Preclinical Model of Gene Therapy for Leukocyte Adhesion Deficiency Type I
thesis
Molecular Biosciences
madrid, 2019
ZE ÑÚ N A SE M A NIT SIR C
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA FACULTAD DE MEDICINA
Preclinical Model of Gene Therapy for Leukocyte Adhesion Deficiency Type I
Tesis Doctoral presentada por Cristina Mesa Núñez, licenciada en biotecnología, para optar al grado de Doctor en Biociencias Moleculares con Mención Internacional por la
Universidad Autónoma de Madrid,
Directores de Tesis
Elena Almarza Novoa Juan Antonio Bueren Roncero
Madrid, 2019
CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGÉTICAS, MEDIO AMBIENTALES Y TECNOLÓGICAS (CIEMAT) – CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS EN RED DE ENFERMEDADES RARAS (CIBERER) –
INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN SANITARIA DE LA FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ (IIS – FJD)
Elena Almarza Novoa, investigadora post-doctoral de la División de Terapias Innovadoras en el Sistema Hematopoyético del Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT), y Juan Antonio Bueren Roncero, investigador titular del OPIS y Jefe de la División de Terapias Innovadoras en el Sistema Hematopoyético del CIEMAT, certifican que la presente memoria titulada Preclinical Model of Gene Therapy for Leukocyte Adhesion Deficiency Type I ha sido realizada por Cristina Mesa Núñez bajo la dirección conjunta de los que suscriben, y cumple las condiciones exigidas para optar al título de Doctor en Biociencias Moleculares (R.D. 99/2011) con Mención Internacional por la Universidad Autónoma de Madrid.
Elena Almarza Novoa Juan Antonio Bueren Roncero
El trabajo de investigación descrito en la presente memoria ha sido realizado en la División de Terapias Innovadoras en el Sistema Hematopoyético (DTISH) del Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT)/ Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de Enfermedades Raras (CIBERER)/ Instituto de Investigación Sanitaria de la Fundación Jiménez Díaz (IIS – FJD).
Para su ejecución, esta tesis doctoral ha contado con la colaboración de los siguientes programas de investigación:
Master Research Agreement entre Rocket Pharma, CIEMAT, CIBERER e IIS-FJD.
Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (SAF2017-86749-R).
Fondo de Investigaciones Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (RD12/0019/0023).
CellCAM (S2010/BMD-2420).
Programa de transferencia de tecnología en el campo de la terapia génica de la Fundación Botín.
La DTISH forma parte de la Unidad Mixta de Terapias Avanzadas CIEMAT/IIS-FJD y de la Unidad 710 en el consorcio CIEMAT/CIBER de Enfermedades Raras del ISCIII.
Cristina Mesa Núñez ha disfrutado de una beca “Ayudas CIBERER para el inicio de tesis doctorales en Enfermedades Raras” del CIBERER, de un contrato del IIS-FJD y de una beca para la Formación del Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades.
A mis padres
A mi hermano
A mis abuelos
“Caminante, no hay camino, Se hace camino al andar”
Antonio Machado, Proverbios y Cantares
Acknowledgements
ACKNOWLEDGEMENTS
Septiembre de 2014, Madrid.
Dos maletas y un billete de tren. No, no era la primera vez que viajaba sola, pero sí la primera que lo hacía de esta manera: me mudaba a Madrid, ¿por cuánto tiempo?
El 8 de septiembre fue mi primer día en el CIEMAT, creo que nunca olvidaré esa fecha…
- Necesito su DNI y el nombre de su responsable. Le voy a dar una ficha y un papel que tiene que devolverme firmado a la salida. ¿Nunca ha estado aquí? Pues mire, si ve este mapa, el edificio 70 (madre mía, ¿70?) se encuentra justo aquí detrás, subiendo y girando a la izquierda, es muy fácil llegar…
Señor de la seguridad del CIEMAT, le agradezco su confianza, pero nunca sobreestime mi sentido de la orientación. Eran las 10 de la mañana. Pásate después del desa me dijeron (¿desa qué?). Al principio me pareció divertido. ¡Qué simpáticos, quedan todos los días para desayunar! Luego me di cuenta de que en realidad… bueno ha resultado ser algo práctico y útil para el aprendizaje de todos. Después de darle la vuelta, por dos veces, a lo que luego aprendí que eran los edificios 3 y 70, entré por el lado contrario a donde Diego y Guille me estaban esperando. Menos mal que salí con tiempo.
El edificio 70. Fue lo primero que conocí del CIEMAT y creo que a todos los que hemos pasado por aquí nos lo ha presentado (Guille) de la misma manera: “es un edificio inteligente” (ya…). Después de eso, comenzó la ronda de visitas empezando por la famosa y polifacética sala de seminarios/ comidas/ reuniones/ más cosas, seguido de la baticueva, despachos varios, presentación oficial de Juan (EL JEFE) (“¡Bienvenida! Tienes pinta de ser gallega, ¿no?”), laboratorio de procariotas y eucariotas, gente de onco y epitelios, y en cultivos el pitu normal y el pituplus para virus. Nada mal para el primer día, sólo un montón de nombres que no sabía cuánto tiempo iba a tardar en memorizar.
Algún momento de principios de 2019, Madrid.
Casi 5 años han pasado desde que llegué. Muchas veces he pensado que la tesis ha sido la segunda cosa más importante que he hecho en mi vida, la segunda, después de nacer, claro. Una gran sabia me dijo una vez que si superaba la tesis, podría con todo lo que me pasase en la vida (E. Almarza, 2017). Parece que está pasando, y de todo lo que he aprendido en este tiempo me queda claro que no habría ocurrido sin ustedes (como dirían en mi tierra). Así que me gustaría dedicar este apartado a todos los que de una u otra manera habéis formado parte de esta etapa.
A mis jefes y al grupo LAD-I: a mis directores de tesis Elena y Juan, a Montse y a Carlos. A Elena, una de las mejores doctoras que conozco. Jefa, compañera de trabajo, amiga y confidente. Gracias por enseñarme todo lo que sé. Aprender es importante, pero la manera de enseñar lo es todavía más. Gracias por empezar de cero cuando lo he necesitado y dejar que me haga mayor a mi ritmo. Gracias por tu paciencia y perseverancia, por tu esfuerzo, por buscar siempre el lado positivo, por hacérmelo todo mucho más fácil. Por darme libertad y dejarme opinar y equivocarme. Por mostrarme, hacerme partícipe e integrarme en cada uno de los pasos de este proyecto. Ninguno negaremos que ha sido duro, porque nadie dijo que fuera fácil, pero tampoco que no lo fuésemos a conseguir y creo que en el fondo también estaremos de acuerdo en que cada pasito ha compensado todo lo demás. Y, además de todo esto, eres toda una superheroína para Álvaro y Gonzalo (gracias a ti por animarme las correcciones con tus dibujos, ¡eres un artista!). Eres una buena human model a seguir y creo que he tenido muchísima suerte al tenerte como directora de tesis.
Juan. Muchísimas gracias por darme la oportunidad de formar parte de este gran equipo y por la formación que he recibido aquí. Gracias por tu trabajo y por llevarlo todo siempre para adelante. Por ser un jefe cercano y divertido que se implica en todo lo que hace. Por ser la mejor representación de todos nosotros y del trabajo que hacemos. Por tus consejos y tus ideas, siempre aportas una visión más global que lo mejora todo. Por hacer todo esto posible y conseguir que la División de Terapias Innovadoras en el Sistema Hematopoyético se convierta en un laboratorio de referencia en todo el mundo, un sitio donde a todos les gustaría estar, pero que sólo unos privilegiados tenemos la suerte de disfrutar.
