PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA MARINA
OBTENCION DE FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS DE DOMINIO SENCILLO VHNAR DEL TIBURON Heterodonthus francisci NEUTRALIZANTES
DE LAS CITOCINAS TNF-α Y VEGF165
TESIS
que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS
Presenta:
TANYA AMANDA CAMACHO VILLEGAS
Este proyecto de investigación, se realizó en el laboratorio de Inmunología Molecular y Biotoxinas, perteneciente al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE), bajo la dirección del Dr. Alexei Fedórovish Licea Navarro.
Profesionales:
Al Dr. Alexei Fedórovish Licea Navarro por permitirme desarrollar este ambicioso proyecto de investigación, además, por su apoyo, confianza, asesoría y amistad.
A los miembros del Comité de tesis: Dra. Elizabeth Ponce Rivas, Dr. José Alberto Díaz Quiñones, Dr. José de Jesús Paniagua Michel, Dr. Axayácatl Rocha Olivares, por su apoyo y correcciones durante la realización de este proyecto.
Al Dr. José Alberto Díaz Quiñones, por su orientación y hospitalidad durante mi estancia de investigación en el laboratorio de Inmunología, perteneciente a Laboratorios SILANES S. A.
Al M. en C. Fernando Flores, por su apoyo técnico, por ser mí guía de turista durante mi estancia de investigación y por brindarme su amistad.
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada por las becas otorgadas.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por la beca otorgada.
Agradecimientos
Personales:
A mis padres, Néstor Joaquín Camacho Muñiz y Angelina Villegas Monroy, por su amor, su ejemplo, su confianza y por ser impulsores de mi superación.
A mis hermanas Olessya y Celia, por darle alegrías a mi vida y por ser auténticas, las quiero.
A mi esposo Pavel, por estar a mi lado siempre, por el apoyo incondicional, por su profundo amor y sinceridad.
California, México.
Obtención de fragmentos de anticuerpos de dominio sencillo VHNAR
del tiburón Heterodonthus francisci neutralizantes de las citocinas TNF-α Y VEGF165
Resumen aprobado por:
Dr. Alexei Fedórovish Licea Navarro
La Artritis Reumatoide es un desorden inflamatorio, crónico y multisistémico, que afecta principalmente las articulaciones de forma simétrica causando la destrucción del cartílago articular, erosión de hueso y deformidades.
Las citocinas TNF-α (factor de necrosis tumoral alfa) y VEGF165 (factor de
crecimiento vascular endotelial de 165 aminoácidos), están implicadas en el inicio y mantenimiento de esta enfermedad. Una nueva línea de tratamiento para los pacientes con artritis reumatoide se ha desarrollado manipulando las características de los anticuerpos tipo IgG humanos, pero tienen las desventajas de ser inmunogénicos, de difícil eliminación y de poca penetración en los tejidos.
En este trabajo se emplearon los anticuerpos de domino sencillo tipo IgNAR
(nuevo receptor de antígeno) del tiburón Heterodontus francisci para bloquear el
efecto de TNF-α y VEGF165 in vitro, ya que presentan las siguientes ventajas
respecto a los anticuerpos anteriormente generados; presentan alta afinidad por el antígeno, al ser dominios sencillos son más pequeños, carecen de la región Fc de los anticuerpos completos pudiendo ser menos inmunogénicos, son termoestables, podrían penetrar fácilmente los tejidos, por lo tanto su difusión a los sitios de inflamación y su posterior eliminación se daría en poco tiempo.
Se generaron bibliotecas inmunes para cada citocina, además, se empleó una biblioteca no inmune y por medio del despliegue en fagos, se aislaron clonas productoras de proteína en cada biblioteca, de las cuales existen clonas que
tienen la capacidad de neutralizar in vitro la acción biológica de las citocinas en
células sensibles. Los anticuerpos generados podrían ser empleados como potencial tratamiento alternativo para el padecimiento de la artritis reumatoide.
Obtainment of neutralizing single domain antibodies VHNAR from the Heterodonthus francisci shark against the cytokines TNF-α and VEGF165.
Abstract approved by:
Dr. Alexei Fedórovish Licea Navarro
The rheumatoid arthritis is an inflammatory, chronic and multisystemic disease that affects the joint of symmetric form causing damage in the joint cartilage, bone erosion and deformities.
The cytokines TNF-α (tumor necrosis factor) and VEGF165 (vascular
endothelial growth factor) are implicated in the beginning and holding of the disease. New line of treatment for the patients with rheumatoid arthritis has been developed manipulating the characteristics of the human IgG antibodies, with capacity of neutralize the human cytokines, but have disadvantages it is immunogenic, difficult elimination and poor penetration in tissues.
In this work, we have used the single domain antibodies VHNAR from the
shark Heterodontus francisci to neutralize the effect of TNF-α and VEGF165 in vitro
because as they have the advantages, show high affinity, are small, lack the Fc domain of the complete immunoglobulin, are thermostables, they could penetrated tissues easily and the diffusion to the inflammatory site and elimination should be in short time.
We generated immune libraries for each cytokine, besides, we have used one naïve. By means of phage display we isolated productive clones of protein in
each library, finding clones capable of neutralized in vitro the biologic effect of the
cytokines. The generated antibodies could be a potential treatment for the rheumatoid arthritis diseases.
Página
I. INTRODUCCIÓN
I.1. Artritis Reumatoide ……….…... 1
I.1.1 Factor de Necrosis Tumoral (TNF-α): características e implicación en artritis reumatoide …….………... 5
I.1.2 Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF165); características e implicación en artritis reumatoide………..………. 8
I.2 Anticuerpos de tiburón IgNAR .………. 11
II. ANTECEDENTES II.1.1 Medicamentos modificadores de la enfermedad anti-TNF-α ….. 14
II.1.2 Medicamentos modificadores de la enfermedad anti-VEGF165 17
II.2 Bibliotecas de anticuerpos VHNAR ……… 18
III. JUSTIFICACION 21 IV. OBJETIVOS III.1 Objetivo General ...….. 22
III.2 Objetivos Particulares ...…. 22
V.METODO V.1 Generación de las bibliotecas inmunes V.1.1 Protocolo de inmunización ………... 23
V.1.2 Extracción de ARN total ……… 24
V.1.3 Reacción de retrotranscripción ……….………... 24
V.1.4 PCR para obtener ADN doble cadena .……….. 25
V.1.5 Digestión del fragmento VHNAR ……….……… 26
V.1.6 Purificación del vector de clonación pCOMb3X …….……….. 26
V.1.7 Digestión del vector de clonación pCOMb3X ……….……….. 26
V.1.8 Ligación a pequeña escala ... 27
V.1.9 Ligación a gran escala ……….………. 28
V.2 Selección de fragmentos VHNAR específicos para TNF-α y VEGF165. Bibliotecas No Inmunes e Inmunes V.2.1 Reamplificación de la Biblioteca No Inmune ……… 29
V.2.2 Amplificación de las Bibilotecas Inmunes ………. 30
V.2.3 Rondas de selección contra las citocinas. Bibliotecas No Inmunes e Inmunes ……… 31
V.2.4 Preparación de células electrocompetentes E. coli cepas ER2537 y TOP10F´...………. 32
V.2.5 Preparación de fago ayudador VCSM13 ...…... 33
V.2.6 ELISA de fagos obtenidos de las rondas de selección. Bibliotecas No Inmunes y Bibliotecas Inmunes ………...……. 34
V.3 Búsqueda de clonas positivas. Bibliotecas No Inmune e Inmunes V.3.1 PCR de colonia ……….… 34
V.3.3 Aislamiento de plásmido ………. 36
V.3.4 Transformación en la cepa TOP10F´quimiocompetente …... 36
V.4 Expresión de proteína VHNAR en TOP10F´ V.4.1 Expresión de VHNAR ……….... 37
V.4.2 Extracción periplásmica de proteína VHNAR ……….….. 37
V.4.3 ELISA de expresión ………..… 37
V.4.4 ELISA de reconocimiento citocina-VHNAR ………..…. 38
V.5 Purificación de proteína VHNAR por cromatografía de afinidad a metales 38 V.6 Bioensayos in vitro. Bibliotecas No Inmunes e Inmunes V.6.1 Ensayo de citotoxicidad de TNF-α en células L929 …………. 39
V.6.2 Ensayo de neutralización de TNF-α con VHNAR en células L929 ………... 40
V.6.3 Ensayo de proliferación de células HUVEC estimuladas por VEGF165 ………. 41
V.6.4 Ensayo de neutralización de VEGF165 con VHNAR en células HUVEC ………...….. 42
