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ESTABLECIMIENTO DE UN MODELO DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL TUMORAL
CAROL STEFANY RODRÍGUEZ JIMÉNEZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D. C.
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ESTABLECIMIENTO DE UN MODELO DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL TUMORAL
CAROL STEFANY RODRÍGUEZ JIMÉNEZ
Proyecto de Trabajo de Grado para optar por el Título de Licenciado En Biología Modalidad Pasantía
Directora
MSc. CARMEN HELENA MORENO DURÁN Directora Externa
MSc. JOSEFA ANTONIA RODRÍGUEZ GARCÍA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTÁ D. C.
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NOTA DE ACEPTACIÓN
___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________
_________________________________ Director
_________________________________ Co-Director
________________________________ Evaluador
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NOTA ACLARATORIA
La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo debido a que estas hacen parte única y exclusivamente de sus autores.
5 CONTENIDO
RESUMEN ... 6
INTRODUCCIÓN ... 7
JUSTIFICACIÓN ... 9
MARCO TEÓRICO... 10
OBJETIVOS ... 13
METODOLOGÍA ... 14
RESULTADOS... 19
BIBLIOGRAFÍA ... 30
6 RESUMEN
El desarrollo de técnicas de cultivos celulares 3D ha empezado a ofrecer resultados promisorios para el campo de la investigación en la biología del cáncer en los últimos años, sin embargo, es necesario seguir experimentando con protocolos para células tumorales y analizar sus ventajas o falencias con nuevas líneas celulares y/o material extraído de biopsias de diferentes tipos de tumores para los cuales aún no se han estandarizado técnicas de cultivo de ninguna clase. Es por ello que este trabajo tuvo como objetivo establecer un modelo de cultivo tridimensional tumoral con la técnica de esferoides tumorales multicelulares (MTS por sus siglas en inglés) a partir de líneas celulares tumorales y biopsias de tumores de cáncer gástrico y de endometrio, estableciendo protocolos para su siembra y análisis. Los esferoides fueron sembrados a partir de la línea celular SiHa, partiendo de cultivos en monocapa que posteriormente fueron tripsinizados para establecer una concentración ideal que fue sembrada en pozos recubiertos con agarosa al 1%. Con los esferoides ya formados, se están realizando ensayos para realizar cortes que permitan observar la estructura interna de los mismos, los cuales aún siguen en fase análisis. Al finalizar el tiempo de trabajo se logró establecer el protocolo para la siembra de un cultivo celular tridimensional con la técnica de esferoide tumoral multicelular (MTS) a partir de la línea celular SiHa, así como también se espera sembrar dichos esferoides a partir de los cultivos primarios establecidos de células tumorales de cáncer gástrico y de endometrio. Con este protocolo se abre campo a nuevas investigaciones de silenciamiento génico y de penetración de virus en sistemas tumorales más complejos.
7 INTRODUCCIÓN
En la actualidad los cultivos celulares son de gran importancia para muchas áreas de investigación científica dadas las ventajas que ofrece para la realización de estudios en tejidos animales, remontándose a comienzos del siglo XX (Calvo Garcia, 2013) cuando fueron realizados los primeros montajes con la idea de estudiar el comportamiento de las células animales en un sistema controlado, cuyas variables no hubieran podido ser registradas en sistemas in vivo (Freshney, 2007). El avance del sistema se fue dando a medida que se iban superando los obstáculos encontrados a nivel de asepsia, estandarización de medios de cultivo para células específicas y la eliminación y control de los múltiples contaminantes que dificultaban el avance de las investigaciones con dichas técnicas nacientes (Calvo Garcia, 2013).
