INFORME ANUAL 2009
LABORATORIO
CONTENIDO
RESUMEN ... 5
1. Tipo de tests usados, objetivo y número aproximado ... 7
2. Reporte de ocurrencias y de muestras enviadas por los países ... 7
3. Suministro de reactivos de referencia para diagnóstico ... 13
4. Armonización regional y dinámica operativa de la red de laboratorios de América del Sur ... 14
5. Armonización internacional, estandarización de métodos de diagnóstico y control de vacuna e implementación de sistemas de calidad. ... 15
6. Investigación ... 15
7. Eventos internacionales... 15
8. Capacitaciones y discusiones técnicas... 16
9. Participación en proyectos colaborativos a nivel regional e internacional... 17
INFORME ANUAL 2009 LABORATORIO
RESUMEN
En el año 2009 el laboratorio de PANAFTOSA – OPS/OMS ha brindado cooperación técnica dirigida al diagnóstico, vigilancia y control de biológicos, relacionados a enfermedades vesiculares y también en relación a zoonosis emergentes. Se cumplió con las actividades como Laboratorio de Referencia de OIE para enfermedades vesiculares, dentro del marco de la colaboración en la Red de Laboratorios de Referencia Nacionales de América del Sur. Las actividades de armonización regional e internacional de procedimientos de diagnóstico e implantación de sistemas de gestión de calidad, incluyendo biocontención fueron reforzadas. Asimismo, se brindaron capacitaciones a través de la ejecución de módulos o entrenamiento en servicio cubriendo las áreas de diagnóstico, serovigilancia y control de vacuna para enfermedades vesiculares..
Se participó en reuniones de expertos de FAO y OIE, sosteniendo la posición de la región en el ámbito internacional y promoviendo las interacciones con otros organismos de referencia.
Se cumplieron las actividades de referencia, incluyendo caracterización de muestras, provisión de biológicos y kits diagnósticos, capacitaciones, asesorías a consultas y divulgación de información. A continuación se describen las principales actividades realizadas y los resultados alcanzados durante el año 2009.
1. TIPO DE TESTS USADOS, OBJETIVO Y NÚMERO APROXIMADO
2. REPORTE DE OCURRENCIAS Y DE MUESTRAS ENVIADAS POR LOS PAÍSES
2.1. Reporte del número de rebaños con enfermedades vesiculares en América del Sur en 2009 (hasta semana 46)
A continuación se resume el número de focos de Fiebre Aftosa y Estomatitis Vesicular, año 2009, reportados por los países de América del Sur al Sistema Continental de Información y Vigilancia de PANAFTOSA.
Test Para detección Especificidad Total
Aislamiento Viral Vírus infeccioso 108
ELISA-CFL (FA) Anticuerpos Tipo/subtipo 1.059 ELISA-CFL (EV) Anticuerpos Tipo/subtipo 161
ELISA-SI (FA/EV) Antígenos Tipo 128
I-ELISA 3ABC/EITB (FA) Anticuerpos Grupo (proteínas no
capsidales) 24.704/3.828 ELISA Enf. Diferenc.
(Lengua Azul, IBR) Anticuerpos Grupo 30
Inmunohistoquímica Antígeno 10
Inmunoperoxidasa Antígeno 5
IDGA (FA) Anticuerpos Grupo (proteínas no
capsidales) 250
IDGA Lengua Azul Anticuerpos Grupo 10
VN50% (EV) Anticuerpos Tipo/subtipo 20
VN50% (FA) Anticuerpos Tipo/subtipo 40
FC 50% (FA/EV) Antígenos Tipo/subtipo 123
PCR FA (3D) RNA Grupo 10
PCR FA (VP1) RNA Tipo (VP1) 81
Secuenciamiento FA RNA Tipo (VP1) 20
PCR EV RNA Tipo (P y L) 67
Rebaños afectados por Fiebre Aftosa País Virus O Virus A Virus C Diag.
