ESTUDIO IN VITRO DE LAS PROPIEDADES
ANTIINFLAMATORIAS
Y ANTIOXIDATIVAS DE HERBETOM-PM
UNIVERSIDADE DE
SANTIAGO DE COMPOSTELA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOXÍA
E. Vigo, A. Cepeda, O. Gualillo, R. Pérez-Fernández.
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Trabajo subvencionado por un Proyecto de I+D 2000/CE535 (Universidad de Santiago de Compostela-Bioserum Laboratorios, S.L.)
ESTUDIO IN VITRO DE LAS PROPIEDADES
ANTIINFLAMATORIAS Y ANTIOXIDATIVAS
DE HERBETOM-PM
E. Vigo, A. Cepeda, O. Gualillo, R. Pérez-Fernández
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, FACULTAD DE MEDICINA, UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA.
Trabajo subvencionado por un Proyecto de I+D 2000/CE535 (Univer-sidad de Santiago de Compostela-Bioserum Laboratorios, S.L.)
INTRODUCCIÓN
La inflamación es un proceso complejo que se caracteriza, entre otros factores, por la pre-sencia de ciertos mediadores, incluyendo dentro de éstos al óxido nítrico.
El óxido nítrico (NO) es un gas biológicamente activo cuyas acciones, dependiendo de la magnitud y duración de su síntesis por las células, pueden agruparse en dos tipos: a) Las que están implicadas en la regulación de procesos fisiológicos. Estas acciones están
mediadas por pulsos de pequeñas cantidades de NO, que actúa como un mensajero in-tracelular lábil (como por ejemplo sobre el tono vascular, agregación plaquetaria, res-puesta inmune o neurotransmisión central o periférica).
b) Acciones implicadas en procesos patológicos (como en células inflamadas o células tu-morales), en las cuales el NO sintetizado de forma sostenida en elevadas concentracio-nes, posee propiedades citotóxicas relacionadas con la capacidad de esas células para eliminar bacterias, virus o protozoos. Aunque esta última acción es un mecanismo de-fensivo muy importante, puede producirse también una acción lesiva en los tejidos y por tanto estar implicada en la patogénesis de algunas enfermedades inflamatorias agudas o crónicas.
El NO es sintetizado a partir del aminoácido L-arginina por las enzimas óxido nítrico sin-tasas (NOS). Existen tres tipos de NOS, que se clasifican dependiendo del lugar donde son sintetizadas:
1. En células endoteliales, eNOS. 2. En neuronas, nNOS.
3. Un tercer tipo, detectada originariamente en macrófagos, con la característica de ser inducible, la iNOS.
Las dos primeras formas se sintetizan constitutivamente en los lugares mencionados, dando lugar a una baja producción de NO, y cuyo mecanismo de acción está básicamente mediado por agonistas que elevan el calcio intracelular, y este incremento de Ca2+
au-menta la unión de la calmodulina a la NOS, lo que provoca una activación transitoria de la enzima con síntesis de cantidades picomolares (10-12M) de NO. La activación de la iNOS,
en contraste, es a nivel transcripcional. Los macrófagos, células prototípicas de la iNOS, co-mienzan a producir NO varias horas después de la estimulación con, por ejemplo, citoqui-nas (Interferón-g). Después de la transcripción del gen y la expresión de la proteína, los macrófagos activados producen cantidades nanomolares (10-9 M) de NO durante días,
hasta que la enzima es degradada por proteolisis. La regulación de la expresión del gen de iNOS es dependiente de la unión de factores de transcripción a su región promotora. Esta región promotora contiene secuencias consenso para el factor nuclear-κB (NF-κB) y elementos de respuesta para el Interferón-g o para el TNF. La administración de lipopoli-sacárido bacteriano (LPS) induce la unión de NF-κB a la región promotora del gen de iNOS. La modulación de la actividad de NF-κB afecta por tanto a la inducción de iNOS. Así, los corticoesteroides, como la dexametasona (DXM) disminuyen la expresión del gen de iNOS, y por tanto la producción de NO al disminuir la unión de NF-κB al promotor de iNOS. Los antiinflamatorios no esteroideos parece ser que disminuyen también la expresión de iNOS al interferir con la actividad de NF-κB.
El NO puede actuar también como un radical reactivo de forma directa o por interacción con aniones superóxido, producidos en el lugar de la inflamación, formando peroxinitri-tos. El peroxinitrito es un oxidante muy potente que promueve peroxidación lipídica y ac-ciones citolíticas, y puede degradarse y formar radicales hidroxílicos altamente citotóxicos. La formación de peroxinitritos ha sido detectada en zonas inflamatorias, tanto en mode-los animales como humanos.