Una de las técnicas más usadas a nivel mundial es el cultivo celular en dos dimensiones, el cual, a pesar de presentar una cantidad de ventajas con respecto al estudio de comportamiento, migración y proliferación celular, también presenta la gran desventaja de estar desligada de los procesos externos que desarrollan las células en los tejidos in vivo, lo cual puede arrojar resultados sesgados a la hora de hacer cualquier tipo de pruebas, ya que no se toma en consideración la interacción entre las células y su matriz extracelular, ni los complejos procesos que pueden influir en la respuesta a diferentes tratamientos o que podrían afectar la producción de factores de crecimiento y señalización.
Como respuesta a estas desventajas e imprecisiones del cultivo celular en dos dimensiones, han nacido las técnicas innovadoras de cultivo celular tridimensional las cuales centran su teoría en la importancia de la interacción celular y su capacidad de señalización recíproca en cualquier proceso a observar (Freshney, 2007).
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9 JUSTIFICACIÓN
Es bien aceptado el hecho de que los cultivos de células tumorales sembrados en monocapa emulan pobremente el microambiente de un tumor sólido. Más del 90% de las drogas y las terapias exitosamente probadas en estudios preclínicos in vitro en cultivos 2D no alcanzan a tener la eficacia deseada ni los márgenes de seguridad necesarios y requeridos para realizar las pruebas clínicas (Shin, Kwak, Han, & Park, 2013).
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MARCO TEÓRICO
CULTIVO CELULAR 3D: ESFEROIDES
Desde décadas atrás, la investigación en biología del cáncer ha venido estudiando la heterogeneidad de tumores sólidos in vitro desarrollando cultivos en tres dimensiones, dadas sus ventajas frente a los estudios realizados en cultivos 2D y su característica de emular más precisamente ambientes in vivo. Entre los cultivos celulares tridimensionales más usados se encuentran los esferoides tumorales multicelulares (MTS) los cuales son un modelo tridimensional de complejidad intermedia entre el cultivo en monocapa y el tumor sólido, que como se había mencionado antes, refleja mejor el comportamiento del tumor in vivo (Finocchiaro et al., 2004). Los MTS han servido como modelo para una variedad de aproximaciones terapéuticas experimentales y para estudios básicos en la regulación microambiental de la proliferación celular, energía y metabolismo de los nutrientes, invasión e interacción entre las células y la matriz extracelular. Numerosos estudios demuestran que los MTS semejan muchas características de sitios tumorales avasculares, regiones intervasculares de tumores sólidos o micrometástasis, con respecto a la cinética del crecimiento y el microambiente tumoral, por ejemplo, el suministro de nutrientes y oxígeno, el patrón de metabolitos y catabolitos, la distribución del pH y la composición de la matriz extracelular. (Gottfried, Kunz-Schughart, Andreesen, & Kreutz, 2006)
11 Estructura
En la formación inicial de esferoides las células tumorales deben interactuar entre ellas directamente o a través de puentes de matriz extracelular, los cuales interconectan las células dentro de los esferoides. La agregación de células cancerosas en esferoides puede estar mediada además por una gran variedad de mecanismos de adhesión celular tales como la unión entre integrinas, fibronectina y colágeno, y la unión célula-célula mediante asociaciones de cadherina. (Sodek, Murphy, Brown, & Ringuette, 2012).
El centro del esferoide es una zona de hipoxia donde predominan células necróticas/apoptóticas, en la zona intermedia predominan células quiescentes y en la periferia células en división activa. Las zonas de hipoxia pueden desarrollarse en un diámetro de 400µm dependiendo del tamaño del esferoide y de la actividad metabólica de las células cancerosas y reflejan claramente cómo, en cáncer, la glicólisis es la ruta principal para generar su energía. Pese a que los esferoides carecen de interacciones con otras células del carcinoma y no tienen la capacidad de inducir angiogénesis, tienen una compleja red interna organizada que incluye interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, en la cual, cada célula tiene diferentes condiciones de espacio, disponibilidad de nutrientes, oxígeno y exposición a otros tipos de estrés físico y químico, semejando más adecuadamente el tumor (Alépée, Bahinski, Daneshian, Wever, & Fritsche, 2014; Kawano, Kantak, Murai, Yao, & Kramer, 2001; Santini, Rainaldi, & Indovina, 2000)
Crecimiento
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Cuando están en crecimiento, los esferoides despliegan un gradiente de células en proliferación de las capas externas con células quiescentes localizadas en el centro. Cuando las células centrales son privadas de oxígeno y glucosa, mueren y forman la zona necrótica. Esta heterogeneidad celular es similar a la que se encuentra en las microregiones avasculares de los tumores (Sutherland, 1988).