Clinico/epidem. FA Total
Colombia 1 - - - 1
Ecuador (#) 107 - - 21 128
Venezuela 3 10 - - 13
Total 111 10 - 21 142
El resto de los países de Sudamérica, no reportó ocurrencia de enfermedades Vesiculares en el período mencionado
2.2. Diagnóstico/caracterización de muestras recibidas/procesadas en el año 2009.
PANAFTOSA dio apoyo a la Agencia Ecuatoriana de Calidad del Agro – AGROCALIDAD, Ecuador, realizando estudios de aislamiento viral y caracterización antigénica y molecular en 7 muestras de epitelio vesicular provenientes de eventos de Fiebre Aftosa, en las Provincias de Esmeralda, Tsachila, Napo, Imbabura, El Oro, Orellana y Chimborazo (Tabla A.2.). Del total de muestras estudiadas, 6 resultaron positivas para virus de fiebre aftosa tipo “O”. No fue posible aislar virus ni amplificar la secuencia de ARN de virus vesiculares de la muestra de la Provincia El Oro, identificada con el número 119.
Asimismo, se dio apoyo al Instituto Colombiano Agropecuario – ICA, Colombia realizando estudios de caracterización molecular de virus aislado en la emergencia de Fiebre Aftosa ocurrida en la localidad de Nariño (Tabla A.1).
Para aislamiento viral las muestras fueron procesadas e inoculadas en cultivos celulares IB-RS-II y BHK-21 (monocapa y suspensión). La caracterización antigéncia e inmunogénica fue realizada a través de la subtipificación, determinación de relaciones serológicas “r” y estimativa de expectativa de protección (EPP) mediante ELISA-CFL usando paneles de sueros de referencia de animales vacunados y revacunados con vacuna trivalente formulada con adyuvante oleoso. Para los estudios moleculares, se efectuó la amplificación específica por PCR y el secuenciado del gen que codifica para la proteína VP1 (gen 1D - Fiebre Aftosa).
Los resultados de caracterización antigénica de las muestras recibidas se muestran en la Figura 1 y los estudios de relaciones filogenéticas se muestran en: Figura 2. El perfil antigénico de las cepas aisladas permite encuadrarlas dentro del subtipo O1. Los resultados obtenidos del estudio frente a paneles de sueros de bovinos vacunados (30 días pos vacunación y 30 días pos revacunación) con vacuna trivalente oleosa formuladas con la cepa O1 Campos Br/58 indican que rebaños bajo programas de vacunación sistemática con vacunas conteniendo esta cepa estarían protegidos frente a
Rebaños afectados con Estomatitis Vesicular
País New Jersey Indiana Diag. Clin EV Tot
Brasil - 3 - 3 Colombia 338 37 - 375 Ecuador (#) 1 - - 1 Perú 44 - - 44 Venezuela 14 - - 14 Total 397 40 0 437
las cepas aisladas de focos de campo (Figura1). Los resultados obtenidos en estudios moleculares indican que las cepas analizadas son endógenas del continente. El análisis filogenético muestra una relación próxima de las secuencias genéticas con las de virus circulantes en la región andina en años anteriores
A – FIEBRE AFTOSA – muestras de episodios ocurridos en 2009 A.1. COLOMBIA
Código del
País Localidad Especie PCR - Secuencia
35354-1 Nariño Porcino FA-Virus O (*)
35354-2 Nariño Porcino FA-Virus O (*)
35354-3 Nariño Porcino FA-Virus O (*)
(*): Virus secuenciado. Resultado en figura 2
A.2. ECUADOR
(*): Virus secuenciado. Resultados en figura 2
También se colaboró con el MAPA, Brasil en análisis de 28 muestras de sueros de bovinos y bubalinos por prueba de virus neutralización para identificación de anticuerpos de estomatitis vesicular,
identificándose anticuerpos para el serotipos Indiana en tres de las muestras. Además se apoyó al MGAP, Uruguay en el análisis de sueros de animales centinelas de un grupo de 4000 bovinos a ser exportados a la República Popular de China. Fue demostrada ausencia de circulación de virus de fiebre aftosa en el rebaño en cuarentena.
