AVANCES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA FUSARIOSIS DEL MAÍZ EN SINALOA

(1)

AVANCES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA

FUSARIOSIS DEL MAÍZ EN SINALOA

Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza

(2)

Superficie total de cultivos

1, 400, 000 Ha

Producción de maíz:

• 500-600,000 Ha

• 13, 000 MDP

29, 000 Ha en pérdidas

(costo ~780 MDP)

(3)

Fusariosis del maíz en Sinaloa (2009)

Pudrición del tallo y raíz

Pudrición en nodos e internodos

de la raíz

Macroconidio

Microconidio

Figueroa-López

(4)

(5)

Rizósfera

• ~4,000 especies de bacterias

por gr de suelo

• Solo podemos cultivar 1-5%

de los microorganismos (MOs)

• La planta afecta distribución

y abundancia de los MOs del

suelo

• Entender las interacciones

MOs-planta nos ayudaría a

desarrollar

estrategias

de

control biológico

(6)

(7)

La salud de la raíz de una

planta se debe, en parte, a la

capacidad de asociarse con

los microorganismos

(8)

(Munkvold y Desjardins, 1997)

Residuos infestados

(micelio o conidiosporas)

Acarreo por

viento o lluvia

_{por insectos}

Daño

Semilla

contaminada

(9)

9 Uso de Bacterias Promotoras del Crecimiento

Vegetal (BPCV) como antagonistas a

Fusarium

Las BPCV son usadas en biocontrol de patógenos

Alternativa amigable para el ambiente

Pueden tener muchos efectos benéficos en plantas

Bacillus

spp. ha sido ampliamente estudiado

• Potente antagonista diversos patógenos

• Capaz de producir compuestos antifúngicos

(10)

10 Mejora

nutricional

Producción de

Fitohormonas

Biocontrol de

patógenos

Sideróforos

Fosfatos

Fijación de

nitrógeno

Citocininas

Auxinas

Giberelinas

Antibióticos

Enzimas

hidrolíticas

Ácido

cianhídrico

Promoción del

crecimiento

vegetal

Efecto de las BPCVs sobre las plantas

(11)

Objetivo general del trabajo

Desarrollar un producto agrobiológico

en base a microorganismos de la

rizósfera del maíz

nativos de Sinaloa

para el biocontrol de

Fusarium

verticillioides

(12)

Estrategia General del Proyecto

Colección de 11,520 bacterias nativas de

Sinaloa mantenida a -70

°

C

Pruebas en medio sólido (42 antagonistas) y

hemólisis (14 antagonistas)

Ensayos en planta para seleccionar los 3

mejores antagonistas para pruebas de campo

Ensayos masivos en líquido para seleccionar

622 potenciales antagonistas a

Fv

Pruebas de validación en campo con las tres

bacterias antagonistas

(13)

Muestreo dirigido de plantas enfermas

vs. sanas en el mismo surco

(14)

Caldo Dextrosa y

Papa

Aislados bacterianos

Toma del aislado

bacteriano

_{el aislado bacteriano}

Inoculación con

Fusarium verticillioides

Bioensayo

Incubar en agitación

(15)

Cuantificación de biomasa fúngica

Tres lavados con

buffer PBS

Agregar WGA

Tres lavados con

buffer PBS

Incubar 4ºC toda la

noche

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Placa óptica 96 pozos

Incubar en agitación

(16)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Formato 12 x 8 = 96 pozos

Celda con probable

antagonista

WGA ALEXA FLUOR 488nm (Wheat Germ Agglutinin Alexa Flúor 488 nm)

Fuente:Maldonado-Mendoza

Pruebas de antagonismo en medio líquido

(17)

Fusarium

Posible antagonista

Fusarium

Posible antagonista

A. Antagonista controlando

el crecimiento de

Fusarium

B. Fusarium

crece ya que no

hay efecto antagonista

Celda de 2 ml del formato de 96

pozos con 500 µL de caldo Papa

Dextrosa con

Fusarium

y los

aislados

Se incubó 25°C,

250 rpm 30 h

Fusarium

Posible antagonista

23

6 FOR

L

236

FORL

Fuente: Maldonado-Mendoza

Pruebas de antagonismo en medio líquido

Cuantificación de biomasa fúngica

(18)