A Montserrat Aldea, mi “Aldeíta”. Por todo lo que me has enseñado desde cero. Por los trucos que acortan protocolos. Por los momentos de confidencia en cultivos y todas esas historias que nos inventamos sobre las donantes de cordón. Por tu ritual de iniciación cuando me asignaron sitio. Por todo el cariño que he sentido por tu parte y la confianza
ACKNOWLEDGEMENTS
que me has dado. Por ayudarme cada vez que lo he necesitado y por seguir haciéndolo todo este tiempo. Por escucharme, entenderme, aconsejarme y animarme. Y gracias por los Manolitos que nos acompañan en las celebraciones de grupo.
Charlos. Por hacérmelo todo más fácil. Porque a veces, ni entre los dos sumamos uno, pero otras nos multiplicamos por 1000. No sé qué habría hecho sin ti. Qué suerte que formes parte de este grupo y que podamos contar contigo para todo. Gracias por tu infinita paciencia, por sacar fuerzas cuando no nos quedan, por escucharme, apoyarme y darme ánimos. Por colocarme al erizo cuando me porto bien y no dejar que lleve nada cuando he salido de casa habiendo derramado el café. Por los WhatsApp y los audios tontos que tanto me hacen reír. Por todo tu cariño y por tu amistad. Y también, gracias por tus asesoramientos en tecnología (creo que hablo en nombre de todos) que me han salvado más de un regalo. Eres un ser maravilloso con todo lo que eso significa. Te mereces muchas cosas buenas, y espero que te pasen.
A Vero. A ti todos te consideramos parte del grupo. La murciana más trabajadora y aplicada que conozco. Gracias por tu simpatía, por el cariño, por enseñarnos tanto y aprender tan rápido. Porque es un placer trabajar contigo y espero que hagas muchas más estancias en Madrid.
A Guille. Gracias por ser jefe (cuando lo he necesitado) y sobre todo amigo. No conozco a nadie al que le pegue más la expresión “es muy tú” que a ti, porque eres único.
Gracias por las mañanas en el Reina Sofía, las comidas en los bares más chic de Madrid, las tardes en las clases de pintura y por todos los ratos que pasamos juntos, donde sean y con quien sean. Gracias por tu naturalidad, por tu simpatía, por hablar sin tapujos de cualquier tema. Por ser tan divertido y espontáneo. Gracias por tu confianza, por la ayuda y el trabajo, por el apoyo, por los ánimos y por todos los consejos. Eres una grandísima persona y un grandísimo científico. Y por supuesto gracias también a Guillermo, por su amabilidad, por su cariño, por su simpatía y por compartir todos esos ratos con nosotros.
Sois muy especiales para mí.
A la baticueva. A Rosa, a ti gracias por ser tú en toda tu esencia, por lo divertida que eres, por tus historias, por tu manera de decir las cosas y por llevar el mejor laboratorio de cultivos que he visto nunca (y he visto unos cuantos). Gracias también por hacer uso del ascensor cuando lo he necesitado. Sabes que te aprecio mucho. A Óscar, el único chico de la cueva. Qué suerte tienen de tenerte y tú de tenerlas a ellas. Para mi eres todo un sabio y un referente en CRISPR y en cualquier otra cosa que se me pueda ocurrir, siempre tienes una solución para todo. Gracias por ayudar y estar siempre disponible. Susana, siempre divina e implicada en mil proyectos. Gracias por los buenos ratos, especialmente en los
congresos y por sacar una sonrisa aun cuando no hay ganas. Y también por tu silla cuando nos reunimos en la bati (Rosa, gracias a ti también por eso). María, porque me trasmites paz sólo con estar presente. Mercedes, gracias por tu paciencia con la estadística, no sé cuánto te debo. Y a todos, gracias por las charlas, por los ánimos, por los consejos. Por los momentos de risas y por las confidencias. Porque lo que pase en la baticueva debería quedarse en la baticueva. Gracias por todo el trabajo que hacéis y por vuestra calidad científica, sois el mejor ejemplo.
A José Carlos. Por todo tu trabajo y esfuerzo, por mantener la calma y sacar una sonrisa. Gracias por todo lo que me has enseñado de citometría, es el curso en el que más he aprendido. Por todos los buenos ratos que pasamos también fuera del CIEMAT y sobre todo por llevarnos sanos y salvos a Florencia (querer ir a Florencia pero volar a Pisa y al final aterrizar en Génova fue toda una aventura). Y aunque creo que es una batalla perdida, tengo que decirte que mis calcetines de patatas fritas (gracias Sara) le hacen una buena competencia a cualquiera de los tuyos.
A Rebe. Gracias absolutamente por todo: por tu trabajo, por enseñarme todo lo que sé de citometría, por ayudarme siempre que lo he necesitado, por los sorting interminables de LSK, por tus buenos consejos y los ratos de risa. Por enseñarnos tu pueblo y presentarnos a tu familia: Iván y tus peques Hugo y Julia. No hay mejor ejemplo de que El Barraco “es un pueblo precioso” y de que “es una gran familia” (esa canción todavía se tararea sola en mi cabeza…).
A Paula. Muchísimas gracias por todo. Por los ánimos cuando han hecho falta, por preocuparte y estar pendiente, por tener siempre algo que aportar. Por los buenos ratos compartidos en congresos, reuniones, tesis, etc. Y por supuesto por todo tu trabajo y por todo tu esfuerzo, que me parecen increíbles.
Marina. Gracias por acompañarnos en las comidas. Sabes que nos encanta que te sientes con nosotros. Y gracias también por tus ánimos y por dejar que me cuele en citometría.
Jaco. Menuda cabecita pensante, siempre llena de ideas y de experimentos pendientes. Todos tus fans agradecemos tus iniciativas para subir a comer al Chiringuito.
¡Cualquier momento es bueno para celebrar lo que sea!
Chicas GMP. A María, fuerte y luchadora. ¡Tú puedes con todo lo que te venga! A Bego, la mejor cocinera que conozco. Gracias por las comidas en tu casa y las clases de baile de los inicios, ¡eres toda una artista! Y a las dos, gracias por vuestro cariño, por vuestros consejos y experiencia, por los buenos ratos que echamos juntas.
La ciencia es un trabajo totalmente vocacional y creo que de eso todos vamos de sobra, especialmente en los tiempo que corren. Pero todo ha sido mucho más fácil gracias
ACKNOWLEDGEMENTS
a vuestro trabajo. A Nadia. Gracias por tu gestión y por soportar todos los marrones que te caen cuando nos vamos de congreso. Gracias por evitarnos todos los trámites, estar siempre pendiente y hacérnoslo todo más fácil. A Isra. Me abandonaste al cambiarte de sitio, pero sigues siendo la primera persona, junto con Marisa, a la que saludo cuando llego al CIEMAT. Echo de menos nuestras charlas sobre libros, pero seguiremos siendo asesores literarios en la distancia. Muchas gracias por ser siempre tan simpático y amable conmigo.
Gracias a todo el equipo de pedidos, por conseguirnos lo que necesitamos lo más rápido posible y por aguantar lo pesados que somos a veces. Gracias a Sergio, sobre todo por todas las gestiones con Vivotecnia y por las tartaletas que traes a las rifas de Navidad, a Sole y sus luchas con el edificio inteligente, a Mamen por tener siempre una sonrisa para todos y a Aurora y su trabajo en la Fundación (por cierto, nunca se me olvidará el cumple de tu hijo).
Laboratorios de euca/proca. A Aída. Para mi toda una referente y fuente de sabiduría. Una mujer de ideas claras. Gracias por involucrarte con todos cuando necesitamos tu ayuda y por ofrecernos una visión alternativa. Muchas gracias por los consejos, por los ánimos y por ayudarme con Charlos cuando lo necesito (esto es de broma). Me gusta mucho hablar contigo y quiero que sepas que no me voy a casa contenta si no me deseas un buen finde. A MLuz, la chica de los cordones y de absolutamente todo.
