OBJETIVOS DE LA SESIÓN 8
Analiza los medios de cultivo y sus caracteristicas
Por tanto…
• Al finalizar la sesión, estará en capacidad de apropiarse de
conocimientos básicos de la microbiología y de las estructuras de los microorganismos .
Medios de cultivo .
• Un medio de cultivo constituye el conjunto de nutrientes indispensables para el crecimiento de un microorganismo.
• La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente entre microorganismos.
• Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
• Indispensables: Agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
• Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar- agar), tampones, indicador de pH, etc.
• Existen además los medios sintéticos que pueden prepararse a partir de sus componentes individuales, o se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir agua.
Constituyentes, características y clasificación
• Criterios que debe satisfacer el medio de cultivo.
• Debe contener los nutrientes adecuados para el microorganismo específico que se desea desarrollar.
• Debe contener humedad suficiente.
• pH ajustado de manera apropiada.
• Concentración conveniente de oxígeno, (depende de los requerimiento del microorganismo).
• El medio que se va a sembrar debe ser estéril. El medio de cultivo sembrado debe incubarse a la temperatura correcta.
Tipos de Medios de Cultivo
• Los medios de cultivo utilizados para el cultivo de microorganismos se pueden clasificar en:
• De acuerdo a su composición:
• Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo.
• Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate.
• Medios selectivos: son utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población polimicrobiana específica.
• Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de un determinado grupo microbiano, se denomina inhibición de crecimiento. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos.
• Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre otros.
• Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad especifica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios deben poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.
• Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
De acuerdo a su consistencia:
• Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.
• Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los agentes gelificantes más utilizados son la gelatina y el agar.
• Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que la utilizada para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es en el estudio de la motilidad de las bacterias
• Disolver los componentes del medio en agua destilada.
• En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos.
• Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.
Preparación de los medios de cultivo
• Una vez disuelto el medio se debe esterilizar en autoclave a (1210C) durante 15-20 minutos para evitar el crecimiento de contaminantes.
• Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.
• Medios líquidos. Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.
• Cultivar un microorganismo es la operación que consiste en depositarlos asépticamente en un medio de cultivo.
• Empezaremos definiendo el concepto de cultivo mixto y cultivo axénico. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo.
• Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
• Un cultivo mixto, consiste en una mezcla de distintas especies microbianas que se encuentran creciendo de forma conjunta.
Métodos de siembra y aislamiento
• Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza y se pueden obtener artificialmente en el laboratorio por medio de técnicas que describiremos a continuación.
Recomendaciones Generales para el cultivo de microorganismos
• Realizar la siembra en medios de cultivos previamente esterilizados y adecuados para el microorganismo que se desea aislar
• Emplear instrumentos estériles
• No contaminar ni destruir los microorganismos
• Depositar los microorganismos asépticamente en los medios de cultivo
• Esterilizar los instrumentos empleados, inmediatamente después de cada operación
Los instrumentos empleados corrientemente en la siembra son:
• Asa de Siembra: se utiliza un alambre de platino, o alambre de una aleación niquel-cromo (nicrom). Este alambre tiene un diámetro de 0,3 a1 mm y esta sujeto a un mango o porta asa metálico o de vidrio.
• El alambre puede ser totalmente recto (asa en punta o aguja), recto con un anillo de aproximadamente 3 mm de diámetro en la extremidad (asa) o aplastado en el extremo (espátula). Puesto a la llama del mechero alcanza rápidamente el rojo vivo ( 1.300°C ) y también rápidamente se enfría.
La técnica general de para el cultivo de microorganismos dependerá de:
• Estado físico del material a sembrar (sólido o líquido)
• Estado físico del medio de cultivo (agar o caldo)
• Ambiente en el cual crece el microorganismo (aerobiosis, microaerofilia o anaerobiosis)
Procedimiento para el cultivo de microorganismos
• Cuando se trabaja con microorganismos es importante el uso de barreras de protección como mandil, guantes y mascarilla con el fin salvaguardar nuestra salud de microorganismos potencialmente patógenos .
• Así mismo, se deben mantener un conjunto de condiciones de asepsia como limpiar la zona de trabajo y usar material estéril para evitar la contaminación de las muestras y/o cultivos.