(19)

622 aislados seleccionados

Prueba en líquido

42 aislados seleccionados

Prueba en sólido

(20)

20 α-hemólisis = Parcial

β-hemólisis = Total

γ-hemólisis = No hemólisis

Tipo de hemólisis

Pruebas de hemólisis

Pruebas de hemólisis como factor de selección

50 µL

sobrenadante

β

γ

37ºC – 24hr

(21)

Aislados Identificados

Molecularmente

% INHIBICIÓN LIQUIDO

% INHIBICIÓN SOLIDO

HEMÓLISIS

2 Bacillus megaterium

₈₈

66 α

3 Pseudomonas putida

₈₄

67 α

4 Bacillus megaterium

₈₉

71 γ

5 Bacillus megaterium

₉₁

66 α

7 Bacillus megaterium

₇₄

71 α

8 Paenibacillus polymyxa

₆₂

85 γ

9 Bacillus cereus

₆₂

70 γ

12 Bacillus megaterium

₈₄

56 α

13 Bacillus subtilis

₈₆

63 α

22 Bacillus

sp.

₇₄

68 γ

23 Bacillus megaterium

₆₄

63 γ

24 Bacillus cereus

₇₂

73 γ

25 Bacillus cereus

₉₃

52 γ

35 Bacillus

subtilis

₇₆

73 γ

Características de los 14 mejores antagonistas

seleccionados para evaluar en planta

(22)

A

B

C

D

b b ab ab ab ab b b ab a ab ab ab ab 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35 Roo t vo lu m e (c m 3) a a ab ab b ab ab ab ab b ab ab b ab 0 20 40 60 80 100 120 CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35 Se ve rity (% ) a ab ab ab b ab ab ab ab ab ab ab ab b b 0 20 40 60 80 100 120 CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35 Se ve rity (% ) c c b c a bc d d bc c bc bc bc b a 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35 Roo t vo lu m e (c m 3)

Tres antagonistas seleccionados para pruebas en campo

por disminuir la severidad de la fusariosis en plántulas de maíz

Híbrido Cebú

(23)

Características de antagonismo y de promoción del

crecimiento vegetal de los aislados

No.

Aislado

Fosfato

Auxina

Quitinasa

Sideróforos

Proteasa

Glucanasa

B2

Bacillus megaterium

-

+

Ps3

Pseudomonas putida

-

+

-

+

B4

Bacillus

sp.

+

-

+

B5

Bacillus

sp.

+

-

+

B7

Bacillus megaterium

-

+

Pa8

Paenibacillus polymyxa

+

-

+

B9

Bacillus cereus

-

+

B12

Bacillus subtilis

+

-

+

-

B13

Bacillus aquimaris

+

-

+

-

+

B22

Bacillus megaterium

-

+

B23

Bacillus

sp.

+

-

+

-

B24

Bacillus cereus

-

+

B25

Bacillus cereus

-

+

B35

Bacillus

sp.

-

+

(24)

Compatibilidad entre aislados

4 5

8 9 22 23 24 25 35

4

5

8

9

22

23

24

25

35 COMPATIBLES

NO COMPATIBLES

24

(25)

Fecha de siembra:

Primer experimento: ciclo Otoño-Invierno 2011-2012

Segundo experimento: ciclo Otoño-Invierno 2012-2013

Diseño Experimental:

Bloques completamente al azar

con tres repeticiones. Anova, Tukey P<0.05

TRATAMIENTOS

1 AISLADO A

2 AISLADO B

3 AISLADO C

4 A+B

5 A+C

6 B+C

7 A+B+C

8 CONTROL ABSOLUTO

9 CONTROL DE PATOGENICIDAD

( +

Fusarium

)