Código del País Provincia Especie Aislamiento Viral PCR del epitelio
18 Esmeraldas Bovino FA-Virus O FA-Virus O(*)
25 Tsachila Bovino FA-Virus O FA-Virus O(*)
39 Napo Bovino FA-Virus O FA-Virus O (*)
57 Imbabura Bovino FA-Virus O FA-Virus O (*)
119 El Oro Bovino Negativo (FA-EV) Negativo (FA-EV)
128 Orellana Bovino FA-Virus O FA-Virus O (*)
Figura 1. Perfil antigénico, determinado por subtipificación en fijación de complemento 50%, relaciones serológicas “r1” y EPP frente al banco de sueros de bovinos 30 dpv y 30 dpR, de cepas FA O-Ecuador 2009
Sueros Hiperinmunes numerados en gráficos de subtipificación:
1
O1 Campos Brasil/58
2
O1 Urubamba Peru/63
3
O1 Caseros Argentina/67
4
O Mato Grosso do Sul Brasil/80
5
O Colombia/64
6
O Brasil/70
7
O Cura Venezuela/71
8
O Polivalente
Relación serológica “r”: Muestra "r" 1 18 0,40 2 25 0,78 3 39 0,77 4 57 0,81 5 128 0,84 6 164 0,79 7 O1 Campos 1,00Cobertura de cepa vacuna O1 Campos - Expectativa de Protección (EPP)
EPP ELISA‐CFL
Cepa viral 30 dpv 30 dpR
Figura 2. Relaciones filogenéticas, determinadas con la secuencia completa de la región que codifica para la proteína VP1 (639n), para el Virus de la Fiebre Aftosa, tipo O
2.3. Estudios de control de vacunas antiaftosa
Se realizaron estudios de referencia en vacunas (producto final) para verificar ausencia de virus C en el producto a ser exportado a regiones históricamente sin registro de ocurrencia de dicho serotipo a través de pruebas de virus neutralización en sueros de animales vacunados con el producto. Asimismo a pedido del MAPA, Brasil se realizaron pruebas para identificación de antígeno de virus A Arg/2001 y O1 Taiwan mediante perfil de reactividad con anticuerpos monoclonales en muestras de vacunas de fiebre aftosa producidas en Argentina y registradas para comercialización en Brasil.
2.4. Investigación seroepidemiológica
Dando continuidad a la cooperación técnica al proyecto FOCEM “Programa de Acción MERCOSUR Libre de Fiebre Aftosa”, en el marco del PAMA/CMA/CVP, se concluyó el análisis de la totalidad de las muestras de suero correspondientes al primer muestreo longitudinal (y sus etapas complementarias) realizado en las zonas de alta vigilancia (ZAV) de Argentina, Bolivia, Brasil y Paraguay. Las muestras fueron testadas mediante I-ELISA 3ABC / EITB y los resultados discutidos durante la reunión mantenida con los expertos del PAMA en el mes de agosto de 2009 en PANAFTOSA. Además durante el periodo se dio inicio al análisis de las muestras de suero correspondientes al segundo muestreo longitudinal realizado en dicha ZAV.
3. SUMINISTRO DE REACTIVOS DE REFERENCIA PARA DIAGNÓSTICO 3.1. Respuesta a las solicitudes de reactivos de referencia para diagnóstico
El laboratorio de PANAFTOSA colaboró con los países en el suministro y control de calidad de insumos de referencia, para actividades de diagnóstico e investigaciones relacionadas a la vigilancia epidemiológica de la fiebre aftosa y otras enfermedades confundibles, así como para control de vacuna y evaluación de inmunidad poblacional. En la siguiente tabla se resumen los biológicos (A) o kits completos (B) entregados a los diferentes países para la ejecución de las pruebas correspondientes.