• Dependiendo de la naturaleza de la muestra de la que se requiere aislar los microorganismos algunas veces será necesario aplicar algunas técnicas para disminuir la carga de microorganismos. Por ejemplo, las muestras de suelo pueden contener un número extremadamente alto de células bacterianas por gramo.
• Para efectuar el estudio fisiológico de un microorganismo o para su correcta identificación es necesario separarlo de la población mixta en la que se encuentra.
• Para tal fin se emplean técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de cultivos axénicos o puros.
• De manera general los métodos de aislamiento incluyen: 1.
Separación física de los microorganismos mediante: a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, que consiste en la dilución de una muestra ambiental (suelo o agua) en agua estéril o solución salina para disminuir la carga de microorganismos.
Fuente: http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/pharm/prov_pharm/ptn/Microbiology%20with%20 basis%20immunology/2/Lesson%203.%20The%20main%20methods,%20principles%20and%20steps%20of%20isolation%20of%
20bacteria%E2%80%99s%20pure%20cultures.files/image004.jpg
• Siembra por agotamiento que consiste en realizar estrías con ayuda de un asa bacteriológica en la superficie de una caja petri con medio de cultivo general o específico dependiendo de los objetivos del investigador.
• Procedimiento para aislamiento de bacterias por estriación:
• El inoculo se extiende sobre una pequeña superficie del agar
• Se flamea el asa y se espera un tiempo prudencial hasta que esta se enfríe
• Se toma el inóculo (puede ser un cultivo previo en un tubo de ensayo o cualquier muestra ambiental)
• Se trazan 3 líneas oblicuas a partir del deposito original ( sin pasar el asa 2 veces por el mismo sitio ).
• Flamear el asa, girar la placa levemente en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 líneas de la misma forma anterior. Volver a flamear el asa, girar la caja en sentido de las manecillas del reloj y volver a trazar 3 líneas de la misma forma.
Repetir este proceso como se indica en la siguiente figura hasta llenar la caja con 4 conjuntos de líneas.
• Flamear el asa y trazar una estriación en forma de zig-zag sobre la superficie del agar que ha quedado libre
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/pharm/prov_pharm/ptn/Microbiology%20with%20basis%2 0immunology/2/Lesson%203.%20The%20main%20methods,%20principles%20and%20steps%20of%20isolation%20of%20bacteri a%E2%80%99s%20pure%20cultures.files/image019.jpg
Multiplicación de microorganismos
• Si el objetivo es estudiar algunas propiedades fisiológicas de los microorganismos aislados, por ejemplo, producción de ciertas enzimas, o metabolitos secundarios es necesario aumentar su biomasa es decir multiplicarlos para poder desarrollar distintos ensayos.
• Una vez que se ha logrado la obtención de cultivos puros, se puede multiplicar los microorganismos usando medios de cultivo y condiciones de incubación apropiadas.
• Para el caso de los hongos se puede utilizar cajas Petri con medios enriquecidos o con distintos sustratos sólidos y en el caso de las bacterias se realiza generalmente en medios de cultivo líquidos.
• Generalmente se podrá verificar el crecimiento microbiano luego de 48 horas en medios sólidos por el crecimiento de las colonias de hongos o bacterias y en medios líquidos cuando se observa un cambio en la turbidez del medio de cultivo.
Actividad en clase:
• Realice la actividad asignada.
• El plazo máximo de entrega de tareas es hasta viernes antes del examen
• Se considerara originalidad, redacción, desarrollo de ideas.
Bibliografía Básica
Título Autor Editorial
Biología Audesirk BIOTECNOLOGIA
AMBIENTAL
CASTILLO RODRIGUEZ, FRANCISCO
TEBAR 2014
Bibliografía
Complementaria
Texto Autor Editorial
Hongos Y Plantas Micorrizas Arbusculares
Guadarrama Chavez digital
Microorganismos".
Consultado: 05 de mayo de 2020.
Julia Máxima Uriarte.
Caracteristicas.co. Última edición:
9 de marzo de 2020. Disponible en:https://www.caracteristicas.co /microorganismos/.
Las Micorrizas En La Evolucion De Las Plantas
Villegas Rios digital