Muchas gracias por ser siempre tan amable y simpática, por echarnos una mano cada vez que lo hemos necesitado y por tener tanta paciencia en los momentos más críticos. Eres genial. A Laura Cerrato, toda calidad. Y a Miriam, por el cariño que desprendes, por tu amabilidad y por tus historias durante las comidas. A Lara, mi primera compañera de sitio cuando me sentaba en poyata. Gracias por tu paciencia con la TaqMan (hemos dado mucha guerra) y por tener siempre una sonrisa.
Pequehematos, la nueva generación de científicos que conquistará el mundo. Gracias por estar, por los buenos momentos compartidos, por las risas, los cafés y las tertulias durante las comidas. Por las salidas en Madrid y los viajes más allá de la ciencia. Por la compañía, los ánimos y el apoyo, por hacer de esto más que el sitio donde venimos a trabajar. Porque juntos sumamos más de lo que somos y porque nadie puede dudar de que somos una buena piña.
Gracias a Yari, mi negri. Por todos los favores que me haces, por preocuparte y por estar siempre atento y pendiente a cualquier cosa que necesite. Por hacerme reír y portarte tan bien conmigo. Por la confianza y por nuestros ratos de charla profunda. Por tener un corazón tan grande.
A Fran. Mi no compañero de clase en la Uni, pero el mejor biotecnólogo del que podría rodearme. Ya todo un doctorazo. Gracias por la acogida cuando llegué, por entender lo que significa chaleco sin que tenga que explicarlo, por tardes de juego y quedadas en el cine. Inolvidable Moonlight, aunque nunca la entendiésemos. Gracias por estar siempre dispuesto a ayudar, por enseñarme a hacer foci y por aguantar mi pregunta diaria sobre los trámites de la tesis. Por tu amabilidad y caballerosidad, pero sobre todo por tus chistes malísimos que al final siempre acaban haciéndome reír. Grande Fran.
A mis chicas de Reina Vic: Charito y Raquel, el dúo dinámico del grupo. Rosario, la valenciana más fiestera y con más carácter. Divertida, trabajadora y con pelazo ¡lo tienes todo! Raqueliña, mi percebe favorito y hermana de piercing (sí Omaira, he dicho piercing).
Gracias por comer caldo de carne y regalarnos las sobremesas que le siguen. Gracias a las dos por vuestro cariño y vuestro apoyo.
A Laura. Cara-guapa (ya es hora de cambiarte el nombre), amante del negrito ojos claros y de la purpurina y la persona más espontánea que conozco. Gracias por los momentos de risa y los buenos ratos, eres maravillosa.
A la imparable Virgi. Trabajadora como la que más y toda una terremoto en el gym y en el baile.
A Andrea. Por tu dulzura y tu calma. Por tus postres, siempre tan ricos. Estoy segura de que vas a ser una gran científica y una gran cocinera.
A María la más pequeña de todas, el bebé científico. Gracias por preocuparte, por escuchar y por los ánimos.
Y la Junta de Andalucía en el CIEMAT sigue creciendo con la llegada de Mercedes e Isa. Gracias chicas por los momentos de risa, por la complicidad, por los ánimos y el apoyo y por el cariño. Espero que se siga celebrando el 28 de febrero con un buen desayuno andaluz.
A Jonathan, por participar en este nuevo proyecto del gene editing en LAD-I. Y a Esther, Coco, por tu simpatía.
A mis Jinetes, mi familia de Madrid. Gracias. Por existir. Porque esto no habría sido los mismo sin vosotros. Los buenos amigos siempre te acompañan y cuando gritas tres veces su nombre aparecen, estés donde estés. A Sara, trabajadora, luchadora, inconformista, reivindicativa. Gracias por todo lo que me has enseñado, porque ahora sé tirar cañas; y por lo que me queda por aprender de ti. Es maravilloso cuando hablas sin decir nada y nosotros somos capaces de entenderte. Gracias por tus Post-it que suben el ánimo y por tu implicación con los demás. Gracias por uno de los findes más divertidos en Aso de Sobremonte, un pequeño gran pueblo, y por tirarnos por la tirolina más larga de
ACKNOWLEDGEMENTS
España. Por ser mi co-profesora de prácticas, mi compañera de pintura y Saratha CRISPR.
Estoy muy orgullosa de que hayas dejado a todos con la boca abierta en el ASGCT. Gracias al para siempre Fans. Tan Fans que a veces se me olvida su nombre (Carlos Carrascoso Rubio). Porque estás completamente loco y eso me encanta. Porque a veces eres como un niño pequeño y otras me das los mejores consejos que puedo recibir y en el momento más oportuno. Por ser tan adorablemente tonto y sereno a la vez. Por ser un buen amigo del que casi no tengo que preocuparme (a menos que salga de fiesta). Por hacer de mí cuando no estoy y por toda la ayuda que he tenido siempre por tu parte. Por tus abrazos cuando los he necesitado y por ser mi compañero en los congresos. Por meterte siempre en el papel, ser rociero te sienta muy bien. A Omaira. Tú tienes especial hasta el nombre. Junto a mi abuela, eres la persona más altruista y sin duda, una de las mejores personas que he conocido. Y la que peor sabe tararear del mundo. Gracias por tu apoyo y por darme el golpe de realidad cuando me ha hecho falta. Por tu sinceridad y por tu cariño. Por escucharme, por mirar por mí y por aguantarme. Por tus audios interminables de 15 minutos que se cuelan en mi lista de reproducción. Por llenar mi Netflix de series que nunca voy a ver mientras comemos pizza en mi piso. Porque nos morimos contigo cuando te mueres de la risa. Y gracias también a toda tu familia: Chemi, Pola, LaPili (la mejor pastelera del universo, científicamente testado jejeje), Fifi, Pancho, Andrés y también a Diego. Por acogernos e invitarnos los domingos a las comidas familiares que nos hacen sentir como en casa. Por las barbacoas y las tardes en la piscina. Y porque sois una familia maravillosa a la que tenemos mucho que agradecer. Mis Jinetes, sois increíbles como personas y como profesionales y tengo muchísima suerte de poder contar con vosotros.
Gracias por todo el cariño, el apoyo y vuestra amistad, porque con vosotros he vivido los momentos más especiales en Madrid y porque estoy segura de que los seguiremos viviendo en cualquier sitio. Os quiero mucho.
A los que alguna vez estuvieron. Especialmente a Diego y a su “calabasa en sarsa”.
Gracias por todo lo que me enseñaste, por tus consejos, porque para mí siempre has sido un punto de referencia. Por tu preclínica y por ser la base de mi tesis. Porque “tienes un arte que no se te puede aguantá, o por lo menos yo no lo aguanto”. Al terremoto MJ:
imparable, incansable, infinitamente trabajadora. El pequeño Juan estará muy orgulloso de su madre. A la maravillosa y cariñosa Fati. Echo de menos los ratos de tertulia en euca, los consejos de moda y el repaso de todos los outfits de cada evento. A la bella Vic, siempre tan estupenda y amable. Por marcar la diferencia con tus seminarios tan originales y porque tu tesis fue la primera a la que fui y eso es algo que nunca voy a poder olvidar. A Maru.
Creo que eres la única persona que conozco a la que le encanta contar colonias. Gracias por enseñarme tanto, por todo tu cariño y por llevar constantemente una sonrisa dibujada.
Siempre es un placer volver a verte. A Sergio. Por los buenos ratos, por tu sentido del humor y por tu generosidad al caerte conmigo de la bici. A Miguel Peces-Barba, pescaíto.
Por tu simpatía y por hacernos pasar a todos uno de los findes más especiales en Sonseca.