10 CONTROL INOCULANTE

BIOLÓGICO COMERCIAL

11 CONTROL CON LB

Establecimiento del experimento en campo

2 11 3 6 9 5 10 7 1 4 8

1

5 _{8 7 10 11 3 4 9 2 6}

11 4

_{9 2 1 7 6 8 5 10 3}

BLOQUES

Variables a medir:

Altura

Grosor de tallo

Altura

de

la

primera

mazorca

Incidencia y severidad de

pudrición de tallo

Incidencia y severidad de

pudrición de mazorca

Rendimiento de grano

Humedad de grano

Comprobación

de

esterilidad de semillas de maíz

con identificación morfológica

y

molecular

de

hongos

asociados a granos de maíz

Evaluación de fumonisinas

presentes en granos de maíz

(26)

26 Establecimiento del experimento en campo

Propagación del inóculo de

Fv

en maíz picado

(27)

(28)

Pruebas en campo (FPS El Realito. 07/05/2012)

(29)

Las bacterias antagonistas afectan la incidencia

y severidad de pudrición en mazorca

Tratamiento

Variables

% Incidencia de

pudrición

en

mazorca

% de Severidad

de pudrición en

mazorca

6 B+C

69.2ª

13.8

b

7 A+B+C

8.6

c

_3.8

c

8 CONTROL ABSOLUTO

77.0

a

_15.4

b

9 CONTROL (+ Fusarium)

80.2

a

_34.7ª

10 CONTROL CON LB

58.6

a

_18.3

b

11 CONTROL COMERCIAL

72.9

a

_18.3

b

(30)

TRATAMIENTOS

Rendimiento de grano

(t ha

-1

₎

1 AISLADO A

11.00 a

2 AISLADO B

11.22 a

3 AISLADO C

9.66 ab

4 A+B

10.51 a

5 A+C

9.59 ab

6 B+C

9.59 ab

7 A+B+C

11.34 a

8 CONTROL ABSOLUTO

9.45 ab

9 CONTROL DE PATOGENICIDAD (+ Fv)

7.10 b

10 CONTROL CON LB

9.04 ab

11 CONTROL COMERCIAL

9.54 ab

Los antagonistas mejoran el rendimiento del grano (159 dds)

Ciclo O-I de 2012. Letras iguales en las columnas no presentan diferencias

significativas (Tukey

, α= 0.05).

(31)

Segundo experimento en campo El Realito resultados

parciales (2012-2013)

Tratamiento

Variables

% Incidencia de pudrición en tallo Nivel de severidad

de pudrición en

tallo a 159 DDS

(escala de 0 a 5)

41 dds

98 dds

1 Control absoluto híbrido Garañón

5 Control absoluto híbrido Dekalb 2038

(32)

Segundo Experimento en campo NO

infestado de

Fusarium

ciclo 2012-2013

• Cosecha realizada en junio 2013

• Helada en enero 2013

• No incidencia, no severidad en raíz y tallo

• Daño por cogollero

• Probable incidencia en mazorca

(33)

Bacillus cereus

disminuye la incidencia y

severidad de pudrición en mazorca (187 dds)

Tratamiento

Variables

% incidencia en

pudrición de

mazorca

% severidad en

pudrición de

mazorca

1 Control absoluto híbrido Cebú

87.1

ab

_76.2

a

2 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla)

69.2

c

_34.1

c

3 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla y tallo)

74.3

b

_28.3

d

4 Control absoluto híbrido Garañón

94.4

a

_62.7

bc

5 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla)

88.3

a

_34.2

c

6 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla y

tallo)

71.1

bc

_37.5

c

7 Control absoluto híbrido Gorila

92.3

a

_68.2

b

8 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla)

74.5

b

_33.0

c

9 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla y

tallo)

(34)

Bacillus cereus

aumenta el rendimiento de

grano (187 dds)

(35)

Estandarización de la producción del inóculo en

fermentadores de 3 L

Laboratorio de Bioenergéticos

Dra. Claudia Castro Martínez

M.C. Juan Carlos Martínez Álvarez

(36)

Formulación en polvo a base de esporas de

Bacillus

spp

. nativos de Sinaloa para el control de

Fv

en maíz

Establecer y optimizar la producción de esporas de

Bacillus

sp

.