V7. Secuenciación ……… 42
VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES VI.1. Generación de las bibliotecas inmunes VI.1.1 Extracción de ARNtotal y retrotranscripción ……...…………. 44
VI.1.2 PCR para obtener ADN doble hebra ……….... 45
VI.1.3 Digestión del vector de expresión pCOMb3X y del fragmento ……… 46
VI.1.4 Ligación de fragmentos VHNAR y el vector de expresión .… 47 VI.2 Selección de fragmentos VHNAR específicos para TNF-α y VEGF165. Bibliotecas no inmunes e inmunes VI.2.1 Rondas de selección. Biblioteca Inmune y Biblioteca no inmune ………. 48
VI.2.2 ELISA de fago ………..……... 52
VI.3 Búsqueda de clonas positivas VI.3.1 PCR de colonia ……….. 54
VI.4 Expresión de VHNAR VI.4.1 ELISA de expresión ………... 55
VI.4.2 ELISA de reconocimiento VHNAR-citocina ………... 59
VI.5 Bioensayos in vitro VI.5.1 Ensayo de citotoxicidad de TNF-α en células L929 ……… 62
VI.5.2 Ensayo de neutralización de TNF-α con VHNAR en células L929 ………... 64
Página
VI.5.4 Ensayo de neutralización de VEGF165 con VHNAR en
células HUVEC ……….…. 69 VI.6 Secuenciación ………. 71
VII. CONCLUSIONES 73
VIII. PERSPECTIVAS ……… 74
1 Corte sagital de una articulación de rodilla ... 2
2 Proceso inflamatorio en artritis reumatoide ………….……… 4
3 Estructura de TNF-α ……… 7
4 Estructura tridimensional de VEGF165 ………... 9
5 Comparación entre inmunoglobulinas ……….. 12
6 Comparación entre dominios variables ……… 13
7 Antagonistas anti-TNF-α ……….……… 16
8 Representación esquemática de formatos de anticuerpos ... 20
9 Retrotranscripción de ARN total……… 44
10 PCR para obtener ADN doble hebra……….. 45
11 Digestión del vector pCOMb3X ……….. 46
12 Titulación de salida de fagos, Bibliotecas No Inmunes …….. 50
13 Titulación de salida de fagos, Bibliotecas Inmunes ………… 51
14 ELISA de fagos, Bibliotecas No Inmunes ………. 53
15 ELISA de fagos, Bibliotecas Inmunes ………... 54
16 ELISA de expresión, Bibliotecas No Inmunes ………. 57
17 ELISA de expresión, Bibliotecas Inmunes ………... 58
18 ELISA de reconocimiento, Bibliotecas No Inmunes ………... 60
19 ELISA de reconocimiento, Bibliotecas Inmunes ………. 61
20 Ensayo de citotoxicidad de TNF-α en células L929 ………... 63
21 Ensayo de neutralización de 5DL50 de TNF-α con proteínas VHNAR ……… 66
22 Ensayo de proliferación de células HUVEC por acción de VEGF165 ……….. 68
23 Ensayo de neutralización de VEGF165 por las proteínas VHNAR en células HUVEC ……….... 70
LISTA DE TABLAS
Tabla Página
I Citocinas expresadas en el tejido sinovial reumatoide ………... 3
II Protocolo de inmunización ……….. 23
III Condiciones de PCR para la amplificación de ADN doble
hebra ………... 26
IV Oligonucleótidos específicos para amplificar fragmentos
VHNAR ………... 35
V Condiciones de PCR para amplificar fragmentos VHNAR de
colonia ………. 35
VI Comparación entre la ligación a pequeña escala y la ligación a
gran escala ………. 48
VII Comparación de las DL50 de cuatro lotes de TNF-α,
empleados en el bioensayo de citotoxicidad en células L929
……….. 64
VIII Comparación de las DI50 de las proteínas VHNAR contra
TNF-α en células L929 ……….. 67
IX Determinación de la DE50 de la citocina VEGF165 en células
HUVEC ………... 68
X Comparación de las DI50 de las proteínas VHNAR contra
I.1 Artritis Reumatoide.
La Artritis Reumatoide (AR) es un desorden crónico-degenerativo, sistémico, caracterizado por la inflamación progresiva del sinovio que provoca la eliminación de cartílago articular y hueso marginal, causando deformaciones, problemas de movimiento y limitación de la actividad física. Después de 10 años de padecer AR, sólo el 40% de los enfermos pueden realizar algún trabajo físico; después de 20 años el 80% de los pacientes están discapacitados y el 19% están completamente incapacitados. El daño causado al cartílago es irreversible (van de
Putte et al., 2003). Esta enfermedad, afecta al 1% de los adultos de 35 años y al
2% de los adultos de 60 años o más, siendo más afectadas las mujeres en
proporción 3:1 respecto a los hombres (Hochberg et al., 2003). La susceptibilidad
genética está relacionada con los haplotipos DR4 y en menor medida a
HLA-DRW1D ubicado en el cromosoma 6 humano (Abbas et al., 2004; Chen et al.,
2006).
El sinovio es el tejido fibroso que reviste las articulaciones y secreta el líquido sinovial, que ayuda a reducir la fricción y el desgaste en una articulación. En pacientes con artritis reumatoide, se inflama e incrementa de masa por la hiperplasia, incrementando el volumen de líquido sinovial, resultando en inflamación y dolor. La inflamación del sinovio, invade la interfase entre cartílago y hueso causando su invasión y destrucción (pannus) y provoca la erosión que produce finalmente las deformidades características de la AR persistente
(Middlenton et al., 2003; Paleolog, 2002) (Figura 1).
tener altos niveles de factor reumatoide en sangre. Sin embargo, muchos pacientes no pueden ser clasificados con estos criterios hasta que la enfermedad
está avanzada (Cheng et al., 2006).
Figura 1 unarticulaciónderodillasa(a)
Figura 1. Corte de rodilla. a) Corte sagital de una articulación de rodilla sana y otra con artritis reumatoide AR; b) mostrando la destrucción del hueso y cartílago producto del proceso inflamatorio agudo.
La artritis reumatoide, es considerada una enfermedad autoinmune, ya que las células del sistema inmune del organismo son las causantes de la inflamación, dolor y erosión de las articulaciones. En el líquido sinovial, se han detectado numerosas citocinas como la Interleucina 1 (IL-1), el Factor de Necrosis Tumoral
alfa (TNF-α) e Interferón gama (INF-γ) (Tabla I). Estas citocinas, activan a las
células sinoviales para que produzcan enzimas hidrolíticas, como Colagenasa, Catepsina B y L, Estromelisina (MMO-3), Gelatinasa B (MMP-9), Colagenasa 3 (MMP-13) que provocan la destrucción del cartílago, ligamentos y tendones
(Abbas et al., 2004; Middlenton et al., 2003).
Músculo
a) b)
Erosión de hueso y cartílago Cartílago Tendón
Hueso
Articulación
Líquido sinovial Sinovio
Hueso
Pérdida ósea
Tabla I. Citocinas expresadas en el tejido sinovial reumatoide (modificado de Andreakos et al., 2002).
Inflamatorias Inmuno-reguladoras
Quimiocinas Factores de crecimiento
IL-1α,β IL-4 IL-8 VEGF
TNF-α IL-10 MIP-1 FGF
IL-6 IL-11 MCP-1 PDGF
GM-CSF TGFβ RANTES
IL-2 INF-γ
La inflamación crónica causada por la autoinmunidad, libera citocinas, produce auto-anticuerpos, forma inmunocomplejos, activa células T citotóxicas
(CD8+), células Asesinas Naturales (Natural Killers), macrófagos, leucocitos y
favorece la extravasación. Los auto-anticuerpos, inducen daño tisular por la lisis celular y la activación del sistema del complemento, iniciando los mecanismos citotóxicos dependientes de anticuerpos o por la unión a receptores de superficie
(Horai et al., 2004). Las células T, a su vez, provocan daño tisular debido a su
acción citotóxica directa, al liberar citocinas autócrinas; o indirectamente, por la liberación de citocinas de acción parácrina, que activan macrófagos y estimulan a los linfocitos B autoreactivos, mismos que inducen la inflamación local (Andreakos
et al., 2002). En algunos casos, se observan folículos linfoides (nódulos
reumatoides), parecidos a centros germinales con agregados de células T y B, lo
cual agudiza este padecimiento (Klimiuk et al., 2002) (Figura 2).
metotrexato (MTX) que se incluye en los fármacos anti-inflamatorios que modifican
la enfermedad (DMARDs) (Choy et al., 1998; Todd et al., 2007). Los DMARDs,
son los únicos que han logrado disminuir la destrucción de las articulaciones (van
de Putte et al., 2003).
Condrocitos Células
sinoviales Osteoclastos
Célula B
Célula PlPlasma
Célula T
APC
De las citocinas que influyen en el origen y mantenimiento de la artritis reumatoide, sólo serán empleadas dos en este proyecto, una por su acción
proinflamatoria: TNF-α y la otra por su función de activación de la angiogénesis:
VEGF165.
I.1.1 Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-α): características e implicación en artritis reumatoide.