A Mariela. Por darme a probar el mate y por el cariño que desprendes. Creo que nunca he visto a nadie tan emocionada al recibir un regalo de cumpleaños. La farándula te espera. A la imparable Carmensín, la que se apunta a cualquier plan y en cualquier lugar. A Raquel Chinchón, la más chic; y a Miguel el roquero metalero. Y por supuesto también a otros que pasasteis por aquí: Carlos V, Julia, Esther, José Bustos, Javi, Virginia, Fede y un largo etcétera.
Onco. Gracias a todos ellos. A mi Raque miarma. Guapa, simpática, divertida, trabajadora, mi otra mano cuando llegué. Por todos los momentos que me haces pasar, siempre cargados de risa; por tus sabios consejos de pitonisa; y por esos achuchones que arreglan el día. Te adoro pequeña. A Cristian, el que siempre tiene hambre. Gracias por enseñarme una profesión, porque nunca nadie me había enseñado antes a coser un plátano y ahora podría dedicarme a ello. Gracias por tus comentarios de estilo y por todo.
A Cris Segovia, la más mimosa de todas. Gracias por todos tus consejos sobre el visado, no sé si eres consciente de todo lo que me ayudaste. A Carol y a sus uñas perfectas, siempre dando caña, como a mi me gusta. A Ester. Amable, graciosa, cariñosa y divertida. Gracias por los ánimos, por tener siempre buenas palabras, por preocuparte y por estar pendiente.
Eres un encanto. A Sara y Ricardo, siempre tan amables y sonrientes. Da gusto cruzarse con vosotros por los pasillos. A La Jose, la encargada de la sala común; y a Manuel por su dedicación con la qPCR. A Ángel, por su labor y paciencia organizando los seminarios de los jueves. Tengo que confesarte que hui de ti durante mucho tiempo para que no me tocase dar el seminario, pero te agradezco que me hicieses darlo, me sirvió muchísimo. Y gracias por la Coca-Cola en el momento preciso en el animalario.
Epitelianos. En especial a Vic, mi compañera de beca lanzadera primero y de FPU después. La primera persona a la que conocí aquí, incluso antes de llegar. Gracias por tu cariño y espontaneidad, eres un encanto de persona. Me parece increíble cómo eres capaz de emocionarte con cualquier cosa. Creo que siempre recordaré cómo gritaste cuando viste nevar en el CIEMAT. Y qué bonita casualidad que compartamos playa, siempre nos quedará Matalascañas. A Bonafont, mi otro melón (ya sabes que mi primer melón es mi abuela), el más polifacético de todos: inteligente, trabajador, amante de la ciencia, fiestero, viajero. Pero lo más importante es que nunca pierde la sonrisa, porque transmites alegría sólo con estar presente. Gracias por tu cariño, por tu simpatía y por ser tú, Parki. A Vero, la que pone la voz cantante y la más cariñosa de todas. A Rodolfo, por toda su ayuda en el nuevo camino que emprendemos en el gene editing. A Kiko, por los buenos días y buenas
ACKNOWLEDGEMENTS
tardes bien dados, da gusto cruzarse contigo. Por ser siempre tan amable y por ayudarnos a organizar las muestras de histología de la biodistribución.
A todo el personal del animalario, por encargaros de nuestros bichitos. Gracias a Jesús, por todo lo que nos enseñas, por tu ayuda cada vez que la necesitamos y por gestionarnos con cariño el aislador; a Edilia, siempre con una sonrisa y dispuesta a echar una mano; y a Miguel Ángel, pendiente de cada jaula y de cada animal, para que estén en las mejores condiciones. Gracias por todo vuestro trabajo y profesionalidad. Gracias también a Sergio, por estar siempre disponible y encargarse de las irradiaciones. ¡Feliz jubilación!
A Rosita, Freddy y María José. Gracias por encargaros de que nunca nos falte de nada y por mantener la sala de cultivos impecable.
Thanks to Norman, the best English teacher I have ever met. I think you will never forget my first desayunario, although I do not want to remember it anymore. Probably, you are not aware how much I have improved my English and my speech abilities because of your help. Thanks for every advice. I am truly thankful to you.
Thanks to Rocket Pharma, especially to Gaurav, Kinnari, Jonathan, Brian and Miriam.
Thanks for making this project a reality. I honestly appreciate your support, effort and contributions. Thanks for being part of this group and work together to achieve a common goal: the first gene therapy clinical trial basd on lentiviral vector for LAD-I patients.
Thanks to Donald Kohn and his team. Thanks for giving me the opportunity to work and collaborate with you. Traveling to Los Angeles has been one of the most amazing professional and personal experiences of my life. Thank you for your nice welcomed, for your tips and for leading me to attend to a transplant of a gene therapy-treated patient. It was a pleasure. I am also very grateful to Bea, for teaching me about the ddPCR and everything you know about the world of the CFCs. Thanks for your advices and for your help during my whole stay (including bureaucratic issues). It was a pleasure to share with you my time there. Thanks Zulema, for your warm welcome, for the coffees in the mornings and the BBQ at your home. I appreciate your friendship. And I also want to thank Xanne, Fabrizia, Shantha and Caroline (Doctora nunca) for their help and good reception.
Sin duda mis años de carrera han sido de las mejores etapas de mi vida. Viví experiencias increíbles con personas maravillosas a las que me gustaría agradecer el cariño, el apoyo y el haber formado el grupo tan espectacular que todavía seguimos manteniendo. Así que: a mis biotecnólogos. A María José, Cochi sólo para los muy amigos.
Mi compañera de fatigas en la carrera, de piso durante el máster y mi amiga para siempre.
La que me acompaña a casa aun estando a más de 400 km de distancia, aunque sea por teléfono (sabemos cuándo empieza la llamada pero nunca cuándo acaba). Una mujer luchadora, trabajadora y que nunca se rinde. Porque hemos compartido momentos únicos (espero que no se me vuelva a caer el equipaje del maletero de un coche en marcha). Por estar en las buenas y en las peores y porque a veces sólo me entiendes tú. Gracias por todo. Te quiero. A mi Julio, mi aguacate mitad y uno de mis mejores amigos. Gracias por los ratos de locura, por ser mi compañero de compras (¿o es al revés?), de sofar sound y por las maratones de pelis en mi casa. Por cada momento que pasamos juntos y porque da igual el tiempo que llevemos sin vernos, hay cosas que nunca cambian. A Sofi, mi cariá, mi pequeña petunia. La más aventurera y deportista de todos. Qué pena tenerte tan lejos y echarte tanto de menos. Parece que fue ayer cuando vivíamos juntas y mira cuántos años han pasado. Pero que se prepare el mundo que ella va a llegar adonde quiera. A mi pequenio Lui. Gracias por tu cariño, tu paciencia, tu sentido del humor, por preocuparte y estar atento. Por pasarme papers y tener algo que aportar cuando me atasco. A mi Pau.
Guapa, inteligente, trabajadora, responsable y risueña. Gracias por las noches de juegos, las horas en el gym, los escape rooms, las cenas en nuestro bar de los molletes y los viajes al sur. Por saber escuchar y por tus buenos consejos. Y por supuesto a Javi, tú no eres biotecnólogo pero te lo convalidamos. Hace tiempo que dejaste de ser amigo consorte y te ganaste con creces el derecho a ser uno más del grupo. Gracias por tu sentido del humor y por acompañarnos a todos los planes. A Deivid, el más sereno y responsable. El que mejor sabe escuchar y el que siempre está atento. A Álvaro, el que siempre lucha por lo que quiere, aunque eso suponga irse fuera. A Marina y Paco, el músico biotecnólogo. No sabéis las ganas que tenemos todos de celebrar vuestra boda. ¡Estamos contando los días! A Dani y Tamara, por animar todas las fiestas. A Curro y Angy, porque los BTG estamos por todos lados y qué suerte tuvimos Cochi y yo al encontraros en Salamanca. Gracias por hacer que nos sintiésemos como en casa desde el primer momento y por hacer de ése un año muy especial. Siento que los pimientos de mi padre no lleguen a Cambridge.