Beneficios y usos
13 OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Establecer un modelo de cultivo tridimensional tumoral (MTS) a partir de la línea celular SiHa de cáncer de cuello uterino y de biopsias de tumores de pacientes con diferentes tipos de cáncer.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.1.1 Establecer cultivos celulares primarios a partir de biopsias de pacientes con cáncer. 1.1.2 Desarrollar una metodología óptima para el cultivo de esferoides tumorales a partir de líneas celulares tumorales y de biopsias de pacientes con cáncer.
14 METODOLOGÍA REQUISITOS EXIGIDOS PARA INICIAR LA PASANTÍA
Curso de buenas prácticas clínicas: Se realizó este curso de 14 horas en línea, en el que se abordaron temas de historia, leyes y protocolos de las buenas prácticas clínicas, así como también el trato con los pacientes y el tratamiento de los datos y su confidencialidad. (Certificado Anexo 1)
Curso de Inducción: Con una duración de 5 horas, este curso comprendió temas de bioseguridad, salud ocupacional, manejo de residuos y lineamientos para el trato con pacientes. El curso fue realizado el día 3 de octubre.
1. Cultivos celulares (medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino)
1.1 Cultivo primario en monocapa a partir de líneas celulares
Usando la línea celular SiHa (Células de tejido canceroso cervical positivas para HPV-16), se siembran cajas de 75cm2 con medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino. Al alcanzar la confluencia, se les tripsiniza y se abren en segundas cajas para mantener el cultivo.
1.1.1. Descongelamiento
15 1.1.2. Tripsinización
Cuando las células han alcanzado un 80% o más de confluencia, se realiza un pase de células a una nueva caja. Se inicia retirando todo el medio de la caja de cultivo. Posteriormente, se lavan las células con PBS para retirar cualquier residuo de medio y se agregan de 1 a 1.5ml de Tripsina al 0.5% y se incuban a 37°C por 2 minutos y se golpea la caja firmemente. A continuación, se agregan 3ml de medio DMEM+SFB10% para inactivar la tripsina y se homogeniza con un pipeteador. La suspensión celular se transfiere a un tubo falcon, se centrifuga a 1500rpm por 7 minutos, se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 8 ml de DMEM+SFB10% para transferirlo a cajas de 75cm2. Las cajas se incuban a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO2 en aire.
1.2 Cultivo primario en monocapa a partir de biopsia
Los cultivos primarios se establecen a partir de biopsias de pacientes con diferentes tipos de cáncer. Las biopsias se lavan con medio RPMI 1640 para remover sangre contaminante, se retira el tejido adiposo o necrótico con un bisturí y la biopsia se corta en fragmentos de 1-2 mm3 y se incuba a 37°C por 1-2 h en medio RPMI con 0.5 mg/ml de colagenasa II (Sigma). La suspensión celular se filtra con una membrana de nylon con tamaño de poro de 100µm (Sigma).
16 1.3 Cultivo de MTS
1.3.1. Recubrimiento de pozos con agarosa
Se prepara un recubrimiento para los pozos con el fin de que las células no se adhieran al material plástico del fondo de los pozos. Se prepara el recubrimiento agregando 0,5 g de agarosa a 50 ml de DMEM sin suplementar. La mezcla se esteriliza en autoclave a 121°C y 15lb de presión por 15 minutos. Posteriormente, los 8 pozos centrales de una caja de cultivo celular de 24 pozos, se cubren con 0,5ml de medio de cultivo con agarosa al 1% y se deja gelificar. Para iniciar el cultivo de MTS a partir de líneas celulares, se usan células desprendidas de una caja de cultivo de 75cm2 en confluencia con el mismo protocolo de tripsinización.