A nivel clínico, ha sido demostrado que pacientes con asma bronquial presentan elevadas concentraciones de NO en aire expirado, que disminuyen hacia valores normales tras el tratamiento con antiinflamatorios de tipo esteroideo administrados por vía oral o inhala-dos. Este incremento en los niveles de NO se ha observado también en niños con asma. La Sociedad Respiratoria Europea ha recomendado la medición de NO expirado y nasal en pacientes con asma. También se han encontrado elevadas concentraciones de metabolitos de NO en esputo de pacientes con asma, que se correlacionan con otros marcadores del grado de severidad del asma, tal como porcentaje de eosinófilos, la concentración de pro-teína catiónica de eosinófilos, o el grado de obstrucción del flujo aéreo. Además, los ma-crófagos expresan iNOS y producen NO por un mecanismo mediado por IgE, lo que apoya el papel del NO en la patogénesis de la inflamación asmática.
El uso de fármacos antiinflamatorios (sobre todo de tipo no-esteroideo) es el principal tra-tamiento de las enfermedades con un componente inflamatorio, a pesar de sus efectos se-cundarios a nivel renal y gástrico. Sin embargo, desde hace siglos, algunas culturas han uti-lizado plantas que contienen salicilatos para el tratamiento de signos inflamatorios, lo que ha llevado a la búsqueda de compuestos naturales con actividad antiinflamatoria. El presente trabajo lo hemos enfocado hacia el estudio de las propiedades antiinflamato-rias de un jarabe, Herbetom-PM de Bioserum Laboratorios, S.L., compuesto por extractos de plantas medicinales, e indicado para patología respiratoria (como asma y bronquitis). Para ello, en una línea celular de macrófagos de ratón (J774A.1) inducimos liberación de NO tras estímulo con LPS e interferón gamma y administramos dosis crecientes de Herbe-tom-PM (o antiinflamatorios utilizados como control positivo, o componentes individua-les del jarabe: pino, eucalipto, tomillo o llantén) y valoramos:
A) Inhibición de la liberación de NO. B) Vitalidad celular (efecto citotóxico).
C) Evaluación de la capacidad neutralizante de la formación de radicales libres.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos
El Jarabe Herbetom-PM fue suministrado por Bioserum Laboratorios, S.L., y consiste en una mezcla de extractos secos de diversas plantas medicinales.
Los fármacos antiinflamatorios esteroideos (dexametasona, DMX) y no esteroideos (Ibu-profeno e indometacina ) fueron suministrados por Sigma, USA.
Los plantas medicinales (pino, eucalipto, tomillo y llantén) que forman parte de la com-posición del jarabe fueron suministradas por Bioserum Laboratorios, S.L en forma de ex-tracto seco disolviéndose en agua y etanol al 5% para su utilización en los cultivos celula-res. La concentración utilizada fue de 1.68 mg/ ml.
Cultivos celulares, estimulación de macrófagos con LPS e Interferón-g y tratamientos
La línea celular de macrófagos de ratón (J774A.1) que presenta la característica de poseer iNOS, y por tanto sintetizar NO en respuesta a determinados estímulos, se obtuvo del ECACC (European Collection of Cell Cultures, Reino Unido). Estas células se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DEMEM) con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-gluta-mina, 100 U/ml penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 130 mg/ml de piruvato de sodio, a 37 ºC en una atmósfera de 5% CO2. Para la inducción de NO, las células se trataron con
endotoxina bacteriana (LPS, Sigma, USA) e Interferón-g (IFN, Sigma, USA) a dosis de 1 mg/ml y 15 ng/ml, respectivamente. La administración de Herbetom-PM (HB) fue realizada a dosis crecientes (1-100 ml). La DXM, indometacina e ibuprofeno fueron administradas a dosis estándar (0.001-0.01-0.1-1 mM; 0.01-0.1-0.25 mM y 0.1-0.5-1 mM, respectivamente).
Determinación de la concentración de los metabolitos de NO (nitritos y nitratos).
Para los experimentos de cultivos celulares, se utilizaron placas de cultivo con 24 micro-pocillos y las células fueron sembradas a una densidad de 1x105 células/pocillo. Para la
cuantificación de NO en los cultivos celulares, tras la administración del estímulo y de los tratamientos, se tomaron 100 ml del medio, se añadió igual cantidad de reactivo de Griess y se incubaron las muestras 10 min. a temperatura ambiente, midiéndose la absorbancia a 540 nm. El cálculo de la concentración de nitritos se hace en relación a un patrón de ni-trito sódico.