El Factor de Necrosis Tumoral (TNF) fue descrito entre los años 1960’s y 1970´s al identificar productos derivados de macrófagos y linfocitos que producían necrosis hemorrágicas de tumores sólidos. La superfamilia de TNF, está comprendida por al menos 19 genes que codifican 20 proteínas transmembranales del tipo II, es decir, proteínas que tienen el extremo amino terminal intracelular y el extremo carboxilo terminal extracelular. Esta superfamilia, incluye miembros como
el TNF-α, TNF-β (linfotoxina), el ligando de Fas (FasL) y el ligando de CD40
(CD40L). En 1998, se aceptó una nomenclatura unificada para esta familia, empleando el término TNFSF para la familia de TNF y TNFRSF para sus receptores (Paul, 2003).
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), miembro de la TNFSF, tiene una
vida media de pocos minutos en circulación y representa del 1 al 2% de las proteínas secretadas por los macrófagos activados, aunque también, puede ser secretado por linfocitos B y T estimulados, células NK, mastocitos y fibroblastos
humanos (Chen et al., 2006; Mackay et al., 1993). Es sintetizado como una
glucoproteína homotrimérica de membrana de tipo II, que es escindida por metaloproteasas, liberando polipéptidos de 17 kDa. Tres de estas cadenas polipeptídicas se polimerizan, dando lugar a un homotrímero estable de 51 kDa. El
TNF-α secretado, adquiere una forma de pirámide triangular, donde, cada lado de
la pirámide está formado por una subunidad, por lo tanto, puede unirse a tres
Existen dos receptores para TNF-α: p55 (de 55 kDa, llamado receptor de TNF tipo I) y p75 (de 75 kDa, llamado receptor de TNF tipo II). Sus dominios extracelulares tienen regiones ricas en cisteínas y su dominio intracelular es diverso, sugiriendo que activan diferentes procesos de transducción de señales
(Mackay et al., 1993). Ambos receptores se encuentran en todos los tipos
celulares a excepción de los eritrocitos, estando p75 mayoritariamente en células
endoteliales y hematopoyéticas. La afinidad de TNF-α contra estos receptores
tiene una constante de disociación Kd = ∼1X10-9 y de Kd = ∼5X10-10,
respectivamente (Paul, 2003).
Las principales funciones de TNF-α son: 1) Favorecer el reclutamiento de
neutrófilos, macrófagos y linfocitos a la zona de inflamación, al inducir una mayor expresión de moléculas de adhesión en las células endoteliales como las E-selectinas, Molécula de Adhesión Celular tipo 1 (ICAM-1) y Molécula de Adhesión de Células Endoteliales tipo 1 (VCAM-1), y por lo tanto favorecer la extravasación
durante el proceso inflamatorio (Klimiuk et al., 2002); 2) Activar la producción de
citocinas y quimiocinas que favorecen el proceso inflamatorio, como el Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF), Interferón
gama (INF-γ), Interleucina 1 (IL-1), Interleucina 6 (IL-6) e Interleucina 8 (IL-8)
(Abbas et al., 2005); 3) Inducir necrosis hemorrágica en tumores y daño en tejidos;
4) Inducir apoptosis en algunas líneas celulares de cáncer, en poblaciones de linfocitos y células epiteliales (Paul, 2003).
séptico, meningococcemia, artritis reumatoide, otitis media, hepatitis B y C,
síndrome de Reys y malaria cerebral entre otras (Abbas et al., 2004; Paul, 2003).
Figura 3. Estructura de TNF-α, homotrímero de 51 KDa, forma una pirámide que puede unirse a tres receptores al mismo tiempo. Las tres cadenas peptídicas se representan en diversos colores (http://www.rcsb.org/).
Se ha encontrado que, al bloquear TNF-α y sus receptores p55 y p75 se
inhibe la producción de IL-1 (citocina que también es importante en el proceso
inflamatorio), y la síntesis de otras citocinas como GM-CSF, INF-γ, IL-6, IL-8 y la
formación de complejos inmunes, ya que el TNF-α es la citocina pro-inflamatoria
más producida en el sinovio reumático y es activadora de la cascada de citocinas
que favorecen el proceso inflamatorio (Andreakos et al., 2002; Chang y
I.1.2 Factor de Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF165): características e implicación en artritis reumatoide.
El aumento en la proliferación de las células sinoviales y de volumen del líquido sinovial provocan una demanda adicional a la vasculatura normal llevando a un estado hipóxico, ambos factores son señales para iniciar el proceso de angiogénesis, es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos partiendo de los
ya existentes (Sone et al., 2001). En condiciones normales, la angiogénesis es
esencial en el desarrollo fetal, en la reparación de daño tisular y en el ciclo reproductivo femenino, al proveer nutrientes, servir de transportador de células y
de productos de desecho (Smith et al., 2005). Su regulación es compleja y
requiere de un fino balance entre mediadores pro-angiogénicos y
anti-angiogénicos (Rueda et. al., 2005). La angiogénesis no regulada contribuye a la
patología de varios padecimientos incluido el cáncer, donde es necesario un mayor aporte de nutrientes y oxígeno (Paleolog, 2002).
Como se mencionó, los tratamientos anti-TNFα pueden inhibir la
angiogénesis, promovida por el Factor de Crecimiento Vascular-Endotelial (VEGF) pues reduce su producción, pero es inefectivo cuando la hipoxia que es independiente del control inmunológico es el mayor estímulo de regulación de VEGF. La hipoxia, es muy común en pacientes con RA, su forma de inducción está mediada en parte, por la transcripción del factor heterodimérico HIF-1 (Factor Inducible por Hipoxia-1) que se une a un intensificador de la transcripción de
VEGF. En los pacientes que responden pobremente al tratamiento anti-TNFα, un
agente anti-angiogénico puede proveer un mayor beneficio (Brenchley, 2001;
Honari et al., 2004).
El Factor de Crecimiento Vascular-Endotelial (VEGF) (Figura 4) es la
citocina más efectiva en promover la angiogénesis (Sone et al., 2001), pues actúa
la histamina (Ng et al., 2006). Además, activa la expresión de proteasas y de
transportadores de glucosa; estimula la migración celular al incrementar la
concentración de Ca2+ intracelular; activa la división celular; protege a las células
endoteliales de la apoptosis y senescencia e induce la angiogénesis in vitro e in
vivo (Zeng et al., 2001).
Fue parcialmente purificado por Senger et al. (1983) en medio de cultivo de
líneas celulares de cobayo, nombrándolo ¨Factor de Permeabilidad Vascular¨, pero, fue hasta 1989 que Ferrara y colaboradores obtuvieron la secuencia completa de la proteína VEGF-A.
La familia de VEGF comprende cinco miembros VEGF-A, -B, -C, -D y –E, de los cuales, VEGF-A es la citocina mejor estudiada y está compuesta por
glucoproteínas homodiméricas de 34 a 42 kDa de peso molecular (Cooke et al.,
2001). Por medio de corte y empalme alternativo, se producen cuatro isoformas de un sólo gen, que son designados VEGF121, VEGF165, VEGF189 y VEGF206, consistiendo en 121, 165, 189 y 206 aminoácidos respectivamente. VEGF121 y
VEGF165 representan las isoformas predominantes en los tejidos (Sone et al.,
2001), siendo VEGF165 el de mayor acción biológica (Pandya et al., 2006).
Existen tres receptores de VEGF llamados: Flt-1 (Receptor de VEGF tipo 1); KDR (Receptor de VEGF tipo 2, flt-1 en ratón) y Neuropilina, del cual se conoce muy poco. Los receptores Flt-1 y KDR se expresan selectivamente en las células endoteliales (la expresión de Flt-1 en células HUVEC es un décimo la de KDR) y unen VEGF con diferente afinidad, teniendo una constante de disociación
aproximada de 10 pM y ~400-900 pM respectivamente (Zeng et al., 2001). Tienen
44% de similitud y son estructuralmente similares, y contienen siete dominios de inmunoglobulina extracelulares, un dominio sencillo transmembranal y una
secuencia conservada de tirosin cinasa, interrumpida por un dominio cinasa (Ng et
al., 2006).
Las células endoteliales normales contribuyen al reclutamiento de células del sistema inmune a los sitios de inflamación por la expresión de moléculas de adhesión, dentro de las familias más importantes se encuentran: la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig), ICAM-1, VCAM-1 y CD31; las selectinas, que son moléculas de adhesión que inician la cascada de atracción de leucocitos, y el grupo que consiste en CD34 y L-selectinas que son expresadas en el lumen de las células vasculoendoteliales. La expresión de las moléculas de adhesión está
controlada por citocinas como TNF-α, IL-1 e IFNγ, pues facilitan la adhesión de
leucocitos a las células endoteliales y la extravasación al tejido (Paleolog, 2002).
I.2 Anticuerpos de tiburón IgNAR.
Los componentes principales del sistema inmune adaptativo como los anticuerpos, los receptores de células T y el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de tipo I y II, han sido identificados en peces
cartilaginosos incluyendo a tiburones, rayas y quimeras (Rumfelt et al., 2004) que
divergieron evolutivamente de los vertebrados hace ~450 millones de años
(Streltsov et al., 2004).