1.3.2. Recuento celular
El precipitado celular se resuspende en 1ml de medio DMEM+SFB10%. Se toman 10µl de la suspensión y se mezcla con 10µl de azul de tripan. A continuación, se ponen 10µl de la nueva suspensión en la cámara de Neubauer y se realiza el recuento siguiendo los cálculos de la cámara.
𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ∗ 10000 𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 1𝑚𝑙
1.3.3. Determinación de la concentración celular ideal
Se siembran diferentes concentraciones celulares, partiendo de una concentración estándar de 3,72 x 104 células por pozo (siguiendo protocolo Freshney, 2007). Se ensayan 6 concentraciones diferentes, haciendo dilución de 1:1 en cajas de 24 pozos previamente recubiertas con medio DMEM más agarosa al 1%, con el fin de no permitir que las células se adhieran al fondo del pozo y permitirles que se agreguen libremente. Se realiza el seguimiento del crecimiento de los esferoides mediante un registro fotográfico.
1.3.4. Siembra de esferoides
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deshidratación y posibles contaminaciones del cultivo, se adicionan 500 µl de PBS en los pozos exteriores. Una o dos veces por semana se agregan 300 µl de medio muy suavemente de manera que resbale por las paredes del pozo para asegurar que el esferoide no se disgregue. En caso de tener un medio muy metabolizado se procede a retirar cuidadosamente una parte del mismo con una pipeta.
1.3.5 Seguimiento
Para verificar el crecimiento y agregación de las células, se observan periódicamente en el microscopio invertido, y por medio del dispositivo CytoSmart® proporcionado por la empresa Gen Products, se realiza un seguimiento preciso minuto a minuto. El software del dispositivo permite tener un registro en vídeo de la formación de los esferoides.
1.4. Análisis
Una vez que los MTS alcanzan un tamaño aproximado de 1mm de diámetro, se realizan varios ensayos para el montaje de los cortes en láminas y hacer el análisis de su estructura interna.
Ensayo 1: Se retira el esferoide del pozo cuidadosamente succionándolo con una pipeta pasteur y se coloca sobre una capa de Tissue-tek® en la placa de corte del criostato. Se coloca una segunda capa de Tissue-tek® y se procede a realizar cortes de 3µm de diámetro. Estos cortes son fijados con isopropanol y teñidos con hematoxilina & eosina.
Ensayo 2: Se agregan 10µl de azul de metileno al pozo que contiene el esferoide y se dejan en tinción por 15 min. Posteriormente se retira el esferoide del pozo cuidadosamente succionándolo con una pipeta pasteur y se coloca sobre una capa de Tissue-tek® en la placa de corte del criostato. Se coloca una segunda capa de Tissue-tek® y se procede a realizar cortes de 3µm de diámetro. Estos cortes son fijados con isopropanol y teñidos con hematoxilina & eosina.
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cortes de 3µm de diámetro. Estos cortes son fijados con isopropanol y teñidos con hematoxilina & eosina.
Ensayo 4: Se retira el medio del pozo cuidadosamente sin succionar el esferoide y se fija con formol. Después de 24 horas, se procesan para embeberlos en parafina y realizar los cortes en el micrótomo.
19 RESULTADOS MTS A PARTIR DE LA LÍNEA CELULAR SiHa
Los MTS en pozos se analizaron mediante la medición regular de su diámetro (2-3 veces por semana) usando seguimiento fotográfico por dos semanas (Fig 1 - 4), para determinar cuál de las concentraciones es la que mejor se agrega y determinar si, con el método implementado, los esferoides estarían proliferando o solo agregándose. La evidencia fue tomada los días 15,18, 21 y 23 de noviembre. Las fotos fueron tomadas en un microscopio óptico en aumento de 4x con una cámara de 13MP.