Generar una formulación en polvo a base de esporas de

Bacillus sp.

Evaluar in

vitro

el efecto de la formulación en:

a) control

F. verticillioides

b) eficiencia en el recubrimiento de las semillas de maíz

c) viabilidad y vida de anaquel de las esporas de

Bacillus spp.

d) germinación de las semillas de maíz

Evaluar el efecto de la formulación en el control de

F. verticillioides

en maíz

(37)

Factores con efectos principales

Diseño Plackett-Burman

Zona de optimización

(ascenso más pronunciado)

Optimización DCC

Selección y optimización de nutrientes del

medio de cultivo por MSR

Estandarización de la

concentración

(38)

Producción de esporas

(UFC/mL) de

aislados de

Bacillus

MEDIO

DO 24h

DO 48h

DO 72h

UFC/mL 24h

UFC/ml 72h

1X10

7

_1X10

8

DSM

0.786

0.859

0.867 1.2± 0.16

1.2± 0.14

Medio 1 DSM+ AM

0.656

0.694

0.453 1.1± 0.12

3.3± 0.21

Medio 2 DSM+ AP

1.117

1.31

1.401 2.8± 0.1

2.1± 0.24

Medio 3 DSM+ CSL

1.926

1.658

1.465 3.5± 0.8

2.1± 0.08

Medio 4 DSM+ EC

1.278

1.829

1.546 --

--

Medio 5 DSM+ GLUC

0.993

0.971

0.928 0.1± 0

1.9± 0.04

Medio 6 DSM+ MAL

1.048

0.954

0.878 1.3± 0.16

2.3± 0.37

Medio 7 DSM+ SAC

0.756

0.983

0.916 8.2± 0.2

0.8± 0.12

(39)

MEDIO A B C D E F G 1 1 1 1 -1 1 -1 -1 2 -1 1 1 1 -1 1 -1 3 -1 -1 1 1 1 -1 1 4 1 -1 -1 1 1 1 -1 5 -1 1 -1 -1 1 1 1 6 1 -1 1 -1 -1 1 1 7 1 1 -1 1 -1 -1 1 8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 Letra Componente -1 1 A PEPTONA (g/L) 2.5 7.5 B EXTRACTO DE LEVADURA (g/L) 1.5 4.5 C KCl 10% (mL/L) 5 15 D MgSO4 1.2% (mL/L) 5 15 E MnCl₂ 10 mM (mL/L) 0.5 1.5 F FeSO4 1 mM (mL/L) 0.5 1.5 G Ca(NO3)2 0.5M (mL/L) 1 3

Diseño factorial fraccionado (Plackett-Burman) para evaluar los 7

componentes del medio de cultivo DSM y poder identificar aquellos con

(40)

MEDIO

DO 24h

DO 48h

DO 72h

UFC/ml 72h (1X10

9

₎

1

1.410

2.025

1.816

1.33 2 (EL)

1.683

1.459

1.426

5.13

3

1.171

0.982

0.881

1.10 4 (Mg)

1.557

1.710

1.562

5.60

5

1.778

1.585

1.501

0.30

6

1.975

1.663

1.727

0.43

7

1.755

1.944

1.861

2.00

8

1.068

1.058

0.906

2.90 Después de aplicar el método Plackett-Burman se obtiene

producción de esporas hasta de 5.6 x 10

9 _UFC/ml

(41)

El estudio de la diversidad de las bacterias cultivables en la rizósfera

del maíz nos ayuda a entender porque una planta se enferma

• Se secuenciaron 10,000 aislados y se seleccionaron 7,000 secuencias para

agruparlas por similitud en 185 OTUs

• El análisis de rarefacción nos indicó que el esfuerzo de muestreo para entender

la diversidad total de la muestra debe ser mayor

(42)

Composición de las poblaciones de

bacterias cultivables de la rizósfera

del maíz

Phyla

Firmicutes

(43)