A las que siempre han estado ahí y me hacen recordar los momentos más bonitos cuando las veo. A mi Elena, la mejor amiga que se puede tener. No recuerdo mi vida antes de ti y es que me has acompañado desde que tengo conciencia. A ti tengo que darte las gracias por todo. Por entenderme y apoyarme en cada paso. Por tu sinceridad, porque a veces la confianza…es maravillosa. Por ser amiga y a veces hasta mi madre (aunque con la mía estoy muy contenta). Por los bocatas de choricito en los recreos y por ser la primera persona a la que llamo cuando me pasa algo. Porque eres única y especial y porque te quiero mucho. A mi CrisBa, la más loca de todas. Inteligente, guapa y trabajadora. Con un
ACKNOWLEDGEMENTS
corazón incluso más grande que ella misma. Gracias también por regalarme a mi niño prefe, mi Lucas. A Ana y a nuestra princesa Jimena. Gracias por el cariño y por estar desde pequeñita. A mi compañera de pupitre en el insti, Ana D. Dulce, tierna, encantadora y cariñosa como la que más. Gracias por la portada que me has preparado, por hacer esto incluso más especial. Y gracias también a Aída. Las dos sois infinitamente adorables.
Gracias por nuestras meriendas por Plaza de España, los viajes a casa en los que arreglamos el mundo y los ratitos en Matalascañas.
Y ahora sí llego vuestro turno. Mi familia, lo más importante de mi vida. Porque os lo debo absolutamente todo y ni siquiera sé por dónde empezar a daros las gracias. A mis padres. Gracias por quererme, porque yo también os quiero. Por cuidarme, protegerme y darme la educación que he recibido. Gracias, porque nunca me ha faltado nada y por mantener mi ilusión. Por apoyarme incondicionalmente, dejarme tomar mis propias decisiones y creer en mí. Por darme fuerzas cuando las necesito y por estar siempre ahí.
Por enseñarme que lo mejor de la vida es teneros. A mi madre, la madre más moderna de todas las madres que conozco. Porque me parezco a ti más de lo que me gustaría reconocer, pero a la vez me llena de orgullo. Gracias por enseñarme que nunca hay que rendirse, que siempre hay que luchar por lo que se quiere y que todos somos iguales. Por la confianza, por la complicidad y por todas las cosas que haces por mí a diario. Gracias también por tener aguante infinito cuando me pintas las uñas y no enfadarte cuando te quito la ropa. A mi padre, la persona que más paciencia tiene conmigo en el mundo.
Gracias por escucharme y ser mi paño de desahogos. Por enseñarme que nunca es tarde para hacer lo que se quiere y que si lo quiero lo conseguiré, ya encontraré la manera. Por arreglarme la vida y todos los problemas que me van surgiendo. Porque los dos sois para mi el mejor ejemplo a seguir y si estoy aquí es por vosotros. A mi hermano, el mejor psicólogo que pueda existir y que sólo tiene que proponerse algo para conseguirlo. Gracias por quedarte despierto esperando a que llegase a casa cuando eras pequeño, porque crecer a tu lado ha sido lo más bonito que me ha podido pasar. A veces se me olvida que ya eres grande, pero es que siempre serás el enano de la familia. Y gracias también a Isa, tu también eres parte de la familia. Gracias por tu simpatía, tu cariño y sobre todo por hacerle feliz. A mis eternos cachorros, Lolo y Lula, porque nadie me recibe como ellos cuando llego a casa y porque me dan la tranquilidad que no encuentro en otro sitio. Su cariño no tiene límites y el mío por ellos tampoco.
A mis abuelos, las personas a las que más respeto en el mundo, y a su Chispita.
Gracias por mimarme y estar siempre pendiente de mí. A mi abuela, la persona más generosa de todas. Gracias por las tostadas de los fines de semana cuando estoy en casa y
las paellas de los domingos. Por animarme las siestas con cuentos cuando era pequeña y por preocuparte todos los días por mi. A veces, todos necesitamos que nos recuerden las cosas y yo estoy dispuesta a repetirte todas las veces que necesites que te adoro. A mi abuelo, el señor del tiempo y la persona con más sentido del humor que conozco. Gracias por tu fuerza y tu entereza, no sé que haríamos sin ti. Y si mi abuela al final decide rifarte un día en la tómbola, prometo comprar todas las papeletas para que me toques. Gracias por las aceitunas, los melones que me haces traerme a Madrid y tus berenjenas con miel.
Os quiero mucho y, como me decís todas las noches, “un beso no, un ciento”.
A Paqui y José María. A vosotros os conozco desde pequeña y también sois parte de la familia. Gracias por el apoyo, los ánimos y el cariño. Y a José María, gracias por transmitirme tu entusiasmo por la biología, por ser un buen profesor y porque gracias a ti soy biotecnóloga.
A los Kikos. A Lola, por todo tu cariño, por tus consejos y por escucharme. Por los detalles tan bonitos que tienes conmigo. A Antonio, por tu generosidad y porque sólo tu me entiendes cuando salto para no pisar las rayas del suelo. A Alberto, “señor sí señor” y a Raquel por su simpatía. Sois muy cucos los dos. A mi rubia, mi Lola. La más extrovertida de todos y con un corazón enorme. No tengo ninguna duda de que vas a conseguir lo que te propongas. Y al perro más sinvergüenza de todos, Thor. Gracias a todos por hacerme sentir parte de la familia.
A mi trébol, la mayor suerte de todas las que tengo, mi Rubio. Eres una persona increíble y estoy muy orgullosa de ti. Por ser trabajador, responsable y por arriesgar. Por buscarte siempre nuevos retos y nunca perder las ganas. Gracias por aparecer en el momento preciso y quedarte. Por todo el cariño que me das a mí y a toda mi familia. Por estar siempre a mi lado aunque nos separen kilómetros. Por apoyarme y entenderme y cruzar el charco si hace falta. Porque sabes hacerme reír hasta cuando no tengo ganas. Y cuándo me preguntas si soy feliz, la respuesta es sí, y contigo más. Te quiero Kiku. Por todo. Porque sí.
Nunca se me han dado bien los nombres y no pretendo que esto sea una excusa, pero si una explicación. Así que gracias a ti también, aunque tu nombre no aparezca, porque todos los que habéis pasado por este sito me habéis dejado, de una u otra manera, vuestra huella.
ACKNOWLEDGEMENTS
Abril de 2019, Madrid.
Como todo trabajo científico, esto no puede acabar de otra manera que no sea con unas conclusiones:
1. Esto está ya casi casi.
2. Gracias por todo lo que me habéis enseñado personal y profesionalmente. Habéis construido un sitio de referencia y con altísima calidad científica en el que es un placer estar.
3. Gracias por todas las experiencias que me habéis hecho vivir.
4. En definitiva: gracias a todos por hacer que estos 5 años hayan sido increíbles.
¡GRACIAS!
Cris
“Somewhere, something incredible is waiting to be known”
Carl Sagan
Summary
SUMMARY
Leukocyte adhesion deficiency type I (LAD-I) is a primary immunodeficiency caused by an impaired neutrophil migration in response to bacterial infections. The genetic causes of LAD-I are mutations in the ITGB2 gene that encodes for CD18, the common subunit of β2 integrins. These heterodimers are involved in the trafficking and extravasation of leukocytes to inflamed areas. The severity of the LAD-I disease is associated with the percentage of CD18 expressing cells. Patients with less than 2% CD18+ cells suffer a severe disease with a very high mortality rate before the age of 2. The current curative treatment of these patients is the allogenic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation from healthy donors. The ex vivo gene therapy (GT) of autologous HSCs has been proposed as a good therapeutic option for these patients when non-HLA- matched related donors are available.