A. Set de biológicos para el número indicado de ensayos
País Tests Argentina Bolivia Brasil Chile Colombia Paraguay Perú Venezuela Total
Tipificación ELISA-SI (FA/EV) 1.400 3.150 1.750 350 700 7.350 FC 50% (FA/EV) SHI 15.500 15.500 2.500 6.000 39.500 ELISA CFL Seroepidemiologia FA 20.000 2.000 2.000 4.000 28.000 ELISA CFL Seroepidemiologia EV 17.000 3.000 4.000 2.000 2.000 4.000 32.000 ELISA CFL Control Vacuna (FA) 5.000 268.000 55.000 30.000 24.000 382.000 ELISA CFL Control Vacuna (EV) 4.000 4.000 IDGA-3D (FA) 6.000 22.000 4.000 4.000 1.000 37.000 IDGA-LA 1.000 1.000 2.000 ELISA CFS-LA 3.000 2.000 1.000 1.000 7.000 ELISA CFS-IBR 1.000 2.000 3.000
B. Kits completos para el número indicado de ensayos
Tests Argentina Bolivia Brasil Chile Colombia Paraguay Peru Uruguay Venezuela Total
I-ELISA 3ABC 61.600 13.200 165.440 2.640 18.480 44.880 6.160 4.400 2.640 319.440
EITB 5.000 0 18.000 200 1.400 5.000 800 1.000 200 31.600
Asimismo, han sido producidas y distribuidas las líneas celulares BHK-21 C13, IBRS II y Vero para diagnóstico y producción de inmuno biológicos. Adicionalmente cepas virales O1 Campos, A24 Cruzeiro y C3 Indaial fueron distribuidas a laboratorios de producción de vacuna de Brasil y Paraguay.
4. ARMONIZACIÓN REGIONAL Y DINÁMICA OPERATIVA DE LA RED DE LABORATORIOS DE AMÉRICA DEL SUR
Se ejecutó la ronda correspondiente al año 2009 de la Prueba Interlaboratorio para los tests de tipificación de virus vesiculares. Participaron 11 laboratorios de 9 países de América del Sur. Diez laboratorios tuvieron resultado satisfactorio. Un laboratorio presentó no conformidades y se recomendaron medidas correctivas. A solicitud del laboratorio, se remitió nueva colección de muestras para análisis confirmándose resultado satisfactorio.
En el marco del PAMA/CMA/CVP, proyecto FOCEM, se colaboró en las actividades correspondientes al sistema de vigilancia epidemiológica longitudinal activa aplicado en la zona de alta vigilancia, dando continuidad al procesamiento de la totalidad de muestras de sueros correspondiente al primer muestreo longitudinal (etapa inicial y estudios complementarios).
5. ARMONIZACIÓN INTERNACIONAL, ESTANDARIZACIÓN DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO Y CONTROL DE VACUNA E IMPLEMENTACIÓN DE SISTEMAS DE CALIDAD.
Se participó en la reunión de la red de laboratorios de referencia de OIE/FAO para fiebre aftosa llevada a cabo en New Delhi, India del 23 al 27 de Noviembre. Fueron discutidos aspectos relacionados a “vaccine matching”, a metodologías para determinar la eficiencia de programas de vacunación a campo y a las actividades de los laboratorios en atención a ocurrencias de fiebre aftosa en sus respectivas regiones. Se colaboró en la elaboración del informe anual unificado acerca de las actividades de los laboratorios de referencia de OIE y/o FAO, en el año 2009 el cual incluye además las conclusiones de su reunión anual.
6. INVESTIGACIÓN
Como parte de un proyecto de cooperación entre el Ministerio de Agricultura, Pecuaria y Abastecimiento de Brasil, la EMBRAPA de Brasil y PANAFTOSA se inició la preparación de un proyecto de laboratorio para desarrollo de un kit completo ELISA para uso en control de calidad de vacuna para fiebre aftosa.
7. EVENTOS INTERNACIONALES
Se participó y/o promovió el desarrollo de los siguientes eventos:
• II Taller de Caracterización de Fiebre Aftosa en el Norte de Perú, 25 de Enero a 01 de Febrero. • International course of virus isolation in tissue culture and antigen detection for the diagnosis of
vesicular diseases. CFIA/PANAFTOSA-OPS/IICA, Winnipeg, Canada 16-20 de Febrero. • Reunión del Comité Veterinario Permanente (CVP), 03 a 14 de Marzo.
• Seminario Internacional: " Países y Zonas Libres de Fiebre Aftosa – Logros y Peligros: Una Visión de Futuro”, Cartagena de Indias, Colombia 20 - 21 de Abril
• Reunión Ordinaria del Grupo Interamericano de Erradicación de la Fiebre Aftosa – GIEFA, Cartagena de Indias, Colombia, 22 de Abril.