Los anticuerpos IgM e IgW de los peces cartilaginosos presentan dominios
variables en las cadenas pesadas y ligeras VH/VL (Streltsov et al., 2004) al igual
que los anticuerpos humanos. Sin embargo, Greenberg y colaboradores (1995), reportaron el aislamiento de un nuevo miembro en la familia de las
inmunoglobulinas en el tiburón Glinglymostoma cirratum que sólo contiene el
fragmento variable pesado (VH) teniendo un peso molecular de 12 kDa y cinco
dominios pesados constantes, llamado IgNAR (nuevo receptor de antígeno). También, en camélidos se han encontrado anticuerpos que carecen de cadena
variable ligera (VL) y además, la constante pesada 1 (CH1), teniendo un peso
molecular de ~95 kDa comparados con los ~160 kDa de un anticuerpo humano (Riechmann y Muyldermans, 1999) (Figura 5).
El arreglo de IgNAR consta de cinco regiones constantes y una variable,
además, es muy similar a los VHH encontrados en camélidos, pudiendo significar
una convergencia evolutiva en el ámbito molecular. Los VHH, son capaces de
unirse a un amplio rango de proteínas, haptenos y péptidos (Nuttall et al., 2002).
Los genes de IgNAR, se encuentran agrupados, cada grupo ésta
compuesto por una región sencilla variable (VH), tres elementos de diversidad (D)
y un gen sencillo de unión (J) (Stanfield et al., 2004). El repertorio primario de VH
et al., 2003). La secuencia AGC/T es un ¨punto caliente¨ de mutaciones por
sustitución de bases, difiriendo del mecanismo presente en mamíferos donde las mutaciones ocurren en regiones con pares de GC. Además, muchas mutaciones ocurren en pares o tripletes, presumiblemente para conservar el marco de lectura
(Díaz et al., 1999).
Ig camélidos IgNAR IgG
Figura 5. Comparación entre inmunoglobulinas. a) Ig de camélidos, consta de dos regiones constantes y sus dominios sencillos; b) IgNAR, tiene dos cadenas pesadas, con cinco regiones constantes y una región variable pesada; c) IgG humana, compuesta de tres dominios constantes pesados y dos cadenas pesadas variables y dos cadenas ligeras variables (Holliger y Hudson, 2005).
de tirosina conservado en el CDR1, probablemente sirven como primera línea de defensa. Independientemente del tipo, las inmunoglobulinas IgNAR tienen un CDR2 y un CDR4 poco variable y concentran su diversidad en su CDR3, que
puede variar de 5 a 23 residuos de largo dependiendo del tipo (Streltsov et al.,
2004).
El dominio variable de IgNAR tiene estructura de sándwich β y consiste de 8
cadenas β (Figura 6) debido a la falta del CDR2, a diferencia de las 10 cadenas
que se encuentran en la familia de inmunoglobulinas humanas,. Su CDR3 tiene una longitud de 15 a 23 residuos (en tipo I) y contiene enlaces disulfuro inusuales. Las características de IgNAR hacen difícil su clasificación. Al compararlo con inmunoglobulinas de vertebrados, se encontró que existe una homología del 35%
de la región VH de IgNAR con la región VH de las inmunoglobulinas Vκ humana
(Stanfield et al., 2004).
a) b)
II. ANTECEDENTES
II.1.1 Medicamentos biológicos modificadores de la enfermedad (DMARD´s) anti-TNF-α.
Actualmente, existen tres DMARDs que bloquean la actividad de TNF-α, y
que han sido aprobados por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos) y la EMEA (Agencia Europea de Evaluación de Medicamentos) para su uso en pacientes con artritis reumatoide.
En 1992, se iniciaron los ensayos clínicos con Infliximab (Remicade, Schering-Plough), que es un anticuerpo monoclonal tipo IgG1 quimérico de ratón y
humano (25% ratón/75% humano) con capacidad de neutralizar TNF-α
monomérico o trimérico, cuando está en forma soluble, en transmembrana y unido a su receptor. Dado que contiene la región constante del anticuerpo, puede lisar
las células que expresan TNF-α debido a la activación del sistema del
complemento. En 1998, fue aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Crohn y se extendió su indicación para el tratamiento de AR, logrando disminuir el dolor, la rigidez matutina y la inflamación después de una a dos semanas de tratamiento, con una dosificación de 3 mg/kg vía intravenosa y
una vida media en circulación sanguínea de 8 a 10 días (Andreakos et al., 2002;
Fleischmann y Shealy, 2003).
Etanercept (Enbrel, Wyeth Laboratories), es un antagonista del receptor humano p75. Consiste en una fusión dimérica que contiene la porción extracelular del receptor humano p75 unido a la porción Fc (fragmento constante) de la IgG1.
Su acción primaria es unirse e inactivar el TNF-α soluble y de membrana. Aunque
la región Fc contiene el sitio de unión de complemento no lisa las células que
expresan TNF in vitro, sin embargo, la adición de la región Fc de la IgG1 humana
le proporciona una vida media de 4.8 días y una afinidad de unión de 10-10 M
aproximadamente 400,000 pacientes con este medicamento. Es administrado una vez a la semana subcutáneamente con dosis de 50 mg/kg. Actualmente, Etanercept puede ser usado en el tratamiento de artritis idiopática juvenil,
espondilitis anquilosante y psoriasis artropática severa (Chen et al., 2006); sin
embargo, existe el reporte de la generación de fibroblastos en pacientes que han
sido tratados con etanercept (Phillips y Weinblatt et al., 2005).
En el 2002, se aprobó Adalimumab (Humira, Abbott Laboratories), el cual es una IgG1 que ha sido modificada empleando la tecnología de despliegue en fagos, con secuencias de aminoácidos de líneas germinales humanas, haciéndolo indistinguible en estructura y función a la IgG1 normal. Tiene una alta especificidad
y una afinidad de 6X10-10 M. Además, ha sido manipulado para tener un bajo
grado de inmunogenicidad (van de Putte et al., 2003). Tiene la capacidad de lisar
las células que expresan TNF in vitro en presencia del complemento, su vida
media en suero es de 14 a 19 días (Fleischmann y Shealy, 2003).
Lenercept (Genentech, Roche), es una fusión similar a etanercept pero, está dirigido al dominio extracelular del receptor p55. Es purificado de células eucarióticas como una proteína glucosilada de 120 kDa. Su beneficio terapéutico
se demostró en animales de laboratorio, dada su capacidad de neutralizar TNF-α
en sepsis severas y choque séptico (Richter et al., 1998). En pruebas clínicas
iniciales, presentó alto grado de inmunogenicidad en pacientes con artritis reumatoide (Fleischmann y Shealy, 2003).
Dos terapias biológicas alternativas, fueron aprobadas en 2006 por la FDA: Rituximab (Rituxan, Roche) que es un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD20 de los linfocitos B y Abatacept (Orencia, Bristol-Myers) dirigida contra el antígeno humano citotóxico asociado a linfocito T (CTLA-4) unido a la porción Fc de la IgG
(Economides et al., 2003; Genovese et al., 2005; Todd et al., 2007).
Estos antagonistas (Figura 7), presentan muchas ventajas sobre otros DMARDs, debido a que exhiben un corto tiempo de respuesta, proveen una respuesta clínica significativa, mejoran la calidad de vida (Chang y Kavanaugh,
2005) y, basados en los efectos a corto plazo de neutralización del TNF-α y
marcadores biológicos, se ha propuesto que estos tratamientos reducen la activación endotelial y la angiogénesis, logrando ser condro-protectivos (den
Broeder et al., 2002).
Región variable de ratón
IgG1 humana Fc de IgG1
humana
Receptor p75 humano
Región variable humano TNF-α
II.1.2 Medicamentos biológicos modificadores de la enfermedad (DMARD´s) anti-VEGF165.
Las ventajas de la terapia anti-angiogénica incluyen; primero, la supresión del crecimiento de vasos sanguíneos, disminuyendo el aporte de nutrientes a las células metabólicamente activas presentes en el tejido inflamado; segundo, al evitar la angiogénesis, se bloquea el acceso de células inflamatorias al tejido; tercero, al inhibir la activación de las células endoteliales, su proliferación y reacomodo, se inhibe la producción de factores solubles derivados de éstas células como selectinas, quimiocinas y citocinas (Griffioen y Molema, 2000).
Cooke y colaboradores, en 2001, aislaron un scFv (fragmento variable de cadena sencilla) llamado LL4, que reconoce el complejo VEGF:receptor. Fue
obtenido de ratones inmunizados con VEGF165 empleando la técnica de
despliegue en fagos, logrando su expresión en bacterias y su purificación por cromatografía de afinidad. Por inmunohistoquímica, se demostró que este scFv LL4 se une al endotelio placentario humano y a un amplio rango de tumores.