Our laboratory has previously shown that the LV:Chim.hCD18 carrying the human ITGB2 gene under the control of a myeloid Chimeric promoter efficiently expresses the therapeutic human CD18 protein in myeloid cells from CD18HYP mice, and restores the functionality of these cells1. To complete the preclinical studies required for the development of a gene therapy trial in severe LAD-I patients, further preclinical studies have been now developed to confirm the safety and efficacy of the approach.
The characterization of CD18 expression in human HSCs from healthy donors (HDs) indicated that the absence or low expression of CD18 defines a population with long-term repopulating activity. Significantly, the transduction of HD CD34+ cells with the therapeutic Chim.hCD18- lentiviral vector (LV) did not affect the membrane expression of CD18, and preserved the in vivo repopulating potential of transduced cells. Biodistribution studies in mice showed that there was no mobilization or shedding of the LV, or risks of LV germline transmission after the infusion of transduced HSCs.
Due to the modest levels of gene marking in human CD34+ cells transduced with the therapeutic LV, different molecules were used to enhance the transduction of these cells.
The addition of a combination of specific molecules during the transduction protocol revealed a marked increase in the genetic modification of primitive HSCs, without affecting their multi-lineage long-term repopulating potential. Additionally, our optimized transduction protocol demonstrated the phenotypic correction of the neutrophil extravasation defect in a severe mouse model of LAD-I.
Finally, the transplantation of NSG mice with human CD34+ cells that had been transduced under Good Manufacturing Practice with the therapeutic LV demonstrated the stable gene marking of primitive HSCs with preserved repopulation potential.
La deficiencia de adhesión leucocitaria tipo I (DAL-I) es una inmunodeficiencia primaria causada por una disminución en la capacidad de migración de los neutrófilos en respuesta a infecciones bacterianas. La causa genética son mutaciones en el gen ITGB2, que codifica la proteína CD18 que constituye la subunidad común de las integrinas β2. Estos heterodímeros están involucrados en la extravasación de los leucocitos a sitios de inflamación. La gravedad de la enfermedad está relacionada con el porcentaje de células que expresan CD18. Los pacientes con menos de un 2% de células CD18+ padecen una enfermedad grave caracterizada por una elevada tasa de mortalidad durante los 2 primeros años de vida. Actualmente, la única cura para estos pacientes es el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (CMHs) de donante sano. La terapia génica (TG) de CMHs autólogas se ha propuesto como una buena alternativa en ausencia de donantes compatibles.
Previamente en nuestro laboratorio hemos demostrado que el vector terapéutico LV:Chim.hCD18, portador del gen humano ITGB2 bajo el control de un promotor quimera mieloide, es capaz de expresar eficazmente la proteína hCD18 en las células mieloides en el modelo de ratón CD18HYP y de recuperar la funcionalidad deestas células1. Durante el desarrollo de este trabajo se han completado los estudios preclínicos requeridos para el desarrollo de un ensayo de TG en pacientes con DAL-I severa. La caracterización de la expresión de CD18 en CMHs humanas de donantes sanos demostró que la ausencia o baja expresión de CD18 está asociada a una población con una alta capacidad de reconstitución a largo plazo. La transducción de estas células con el vector LV:Chim.hCD18 no afectó a los niveles de expresión en membrana de CD18 ni al potencial de reconstitución de las células transducidas in vivo. Los ensayos de biodistribución en ratón mostraron que no había riesgo de transmisión del vector lentiviral tras la infusión de las células transducidas.
Debido a la baja eficiencia de transducción de células CD34+ con el vector terapéutico, se ha investigado el efecto del uso de diferentes moléculas que mejoren la transducción de estas células. La adición de una determinada combinación de moléculas potenciadoras de la transducción permitió incrementar la eficacia de transducción de las CMHs más primitivas, manteniendo su capacidad de reconstitución a largo plazo. De manera adicional, nuestro protocolo de transducción optimizado ha confirmado su eficacia para la corrección fenotípica del defecto de extravasación de neutrófilos un modelo de ratón severo para DAL-I.
Finalmente, células humanas CD34+ transducidas según normas de correcta fabricación con el vector terapéutico, se trasplantaron a ratones NSG immunodeficientes.
En estos experimentos demostramos que la transducción era estable y no afectaba a la capacidad de reconstitución de las CMHs.
“Eppur si muove”
Galileo Galilei
Index
INDEX ... 1 LIST OF ABBREVIATIONS ... 7 INTRODUCTION ... 15 1. HEMATOPOIETICSYSTEM ... 17
1.1. Hematopoietic stem cells in mice ... 17 1.2. Hematopoietic stem cells in humans ... 18 1.3. Hematopoietic niche ... 19 2. LEUKOCYTEADHESIONCASCADE ... 19 2.1. Integrins... 20 2.1.1. Structure ... 20 2.1.2. Signaling: inside-out and outside-in ... 21 2.1.3. Β2 integrins ... 22 2.2. Phases of leukocyte adhesion cascade ... 23 2.2.1. Rolling ... 24 2.2.2. Integrin activation and firm adhesion ... 24 2.2.3. Extravasation ... 25 3. LEUKOCYTEADHESIONDEFICIENCIES ... 26 3.1. Leukocyte adhesion deficiency type I ... 27 3.1.1. Clinical manifestations and prognosis ... 28 3.1.2. Prevalence ... 29 3.1.3. Diagnosis ... 29 3.1.4. Treatment ... 30 3.1.4.1 Symptomatic treatment ... 30 3.1.4.2 Hematopoietic transplant ... 30 3.1.5. LAD-I animal models ... 31 3.1.5.1. Mouse model ... 31 4. HEMATOPOIETICSTEMCELLGENETHERAPY ... 32 4.1. Safety of gene therapy ... 33 4.2. Lentivirus ... 34 4.2.1. Infection cycle ... 35 4.3. Lentiviral vectors ... 36 4.3.1. Lentiviral vector development and design ... 36 5. GENETHERAPYFORLAD-I ... 38 5.1. Previous studies ... 38 5.2. Development of the Chim.hCD18 lentiviral vector for LAD-I gene therapy ... 40
OBJECTIVES... 43 MATERIALS & METHODS ... 47 1. CELLCULTURE ... 49
1.1. Cell lines ... 49 1.1.1. Liquid culture ... 49
INDEX
1.2. Primary cells ... 49 1.2.1. Human CD34+ cells ... 49 1.2.1.1. Purification of CD34+ cells from cord blood ... 50 1.2.1.2. Cell sorting ... 50 1.2.1.3. Liquid culture ... 50 1.2.1.4. Transduction of human CD34+ cells ... 51 1.2.1.5. Methylcellulose culture ... 53 1.2.1.6. Soluble ICAM-1 binding assay ... 53 1.2.2. Mouse cells ... 54 1.2.2.1. Purification of mouse hematopoietic stem cells ... 54 1.2.2.2. Liquid culture ... 56 1.2.2.3. Transduction of mouse hematopoietic stem cells ... 56 1.2.2.4. Methylcellulose culture ... 57 2. ANIMALEXPERIMENTATION ... 57 2.1. Mice breeding and facilities ... 57 2.2. Mouse strains ... 58 2.3. Hematological sampling ... 60 2.4. Transplantation experiments ... 61 2.4.1. Xenotansplants in mice ... 61 2.4.1.1. Study of CD18 expression in long-term repopulating hematopoietic stem cells ... 61 2.4.1.2. In vivo evaluation of potential transgene over-expression, effect of transduction enhancers and validation runs ... 62 2.4.1.3. Secondary transplant ... 62 2.4.2. Ex vivo gene therapy experiments ... 62 2.5. Inflammation models ... 64 2.5.1. Lipopolysaccharide- induced asthma model ... 64 2.5.2. Lipopolysaccharide- induced pad inflammation model ... 65 2.6. Mobilization ... 66 2.7. Toxicology and biodistribution ... 67 2.7.1. Lin- cell transduction and liquid culture ... 67 2.7.2. Organ sampling ... 68 2.7.2.1. Biochemical profile in peripheral blood serum samples ... 69 2.7.2.2. Detection of replication competent lentiviruses by p24 ELISA ... 70 3. FLOWCYTOMETRYANALYSES ... 70 3.1. Hematopoietic progenitor population study ... 70 3.2. Analysis of the cell cycle of human hematopoietic stem cells ... 71 3.3. Integrins’ expression studies ... 71 3.4. Distribution of cell lineages in transplanted mice ... 72 4. LENTIVIRALVECTORS ... 73 4.1. Plasmids ... 73 4.1.1. LV:Chim.hCD18 ... 73 4.2. Production of research-grade lentiviral vector ... 73 4.3. Titration ... 74 5. QUANTITATIVEANALYSES ... 75
