resultados de la curva de calibración de Albúmina para la se$unda sesión con o!r" un tiempo de reacción de 30 min& as absorbencias #ueron tomadas por di#erentes $rupos

Concentración Absorbancia 1 Absorbancia 2

0 0,000 0,000 50 0,044 0,029 100 0,020 0,0%2 150 0,127 0,117 200 0,163 0,155 250 0,19% 0,200

Tabla $. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión sin o!r", cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&

0 0,000 0,000 50 0,013 )0,03 100 0,0%9 0,025 150 0,091 0,043 200 0,14% 0,131 250 0,1%2 0,15%

Tabla %. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&

0 0,000 0,000 50 0,050 0,01% 100 0,075 0,077 150 0,110 0,10% 200 0,1%5 0,11% 250 0,244 0,160

Tabla 1&. Resultados de la curva de calibración de 'ase(na para la se$unda sesión con o!r" " un tiempo de reacción de 30 min, cada Absorbancia #ue tomada por di#erentes $rupos&

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'uestra Absorbanci a sin (o)ry

Absorbancia con

(o)ry 1& min

Absorbancia con (o)ry 3&

min

Albumina de *uevo ))) 0,904 )))

+esconocida ))) 1,6%3 )))

Tabla 11. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la primera sesión&

Absorbancia con (o)ry 1& min

min

'ase(na 1 ))) 0,01% )))

'ase(na 2 ))) 0,0%% )))

Tabla 12. Resultados para la muestra de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la primera sesión&

Absorbancia con

(o)ry 1& min

min uestra problema 1 -sólida. 0,067 0,016 )0,001 uestra problema 2 -li/uida. 0,142 0,115 0,112 Albúmina de uevo 0,133 0,106 0,105

Tabla 13. Resultados para las muestras de Albúmina, cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la se$unda sesión

Tabla 1. Resultados para las muestras de 'ase(na cada muestra #ue tratada por di#erentes $rupos, para la se$unda sesión

Absorbancia con

(o)ry 1& min

min

'ase(na con $rasa 0,129 )0,014 )0,031 'ase(na sin $rasa 0,135 )0,052 0,013

(5)

3. An*lisis y resultados.

La determinación de la concentración de proteínas es com!n en los laboratorios. E#isten diversos m"todos para dic$a operación% entre ellos podemos encontrar el m"todo de Biuret% el m"todo de &zul de 'oomasie% el m"todo de Lory% cada uno tiene una determinada sensibilidad% pero este !ltimo (Lory) combina el reactivo de Biuret y el reactivo de olin% lo *ue proporciona una me+or sensibilidad al m"todo.

En eneral el m"todo se desarrolla en unos determinados pasos estandarizados% se inicia con la ,abricación de una curva de calibración% para ello es necesario la utilización de un patrón% en nuestro caso se utilizaron - patrones% primero la &lbumina y la seundo la caseína% posteriormente se realiza una lectura en el espectro,otómetro el cual arro+ara un valor determinado de absorbancia de cada patrón% ,inalmente con el previo tratamiento de la muestras problemas se realiza la lectura de absorbencias% las cuales con la ayuda de la ecuación de las curvas de calibración se determina su concentración.

Las reacciones *uímicas ocurridas en la e#perimentación se presentan y se describen a continuación. El m"todo de Lory inicia con la adición del reactivo de Biuret a las muestras a traba+ar% el reactivo de Biuret est compuesto por una disolución bsica de sul,ato de cobre ('u/01) lo cual permite la ,ormación de un comple+o oranometlico

donde el centro metlico ser el 'u-2_{% los pares electrónicos presentes en los tomos de}

3itróeno se coordinan al centro metlico% adems debido a la eometría plana del enlace peptídico y la tetra$"drica del carbono 4% los cuatro enlaces coordinados entre los nitróenos y catión cobre (55) solo es posible si en la cadena de 46aminocidos e#isten dos% tres o ms enlaces peptídicos se!n se trate de una estructura $"lice o pleada de la proteína. La coordinación de los cationes cobre (55) se repite sistemticamente a lo laro de

todo la estructura de cadena proteica. El medio bsico en el cual est presente el /ul,ato de 'obre% permite la ,ormación de $idró#ido de cobre ('u(07)-) el cual se disocia como 'u-2

y -076_{% por lo tanto $ay iones c!pricos presentes en solución acuosa para poder reaccionar%}

adems de ello evita la reducción a 'obre (5).