• 36ª Reunión Ordinaria de la Comisión Sudamericana de Lucha contra la Fiebre Aftosa (COSALFA), Cartagena de Indias, Colombia, 23 - 24 de Abril.
• Reunión de Expertos de Laboratorio en materia de Bioseguridad y Control de Calidad de Vacunas Antiaftosa del proyecto FOCEM “Programa de Acción MERCOSUR Libre de Fiebre Aftosa”. Río de Janeiro, Brasil, 19 a 22 de Febrero.
• Conferencia Global OIE/FAO de Fiebre Aftosa. Asunción, Paraguay 23 al 27 de Junio
• Biosafety and Laboratory Biosecurity Meeting for Animal and Human Stakeholders, Paris, Francia 30 de Junio a 2 de Julio
• Seminario Inter-Regional para Países de Lengua Portuguesa : Concientización sobre bioseguridad; Rio de Janeiro, Brasil 27-31 Julio.
• Reunión de Expertos del proyecto FOCEM “Programa de Acción MERCOSUR Libre de Fiebre Aftosa”. Río de Janeiro, Brasil, 03 a 07 de Agosto.
• Reunión Multilateral para socialización de la propuesta de estructuración del Programa Nacional de Erradicación de la Fiebre Aftosa en Ecuador, 26 de Octubre al 05 de Noviembre.
• Reunión de la red de laboratorios de referencia para fiebre aftosa de OIE/FAO, New Delhi, India, 23 – 27 Noviembre.
• 12ª Reunión de Directores de Programas Nacionales de Rabia de Latinoamérica, La Antigua, Guatemala, 30 de Noviembre-02 de Diciembre
8. CAPACITACIONES y DISCUSIONES TÉCNICAS A. Entrenamientos individuales en PANAFTOSA
Dra. Liana Yumi. UFF/Brasil 1 Setiembre a 31 Diciembre
Identificación de anticuerpos por ELISA-CFL
Dra. Carolina Cochito UFF/Brasil 1 Setiembre a 31 Diciembre
Detección molecular del Virus de la Estomatitis Vesicular. Identificación de anticuerpos por prueba de Virus neutralización
André Luiz Soares. Brasil 1 Setiembre a 31 Diciembre
Tipificación de antígenos de virus vesiculares por prueba de Fijación de Complemento y ELISA-SI Identificación de anticuerpos por ELISA-CFL
B. Capacitación Intramural PANAFTOSA
Se ofrecieron 5 módulos para capacitación intramural en las áreas que se detallan a continuación: Módulo 1 – Técnica inmuno enzimática para detección de anticuerpos de fiebre aftosa (ELISA-CFL)
22 a 26 de Junio
Módulo 2 – Cultivo celular - 29 de Junio a 04 de Julio
Módulo 3 – Técnica de virus neutralización para identificación de anticuerpos de estomatitis vesicular 06 a 10 de Julio
Módulo 4 – Técnica inmuno enzimática para tipificación de antígenos de fiebre aftosa y estomatitis vesicular (ELISA-SI): 10 a 14 de agosto
C. Cursos
International Course in Viral isolation and typing for the diagnosis of foot-and-mouth disease and vesicular stomatitis. Winnipeg, Canadá, 16 – 20 de Febrero.
Limberg Rojas Guzmán, LIDIVET, Bolivia Nancy Naranjo, LNDV-ICA, Colombia Hernan Abad (AGROCALIDAD, Ecuador) Salomón Ortiz (SENASA, Perú)
Christel Machin Pire (SASA, Venezuela)
D. Consultorías y visitas técnicas a países LANAGRO-PA, Belém, PA Brasil 05 – 16 de Marzo
Visita técnica para preparación de cultivo celular a ser usado en prueba de VirusNeutralización. MERIAL Saúde Animal, Paulinia, SP Brasil 26 – 29 de Mayo
Visita técnica para colaboración en realización de pruebas de Virus Neutralización en vacunas de exportación.