En 2004, la FDA y en 2005 la EMEA, aprobaron Bevacizumab (Avastin, Genentech), que es un anticuerpo IgG1 monoclonal humanizado que se une e
inhibe la actividad biológica del VEGF tanto in vivo como in vitro. Contiene las
regiones de los FR (estructurales) y las regiones de los CDRs (regiones determinantes de la complementariedad) de anticuerpos de ratón que se unen a VEGF para evitar la angiogénesis. El sistema de expresión recombinante son células de ovario de ratón y su peso molecular aproximado es de 149 kDa. Se emplea en el tratamiento de cáncer colorectal logrando extender la esperanza de
vida (Smith et al., 2005; http://www.fda.gov/).
Asimismo, Pegaptanib (Macugen, EyeTech Pharmaceuticals), bloquea
específicamente VEGF165 y ha sido validado en ensayos clínicos. Este aptámero
por la edad. Pegaptanib, es administrado en una dosis de 0.3 mg una vez a la
semana por seis semanas en inyecciones intravitreales (Ng et al., 2006).
Los DMARDs biológicos, representan un avance en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes. En el pasado, había pacientes en quienes ninguna de las terapias existentes era capaz de controlar la inflamación y la posterior destrucción de las articulaciones. Para estos pacientes, los nuevos fármacos representan una segunda oportunidad de vida (Fan y Leong, 2007).
II.2 Bibliotecas de Anticuerpos VHNAR.
Existen por lo menos 17 anticuerpos aprobados por la FDA para el uso en pacientes con diferentes enfermedades y aproximadamente 352 se encuentran en ensayos clínicos de fase I o fase II, constituyendo, cerca del 25% de las proteínas que se encuentran en ensayos clínicos. Muchos esfuerzos han sido dirigidos a reducir el tamaño convencional de los anticuerpos pero, manteniendo las propiedades de unión al antígeno, como son: alta especificidad, afinidad y avidez
(Dumoulin et al., 2002; Smith et al., 2005).
La identificación de pequeños fragmentos de anticuerpos capaces de unirse al antígeno, ha progresado de moléculas recombinantes Fab (fragmento de unión al antígeno) y scFv (fragmento variable de cadena sencilla) a dominios sencillos
de unión a proteínas basados en inmunoglobulinas de dominios tipo VH (variable
pesado), ofreciendo el desarrollo de nuevas estrategias inmuno-terapéuticas e inmuno-diagnósticas. La mimetización de los fragmentos de unión al antígeno a dominios más pequeños ofrece la ventaja de incrementar la estabilidad y la posibilidad de acceso a epítopos antigénicos que no son reconocidos por
Según Riechmann y Muyldermans (1999), al comparar anticuerpos de
camello tipo VHH con la fracción VH humana se podrían diseñar fragmentos VH
humanos modificados (quiméricos), que tendrían las características de ser pequeños y unidades eficientes de reconocimiento y que por lo tanto, pueden competir exitosamente con los scFv en diversas aplicaciones.
Nuttall y colaboradores (2002), lograron construir una biblioteca de anticuerpos de tiburón no inmune, por medio de la técnica de despliegue en fagos
basados en regiones variables de wIgNAR del tiburón inmunizado Orectolobus
maculatus, con la capacidad de reconocer la proteasa gingipaina K de
Porphyromonas gingivalis (bacteria anaeróbica estrechamente relacionada con
enfermedades periodontales). Además de clonarlo en una cepa de E. coli
productora de proteínas. Siendo la primer descripción de especificidad antigénica de NARs obtenidos del repertorio natural del tiburón como probable fuente de anticuerpos de dominios sencillos con alta afinidad.
Nuttall et al. (2003), generaron una biblioteca in vitro con regiones de CDR3
sintéticos de 15 a 18 residuos de longitud, obteniendo una clona (12F-11) que es
capaz de reconocer con una Kd= 2.2X10-9 M a la proteína Tom70, que es un
receptor de traslocasa en la mitocondria humana.
En el 2003, Dooley y colaboradores seleccionaron una biblioteca generada en Ginglymostoma cirratum que fue inmunizado con lisozima de huevo blanco de
gallina (HEL), resultando en clonas altamente especificas al antígeno, con una
afinidad de nanomolar (en un rango de 10-7 a 10-10 M) y gran resistencia a la
desnaturalización por calor, al conservar más del 20% de su funcionalidad después de ser incubado 3 horas a temperaturas de 100º C.
También se obtuvieron VHNAR dirigidos contra lisozima y el antígeno 1 de
en E. coli de forma estable, correctamente plegados y con una afinidad de
1.31X10-7M (Nuttall et al, 2004).
Figura 8. Representación esquemática de diferentes formatos de anticuerpos. a) Fab (fragmento de unión al antígeno); b) scFv (fragmento variable de cadena sencilla); multímeros conjugados de Fab: c) Fab dimérico F(ab)2; d) Fab trimérico F(ab)3; formatos multiméricos: e) Bis-scFv; f) di-anticuerpo (diabody); g) mini-anticuerpos (minibody); h) tri-anticuerpos (triabody); i) tetra-anticuerpos (tetrabody); dominios sencillos: j) VHH camélidos; k) VHNAR; l) dominio VH y VL de humanos. Los pesos moleculares son aproximados. Se especifica su capacidad de unión al antígeno (Holliger y Hudson, 2005).
Fab (~55KDa)
F(ab)2
biespecífico (~110KDa)
F(ab)3
Triespecífico
(~165 KDa) Mini-anticuerpo (bivalente) (~75KDa)
Tri-anticuerpo (trivalente)
(~75KDa)
Tetra-anticuerpo (tetravalente)
(~100KDa) ScFv
(~28KDa)
Bis-scFv (biespecífico) (~55KDa)
Di-anticuerpo (biespecífico) (~50 KDa)
a) b)
c) d)
e) f)
g)
h)
i)
j) k) l)
Dominio Dominio Dominio VHH VHNAR VH y VL
III. JUSTIFICACIÓN
Los medicamentos biológicos modificadores de la enfermedad (DMARD´s), para el tratamiento de la artritis reumatoide que existen actualmente en el mercado dirigidos contra las citocinas empleadas en este trabajo, presentan múltiples deficiencias como: baja penetración en los tejidos debido al tamaño; alta inmunogenicidad al contar con el fragmento Fc de las inmunoglobulinas; producen anticuerpos contra los DMARD´s biológicos y son difíciles de eliminar del organismo.
En el presente trabajo, se propone el empleo de fragmentos de anticuerpos de dominio sencillo obtenidos de bibliotecas no inmunes e inmunes, desplegados
en fagos filamentosos, con capacidad de neutralizar in vitro la acción biológica de
las citocinas TNF-α y VEGF165 ya que; son pequeños (12-16 kDa) y podrían
penetrar en los tejidos y vasculatura fácilmente; mantienen una alta afinidad por el
antígeno (rango de 10-7 a 10-10 M); podrían considerarse poco inmunogénicos y de
IV. OBJETIVOS
IV.1 Objetivo General
Obtener fragmentos de dominio sencillo VHNAR del tiburón
Heterodonthus francisci por medio de la técnica de despliegue en fagos, con
capacidad neutralizante in vitro de las citocinas humanas TNF-α y VEGF165.
IV.2 Objetivos Específicos
1. Obtener bibliotecas de fragmentos VHNAR a partir de tiburones
inmunizados con las citocinas humanas TNF-α y VEGF165.
2. Aislar y expresar las proteínas seleccionadas de la biblioteca no
inmune y de las bibliotecas inmunes por la técnica de despliegue en fagos.
3. Determinar por medio de ensayos de actividad en líneas celulares
sensibles a la acción biológica de las citocinas TNF-α y VEGF165 la
dosis letal media (DL50) y la dosis efectiva media (DE50)
respectivamente.
4. Determinar la capacidad neutralizante (DI50), de las proteínas
VHNAR obtenidas contra TNF-α y VEGF165 por medio de bioensayos
V. METODO
V.1 GENERACION DE LAS BIBLIOTECAS INMUNES. V.1.1 Protocolo de Inmunización.
Se inmunizó un tiburón Heterodontus francisci con una solución de TNF-α
(PEPROTECH) y VEGF165 (PEPROTECH) a una concentración inicial de 1
µg/mL, durante cinco meses por vía intravenosa de acuerdo con el protocolo descrito en la tabla II. Antes de la primera inmunización y antes de sacrificar al organismo, se obtuvo suero de la vena caudal.
Tabla II. Protocolo de inmunización.
Semana Extracción de sangre
Vía de inmunización
0 ++
1 -- Intramuscular. Adyuvante Completo de Freund (SIGMA)
2 ++
--3 -- Intravenosa. Adyuvante Incompleto de Freund (SIGMA)
4 ++
--5 -- Intravenosa. PBS.
6 ++
--7 -- Intravenosa. PBS.
8 ++
--9 -- Intravenosa. PBS.
10 ++
--11 -- Intravenosa. PBS.
12 ++
--16 -- Intravenosa. PBS.
17 ++
--18 -- Intravenosa. PBS.
V.1.2 Extracción de ARN total.