(6)

8ara aumentar la sensibilidad de la reacción de Biuret% el comple+o proteína6'u-2_{se $ace}

reacciona con el reactivo de ilon6 'iocalteus% dando una coloración azul% con un m#imo de absorción de 9; nm <=>_{. Esta coloración se atribuye a la reducción del ?cido}

,os,omolibdico  ,os,otunstico a azul de $eteropolimolibdeno de composición no de,inida por medio de los residuos tirosilos% tripto,anilos% ye una menor rado% cisteínilos e $istidilos

de la proteína *ue ,orman comple+o con 'u-2 <->_{. Anas determinadas características del}

m"todo de Lory son la intensidad de la coloración% *ue varía con la composición de aminocidos de de la proteína% es ms sensible *ue el m"todo de Biuret. El rano es de ;%=6 = mmL. <->_{la reacción de Lory se puede represar mediante el siuiente es*uema (,iura}

-).

+i,ura 2. s/uema para la reacción de o!r"&

La e#perimentación para esta prctica se realizó en dos sesiones en la primera sesión no se obtuvieron los resultados esperado% debido a una serie de errores e#perimentales cometidos por cada rupo de traba+o% uno de ellos ,ue el no desenrasado de las muestras de caseína%

la cual se e#tra+o en ,unción del punto isoel"ctrico% otro error *ue se cometió ,ue el tiempo de reacción para Lory% cada rupo no se sincronizo para poder obtener un buen resultado% los valores obtenidos en esta sesión se reportaron en las tablas =% -% % 1% == y =-.

/e tomó un rano de concentraciones para las curvas de calibración de ; a ; ppm% *ue es un rano muy pe*ueCo para las muestras% en las ,iuras  se representan las curvas de calibración realizadas para la alb!mina (tabla =) en donde la absorbancia - corresponde la tomada por mi rupo. /e realizó una comparación entre etas tres r,icas y se obtiene *ue la me+or ra,ica para representativa es la *ue nosotros realizamos debido a *ue el coe,iciente de 8irson (R -_{) posee una mayor linealidad *ue las dems (ver tabla =).}

Absorbancia 1 Absorbancia 2 Absorbancia 3

Coe-iciente de

earson / R2₀ _0,957 _0,997 _0,934

cuación de la

recta "0,000711   0,002714 " 0,000602 0,000333 " 0,000557 0,00357

(7)

0 10 20 30 40 50 0 0 0!01 0!01 0!02 0!02 0!03 0!03 0!04 0!04 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+ Concentracion / ppm Absorbancia

+i,ura 3. 'omparación entre las curvas de calibración para la tabla 1&

& las mismos patrones se les adiciono el reactivo de Lory *ue se tomó un tiempo de reacción apro#imadamente durante =; minutos% los resultado de esta parte de la e#perimentación se consinan en la tabla -. /e procedió a ra,icar los datos obtenidos para cada rupo% la r,ica 1 re,le+a los datos presentes en la tabla . La absorbancia -corresponde a la tomada por nuestro rupo.

