Electroforesis en gel de DNA

(1)

Electroforesis en gel de DNA

Método analítico de visualización del DNA basado en la migración del DNA a través de basado en la migración del DNA a través de un gel

Gel Polímero de agarosa

P lím d il mid p li il mid Polímero de acrilamida o poliacrilamida

V = q E / f

V= velocidad de migración

S Lobos C

S Lobos C -- U de ChileU de Chile

V= velocidad de migración

E= gradiente de potencial eléctrico (Volts/cm)

q= carga eléctrica efectiva de la partícula

f= coeficiente de fricción (tamaño y forma)

(2)

2 Gel electrophoresis of DNA

S Lobos C

(3)

Electroforesis en gel de DNA

Gel de poliacrilamida

Tinción con nitrato de plata

Marcaje radiactivo Marcaje radiactivo

Marcaje fluorescente Electroforesis vertical

S Lobos C

(4)

4 Aspectos que afectan la migración del ADN

Tamaño del DNA

Tamaño del poro (concentración del gel) Voltaje aplicado

Voltaje aplicado

Conformación del DNA

S Lobos C

V = q E / f

(5)

Aspectos que afectan la migración del ADN

S Lobos C

(6)

6

S Lobos C

(7)

Amplificación de DNA

In vivo Clonamiento

In vitro PCR

S Lobos C

(8)

8

Clonamiento

Amplificación IN VIVO de secuencias Amplificación IN VIVO de secuencias determinadas de DNA basada en el uso de:

-Vectores Vectores -Ligasa

-Células vivas -etc

S Lobos C

(9)

• Plasmidio - Molécula de DNA circular

extracromosómico que se replica de modo autónomo Tipos de vectores de clonamiento

extracromosómico que se replica de modo autónomo dentro de una célula bacteriana

Límite de clonación: 100 a 10,000 pb ó 0.1-10 kb.

• Fago - Derivado del bacteriófago lambda; moléculas Fago Derivado del bacteriófago lambda; moléculas de DNA lineal, su DNA puede ser reemplazado por DNA extraño sin alterar el ciclo celular . Límite de clonación: 8-20 kb.

• Cosmidio - Molécula de DNA circular

extracromosómica que combina aspectos de

plasmidios y fagos; Límite de clonación: 35-50 kb.

S Lobos C

(10)

10 • Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) - Tipos de vectores de clonamiento Basados en plasmidios mini -F bacterianos.

Límite de clonación: 75-300 kb.

• Yeast Artificial Chromosomes (YAC) -

Cromosoma artificial que contiene telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador para su identificación en células

l í l ó k

S Lobos C

de levadura. Límite de clonación: 100-1000 kb.

(11)

Introducción de un fragmento de DNA en un plasmidio

(12)

12

S Lobos C

(13)

S Lobos C

(14)

14 Los vectores plasmidiales: Un poco de historia

Amp

^r

Amp

^r

Amp

^r

Tet

^r

Aumento Nº copias

S Lobos C

(15)

Amp

^r

, Tet

^r

, Cm

^r

S Lobos C

(16)

16 Selección de recombinantes

Inactivación por inserción versus α-complementación

S Lobos C

(17)

S Lobos C

(18)

18

S Lobos C

(19)

Clonamiento por inserción direccional

S Lobos C

(20)

20 Transcripción “in vitro”

Salmonella typhimurium SP6 phage

S Lobos C

(21)

OP

S Lobos C

(22)

22 Carece del gen rop y

tiene una mutación t ^s en el RNA II. A 37ºC puede Serie de vectores plasmidiales pUC. Selección de recombinantes por α-

complementación

el RNA II. A 37 C puede llegar a 70 copias por célula y a 42ºC más de 200 copias por célula.

Posee los primeros 58 aa de la β-galactosidasa (péptido alfa o α).

Dentro del péptido α posee un sitio de múltiple clonamiento (MCS) en perfecto marco de lectura

l é tid con el péptido α.

S Lobos C

(23)

Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC18

Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC19 Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC19

S Lobos C

(24)

24 α - complementación es una complementación Intra-alélica E. coli JM109 (F’traD36 proA+B+ lacI ^q ▲(lacZM15/▲(lac-proAB)glnV44 e14 gyrA96 recA1 endA1 thi hsdR17

Cromosoma

AL + Xgal Amp ^s

β-gal ^-

Colonias blancas C t i l β l

F’ p

Cromosoma

Transformación con pUC o derivado C-terminal β-gal

Cromosoma

F’

AL + Xgal Amp ^r

β-gal ⁺ /Colonias azules α-complementación (+)

S Lobos C

(25)

Principal ventaja: Screening Principal ventaja: Screening

Azul/Blanco Azul/Blanco

z

z Cuando se inserta un Cuando se inserta un fragmento de DNA en fragmento de DNA en el polylinker el péptido el polylinker el péptido α

α no se produce no se produce α

α no se produce. no se produce.

Medio de cultivo rico+Amp

z Por lo tanto colonias bacterianas que poseen el plasmidio con un inserto de DNA son blancas.