Se sacrificó al tiburón para obtener el bazo, esto se realizó en condiciones de asepsia, todo el material fue lavado con agua conteniendo dietil-pirocarbonato DEPC (SIGMA) al 0.1%, para evitar la acción de las ARNasas. Por disección, se extrajo el bazo y se lavó con agua-DEPC al 0.1% y se homogenizó con 15 mL de TRI-Reagent (SIGMA) en un homogenizador mecánico. Se incubó la muestra 5 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 20 mL de reactivo TRI y se centrifugó a 3,500 rpm por 10 minutos a 4º C para compactar los detritos celulares. El sobrenadante, fue transferido a un tubo limpio y se añadieron 1.5 mL de reactivo BCP (SIGMA), se agitó vigorosamente por 15 segundos y se centrifugó a 12,000 rpm por 20 minutos a 4º C. Después de la centrifugación, se formaron tres fases de diferente densidad, con cuidado, se tomó sólo la fase acuosa, que es donde se encuentra el ARN total. Se transfirió a un tubo limpio y se agregaron 15 mL de isopropanol 100%, se agitó por 15 segundos y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 12,000 rpm por 15 minutos a 4º C. Se descartó el sobrenadante y se agregaron sin resuspender 15 mL de etanol 75%, se centrifugó a 17,500 rpm por 15 minutos a 4º C. Se decantó el sobrenadante y el
precipitado fue secado a temperatura ambiente y resuspendido en 100 μL de agua
tratada con DEPC al 0.1%. Se hicieron alícuotas de 10 μL y se almacenaron a
-75ºC. La cuantificación se realizó en un espectrofotómetro (Bio-RAD Smart Spec 3,000) a una longitud de onda de 260 nm. Con la finalidad de obtener la pureza de extracción se empleó la relación 260 nm/280 nm.
V.1.3 Reacción de Retrotranscripción.
Empleando el kit Acces RT-PCR System (PROMEGA), se hizo la retrotranscripción empleando solamente el oligonucleótido anti-sentido (Tabla IV)
y 1 μg de ARNtotal. Este fragmento, fue visualizado en un gel de agarosa al 2%
V.1.4 PCR para obtener ADN doble cadena.
Por medio de la reacción de PCR, se generó la doble hebra de ADN empleando una mezcla de oligonucleótidos (Tabla IV), que incluyen 7 oligonucleótidos sentido y uno antisentido, específicos para amplificar los fragmentos variables de IgNAR. En la reacción, se empleó la enzima TAP polimerasa (CLP) que se activa a 94º C y evita la generación de fragmentos inespecíficos. Las condiciones de reacción de PCR se muestran en la Tabla III. Una alicuota del producto se visualizó en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio.
Los oligonucleótidos empleados incluyen la secuencia de corte de la enzima
SfiI (no mostradas). Se hicieron las reacciones de PCR suficientes para obtener la
cantidad necesaria de ADN para generar cada biblioteca inmune.
El total de las reacciones de PCR, se mezclaron y se cargaron en un gel preparativo de agarosa al 1.5%, se cortó la banda de interés. Esta banda, fue congelada a -75º C y triturada hasta obtener la mayor cantidad de ADN (repitiendo el proceso en cuatro ocasiones), este método es llamado
congelamiento-trituración, se filtró en una membrana de 0.45 μm centrifugando 15 minutos a
12,000 rpm y esto se precipitó toda la noche a –20º C con; 1/10 volúmenes de
acetato de sodio 3 M pH 5; 2.2 volúmenes de etanol al 100% y 1 μL de glucógeno.
Tabla III. Condiciones de PCR para la amplificación de ADN doble hebra.
Numero de ciclos
Temperatura ºC
Tiempo
1 94º 5 minutos
30 94º 30 segundos
56º 30 segundos
72º 1 minuto
1 72º 10 minutos
V.1.5 Digestión del fragmento VHNAR.
Se digirieron 1.5 μg del fragmento VHNAR correspondiente a TNF-α y 1.2
μg de VEGF165 con la enzima de restricción SfiI (40 U/μl-PROMEGA), empleando
5 U por μg de ADN, por 5 horas a 55º C a un volumen final de reacción de 25 μL.
Se inactivó la enzima 15 minutos a 65º C. Se hizo un gel preparativo al 2% para recuperar el ADN purificando por el método de congelamiento-trituración.
V.1.6 Purificación del vector de clonación pCOMb3X.
Empleando el kit Qiagen Maxi Prep (QIAGEN), se purificó el plásmido pCOMb3X de un volumen final de cultivo de 2.5 L. Se cargó una alícuota en un gel de agarosa al 1% para visualizar la calidad de la purificación. Se cuantificó por espectrofotometría a 260 nm.
V.1.7 Digestión del vector de clonación pCOMb3X
Se digirieron 10 μg de vector en un volumen de reacción de 20 μL,
empleando 5 U por μg de ADN de la enzima SfiI (40 U/mL). Se incubó 5 horas a
cargó en un gel preparativo y se cortaron las bandas de los fragmentos de 3,500 pb y 1,500 pb, que corresponden respectivamente, al vector cortado en sus dos sitios de restricción y al fragmento de relleno que resulta de ésta digestión. Se obtuvo el ADN por el método de congelamiento-trituración y se precipitó, agregando 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.8 y 2.2 volúmenes de etanol al 100% toda la noche a -20º C. Se centrifugó 20 minutos a 4º C, se descartó el sobrenadante y se añadió 1 mL de etanol al 75%, se centrifugó a 12,000 rpm por 20 minutos. Se descartó el sobrenadante y se secó el pellet de 5 a 10 minutos a 37º C. Se resuspendió en agua libre de nucleasas y se fue almacenado a –20º C.
V.1.8 Ligación a pequeña escala.
Se realizaron ligaciones de prueba a pequeña escala para asegurar que los reactivos y los fragmentos digeridos se encontraban en óptimas condiciones. Con
la enzima T4 ADN ligasa (CLP), se ligaron el inserto VHNAR y el vector pCOMb3X
previamente digeridos en relación molar 1:1, es decir, un fragmento VHNAR y un
vector pCOMb3X. El volumen final de reacción fue de 20 μL, con 5 U de T4 ligasa
/μg ADN. Se incubó 12 horas a 25º C y se inactivó la enzima a 65° C por 15
minutos. También, se hicieron reacciones de prueba con el vector digerido en ambos sitios de corte y el fragmento de relleno como control positivo y como control negativo, se empleó el vector sin fragmento de relleno con enzima y sin enzima.
Para verificar la eficiencia de la ligación, 1.5 μL del producto de cada
ligación a pequeña escala fue electroporado (200 Ohms, 2.5kV y 4 milisegundos)
en 50 μL de células E. coli cepa ER2537 electrocompetentes. Inmediatamente
después, se lavó la celda de electroporación con 2 mL de medio SOC (2%
triptona, 0.5% extracto de levadura, 0.05% NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2,
sembraron en placas de LB agar con ampicilina (20 μg/mL concentración final),
diluciones de 1 μL, 10 μL y 100 μL de este cultivo. Se incubaron toda la noche a
37º C. Se cuantificó el número de colonias y se obtuvo la eficiencia de ligación y transformación expresado como unidades formadoras de colonias (ufc).
V.1.9 Ligación a gran escala.
Una vez determinada la eficiencia de ligación, se procedió a la ligación a
gran escala. En un volumen final de 200 μL, se agregaron 1.3 μg de pCOMb3X
digerido y 350 ng de los fragmentos VHNAR, con 5 U/μg ADN de T4 ligasa,
incubándose 12 horas a 25º C. El producto total de la ligación, fue electroporado
en 300 μL de células ER2537 electrocompetentes incubadas previamente 1
minuto con el ADN. Se lavó la celda con 3 mL de medio SOC previamente ambientado. Se incubó 1 hora a 37ºC a 250rpm, después se agregaron 10 mL de
medio SB y 3 μL de ampicilina (100 mg/mL concentración inicial). Se preparó una
dilución de 1:100 del cultivo y se sembraron 10 μL y 100 μL en placas de LB agar
con ampicilina (20 μg/mL concentración final) toda la noche. Se calculó el tamaño
de la biblioteca empleando la siguiente fórmula:
Volumen final de la ligación Número de ufc Volumen de cultivo Volumen de la ligación transformada volumen de siembra
V.2 SELECCIÓN DE FRAGMENTOS VHNAR ESPECÍFICOS PARA LAS
CITOCINAS TNF-α Y VEGF165. BIBLIOTECAS NO INMUNES Y
BIBLIOTECAS INMUNES.
En nuestro laboratorio se contaba con una biblioteca procedente de un
tiburón H. francisci no inmunizado y dado que existe evidencia científica (Dooley et
al., 2003, 2005; Nuttall et al., 2000, 2001, 2002, 2004) de que es posible obtener
anticuerpos de tipo VHNAR de bibliotecas no inmunes empleando la técnica de
despliegue en fagos, se optó por realizar rondas de selección de ésta biblioteca
contra las citocinas recombinantes humanas TNF-α y VEGF165. Asimismo, se
emplearon las bibliotecas inmunes generadas.