0 10 20 30 40 50 0 0 0!01 0!02 0!03 0!04 0!05 0!0 0!0-0!0. 0!0/ 0!1 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+ Concentracion / ppm Absorbancia

(8)

/i comparamos estas tres curvas de calibración la me+or se para ,iura 1 (ver tabla =9) se puede observar *ue la curva de absorbancia = posee me+or linealidad *ue las dems por lo

tanto es la me+or

Coe-iciente de

earson / R2₀ _0,964 _0,7%3 _0,1%2

cuación de la

recta "  0,000509  0,001619 "  0,000%69 ) 0,00104% "  0,000769  0,007619

Tabla 1". 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 4&

La muestra para la curva de calibración de 'aseína se realizó por di,erentes rupos en donde como patrón primario se utilizó caseína con un buen porcenta+e de pureza% en la tabla  se representan las absorbancias de cada concentración obtenida% se representaron las r,icas correspondiente en la ,iura % en la tabla = se especi,ica las características de la ,iura . 0 10 20 30 40 50 0 0 0 0 0!01 0!01 0!01 0!01 0!01 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ Concentracion / ppm Absorbancia

+i,ura !.'omparación de las curvas de calibración para la tabla 3&

Absorbancia 1 Absorbancia 2

Coe-iciente de earson / R2₀

0,9%4 0,975

(9)

recta

Tabla 1#. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 5&

/e!n la ,iura  y la tabla = la me+or linealidad la representa la absorbancia =. & los patrones se les adiciono Lory y se de+ó reaccionar durante =; min y se obtuvieron los

datos *ue estn consinados en la tabla 1% se compararon estos datos con una r,ica *ue se representa en la ,iura 9 y las características de las r,icas se representan en la tabla =.

0 10 20 30 40 50 0 0!04 0!03 0!02 0!01 0 0!01 0!02 0!03 0!04 0!05 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A"#$"%&'(% 3 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 3+ Concentracion / ppm Absorbancia

+i,ura ".'omparación de las curvas de calibración para la tabla 4&

Coe-iciente de earson / R2 0 0,0445 0,631 0,011 cuación de la recta "  0,0001%6 ) 0,01%476 "  0,000674 ) 0,006524 "  )0,000066 ) 0,016%57

Tabla 1$. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 6&

La ra,ica *ue posee mayor linealidad es la de absorbancia -.

En la seunda sesión se lleó a un acuerdo por cada rupo en donde se acordó una me+or sincronización% un desenrasado de muestra de caseína% y la corrección para la concentraciones de la curva de calibración% los resultados obtenidos en esta sesión se consinaron en las tablas %9% % % F y =;. &$ora se proceder de la misma manera para ra,icar y comparar los resultados de di,erentes rupos% y posteriormente a este se comparar los datos de la primera sesión con los de la seunda sesión.

(10)

La ra,ica  muestra la comparación de los resultados de la tabla *ue corresponde a la curva de calibración de la &lb!mina% en la tabla =F se representa las características de la ,iura . 'abe resaltar *ue la absorbancia ,ue tomada por nuestro rupo

0 50 100 150 200 250 300 0 0!02 0!04 0!0 0!0. 0!1 0!12 0!14 0!1 0!1. 0!2 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ Concentracio / ppm Absorbancia

+i,ura #. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 5& Albumina sin o!r" se$unda sesión& Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,995 0,999 cuación de la recta "  0,000711  0,006%10 "  0,0006%1  0,000524

Tabla 1%. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 7&

/e concluye *ue la r,ica &bsorbancia - posee mayor linealidad. /e adicionaron a los patrones el reactivo de Lory y se tomó un tiempo de reacción de =; minutos% estos datos estn consinados en la tabla 9% la ,iura  y la tabla -; representan las características de las r,icas. Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,935 0,3%7 cuación de la recta "  0,000965 ) 0,02523% "  0,000522 ) 0,020952

(11)

Tabla 2&. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura %& 0 50 100150200250300 0!05 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ Concentracion / ppm Absorbancia

+i,ura $. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 6& Albúmina con o!r" con 10 min de reacción, se$unda sesión&

La ra,ica absorbancia = posee la me+or linealidad. /e tomó un tiempo de reacción de ; minutos los resultados estn consinados en la tabla % se compararon las dos absorbancias tomadas y estas se presentan en la ,iura F y en la tabla -=.