Al hacer el seguimiento fotográfico, es evidente que los esferoides no solo se agregan al pasar un par de días de sembrados, sino que también empiezan a proliferar y a aumentar su tamaño. Estos pozos fueron mantenidos por un mes después del último registro fotográfico y allí se pudo evidenciar que en el de menor concentración (pozo 6) las células seguían proliferando y agregándose después de 6 semanas (Ver video enlace anexo 2).
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Para evidenciar el movimiento de las células agregándose, se usó el equipo CytoMate® con el software CytoSmart® proporcionado por la empresa Gen Products (Fig. 5), con el cual fue posible llevar registro minuto a minuto de varios esferoides, tanto para los primeros minutos en que se agregaban las células, como también en viejos esferoides que después de un mes seguían proliferando agregándose (Video enlace anexo 2 y 3).
Al tener la concentración ideal para la siembra de los MTS, se inicia la siembra en masa para hacer los cortes y el análisis de los mismos. Se siembran todos los esferoides con una concentración estándar de 9,30 x 103 células por pozo y al cabo de una semana se obtienen los esferoides agregados que se pueden observar a simple vista (Fig. 7). Estos son examinados con microscopio invertido en aumento de 10x (Fig. 8) con el fin de revisar la compactación de las células.
Además del registro fotográfico con el que se hizo seguimiento a los esferoides, se verificó la viabilidad de los mismos sembrando un esferoide de cada caja de 24 pozos en una caja de cultivo de 25cm2 (Fig. 9). A partir de esta prueba se inician los ensayos para realizar los cortes.
Ensayo 1: Los esferoides, al ser de un color parecido al del Tissue-tek® congelado, se confunden y no es posible determinar donde iniciar la realización los cortes, ya que no se logra diferenciar el lugar en donde se encuentra el esferoide.
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Ensayo 3: La tinción con azul de Evans, en la misma proporción de 10µl por 15 min en cada pozo, da mejores resultados y los esferoides quedan compactos y fáciles de transportar, por lo cual son transferidos con éxito al Tissue-tek®. En esta oportunidad no es posible realizar los cortes por problemas de mantenimiento del criostato, por lo cual, a pesar de tener el esferoide embebido en el Tissue-tek®, debe ser descartado.
Ensayo 4 y 5: Estos ensayos aún están en proceso. Para el ensayo 4, los esferoides fueron fijados en formol, teñidos con azul de evans y embebidos en parafina, y aún está pendiente la realización de los cortes. Para el ensayo 5 los esferoides ya han sido sembrados y se espera embeberlos en agarosa tan pronto alcancen su tamaño ideal.
CULTIVOS PRIMARIOS
Para iniciar el crecimiento de los esferoides a partir de cultivos primarios, se tomaron células congeladas obtenidas de biopsias de cáncer gástrico y cáncer de endometrio en pase I. Se inició el cultivo en monocapa siguiendo el protocolo establecido. Actualmente el cultivo empieza a mostrar avances y aún está pendiente la siembra de los esferoides, pues los cultivos aun no alcanzan la confluencia necesaria.
Fig.1 Registro fotográfico pozos #1 y #2: En los pozos 1 y 2 se sembraron concentraciones
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ensayos para la concentración ideal, ya que su protocolo estaba determinado para iniciar los esferoides en cajas de cultivo de 25cm2 y después ser transferidos a pozos.
Fig. 2: Registro fotográfico pozos #2 y #3: En el último de los pozos #2 (arriba izquierda) se
evidencia la presencia de la capa delgada de células fuera del esferoide fuera de foco, pero al mirar los pozos #3 con la concentración ideal de células de 9,30x104 células por pozo, se nota como dicha capa no aparece.