Ensayo MTT para la valoración de la vitalidad celular
La vitalidad celular se determina por el método de reducción del MTT (MTT, Boehringer Mannheim, Alemania), basado en un ensayo colorimétrico. Las células (a una densidad de 1000 células/pocillo) son incubadas con o sin LPS+ IFN y con dosis crecientes de los distin-tos tratamiendistin-tos, a 37ºC en atmósfera de CO2durante 24 horas y se les administran 10 ml
de la solución de MTT. Tras incubación durante 4 h a 37ºC, los cristales de sal de forma-zano presentes en las células viables se solubilizan con un tampón de lisis y se determina la absorbancia a 540 nm de cada pocillo. La absorbancia de las muestras tratadas compa-rada con el valor del control no estimulado (100% de vitalidad) proporciona el índice de vitalidad de las células.
Efecto Scavenger (determinación de la formación de radicales libres)
Se utiliza el PAPA-NONOato (Sigma, USA) como donante de NO. Este producto es un com-plejo hidrosoluble capaz de disociarse en aminas libres y radicales NO. El NO donante (20 mM) disuelto en suero que contiene PBS (pH 7.68) se incuba a 37ºC durante 3 h en pre-sencia de concentraciones crecientes de los distintos tratamientos. La concentración de ni-tritos se determinará por el método de Griess descrito previamente.
RESULTADOS
1. Efecto de la estimulación con LPS e Interferón-g (IFN) sobre la liberación de NO en la línea celular J774A.1.
La administración de LPS (dosis de 1 mg/ml) o IFN (dosis de 10 ng/ml) no induce liberación de NO. Sin embargo, cuando se administran conjuntamente, se produce una significativa respuesta en la liberación de NO, cuantificado en forma de nitritos. La dosis utilizada en todos los experimentos la establecimos en 1 mg/ml de LPS + 15 ng/ml de IFN.
2. Efecto del Herbetom-PM y de antiinflamatorios esteroideos (dexametasona, DMX) y no esteroideos (Indometacina e Ibuprofeno) sobre la liberación de NO en la línea celular J774A.
Tanto la administración de Herbetom-PM 5 horas antes del estímulo con LPS+IFN, como la administración conjunta de jarabe y LPS+IFN, como la administración de HB 24 horas post-estimulación celular, provoca un significativo descenso (dosis-dependiente) de la concen-tración de NO, respecto a las células no tratadas con HB. La adminisconcen-tración de DXM 5 ho-ras antes de la estimulación de las células con LPS+IFN disminuye, de forma dosis dependiente la liberación de NO. El mismo efecto es observado cuando el fármaco utili-zado es la indometacina o el ibuprofeno (Fig.1).
Fig. 1. – Efecto (%) de la administración de Herbetom-PM, dexametasona, ibuprofeno e indometacina so-bre la inhibición de la liberación de NO en células J774A.1. La leyenda 1, 2 y 3 representan dosis crecientes de los fármacos utilizados.
3. Efecto de la administración individual o simultánea de distintos componentes del Ja-rabe (Pino, eucalipto, tomillo y llantén) sobre la liberación de NO en la línea celular J774A.1.
1.Cultivo de macrófagos-células control.
2. Deterioro del cultivo de macrófagos tras estimulación inflamatoria a las 24 horas.
3. Mayor deterioro del cultivo de macrófagos tras estimulación inflamatoria a las 48 horas.
4. Inhibición del proceso inflamatorio tras la administración de HERBETOM 2 PM.
Células J774.1 control. Células J774.1 tratadas con lipopolisacárido
(LPS) + interferón γ(IFN) 24 h.
Células J774.1 tratadas con LPS + IFN 48 h. Células J774.1 tratadas con LPS + IFN
+ Herbetom 2 PM.
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El tratamiento de la células con extracto de pino, o de eucalipto, o de tomillo o de llantén (a dosis de 1.6 µg/µl de cada uno de los compuestos) previo a la estimulación con LPS+IFN, provoca una inhibición dosis-dependiente de la liberación de NO. Cuando se administran simultáneamente 2 extractos, se observa una mayor inhibición de la liberación de NO que al administrar 1 solo extracto. Lo mismo sucede cuando el tratamiento se realiza con 3 ex-tractos (Figura 2).
Fig. 2. – Inhibición de NO (%) tras la administración de extracto de Pino (P). Cuando se administran 2 o más extractos simultáneamente (LL, Llantén y E, Eucalipto) se observa una potenciación de la inhibición de NO.