Location Infection

1 B. subtilis 0.0001 0.0031 all five SYM

2 B. cereus 0.0001 0.0001 all five SYM

5 B. megaterium 0.0001 all five

6 Bacillus sp. 0.0001 all five

7 B. cereus 0.0001 0.0002 all five SYM

8 B. subtilis 0.0001 all five

12 B. subtilis 0.0001 all five

13 B. endophyticus 0.0001 all five

17 B. thuringiensis 0.0001 0.02 all five ASY

18 B. subtilus 0.0001 all five

19 B. firmus 0.0001 all five

22 E. cloacae 0.0001 0.001 I, II, III SYM

36 P.putida 0.0049 0.0038 all five ASY

82 Pantoea sp. 0.0001 0.0001 I, V SYM

94 L. sphaericus 0.0001 0.0001 all five SYM

114 Arthrobacter sp. 0.0001 II, IV, V

117 B. niacini 0.0001 all five

128 B. megaterium 0.0001 I, II, IV, V

169 Acinetobacter sp. 0.0016 I, V

179 B. luciferensis 0.0439 all five

239 S. maltophila 0.0015 I, II, III

375 L. sphaericus 0.0039 I, V

383 P. fluorescens 0.0001 0.0001 III, IV, V ASY

388 B. aquimaris 0.027 III, IV, V

422 Paenibacillus sp. 0.0237 I, II, III, IV

Related to infection OTU Organism Pr > Chisq OTUs present at sites

SANA ENFERMA

Poblaciones específicas de

Bacillus

y

Pseudomonas

de la rizósfera del maíz son

modificadas con la aparición de síntomas de fusariosis

(44)

OTUs associated only with asymptomatic

plant rhizospheres

OTU number Putative species Sample point 34 B. cereus I 37 P. putida I 39 P. putida I 46 P. putida I 50 P. putida I 52 Bacillus sp. I 54 B. subtilis I 75 P. putida I 79 B. subtilis I 84 B. pumilus I 313 Enterobacter sp. I 321 B. pumilus I 325 B. pumilus I 331 B. pumilus I 335 Enterobacter sp. I 453 Paenibacillus sp. I 495 B. thuringiensis I 505 B. megaterium I 251 B. pumilus II 600 Pseudomonas sp. III 607 B. cereus III 195 B. cereus IV 167 A. calcoaceticus V 381 B. thuringiensis V 151 Bacillus sp. III / V 162 B. cereus II / III / V 197 B. catenulatus I /IV 254 Bacillus sp. I / II 260 B. cereus I / II 324 B. pumilus I / III 336 B. pumilus I / III 372 B. subtilis I / V 423 B. aquimaris II / IV 464 B. subtilis II / III 494 Bacillus sp. I / II 510 B. megaterium I / II

OTUs associated only with symptomatic plant

rhizospheres

OTU number Putative species Sample point 104 C. sakazakii I 577 B. megaterium I 282 P. mendocina II 642 B. amyloliquefaciens III 650 Aeromonas media III 661 P. fluorescens III 662 B. megaterium III 433 B. subtilis IV 568 B. aquimaris IV 575 B. aquimaris IV 392 L. sphaericus V 393 L. sphaericus V 409 B. subtilis V 123 B. subtilis II / III 124 B. subtilis I / II 127 B. subtilis I / II 168 P. putida II / V 175 Bacillus sp. I / V 183 B. cereus I / V 190 B. cereus I / V 216 Enterobacter sp. I / II 220 B. subtilis II / IV 224 B. cereus II / IV 240 S. maltophila I / III 243 S. canadense II / III 274 Brevibacillus sp. II / IV 281 Paenibacillus sp. II / III / IV 288 Bacillus sp. II / IV 289 Rhizobium sp. II / III 398 Bacillus sp. I / V 401 B. thuringiensis IV / V 411 Bacillus sp. IV / V 441 Terribacillus sp. I / IV 469 B. thuringiensis I / III 490 B. subtilis I / III 592 Bacillus sp. III / IV 593 B. megaterium III / IV 523 Bacillus sp. I / V