Fig. 3: Registro fotográfico pozos #4: Sólo dos de los pozos #4, con concentración de 4,65
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Fig. 4: Registro fotográfico pozos #5 y #6: A pesar de que la concentración de 3,72 x 103 células por pozo, sembrada en los pozos #5, muestra una compactación óptima en dos de los pozos (izquierda) no alcanza un tamaño ideal en el término de dos semanas para realizar ensayos con los cortes. Estos esferoides fueron usados para los ensayos al alcanzar un mes y medio de sembrados, por lo cual se concluye que no es una concentración adecuada por su largo tiempo de crecimiento. En los pozos #6 solo hubo uno que se agregó y proliferó, aunque el registro fotográfico no se incluye en esta figura por calidad de la imagen, sin embargo, en los otros 3 pozos con concentración de 2,42 x 103 células por pozo no se obtuvieron resultados promisorios como se puede observar en la imagen (abajo derecha).
Fig. 5 Derecha: Equipo CytoSmart® Lux; Izquierda: CytoMate® Software. Tomado de
www.cytosmart.com – El equipo es versátil e ideal para la ubicación en la incubadora. Fue
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estar conectado a una red de WiFi para enviar los datos, por lo cual no fue posible hacer un registro de más de un día. (Enlace para los videos en anexo 2 y 3).
Fig. 6 Capa delgada de células no agregadas al esferoide en pozos #1 y #2: Al observar los
esferoides en microscopio óptico se podía enfocar fácilmente esta capa de células no agregada, la cual proliferaba al igual que el esferoide.
Fig.7 Esferoides formados después de una semana: En la imagen se pueden observar los
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Fig. 8 Esferoides formados. Arriba: Aumento 10x Abajo: Aumento 40x: Al observar los esferoides en el microscopio invertido se pudo tener más detalle de su formación, a pesar de que la imagen se vuelve difícil de enfocar por su tridimensionalidad.
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Fig. 10 Proceso de corte en el criostato: En la imagen se puede apreciar el proceso de corte
de la placa de Tissue-tek® (izquierda) y como este se adhiere a la lámina portaobjetos (derecha).
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28 CONCLUSIONES
Se desarrolló una técnica eficiente y efectiva de cultivo de esferoides tumorales provenientes de líneas celulares, los cuales pueden obtenerse en un lapso menor a dos semanas y pueden ser usados en múltiples estudios de respuesta a diferentes tratamientos del cáncer con terapias de silenciamiento y expresión génica. Los esferoides tumorales son una técnica de cultivo celular de amplia versatilidad en el campo de la investigación en biología del cáncer, gracias a su particularidad de ser la fase intermedia entre los cultivos en monocapa y los modelos in vivo. Sin embargo, para obtener esferoides de cultivos primarios se necesita un mayor tiempo para que el cultivo en monocapa alcance la confluencia y se puedan sembrar los esferoides exitosamente.
Es importante tener en cuenta que a pesar de que es posible generar una estructura tridimensional a partir de un cultivo de células, el MTS es un agregado celular muy frágil y se requiere de gran cuidado y experticia para la estandarización de un protocolo adecuado para la realización de los cortes necesarios y así llevar a cabo los análisis.
RECOMENDACIONES
Muchos de los obstáculos para el desarrollo completo de la pasantía se debieron al corto tiempo que se tuvo para desarrollar los protocolos, por lo cual se recomienda desarrollar estas técnicas en trabajos de investigación que tengan un mayor lapso de tiempo para su ejecución y análisis.
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AGRADECIMIENTOS
30 BIBLIOGRAFÍA
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33 ANEXOS Anexo 1: Certificado buenas prácticas clínicas
https://drive.google.com/open?id=0B7X1ZxOf5b8AUGktel9iaU85aWs
Anexo 2: Esferoide después de un mes de sembrado aun agregándose https://drive.google.com/open?id=0B7X1ZxOf5b8AUHFhMHpQTEJ1V2s
Anexo 3: Primera etapa de agregación de las células tumorales