0 100 200 300 0!05 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 0!3 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ '#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

(12)

+i,ura %.'omparación de las curvas de calibración para la tabla 7& Albúmina con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&

Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,9525 0,45%2 cuación de la recta "  0,0011 ) 0,0274 "  0,0007 ) 0,0307

Tabla 21. 'oe#icientes " ecuaciones de las rectas representadas en la #i$ura 9&

8ara la curva de calibración de la caseína se tomaron las mismas concentraciones y se prepararon los patrones% primero se midieron las absorbancias sin Lory estos datos se consinaron en la tabla % se representaron los datos en la ,iura =; y las características de estas se representaron en la tabla --.

0 50 100 150 200 250 300 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ C#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

+i,ura 1&. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla %& 'ase(na sin o!r", se$unda sesión& Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,903 0,996 cuación de la recta "  0,000% ) 0,0119 "  0,000% ) 0,003%

(13)

De la misma manera se representaron los valores de la tabla F *ue corresponden a un tiempo de reacción de =; minutos.

0 50 100 150 200 250 300 0!05 0 0!05 0!1 0!15 0!2 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ A( T(6) A( T(6)

+i,ura 11. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 9, 'ase(na con un tiempo de reacción de 10 min, se$unda sesión&

Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,960 0,%603 cuación de la recta "  0,000% ) 0,0069 "  0,0007 ) 0,0377

8ara un tiempo de reacción de los patrones con caseína de ; minutos los datos obtenidos se representan en la tabla =;% se ra,icaron los datos (,iura =-) y las características se representaron en la tabla -1. Absorbancia 1 Absorbancia 2 Coe-iciente de earson / R2₀ 0,972 0,96% cuación de la recta "  0,0009 ) 0,0079 "  0,0006 ) 0,0006

(14)

0 50 100150200250300 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 0!3 A"#$"%&'(% 1 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 1+ A"#$"%&'(% 2 L(&)%$ *A"#$"%&'(% 2+ C#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

+i,ura 12. 'omparación de las curvas de calibración para la tabla 10& 'ase(na con o!r" con un tiempo de reacción de 30 min, se$unda sesión&

En comparación de las dos sesiones de traba+o en la seunda sesión se obtuvo un resultado me+or% debido a *ue se tuvo un mayor cuidado de traba+o% se tomaron las me+ores ra,icas de cada sesión teniendo en cuanta el coe,iciente de 8earson *ue se encuentran en las respectivas tablas para cada r,icas y se compararon en las ,iuras =%=1 y = y=9% no se puedo comparar los tiempos de reacción de ; min debido a *ue solo se realizó una vez% en la seunda sesión% pero si se observan sus respectivos coe,icientes de 8earson $ay unas absorbancias *ue poseen mayor linealidad.

0 50 100 150 200 250 300 0 0!02 0!04 0!0 0!0. 0!1 0!12 0!14 0!1 0!1. R7 8 1 R7 8 1 P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

C#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

(15)

+i,ura 13. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la Albúmina sin o!r"&

0 50 100 150 200 250 300 0!05 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 R7 8 0!/ R7 8 0!/4 S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+ P$()$% ) (#&

L(&)%$ *P$()$% ) (#&+

C#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

+i,ura 1. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la Albúmina con o!r" " 10 min de reacción&

0 50 100 150 200 250 300 0 0!05 0!1 0!15 0!2 0!25 R7 8 1 R7 8 0!/. P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% ) (#&+ S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

A( T(6) A( T(6)

+i,ura 1!. 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la 'ase(na sin o!r"

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0 50 100 150 200 250 300 0 0!02 0!04 0!0 0!0. 0!1 0!12 0!14 0!1 0!1. 0!2 R7 8 0!/ R7 8 0!3 P$()$% ) (#& L(&)%$ *P$()$% )(#&+ S)9&;% )(#&