5.1. Quantitative PCR ... 75 5.1.1. Vector copy number determination ... 76 5.1.2. Engraftment analyses ... 76 5.2. Digital droplet PCR ... 76 6. STATISTICALANALYSES ... 77 RESULTS ... 79
I.PRECLINICALSAFETYANDTOXICITYSTUDIES ... 81 1. Implications of the ectopic expression of CD18 in human hematopoietic stem cells ... 81 1.1. Analysis of the membrane expression of CD18 in untransduced human hematopoietic stem cells………. 81
1.1.1. Analysis of CD18 expression in cord blood hematopoietic stem cells with different phenotypes ... 81 1.1.2. Study of CD18 expression in long-term repopulating hematopoietic stem cells ... 84 1.2. Analysis of potential toxic effects associated to the ectopic expression of CD18 in hematopoietic stem and progenitor cells ... 86 1.2.1. In vitro studies ... 86 1.2.2. In vivo studies ... 87 2. Toxicology and biodistribution studies of the therapeutic Chim.hCD18-LV in wild type mice ... 89 2.1. In vitro studies of Lin- bone marrow progenitor cells transduced with the LV:Chim.hCD18 .. 90 2.2. In vivo studies in mice transplanted with bone marrow progenitor cells transduced with the LV:Chim.hCD18 ... 90 II.OPTIMIZATIONOFTHETRANSDUCTIONPROTOCOLWITHTHETHERAPEUTICCHIM.HCD18- LV ... 97 3. Improved transduction of human CD34+ cells ... 98 3.1. In vitro evaluation of the efficacy of transduction enhancers ... 98 3.2. Analysis of the in vivo impact associated to the transduction of human CD34+ cells with the therapeutic Chim.hCD18-LV ... 101 4. Efficacy of transduction enhancers in the gene therapy of two mouse models of LAD-I ... 105 4.1. Efficacy of transduction enhancers in the ex vivo gene therapy of CD18HYP mice ... 105 4.1.1. In vitro assessment of the efficacy and toxicology of transduction enhancers on CD18HYP hematopoietic stem and progenitor cells ... 106 4.1.2. In vivo assessment of the efficacy and toxicity of transduction enhancers on hematopoietic stem cells transplanted into CD18HYP mice. ... 107 4.2. Efficacy of transduction enhancers in the ex vivo gene therapy of CD18KO mice ... 111 4.2.1. Phenotype of severe LAD-I mice ... 111 4.2.2. Ex vivo gene therapy of CD18KO mice... 117 III. ANALYSIS OF THE FUNCTIONS OF HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLSTRANSDUCED WITH THE THERAPEUTIC LV:CHIM.HCD18 UNDER GOOD MANUFACTURING PRACTICE CONDITIONS ... 125 DISCUSSION ... 129
I.PRECLINICALSAFETYANDTOXICITYSTUDIES ... 131
INDEX
1. CD18 expression in human hematopoietic stem cells ... 132 1.1. The transmembrane expression of CD18 is reduced in long-term repopulating hematopoietic stem cells ... 132 1.2. Transduction of healthy donor human CD34+ cells with the LV:Chim.hCD18 does not affect the repopulating function of the primitive hematopoietic stem cells ... 133 2. The transduction of mouse hematopoietic stem cells with the LV:Chim.hCD18 does not result in the mobilization or shedding of the vector after transplantation in mice... 135 II.OPTIMIZATIONOFTHETRANSDUCTIONPROTOCOLWITHTHETHERAPEUTICCHIM.HCD18- LV ... 137 3. Transduction enhancers efficiently improve the transduction of human hematopoietic stem cells with the Chim.hCD18-LV without altering their in vivo repopulating properties ... 138 4. Transduction enhancers improve the transduction of LAD-I mouse hematopoietic stem cells . 140 III.THETRANSDUCTIONOFHUMANCD34+CELLSUNDERGOODMANUFACTURINGPRACTICE CONDITIONSWITHTHETHERAPEUTICCHIM.HCD18-LVMEDIATEDSTABLEGENEMARKINGOF PRIMITIVEHEMATOPOIETICREPOPULATINGCELLS ... 144 CONCLUSIONS ... 147 BIBLIOGRAPHY ... 153 APPENDIX I: ADDITIONAL INFORMATION ... 173
“Be positive, patient and persistent”
Bansky
List of abbreviations
LIST OF ABBREVIATIONS
A
ADA Adenosine deaminase
AEMPS Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
ALB Albumin
ALT/GPT Alanine transaminase/ glutamic pyruvic transaminase
APC Allophycocyanin
AST/GOT Aminotransferase/ glutamic oxaloacetic transaminase
B
BAL BFU-E BHQ-1 BLAD BM bp BSA BV
Bronchoalveolar lavage Burst forming unit-erythroid Black hole quencher-1
Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency Bone marrow
Base pairs
Bovine serum albumin Brilliant violet
C
CA Capsid
CAR CXCL12-abundant reticular
CB Cord blood
cCD18 Canine CD18
CD18HYP Hypomorphic CD18 mouse model CD18KO Null CD18 mouse model
cDNA Complementary DNA
CFC Colony forming cell CFU Colony forming unit
CGD Chronic granulomatous disease
Chim Chimeric
CIEMAT Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas C-KIT CD117 tyrosine Kinase receptor
CLAD Canine leukocyte adhesion deficiency CMP Common myeloid progenitor
CMV Cytomegalovirus
cPPT Central polypurine tract
CR Complement receptor
CSF Colony stimulating factor
Ct Cycle threshold
CTS Central terminal sequences
CYT Cytoplasmic
C/EBP-α CCAAT/enhancer binding protein α
D
DAG Diacylglycerol
DAPI 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride
DC Dendritic cell
ddPCR Digital droplet PCR
dm Dimethylated
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium dsDNA Double-stranded DNA
E
EBMT European Bone Marrow Transplantation ECM Extracellular matrix
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EF1α Elongation factor 1 α
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EMA European Medicines Agency
ER Endoplasmic reticulum
ESAM Endothelial cell-selective adhesion molecule ESID European Society of Immunodeficiencies ETP Early thymic progenitor
EU European Union
F
FACS Fluorescence-activated cell sorting
FAM Fluorescein
FBS Fetal bovine serum
FcR Fc receptor
FDA Food and Drugs Administration
FELASA Federation for Laboratory Animal Science Associations FITC Fluorescein isothiocyanate
FLT-3 FMS-related tyrosine kinase 3
FSC Forward scatter
FV Foamyviral vector
G
G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor GEF Guanine nucleotide exchange factor
GEMM Granulocyte/ erythrocyte/ monocyte/ megakaryocyte
gDNA Genomic DNA
GM Granulocyte/ macrophage
GMRP Granulocyte/monocyte-restricted progenitor GMP Good Manufacturing Practice
GPCR G-protein-coupled receptor
GT Gene therapy
Gy Grays
H
Haplo Haploidentical donor HBS Hank's buffered saline
hCD18 Human CD18
hCD34 Human CD34
hCD45 Human CD45
HD Healthy donor
hEF1αS Short fragment of the human elongation factor 1 α HEPA High-efficiency particulate
HIV Human immunodeficiency virus
hIL Human interleukin
HLA Human leukocyte antigen