4. Valoración de la vitalidad celular en la línea celular J774A.1 tras la administración de Herbetom-PM, y de antiinflamatorios esteroideos (DXM) y no esteroideos (Ibuprofeno e Indometacina).
La administración de jarabe induce un significativo incremento dosis-dependiente de la vi-talidad celular en las células tratadas con jarabe respecto a las células no tratadas. Cuando las células son estimuladas con LPS+IFN se observa un efecto citotóxico, que se revierte tras la administración de jarabe. Tras la administración de dexametasona a dosis crecientes (0.01 µM-1 µM) observamos una disminución significativa de la vitalidad celular. Este efecto citotóxico es producido también tras el tratamiento de las células con ibuprofeno a dosis de 0.1 mM, 0.5 µM y 1 µM. El tratamiento con indometacina no modifica la vitali-dad celular de forma significativa (Figura 3).
Fig. 3. – Efecto de la administración de Herbetom-PM, Dexametasona, Indometacina e Ibuprofeno a dosis crecientes sobre la vitalidad celular (MTT).
5. Valoración de la vitalidad celular en la línea celular J774A.1 tras la administración de componentes del jarabe.
Tanto la administración de extracto de eucalipto, tomillo o llantén, no disminuye o se in-crementa la vitalidad celular. El tratamiento con extracto de pino provoca un efecto cito-tóxico a dosis superiores a 33 µg.
6. Estudio de la actividad inhibidora de la formación de radicales libres del Herbetom-PM, y de componentes del jarabe en la línea celular J774A.1 (Efecto Scavenger).
Tanto el tratamiento de las células con HB a dosis crecientes (5-100 ml) como la adminis-tración del extracto de eucalipto, extracto de pino, extracto de tomillo o extracto de llan-tén, inducen una significativa disminución de la formación de radicales libres respecto a las células control (no tratadas). La administración del jarabe a dosis equivalente a la ad-ministración de los extractos de forma individual, es más efectiva en la disminución de ra-dicales libres (Figura 4).
Fig. 4. – Efecto de la administración de Herbetom-PM o de extractos de plantas de los que está compuesto sobre la inhibición en la formación de radicales libres. (Efecto Scavenger). Se observa una mayor inhibición al administrar el jarabe que la administración de los principios por separado.
CONCLUSIONES
En el modelo de inducción de NO tras la administración de lipopolisacárido bacteriano (LPS) + Interferón-g en la línea celular de macrófagos de ratón, J774A.1, la administración de Herbetom-PM inhibe de forma significativa la producción de nitritos, lo que parece in-dicar una clara acción antiinflamatoria del jarabe. Sin embargo, al contrario que dexame-tasona e ibuprofeno que también poseen una acción inhibitoria sobre la producción de NO, pero poseen un efecto citotóxico sobre las células, Herbetom-PM incrementa de forma dosis-dependiente la vitalidad celular.
La inhibición de la generación de NO por Herbetom-PM, creemos que es debida a un efecto “scavenging” o atrapador de radicales NO. Así, se produce una disminución de
ra-dicales libres liberados a partir del PAPA NONOato tras la administración del jarabe. El PAPA NONOato es capaz de disociarse de forma espontánea en aminas libres y radicales NO. Una molécula de PAPA NONOato genera dos moléculas de NO. Dado que es bien co-nocido el potente efecto citotóxico de los radicales libres (tal como los peroxinitritos, ONOO–, formados a partir de la interacción de superóxido con NO), la administración de Herbetom-PM en macrófagos activados probablemente ejerce su acción antiinflamatoria a través de un efecto inhibidor en la formación de radicales libres.
La inhibición en la formación de NO tras el tratamiento de las células con distintos com-ponentes del jarabe, como extracto de pino, extracto de eucalipto, extracto de tomillo o extracto de llantén nos muestra que existe sinergismo cuando asociamos 2 o más compo-nentes. La vitalidad celular es mayor en el caso de la administración, a idéntica concen-tración, del jarabe que de los componentes individuales, lo que sugiere asimismo una ac-ción sinérgica de los componentes del jarabe cuando son administrados conjuntamente. Aunque no hemos estudiado el “efecto scavenger” de la adición de 2 o más componentes del jarabe, al comparar la administración de 1 extracto (cualquiera de ellos) con la admi-nistración del jarabe, estando el extracto en ambos casos a la misma concentración, el efecto atrapador de radicales libres es mayor en el caso del jarabe, lo que nos induce a pensar que también en este caso existe una acción sinérgica entre los distintos compo-nentes de Herbetom-PM sobre la inhibición de la formación de radicales libres.
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