L(&)%$ *S)9&;% )(#&+

C#&')&$%'(#&   A"#$"%&'(%

+i,ura 1". 'omparación de las curvas de calibración de la primera " la se$unda sesión para la 'ase(na con o!r" " un tiempo de reacción de 10 min&

La comparación de los traba+os realizados en la primera y la seunda sesión permiten observa la ran di,erencia e#istente% anteriormente se $an nombrado aluno problemas *ue ,ueron correidos para poder obtener un me+or resultado el cual es muy evidente% adems se puede observar *ue una curva de calibración sirve siempre y cuando en el lote de traba+o los paramentos utilizados sean constantes% en otras palabras *ue no cambien nin!n reactivo% o al!n paso de la e#perimentación% o la calibración del espectro,otómetro y $asta los e#perimentadores.

/e de,ine sensibilidad como la pendiente de la curva de calibración de inter"s% esta de,inición aceptada por la 5A8&' <=>_{% aun*ue esta tambi"n est dada por los límites de}

detección y los límites de cuanti,icación% en la tabla - se comparan las pendientes de las rectas de las r,icas de la seunda sesión de traba+o.

/i se observa las pendientes *ue corresponden a la adición de Lory poseen un mayor rado de sensibilidad% *ue es el resultado esperado.

'uestra in (o)ry 1& min con (o)ry 3& min con (o)ry

Albúmina 0,0006%1 0,000965 0,0011

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Tabla 2!. 'omparación de la sensibilidad de las curvas de calibración realiadas en la se$unda sesión, se tomaron las pendientes de las meores curvas de calibración se$ún el

par8metro de coe#iciente de earson

Las muestras estudiadas se reportan en las tablas = y =1% el tratamiento preliminar de las muestras se realizaron de la siuiente manera. Las muestras correspondientes a la tabla = ,ueron sólida y li*uida% la muestra sólida correspóndete a lec$e en polvo se llevó a una concentración de ;; ppm% en donde se diluyeron ;%-  en -; mL de aua% despu"s se tomó - mL y se a,oro a - con aua% con la muestra li*uida (muestra problema -) se realizaron diluciones se tomaron - mL y se a,oraron a - mL de aua% la muestra de albumina de $uevo se preparó tomando el volumen total de la clara del $uevo la *ue se diluyo en -; mL de aua% posteriormente se centri,uo para poder eliminar suspensiones espumosas *ue podrían actuar como inter,erencia en la medida% Las muestras reportadas en la tabla =1 se prepararon de la siuiente manera% La muestra correspondiente a la caseína con rasa se preparó a partir de ;; mL de lec$e% en donde se llevó a un p7 entre 16 unidades con cido cítrico (limón) para realizar la separación en ,unción del p5 (presencia del Giterion)% la mezcla se de+ó reposar durante = día% posteriormente se centri,uo  veces y se eliminó el lí*uido sobrenadante separando la muestra sólida el cual se lavó con aua y para así arantizar la eliminación de partículas de cido cítrico% se secó la caseína en la estu,a a una temperatura de 6; H'% de a*uí despu"s del secado se tomaron ;%=  de caseína y se a,oro a -; mL con aua (1;; ppm)% parte de la muestra de caseína se e#tra+o y se realizó un proceso de desenrasado% se adiciono etanol lo *ue arantizaba esto% y así evitar un reporte erróneo de la medida de la absorbancia% se tomaron ;%;=  y se a,oraron con aua a =;; mL (=;; ppm).

'on la ayuda de las ecuaciones de las me+ores curvas de calibración para la alb!mina y la caseína se proceder a calcular la concentración de las muestras problemas (tabla = y =1). 8ara la alb!mina las me+ores rectas se pueden observar en las tablas =F% -; y -=% cuyas ra,icas corresponden a las ,iuras % y F respectivamente.