LANAGRO-PA, Belém, PA Brasil 07 – 16 de Setiembre
Visita técnica para revisión de procedimientos para preparación de cultivos celulares BHK en suspensión.
Laboratorio GALMEDIC, Asunción, Paraguay 28 de Setiembre a 03 de Octubre Asesoria en producción de cultivos celulares para preparación de antígenos vacunales
Laboratorio Nacional de Diagnostico Veterinario, LNDV-ICA. Bogotá, Colombia 18 – 20 de Noviembre. Asesoría en preparación de cultivo celular para uso en diagnóstico de enfermedades vesiculares.
E. Participación en actualización y de certificación de personal
Conjuntamente con OMS se organizó un curso para certificación de personal en Transporte Aéreo de Materiales Biológicos – Módulo: Preparación de embarques
30-31 de Julio, Río de Janeiro, Brasil
9. PARTICIPACIÓN EN PROYECTOS COLABORATIVOS A NIVEL REGIONAL E INTERNACIONAL Se concluyeron las actividades del proyecto de colaboración con el National Centre for Foreign Animal Disease NCFAD, Canadá para la capacitación en técnicas de diagnóstico de enfermedades vesiculares en países de la Región Andina.
Se dio continuidad al proyecto de colaboración con la Universidad de São Paulo para caracterización de virus de rabia a través de paneles de Anticuerpos Monoclonales producidos con cepas virales aisladas en Brasil.
10. DISEMINACIÓN DE INFORMACIÓN: PRESENTACIONES A CONGRESOS Y/O PUBLICACIONES
Allende, R. Technical Cooperation of PANAFTOSA PAHO/WHO as OIE/FAO Reference Laboratory of Vesicular Diseases and the experience with viral isolation and characterization. National Center for Foreign Animal Diseases, Canadian Food Inspection Agency, 16 Febrero; Winnipeg, Canada.
Allende, R. FMD Laboratories: Biosafety and Biosecurity in South American Countries. In: OIE/OMS Biosafety and Laboratory Biosecurity Meeting for Animal and Human Stakeholders, 30 Junio a 2 Julio; Paris, Francia.
Allende, R. Measuring vaccine coverage in the field. In: OIE/FAO FMD Reference Laboratories Network Meeting, 23-27 November 2009; New Delhi, India
Bergmann I, Malirat V, Campos RM, Neitzert E. The use of diagnostic kits and non-structural protein tests for foot and mouth disease in cattle and in other susceptible species: constraints and challenges. In: OIE/FAO Global Conference on Foot and Mouth Disease. The Way Towards Global Control; 24-26 June 2009; Asunción, Paraguay.
Darsie G. Bioseguridad y bioprotección en laboratorios. In : Seminário Internacional Países y Zonas Libres de Fiebre Aftosa, Logros y Peligros: Una Visión de Futuro ; 20-21 Abril 2009; Cartagena de Indias, Colombia.
Darsie G. Biossegurança e bioproteção em laboratórios na América do Sul. In : Seminário Inter-Regional para Países de Lingua Portuguesa : Conscientização sobre Biossegurança ; 27-31 Julio 2009 ; Rio de Janeiro, Brasil.
Naranjo, J ; Experiencias regionales de zonificación de emergencias y recuperación de status de libre. In : Seminário Internacional Países y Zonas Libres de Fiebre Aftosa, Logros y Peligros: Una Visión de Futuro ; 20-21 Abril 2009; Cartagena de Indias, Colombia.
Saraiva V. Foot and mouth disease situation and control strategies in South America – the current situation. In: OIE/FAO Global Conference on Foot and Mouth Disease. The Way Towards Global Control; 24-26 June 2009; Asunción,Paraguay.
Saraiva V. Experiencias regionales en obtención de zonas libres: con y sin vacunación. In : Seminário Internacional Países y Zonas Libres de Fiebre Aftosa, Logros y Peligros: Una Visión de Futuro ; 20-21 Abril 2009; Cartagena de Indias, Colombia.
36a. Reunión Ordinaria de la Comisión Sudamericana para la Lucha contra la Fiebre Aftosa ; 20-24 Abril 2009; Cartagena de Índias, Colombia.