V.2.1 Reamplificación de la Biblioteca No Inmune.
Se creció un cultivo de 2 mL de medio SB conteniendo 2 μL de células
ER2537 electrocompetentes sin antibiótico y se incubaron en agitación a 250 rpm hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm fue de 1. Las células se
infectaron con 10 μL de fagos de la biblioteca no inmune y se incubaron 15
minutos a temperatura ambiente para permitir la infección. Se agregaron 10 μL de
ampicilina (100 mg/mL).
Para calcular el tamaño de la biblioteca expresada en unidades formadoras
de colonia, se sembraron 1 μL y 10 μL de una dilución 10-4 del cultivo anterior de 2
mL, en placas de LB agar con ampicilina (20 μg/mL). Se incubaron toda la noche a
37º C. Para calcular el número de transformantes se multiplicó el número de colonias por el volumen de cultivo y se dividió entre el volumen de siembra. El
cultivo se incubó 1 hora a 37º C y 300 rpm, después se agregaron 15 μL de
Se agregaron 2 mL de fago ayudador VCSM13 y 148 mL de medio SB
precalentado conteniendo 75 μL de ampicilina (100 mg/mL). Se agitó por 2 horas a
300 rpm y 37º C y se añadieron 280 μL de kanamicina (SIGMA) y se continúo
agitando toda la noche a 300 rpm y 37º C. Para precipitar los fagos amplificados, se centrifugó el cultivo a 4,500 rpm por 20 minutos a 4º C, el sobrenadante se decantó y se transfirió a tubos limpios que contienen 8 gr de polietilenglicol-8000 (PEG-8000) y 6 gr de NaCl, se agitó a 300 rpm por 5 minutos para disolver los sólidos, posteriormente se incubó en hielo 30 minutos. Se centrifugó a 12,000 rpm por 30 minutos, una vez precipitados, se decantó el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 2 mL de albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en PBS 1X. Se transfirió a tubos de 2 mL y se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos. El
sobrenadante se filtró en una membrana con tamaño de poro de 0.2 μm.
V.2.2 Amplificación de las Bibliotecas Inmunes.
Después de electroporar la ligación a gran escala, se tomó el cultivo del
apartado V.1.9, y se le añadieron 10 mL de medio SB y 3 μL de ampicilina (100
mg/mL). Para calcular el número total de transformantes, se diluyeron 2 μL del
cultivo en 200 μL de medio SB, y se sembraron 10 μL y 100 μL de esta dilución, se
incubaron a 37° C toda la noche, se calculó el número total de transformantes,
multiplicando el volumen de cultivo y dividiéndolo entre el volumen de siembra.
El cultivo se incubó 1 hora a 37° C y 250 rpm. Se agregaron 4.5 μL de
ampicilina (100 mg/mL), y se incubó 1 hora adicional. Se le adicionaron 2 mL de
fago ayudador VCSM13 y 183 mL de medio SB conteniendo 92.5 μL de ampicilina
(100 mg/mL), agitándolo por 2 horas a 37° C y 300 rpm. Se añadieron 280 μL de
Se precipitaron los fagos como se describió en el apartado V.2.1 con PEG-8000-NaCl y se recuperaron por centrifugación, los 2 mL finales fueron empleados en las rondas de selección.
V.2.3 Rondas de selección contra las citocinas. Bibliotecas No Inmunes y Bibliotecas Inmunes.
Los fagos obtenidos después de la reamplificación de la biblioteca
(apartado V.2.1), se pusieron en contacto con 50 μL de citocina inmovilizada (5
μg/mL) en dos pozos de una placa de ELISA (COSTAR), previamente incubada 1
hora a 37º C y bloqueada por 1 hora a 37º C con 150 μL de BSA 3%-PBS 1X. Se
incubaron 50 μL de fagos a 37º C por 1 hora. Posteriormente, se iniciaron los
lavados astringentes en el siguiente orden: 5 lavados para la ronda 1; 10 lavados para la ronda 2; 15 lavados para la ronda 3 y 20 lavados para la ronda 4. Dichos
lavados implican subir y bajar 150 μL de Tween 0.05%-PBS 1X por pozo, cinco
veces y dejando reposar 5 minutos entre cada lavado. Este proceso se repitió en cada una de las rondas.
Después de las rondas de lavados correspondientes, se agregaron 50 μL
de Tripsina 10 μg/mL (DIFCO) en BSA 1% y se incubó 30 minutos a 37º C. Se
lavó esta solución subiendo y bajando el volumen vigorosamente 10 veces y con
estos fagos se infectó un cultivo de 2 mL de células E. coli cepa ER2537 que se
encontraban a una densidad óptica de 1 a 600 nm. Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente, para permitir la infección de las bacterias por los fagos seleccionados. El cultivo se transfirió a un tubo de 50 mL conteniendo 6 mL de
medio SB y 1.6 μL de ampicilina (100 mg/mL), para calcular la cantidad de clonas
que fueron infectadas por los fagos seleccionados (titulación de entrada), se creció un cultivo de 2 mL de células ER2537 a una densidad óptica de 1, de este cultivo,
se tomaron 50 μL y fueron infectados con 1 μL de una dilución 10-8 de fagos
temperatura ambiente y se sembraron en placas de LB agar con ampicilina (20
μg/mL). Las placas se incubaron toda la noche a 37º C. Para hacer la ¨titulación de
entrada¨, se diluyeron 2 μL de la muestra y 200 μL de medio SB, y se sembraron
100 μL y 10 μL de esta dilución en placas de medio LB con ampicilina toda la
noche a 37° C. El cultivo se incubó 1 hora a 37º C agitándose a 250 rpm.
Después, se agregaron 2 μL de ampicilina (100 mg/mL) y se incubó otra
hora. Este cultivo fue transferido a un matraz de 500 mL y se le añadió 1 mL de
fago ayudador VCSM13, 91 mL de medio SB y 46 μL de ampicilina (100 mg/mL).
Se incubó 2 horas a 37º C y 250 rpm. Se agregaron 140 μL de kanamicina (50
mg/mL-SIGMA) y se incubó toda la noche. Este proceso se repitió en cada una de las rondas de selección, sólo que, para las siguientes rondas, se empleó un pozo de la placa de ELISA conteniendo el antígeno inmovilizado y se fueron aumentando los lavados astringentes. De estas clonas es posible hacer PCR de colonia para seleccionar clonas que tengan inserto.
V.2.4 Preparación de células electrocompetentes E. coli cepas ER2537
y TOP10F´.
Se creció un cultivo de células ER2537 o TOP10F´, en medio LB sólido sin antibiótico, toda la noche a 37º C con la finalidad de aislar colonias. Al día siguiente, se tomó una sola colonia y se inocularon 15 mL de medio SB líquido sin antibiótico toda la noche a 37º C con agitación de 250 rpm. Después, se tomó un inóculo de 1/100 y se colocó en 500 mL de medio SB previamente ambientado a
37º C conteniendo 10 mL de glucosa 20% y 5 mL de MgCl2 1 M, sin antibiótico. Se
minutos. Se descartó el sobrenadante y se repitió el proceso dos veces más. Después de cada centrifugación se redujo el número de tubos a la mitad. Al finalizar, con cuidado, se decantó el sobrenadante hasta que se deslizó la superficie del paquete celular y fue resuspendido en este volumen. Se hicieron
alícuotas de 50 μL, 100 μL y 300 μL que fueron almacenadas a –75º C.
V.2.5 Preparación de fago ayudador (VCSM13).
Se inocularon 2 mL de medio SB con 2 μL de células ER2537 y se agitó 1
hora a 37º C. Se preparó una dilución de 10-4 de fago ayudador VCSM13 en medio
SB y se infectó con 1 μL el cultivo de ER2537. Se incubó 15 minutos a
temperatura ambiente. Se sembró en placas de LB agar para aislar colonias infectadas, y se incubó toda la noche 37º C. Al siguiente día, se inocularon 10 mL
de medio SB con 10 μL de células ER2537 y se incubó 1 hora 37º C y 250 rpm. Se
transfirió una colonia aislada al cultivo de ER2537 y se incubó por 2 horas a 37º C
a 250 rpm. Se transfirió a un matraz de 2 L con 500 mL de medio SB y 700 μL de
kanamicina (50 mg/mL-SIGMA), y se continúo agitando toda la noche.
Al día siguiente, el cultivo fue transferido a tubos de 50 mL y puesto en agua a 70º C por 20 minutos. Los tubos se centrifugaron 20 minutos a 3,000 rpm. Se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos y se almacenó a 4º C. Para determinar la eficiencia de infección, se creció un cultivo de 2 mL de medio SB con
2 μL de células ER2537 y se incubó 1 hora a 37º C y 250 rpm. Se infectaron 50 μL
de este cultivo con las siguientes diluciones del fago ayudador; 10-7,10-8,10-9 y se
incubaron 15 minutos a temperatura ambiente. Se sembraron en cajas de LB agar toda la noche a 37º C. Al día siguiente se contó el número de colonias para
V.2.6 ELISA de fagos obtenidos de las rondas de selección. Bibliotecas No Inmunes y Bibliotecas Inmunes.