hPGK Human phosphoglycerate kinase HSC Hematopoietic stem cell
HSCT Hematopoietic stem cell transplant
LIST OF ABBREVIATIONS
HSPC Hematopoietic stem progenitor cell HVCN High vector copy number
I
iC3b Inactive complement component 3b ICAM Intercellular adhesion molecule
IL Interleukin
IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
IN Integrase
IP3 Inositol triphosphate IRB Institutional review board
J
JAM Junctional adhesion molecule
K
Kbp Kilobase pairs
L
LAC Leukocyte adhesion cascade LAD Leukocyte adhesion deficiency
LB LentiBOOST
LCL Lymphoblastic cell line
LEPR Leptin receptor
LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen 1 LMPP Lymphoid multipotent progenitor
LPS Lipopolysaccharide LSK Lin-SCA-1+C-KIT+
LTag Large T antigen
LT Long-term
LTR Long terminal repeat LV Lentiviral vector
LVCN Low vector copy number
M
MA Matrix
Mac-1 Macrophage-1 antigen
MADCAM Mucosal vascular addressin cell-adhesion molecule MEP Megakaryocyte/erythrocyte-restricted progenitor MFD Matched family donor
MFI Mean fluorescence intensity MIDAS Metal-ion-dependent adhesive site MLP Multi-lymphoid progenitor
MLV Murine leukemia virus
MMFD Mismatched family donor
MOI Multiplicity of infection mPB Mobilized peripheral blood mPGK Murine phosphoglycerate kinase MPP Multipotent progenitor
mpt Months post-transplant MRD Matched related donor
MSCV Murine stem cell virus MSD Matched sibling donor MSC Mesenchymal stromal cell MUD Matched unrelated donor
N
N Sample size
NC Nucleocapsid
NOD Nonobese diabetic
NK Natural Killer
O
O/N Overnight
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
ORF Open reading frame
P
PB Peripheral blood
PBS Phosphate-buffered saline
PE Phycoerythrin
PECAM-1 Platelet endothelial cell adhesion molecule 1 PGE2 Prostaglandin E2
PGK Phosphoglycerate kinase PI3K Phosphoinositide 3-kinase PIC Pre-integration complex PID Primary immunodeficiency PIP Phosphatidylinositol
PLC Phospholipase C
PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate PMN Polymorfonuclear
PR Protease
PS Protamine sulfate
PSGL P-selectin glycoprotein ligand
Ptprc Tyrosine phosphatase receptor type C P/S Penicillin/streptomycin
Q
qPCR Quantitative PCR
R
RAP-1 Ras-related protein 1
RCLs Replication competent lentiviruses
RD Royal Decree
REDIP Registro Español de Inmunodeficiencias Primarias rhFLT-3L Recombinant human FMS-like tyrosine kinase 3 ligand rhSCF Recombinant human Stem cell factor
rhTPO Recombinant human thrombopoietin RIAM-1 RAP-1 GTP-interacting adaptor molecule rmSCF Recombinant murine stem cell factor rpm Revolutions per minute
RPMI Roswell Park Memorial Institute
LIST OF ABBREVIATIONS
RN Recombinant fibronectin fragment rFN-CH-296 RRE Rev-response element
RT Reverse transcriptase
RV Retroviral vector
S
SA Splice acceptor site SAE Serious adverse event SCA-1 Stem cell antigen 1 SCF Stem cell factor
SCGM Stem Cell Growth Medium
SCID Severe combined immunodeficiency
SCID-X1 X-linked severe combined immunodeficiency SD Splice donor site
SECAL Spanish Society for the Laboratory Animal Science SEM Standard error of the mean
SFFV Spleen focus-forming virus
sICAM Soluble intercellular adhesion molecule SIN Self-inactivating
SPF Specific-pathogen-free
SRC Severe combined immunodeficiency repopulating cells
SSC Side scatter
ssRNA Single-stranded RNA
ST Short-term
SU Surface
SV40 Simian Vacuolating Virus 40
T
TB Trypan blue
TBI Total body irradiation TE Transduction enhancer
TM Transmembrane
TNF Tumor necrosis factor
TR Tandem repeats
TSS Transcription start sites
Ttn Titin
TU Transduction units
TxRd Texas red
U
UCOE Ubiquitous chromatin opening element UCLA University of California Los Angeles
UK United Kingdom
UNT Untransduced
US United States
V
VCAM Vascular cell adhesion molecule
VCN Vector copy number
VE-Cadherin Vascular endothelial cadherin VLA Very late antigen
Vp Viral particles
VSV-G G glycoprotein of the vesicular stomatitis virus vWFA Von Willebrand factor type A domain
W
w TEs With transduction enhancers w/o TEs Without transduction enhancers WAS Wiskott-Aldrich syndrome WBC White blood cell
WPRE Woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element
WPRE* Mutated woodchuck hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element
WT Wild type
X
X-CGD X-linked chronic granulomatous disease
“I put my heart and soul into my work, and I have lost my mind in the process”
Vincent van Gogh
Introduction
1. HEMATOPOIETIC SYSTEM
The hematopoietic system is the responsible for the formation and maintenance of blood and immune cell components2. Human hematopoietic organs include bone marrow (BM), thymus, spleen and lymphoid nodes.
Blood is composed of a heterogeneous group of cells that can be classified in two different lineages: lymphoid and myeloid. The first one plays an important role in the adaptive and innate immune response carried out by T, B and Natural Killer (NK) cells.
Granulocytes, monocytes, erythrocytes and megakaryocytes belong to the myeloid series, responsible for mediating innate immune responses, oxygen transport and hemostasis.
Hematopoiesis consists of a hierarchized system supported by the most primitive hematopoietic stem cells (HSCs), characterized by self-renewal ability as well as by differentiating capacity into different cell types (multipotency). HSCs mainly reside in the bone marrow in a dormant state with a very low division rate (once every 175-350 days in humans3-4 or every 30-50 days in mice5-6), but they can proliferate and give rise to mature blood cells2. Since differentiation is a continuous process in the hematopoietic system, a different number of intermediate cells play a role in this process. Committed progenitor cells have varying degrees of self-renewal and proliferation potential. These progenitors finally give rise to mature cells that have almost lost their self-renewal capacity and carry out the specific function of the myeloid or lymphoid lineages.
1.1. Hematopoietic stem cells in mice
Murine hematopoietic precursors can be identified by their reconstitution ability after transplantation into lethality-irradiated recipients. Based on this capacity, three different multipotent populations have been defined (Figure 1). The most primitive HSC is characterized by the lack of lineage cell surface marker (Lin) and the presence of high levels of stem cell antigen 1 (SCA-1) and CD117 tyrosine Kinase receptor (C-KIT). This phenotype, known as LSK (Lin- SCA-1+ C-KIT+), represents 0.05-0.1% of the total bone marrow population and is composed by different subsets of progenitors. Those cells with long-term repopulating ability and low division rate, called long-term (LT)-HSCs, and the fraction which has lost part of its self-renewal ability, the short-term (ST)-HSCs, are among these progenitor cells7-9. The last step in this hierarchical HSC structure is comprised by the multipotent progenitor (MPP) cells that no longer possess self-renewal ability, but keep differentiation potential to all lineages. It consists of a heterogeneous population difficult to classify by common cell surface markers. They are recognized as LSK CD34+ FLT-3+ cells although other additional markers can be used to better define their different subsets6, 10.