VACUNAS
Papel central: preparar al sistema inmune, a fin de que su respuesta resulte vasta y oportuna cuando el individuo sea invadido por el agente patógeno correspondiente o afectado por sus respectivas toxinas
VACUNAS
•
Es segura
•
Desencadena una vasta respuesta con dosis mínimas del Ag
•
Es estable
•
No requiere refrigeración para su almacenamiento o traslado
•
Su administración es sencilla
•
Es económica
•
No presenta efectos adversos
•
Es polivalente
LA VACUNA IDEAL
Se clasifican con base en las características de los inmunógenos que las conforman:
Las constituidas por microorganismos inactivados
Las conformadas por microorganismos atenuados
Las diseñadas con subunidades (moléculas aisladas pertenecientes al agente causal)
Las fabricadas mediante ingeniería genética (“vacunas de la tercera generación”)
VACUNAS
•
La obtención y preparación del Ag debe involucrar procedimientos “sencillos y seguros” (cultivos, síntesis química o molecular)
•
El Ag debe funcionar como buen inmunógeno y, en especial, inducir una
respuesta inmune de memoria, dependiente de linfocitos T
VACUNAS
•
Se utiliza al microorganismo completo
•
El proceso de inactivación se realiza vía
tratamientos físicos o químicos que no alteran la inmunogenicidad de las determinantes antigénicas correspondientes
•
Su eficacia es limitada, ya que la inmunidad generada sólo es
humoral, y resulta menos intensa y duradera
•
Se requieren grandes cantidades del Ag, lo que impacta negativamente en el aspecto económico
•
Pueden ocasionar efectos adversos relacionados con endotoxinas de las bacterias Gram negativas
Vacunas de μo inactivados
Inducen inmunidad imitando la infección
El μo se reproduce naturalmente, presentando sus Ags
Propician una efectiva, vasta y duradera respuesta inmune
humoral y celular, sin que ocurra la enfermedad
Pueden ser polivalentes
Implican un riesgo potencial de que la virulencia se revierta y, por lo tanto, que se reduzca su seguridad
Vacunas constituidas por μo
vivos atenuados
•
Influyen los costos de almacenamiento y
conservación: se deben mantener a 4°C para preservar su viabilidad y eficacia
•
Involucran la posibilidad de que, durante la atenuación, el μo afecte al personal del laboratorio o de que el producto en
elaboración se contamine con agentes virales
•
Las dificultades asociadas a la atenuación y la reversión de la virulencia dejarán de
representar un problema con la detección-deleción de los genes que codifican para factores de patogenicidad
Vacunas constituidas por
μo vivos atenuados
Sustento: No hay desviación de la respuesta inmune
Vacunas de subunidades
•
Se les denomina así por estar conformadas con una parte definida de los microorganismos (por ejemplo, la cápsula) o de sustancias
excretadas por ellos
•
Incluyen polisacáridos, proteínas o péptidos, elaborados frecuentemente mediante la
tecnología del DNA recombinante o por síntesis química
•
Su desventaja reside en la posible carencia de
complejidad estructural, la cual se traduce en
menor inmunogenicidad
• La cápsula bacteriana es uno de los factores de virulencia más importantes, pero la mayoría sólo está
compuesta por monosacáridos o polisacáridos
• La baja inmunogenicidad de los polisacáridos se ha superado uniéndolos a proteínas transportadoras:
“vacunas conjugadas”
.Éstas promueven una inmunidad celular con linfocitos T de memoria, así como una vasta respuesta humoral
Vacunas de subunidades
Las dirigidas contra:
H. influenzae tipo b (Hib), 5 serotipos de meningococos y 7 a 11 serotipos de S. pneumoniae, han resultado exitosas;
empero, son sólo parcialmente efectivas en niños < 2 años
Vacunas de subunidades
•
Estudios en modelos animales han demostrado ampliamente su eficacia aunque, por razones aún indeterminadas, los resultados no se han podido reproducir en humanos
•
Se intenta superar esas limitaciones, vía:
La optimización de los sistemas de liberación
La variación de las vías de administración
La potenciación de la expresión del Ag implicado
El establecimiento de mejores esquemas de inmunización
El empleo de adyuvantes apropiados
Vacunas de DNA
Generalidades
Cuando el producto es ino- culado se pretende que:
•
Ocurra la transfección
hacia diferentes células del hospedero
•
El DNA exógeno alcance el núcleo “blanco”, en donde tendría lugar la transcrip- ción bajo la influencia de la RNA pol II
Vacunas de DNA
•
Transfección de APCs, para que éstas presenten el Ag a los linfocitos T: Las DCs, Mø y linfocitos B producirán directamente el Ag, lo procesarán y lo presentarán a linfocitos T, vía el MHC-II y, eventualmente, el MHC-I
Vacunas de DNA
Su manejo dentro del hospedero
•
Transfección de céls somáticas (miocitos, queratinocitos y céls epiteliales)
Presentación cruzada. Las céls somáts sintetizan el Ag y lo secretan para que sea endocitado por APCs y lo procesen y presenten dando origen a la respuesta inmune adaptativa
El Ag no liberado es procesado en el proteasoma y presentado, vía el MHC-I, a céls T CD8+. Así, las céls somáticas serán destruidas y liberarán al Ag
restante, para su captación por APCs
Un plásmido suele constituir el vehículo transportador del gen que codifica para el inmunógeno; proviene de alguna bacteria inocua (E. coli), o bien, es producto de técnicas de ingeniería genética y se puede adquirir
comercialmente
Sólo los plásmidos menores de 15 kilobases se asocian a elevados índices de transformación
bacteriana y a tasas convenientes de transfección en las células “blanco” de los individuos vacunados
Vacunas de DNA
Componente indispensable
a) Para su replicación en bacterias
•
El origen bacteriano de replicación.