Con los fagos obtenidos de cada una de las rondas de selección y de cada
una de las bibliotecas, se hizo un ELISA, en el cual se inmovilizan 50 μL de cada
una de las citocinas (50 μg/mL) por triplicado, incubando 1 hora a 37º C. Se
descartó el antígeno y se bloquearon los pozos con 150 μL de leche descremada
al 5%-PBS 1X, se incubó a 37º C por 1 hora. Se descartó la solución y se
agregaron 50 μL de cada una de las rondas de selección, incubando 1 hora a 37°
C. Se descartó la solución y se lavó tres veces con Tween 0.05 %-PBS 1X. Se
agregaron 50 μL del anticuerpo anti-M13 (AMERSHAM BIOLABS) diluido 1:1000
en leche descremada 3%-PBS 1X. Se incubó 1 hora a 37° C, se descartó la
solución y se lavó tres veces con Tween 0.05%-PBS 1X. Se decantó ésta solución
y se añadieron 50 μL de sustrato para peroxidasa (ABTS 20 mg/mL, buffer de
citratos 1x, H2O2 0.3%). Se incubó la placa de 15 a 20 minutos a temperatura
ambiente. Se cuantificó en un lector de ELISA (BIORAD BECHMARK) a 405 nm.
V.3 BÚSQUEDA DE CLONAS POSITIVAS. BIBLIOTECAS NO INMUNES E INMUNES.
V.3.1 PCR de colonia.
De las colonias producto de las últimas dos rondas de selección (R3 y R4), previamente aisladas para cada una de las bibliotecas analizadas, se hicieron reacciones de PCR con una mezcla de oligonucleótidos (Tabla IV) a una
concentración inicial de 20 μM, para verificar si contenían el inserto
correspondiente a los fragmentos VHNAR. Las condiciones de la reacción de PCR
Los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio 5 mg/mL. De las clonas con inserto, se creció un
cultivo de 6 mL de medio SB con 6 μL de ampicilina (20 mg/mL), con la finalidad
de aislar plásmido y poder transformar células TOP10F´, dado que esta cepa es capaz de producir proteína soluble.
Tabla IV. Oligonucleótidos específicos para amplificar fragmentos VHNAR.
Secuencia
Sentido GCACGGCTTGAACAAACACC Sentido CAACGGGTTGAACAAACACC Sentido ACAAGGGTAGACCAAACACC Sentido GCAAGGGTGGACCAAACACC
Sentido GCATGGGTAGACCAAACACC
Sentido GCAAGCCTGGACCAAACACC
Sentido GCATTGACGGACCAAACACC Antisentido GTTCACAGTCAGCACGGTGCCAGCTC
Tabla V. Condiciones de PCR para amplificar fragmentos VHNAR de colonia.
Numero de ciclos
Temperatura ºC
Tiempo
1 94º 7 minutos
30 94º 45 segundos
56º 45 segundos
72º 45 segundos
V.3.2 Células Quimiocompetentes TOP10F´.
Se creció un cultivo procedente de una colonia aislada de TOP10F´ en 2 mL de medio SB toda la noche a 37º C y 250 rpm sin antibiótico. Al día siguiente, se diluyó el cultivo 1:50 en medio SB ambientado y se creció a una densidad óptica aproximadamente de 0.3 a 600 nm. Las células se obtuvieron por centrifugación y
fueron resuspendidas en ½ volumen de CaCl2 100 mM frío. Se incubaron en hielo
por 20 minutos, y fueron centrifugadas a 10,000 rpm para concentrar las células.
En condiciones de esterilidad, se resuspendieron en 1/10 de volumen de CaCl2
100 mM frío. Se incubaron en hielo 1 hora. Las células se emplearon en transformaciones por choque térmico o fueron conservadas agregando glicerol
estéril a una concentración final de 15% haciendo alicuotas de 200 μL en tubos
estériles y se almacenan a –75º C.
V.3.3 Aislamiento de plásmido.
Se empleó el kit Qiagen Miniprep (QIAGEN) y las condiciones proporcionadas por el fabricante para la obtención del plásmido que fue cuantificado a 260 nm.
V.3.4 Transformación en la cepa TOP10F´ quimiocompetente.
Los tubos conteniendo los plásmidos provenientes de las clonas positivas al
inserto se centrifugaron y se tomaron 1.5 μL del fondo del tubo que fueron
transferidos a tubos estériles de 1.5 mL, se pusieron en hielo por 2 minutos. Se
agregaron 50 μL de células TOP10F´ quimiocompetentes, agitando sin
resuspender pues las células son frágiles. Se incubó en hielo por 20 minutos. Para hacer el choque térmico, se incubaron los tubos a 42º C exactamente por 1 minuto e inmediatamente se transfirieron a hielo y se incubaron 5 minutos. Se añadieron
950 μL de medio SOC sin antibiótico. Se incubó de 1 a 1.5 horas a 150 rpm y 37º
C. Se sembraron 50 μL en cajas de LB con agar y ampicilina (20 µg/mL). Se hizo
V.4. EXPRESIÓN DE PROTEÍNA EN CEPA TOP10F´.
V.4.1 Expresión de VHNAR.
De los cultivos procedentes de clonas con inserto y transformadas por choque térmico, se inoculo 1/100 y se crecieron cultivos de 6 mL de medio SB con
20 mM de MgCl2 y 6 μL de ampicilina (20 µg/mL), a una densidad óptica de 0.9 a
600 nm. Para inducir la producción de proteína, se agregaron 7.2 μL de IPTG (0.5
mM- PROMEGA) y se incubó toda la noche a 30º C y 250 rpm.
V.4.2 Extracción periplásmica de proteína VHNAR.
Para obtener la proteína VHNAR, se centrifugaron los cultivos y el paquete
celular fue resuspendido en 1/40 de volumen en solución de choque osmótico PPB (30 mM Tris–HCl pH 8, 0.1 mM EDTA, 20% sacarosa), se incubaron en hielo por 20 minutos. Se centrifugó a 5,000 rpm por 20 minutos para concentrar las células. El sobrenadante, que contiene proteínas, fue transferido a un tubo limpio. Al
paquete celular, se le agregó 1 mL de MgSO4 5 mM frío y se resuspendió,
después se incubó por 20 minutos en hielo. Para concentrar las células, se centrifugó a 5,000 rpm por 20 minutos y el sobrenadante se mezcló con el primer sobrenadante colectado.
V.4.3 ELISA de expresión.
Por triplicado, se pusieron 50 μL de la proteína obtenida por choque
osmótico en pozos de ELISA, se incubó 1 hora a 37º C. Posteriormente, se
descartó la solución y se bloquearon los pozos con 150 μL de BSA 3%-PBS 1X
incubando 1 hora a 37º C. Se lavaron los pozos con Tween 0.05%-PBS 1X tres
veces. Se agregaron 50 μL de anticuerpo anti-HA (ROCHE) diluido 1:1000 en BSA
1%-PBS 1X, y se incubó 1 hora a 37º C. Se lavó tres veces con Tween
buffer de citratos 1x, H2O2 0.3). La placa fue leída después de 20 minutos a 405
nm en un lector de ELISA.
V.4.4 ELISA de reconocimiento citocina-VHNAR.
Se inmovilizaron 50 μL de cada una de las citocinas (50 μg/mL) en una
placa de ELISA por triplicado y para cada clona, se incubó 1 hora a 37º C. Se
descartó el antígeno y se bloqueó la placa con 150 μL de BSA 3%-PBS 1X,
incubando 1 hora a 37º C. Se lavaron los pozos con Tween 0.05%-PBS 1X tres
veces. Se agregaron 50 μL de la extracción periplásmica de las clonas positivas y
se incubó 1 hora a 37° C. Se decantó y lavó tres veces. Se agregaron 50 μL de
anticuerpo anti-HA (ROCHE) diluido 1:1000 en BSA 1%-PBS 1X y se incubó 1
hora a 37º C. Se lavó tres veces y se añadieron 50 μL de sustrato para
peroxidasa. Se leyó la absorbancia a 405 nm.
V.5 PURIFICACION DE PROTEINA VHNAR POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD A METALES.
Una vez seleccionadas las clonas que expresan proteínas VHNAR y que
reconocen a la citocina seleccionada, se indujo un volumen de expresión de 500 mL y se purificó el extracto celular mediante cromatografía de afinidad a metales, empleando columnas His Trap HP (AMESHARM BIOSCIENCES) de 1 mL.
Fue necesario preparar la muestra ajustando la concentración de Imidazol
hasta una concentración final de 40 mM. La muestra se filtró en una membrana de
0.22 μm. Se lavó la columna con 5 mL de agua destilada y se equilibró pasando 5