S Lobos C

(26)

26 z

z Inductor: ISOPROPYL Inductor: ISOPROPYL--ß ß--D D-- THIOGALACTOPIRANOSIDO THIOGALACTOPIRANOSIDO

Principal ventaja: Screening Azul/Blanco Principal ventaja: Screening Azul/Blanco

THIOGALACTOPIRANOSIDO THIOGALACTOPIRANOSIDO (IPTG)

(IPTG)

z

z Indicador colorimétrico: 5 Indicador colorimétrico: 5--bromo bromo-- 4

4--chloro chloro--3 3--indoxyl indoxyl--beta beta--D D-- galactopiranosido (X

galactopiranosido (X--gal), gal),

g p (

g p ( g ), g ),

colonies turn blue colonies turn blue

S Lobos C

(27)

S Lobos C

(28)

28

S Lobos C

(29)

S Lobos C

(30)

30 Células bacterianas hospederas

deben cumplir algunos requisitos

S Lobos C

(31)

S Lobos C

(32)

32

S Lobos C

(33)

METODOS DE TRANSFORMACION

S Lobos C

(34)

34 Electroporation 200 ohms 2.5kV

Time constant 4.5-5 msec 25μF

Field strength 12.5 kV/cm Electrode gap 0.1-0.4 cm

40 μl

4ºC

^{S Lobos C}S Lobos C -- U de ChileU de Chile

(35)

S Lobos C

(36)

36 Biobalística (bombardeo con partículas)

Gen Gun

S Lobos C

Electroforesis en gel de DNA

Electroforesis en gel de DNA

Método analítico de visualización del DNA basado en la migración del DNA a través de basado en la migración del DNA a través de un gel

Gel Polímero de agarosa

P lím d il mid p li il mid Polímero de acrilamida o poliacrilamida

V = q E / f

V= velocidad de migración

V= velocidad de migración

E= gradiente de potencial eléctrico (Volts/cm)

q= carga eléctrica efectiva de la partícula

f= coeficiente de fricción (tamaño y forma)

2

Gel electrophoresis of DNA

Electroforesis en gel de DNA

Gel de poliacrilamida

Tinción con nitrato de plata

Marcaje radiactivo Marcaje radiactivo

Marcaje fluorescente Electroforesis vertical

4

Aspectos que afectan la migración del ADN

Tamaño del DNA

Tamaño del poro (concentración del gel) Voltaje aplicado

Voltaje aplicado

Conformación del DNA

V = q E / f

Aspectos que afectan la migración del ADN

6

Amplificación de DNA

In vivo Clonamiento

In vitro PCR

8

Clonamiento

Amplificación IN VIVO de secuencias Amplificación IN VIVO de secuencias determinadas de DNA basada en el uso de:

-Vectores Vectores -Ligasa

-Células vivas -etc

• Plasmidio - Molécula de DNA circular

extracromosómico que se replica de modo autónomo Tipos de vectores de clonamiento

extracromosómico que se replica de modo autónomo dentro de una célula bacteriana

Límite de clonación: 100 a 10,000 pb ó 0.1-10 kb.

• Fago - Derivado del bacteriófago lambda; moléculas Fago Derivado del bacteriófago lambda; moléculas de DNA lineal, su DNA puede ser reemplazado por DNA extraño sin alterar el ciclo celular . Límite de clonación: 8-20 kb.

• Cosmidio - Molécula de DNA circular

extracromosómica que combina aspectos de

plasmidios y fagos; Límite de clonación: 35-50 kb.

10

• Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) - Tipos de vectores de clonamiento Basados en plasmidios mini -F bacterianos.

Límite de clonación: 75-300 kb.

• Yeast Artificial Chromosomes (YAC) -

Cromosoma artificial que contiene telómeros, origen de replicación, un centrómero de levadura y un marcador para su identificación en células

l í l ó k

de levadura. Límite de clonación: 100-1000 kb.

Introducción de un fragmento de DNA en un plasmidio

12

14

Los vectores plasmidiales: Un poco de historia

Amp

Amp

Amp

Tet

Aumento Nº copias

Amp

, Tet

, Cm

16

Selección de recombinantes

Inactivación por inserción versus α-complementación

18

Clonamiento por inserción direccional

20 Transcripción “in vitro”

Salmonella typhimurium SP6 phage

OP

22 Carece del gen rop y

tiene una mutación t s en el RNA II. A 37ºC puede Serie de vectores plasmidiales pUC. Selección de recombinantes por α-

complementación

el RNA II. A 37 C puede llegar a 70 copias por célula y a 42ºC más de 200 copias por célula.

Posee los primeros 58 aa de la β-galactosidasa (péptido alfa o α).

Dentro del péptido α posee un sitio de múltiple clonamiento (MCS) en perfecto marco de lectura

l é tid con el péptido α.

Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC18

Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC19 Polylinker o Multiple Cloning Site (MCS) – pUC19

24

tiene una mutación t ^s en el RNA II. A 37ºC puede Serie de vectores plasmidiales pUC. Selección de recombinantes por α-

α - complementación es una complementación Intra-alélica E. coli JM109 (F’traD36 proA+B+ lacI ^q ▲(lacZM15/▲(lac-proAB)glnV44 e14 gyrA96 recA1 endA1 thi hsdR17

AL + Xgal Amp ^s

β-gal ^-

AL + Xgal Amp ^r

β-gal ⁺ /Colonias azules α-complementación (+)