8ara la muestra problema = (tabla =) cuya absorbancia sin el reactivo de Lory es ;%;9 y ecuación de curva de calibración es y=0,000681 x+0,000524 _{se calcula la}

concentración de la siuiente manera:

8rimero la variable independiente  representa la concentración (ppm) y la Iariable dependiente y representa la &bsorbancia% por ende si despe+amos  de la ecuación de la recta podemos encontrar el valor de la concentración de la muestra *ue $a absorbido un una determinada lonitud de onda.

x= y

m−b (1)

En donde m es la pendiente de la recta y b es el intercepto. &$ora reemplazamos cada valor en (=) y se obtiene

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x=

0,067

0,000681−0,000524=98,38 ppm

/e procede de la misma manera para cada valor correspondiente de la tabla = y =1 con su respectiva ecuación de recta y se enera la tabla -9.

'uestra Concentración /ppm0

0 min 10min 30 min uestra problema 1 -sólida. 9%,3% 16,61 )0,%%2 uestra problema 2 -li/uida. 20%,52 119,20 101,%5 Albúmina de uevo 195,30 150,94 95,4% 'ase(na $rasosa 161,26 )17,50 )34,44 'ase(na sin $rasa 166,26 )64,50 14,45

Tabla 2". Resultado de las concentraciones en ppm para cada muestra problema tratada

Los resultados obtenidos no ,ueron los esperados% las inconsistencias corresponden a determinados errores% si se observa en las tablas = y =1 $ay absorbancias con valores neativos% en la literatura se encontró *ue este tipo de errores se deben a cuatro tipos de posibles causas <>_{% la primera es la no presencia de muestra en la celda% una seunda causa}

es la mala inserción de la celda en el e*uipo% una tercera causa puede ser una selección errónea de la lonitud de onda% una cuarta causa es la calibración errónea del espectro,otómetro% cada una de estas causa tiene una posible solución por e+emplo para la tercera causa se debe a+ustar la lonitud de onda al rano compatible con el anlisis% en nuestro caso se realizó la medición a sus respectivas lonitudes de ondas para enerar la m#ima absorción de la muestra% para la reacción sin Lory ,ue -; y para las reacciones con Lory ,ue 9;% *ue coinciden con los valores teóricos reportados<1>_{% alunas muestras}

presentaron una absorción muc$o menor a las del rano permitido% $aciendo *ue estas absorbancias este por deba+o del límite de detección (intercepto de la recta en el e+e de las ordenadas) J /e podría pensar en una interpolación de la recta para permitir *ue la absorbancia caia dentro de la curva de calibración% pero analíticamente no se puede realizar ya *ue la curva de calibración es una parte de una curva% adems los límites de detección y cuanti,icación dela curva de calibración obtenida se!n los parmetros obtenidos se vería a,ectados y la desviación estndar de estos aumentaría por ende el error tambi"n aumentaría% otro posible error es el error 7umano% ya *ue las muestras problemas ,ueron tratadas por di,erentes personas% y es sabido *ue cada persona tiene un determinado error de traba+o. La concentración de la muestra total es posible calcular a partir de las concentraciones obtenidas por la absorbancia% si se $ace una relación entre la concentración

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obtenida a unos determinados ramos o mL traba+os con el peso o volumen total de la muestra.