Útil para que el plásmido se pueda replicar en bacterias, generándose múltiples copias
b) Para la identificación de las céls bacterianas clonadas
•
Marcadores de selección: genes de resistencia a antibióticos, los
cuales facilitan la selección de las colonias bacterianas que han
adquirido el plásmido
Vacunas de DNA
C omponentes del plásmido
• El promotor eucariótico. Es el sitio de unión para la RNA pol II. De él depende que inicie la transcripción en células de mamíferos. Los más usados son virales: el del HCMV origina altos niveles de expresión génica
• Secuencia de DNA que codifica para el Ag de interés. Indispensable para prevenir
padecimientos. Se inserta en el “sitio de clonación”, corriente arriba del promotor
• Secuencias finalizadoras de la transcripción.
Garantizan que el mRNA sea terminado apropiadamente; destacan las poli A derivadas del virus SV40
Lipofectamina
• Secuencias inmunoestimulatorias. PAMPs. destacan
dinucleótidos no metilados: motivos CpG (citosina-fosfato- guanina) flanqueados por dos purinas en la posición 5’ y dos pirimidinas en la 3’ (útiles en transfección de APCs)
Vacunas de DNA
C omponentes del plásmido
Vacunas de DNA. Plásmidos
Gen del
Gen de
Resistencia a Ampic
ORI
Motivos CpG
Señal de termi- nación (SV40)
Gen que codifi- ca para el Ag bacteriano de interés
Promotor eucarionte (CMV)
Obtención del gen microbiano de interés
BamHI (G GATCC) BamHI
Gen de interés
Gen de interés
Clonación del vector
ligasas
ligasas
ligasas
BamHI
Gen de interés Plásmido en construcción
BamHI
…
…
Clonación del vector
+
Pretreated with BamH1
Incub 48 h
Sembrar en placa
Selección de colonias clonadas
incubación Ca++ / 42°C, 30 seg
Shock térmico = poros en PC
• Intradérmica (i.d.)
• Intramuscular (i.m.)
• Intravenosa (i.v.)
• Intranasal (i.n.)
• Oral
• Vaginal
Vacunas de ADN
Vías de administración
Vacunas de DNA
Manejo por el hospedero
Vacunas de DNA
Manejo por el hospedero
No se insertan en el genoma del hospedero, ya que de lo contrario podrían activar oncogenes o
inactivar genes supresores de tumores (p53) –se estima que dicha inserción ocurre sólo una
vez por cada millón de células transfectadas–
No originan defectos genéticos heredables, por integrarse a las células germinales
No desencadenan la producción de Acs anti-DNA responsables de provocar o acelerar el desarrollo de enfermedades autoinmunes
Vacunas de DNA
Es indispensable comprobar que:
Virus: HIV, herpes simplex, herpes bovino, HCMV, ébola, hepatitis B, hepatitis C, influenza (flu),
sarampión, rabia y rotavirus
Bacterias: Mycoplasma pulmonis, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Bacillus
anthracis, ECET, Salmonella sp, Rickettsia,
Yersinia enterocolytica y Listeria monocytogenes
Parásitos: Leishmania major, Plasmodium yoelii, Plasmodium falciparum, Schistosoma japonicum y Entamoeba histolytica
Otros: toxina tetánica, alergias y cánceres
Vacunas de DNA
Probables aplicaciones futuras
El principal competidor de las vacunas también reside en la propia industria farmacéutica: los antibióticos, cuya comercialización representa para las empresas
productoras una opción más interesante desde el punto de vista económico, a pesar del serio riesgo para la
salud pública que significa la propagación de la multirresistencia bacteriana
Vacunas de ADN
Obstáculo a vencer
Biotecnología y proteínas
recombinantes
1.
Obtención del gen ¿eu o procarionte? de interés
2.
Inserción del gen en el vector
3.
Transformación de la bacteria o levadura que producirá la proteína
4.
Selección de la cepa transformada (productora)
5.
Proceso de producción
6.
Extracción de la proteína recombinante
7.
Purificación del producto
8.
Formulación
Producción de proteínas
recombinantes
Producción de proteínas recombinantes humanas
Obtención del gen eucarionte de interés
7-methylguanosine- phosphate
Proteínas recombinantes Gen eucarionte de interés
Isopropanol Cloroformo- fenol
Ac. nucleicos
1. DNAsa 2. proteinasa K
Proteínas recombinantes
Vector
Promotor procariote
Gen de la proteína a producirse (cDNA
si es humana) Señal de
Terminación Ori
Resistencia a Antibióticos
(Ampic)
Producción de la proteína recombinante
Recuperación de la proteína recombinante
Producción de proteínas
Gen de interés
cDNA
Proteínas recombinantes
Baja en
plasminógeno es trombogénico Hemofilia
Eritropoyesis (GR) MG-GSF
Detergentes
(subtilisina proteasa) Quesos
Bacterium
CRISPRs: clustered regularly
interspaced short palindromic repeats
CRISPRs: clustered regularly interspaced short palindromic repeats
=
2nd infection