&$ora en,aticemos un poco sobre la e#tracción de la caseína% es sabido *ue la lec$e posee diversas proteínas de las cuales la caseína es la ms abundante representando ms de ;K de contenido total de proteínas. Las caseínas de la lec$e tienen pesos moleculares *ue oscilan entre -.;;; y 1;.;;;J las ms importantes son la 4% la  y la M% *ue representan% respectivamente% el ;% ; y =K del total de las caseínas. En la lec$e% estas proteínas se asocian entre sí para ,ormar micelas% *ue se encuentran estabilizadas y solubilizadas racias a la presencia de la caseína M% y del calcio <>_{(ver ,iura =).}

+i,ura 1#. icelas de case(na en la lec*e&

La propiedad característica de la caseína es su ba+a solubilidad a p7 1%9. El p7 de la lec$e es 9%9 apro#imadamente% estando a ese p7 la caseína carada neativamente y solubilizada como sal clcica. /i se aCade cido a la lec$e% la cara neativa de la super,icie de la micela se neutraliza (los rupos ,os,ato se protonan) y la proteína neutra precipita

+i,ura 1$& Reacción para la etracción dela case(na&

'omo recomendaciones para un me+or resultado en el traba+o se pueden enumerar:

1. 8ara enerar un me+or resultado la e#tracción de la caseína se debe realizar con un

cido d"bil y diluido para así arantizar un me+or control en el radiente de p7 -) /i la absorbancia es mayor al límite superior del rano de medida% siempre se puede

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es in,erior al límite de cuanti,icación del m"todo seleccionado% $ay *ue emplear un m"todo ms sensible.

) 8ara la determinación de la absorbancia despu"s de la adición del reactivo de Lory% se debería planear un m"todo para poder arantizar una sincronía en con el tiempo de reacciones estimado

1) El desenrasado de la muestra de caseína es importante para evitar inter,erencias% es por ello *ue el lavado adecuado con etanol ayuda a reducir este inconveniente

) 8ara el tratamiento de la muestra de albumina es necesario $acer un determinado n!mero de centri,uaciones para eliminar las inter,erencias posibles% estas con la ayuda de la ,uerza centrí,ua pueden llevarse a la separación de la disolución.

9) /e deben tener en cuenta los parmetros *ue puedan enerar un valor neativo en la medida de absorbancia y solucionarlos de manera e,iciente y precisa.

4. Conclusiones

• La comparación del traba+o de varios rupos pudo rea,irmar *ue cada persona tiene

un determinado estilo de traba+o lo *ue es un parmetro importante al momento de realizar un anlisis cuantitativo% adems es importante tener en cuenta *ue para un determinado lote de muestras le corresponde una determinada curva de calibración% una determinada calidad de reactivo% adems una determinada especie de reactivos.

• Las pendientes de cada una de las rectas son las sensibilidades de cada uno de los

m"todos% y sus valores tambi"n son los correspondientes coe,icientes de absorción de los comple+os proteína6reactivo.

• El m"todo de Lory posee una me+or sensibilidad *ue el m"todo de Biuret% esto se

pudo comprobar con la sensibilidad ( pendiente de la recta se!n la 5A8&') de cada curva de calibración realizada% adems el coe,iciente de 8erson es un parmetro lineal *ue arantiza la calidad y la eneración de resultados proporcionales a la concentración del analito en las muestras dentro de un determinado rano

• La eliminación de cual*uier tipo de inter,erencias de las muestras de traba+o

arantizara un me+or reporte en el anlisis% adems si la absorbancia de la muestra est dentro del rano de medida del m"todo seleccionado% mediante la ecuación de la recta de calibrado se puede calcular la concentración de proteína de la disolución problema.

!. 4iblio,ra-ía

:1; <=oo$ A, oller >, 'rouc* R& rincipios de an8lisis instrumental, 6 ta_{d, editorial?}

'en$a$e earnin$ eico +&@ 200%, p8$& 20&

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:3; *ttp?!!!&bvsde&pa*o&or$bvsacdcd29laboratoriocap11&pd# -consultado 11052013. :4;*ttp?depa&#/uim&unam&mam"darc*iveroABCA+DEFCDD'AGRDBHAI12313&pd# -'onsultado 11052013.

:5;*ttp?!!!&u*u&es4%0004034documentosJ20deJ20tetopracticasprotocoloIpracticasIalimentosI0%I09&pd# -'onsultado 11052013.