VI. RESULTADOS Y DISCUSIONES
VI.5.3 Ensayo de proliferación de células HUVEC estimuladas
Para determinar la dosis efectiva media de la citocina VEGF165, se
emplearon células HUVEC, que tienen en su membrana celular el receptor KDR, por lo tanto al estar en contacto con la citocina se induce la activación del proceso de división celular. Se emplearon diluciones seriadas de la citocina para conocer la dosis efectiva media (DE50) y posteriormente realizar el ensayo
de neutralización. En la Figura 22, se muestra la gráfica de proliferación producto de la acción de la citocina en las células HUVEC.
Como puede observarse en la Tabla IX, la dosis efectiva media es de 5.5 ng/mL. El coeficiente de determinación R2, muestra que no existieron variaciones considerables en este ensayo.
Curva de proliferación de células HUVEC por acción de la citocina VEGF165.
Figura 22. Ensayo de proliferación de células HUVEC por acción de VEGF165. Se trató la placa con colagenasa tipo I (16 µg/ml por pozo) por 1 hora. Se cultivaron 5,000 células/pozo
en medio M199 completo por 2 horas. Se agregaron 100 µl que contenían diluciones seriadas
1:3 de la citocina recombinante humana VEGF165, se incubó por 96 horas y se agregó reactivo CellTiter96-ONE, se incubó por 6 horas. Se leyó a 490 nm. Se muestra la desviación estándar del ensayo por triplicado. Los datos fueron analizados por el programa Graph-Pad Prism versión 4.
Tabla IX. Determinación de la dosis efectiva media (DE50) de VEGF165 en células HUVEC. Los datos fueron analizados por el programa Graph-Pad Prism versión 4.
Lote 1 Lote 1 DE50 (ng/mL) 5.55 Grados de libertad 29 Intervalo de confianza 95% 4.9 a 6.29 Número total de valores 33 R2 99.3% 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Concentración de rhVEGF 165 (ng/ml) A b s 4 9 0 nm Sigm oidal dose-response (variable slope)Best-fit values BOTTOM TOP LOGEC50 HILLSLOPE EC50Std. Error BOTTOM TOP LOGEC50 HILLSLOPE95% Confidence Intervals BOTTOM TOP LOGEC50 HILLSLOPE EC50Goodness of Fit Degrees of Freedom R_ Absolute Sum of Squares Sy.xData Num ber of X values Num ber of Y replicates Total num ber of values Num ber of m issing valuesPeproTech VEGF-0.029121.6040.74474.3585.5550.015850.022470.026340.5809-0.06153 to 0.0032901.558 to 1.6500.6909 to 0.79863.170 to 5.5464.908 to 6.289290.99330.13020.06702123333
Efecto del V EGF (PeproTech) con F(ab´) 2sobre células endoteliales de vena umbilical humana (HUEV C, cultivo
primario). Se cultivaron 5,00 0 endotelios /pozo-100µL en medio 199 (Gibco) suplementado con 10% de SFB (Gibco), adicionado con 20µg/ml de f actor de crecimiento endotelial (Sigma), en una placa de 96 pozos (Corning). Brevemente se adicionaron 100µL/pozo de 11 diluciones seriales de V EGF1 6 5 en proporción 1:3 de (iniciado con 300 ng/ml. Se mantuvieron en condiciones de cultivo (37°C, 5% de CO 2, humedad <90%) por 96h. La prolif eración se evaluó con la técnica de CellTiter96-ONE 6h adicionales, a una A bs de 490 nm en el sistema Biomek (Beckman).
VI.5.4 Ensayo de neutralización de VEGF165 con VHNAR en células
HUVEC.
Una vez determinada la DE50, se procedió a realizar el ensayo de
neutralización. Se colocaron 5,000 células HUVEC/pozo en placas tratadas con colagenasa tipo I, y se incubaron las células, después se agregaron 3ED50 de
VEGF165 y diluciones seriadas de las proteínas VHNAR.
En la Figura 23, se muestra el efecto de neutralización de la citocina VEGF165 por las clonas VEGF33-R4I y VEGF36-R4I. Dado que no existía la
cantidad suficiente de proteína del resto de las clonas para realizar este ensayo por triplicado, sólo se analizaron las clonas anteriormente mencionadas.
Para cada clona se muestra el control positivo de neutralización que consta de un F(ab)2 desarrollado y proporcionado por Laboratorios SILANES.
Como se puede observar, los datos fueron ajustados a la curva pero son muy variantes, siendo la clona VEGF36-R4I, la de mejores resultados.
En la Tabla X, se compara el efecto de neutralización de cada una de las proteínas VHNAR analizadas respecto al control positivo F(ab)2 de caballo.
Como puede observarse, es necesaria una mayor cantidad de proteína para neutralizar la misma DE50 respecto al control positivo, de nuevo hay que
recordar que se trata de una proteína de dominio sencillo y que por lo tanto, no tiene la misma avidez que el F(ab)2 usado como control positivo. Realizando
una analogía con TNF-α, podríamos decir, que la clona VEGF36-R4I posee la misma capacidad neutralizante que el control positivo.
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 F(ab´)2 anti-rhVEGF165 (µg/ml) A b s 49 0 n m F(ab)2 CellTiter-ONE clona 33 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 F(ab´)2 anti-rhVEGF1 6 5 (µg/ml) A b s 49 0 n m F(ab)2 CellTiter-ONE clona 36
Figura 23. Ensayo de neutralización de VEGF165 por las proteínas VHNAR en células HUVEC. Se trató la placa con colagenasa tipo I (16 µg/ml por pozo) por 1 hora. Se cultivaron
5,000 células HUVEC/pozo en 100 µl de medio M199 por 2 horas. Se agregaron 3DL50 de la citocina VEGF165 y diluciones seriadas 1:3 de la proteína VHNAR específica, en un volumen final de 100 µl. Se cultivó por 96 horas y se agregaron 20 µL de reactivo CellTiter96-ONE, se
incubó 6 horas. Se leyó a 490 nm. a) clona VEGF33-R4I; b) clona VEGF36-R4I. Como control positivo de neutralización se empleó un F(ab)2 de caballo desarrollado por Laboratorio SILANES. Los datos fueron analizados por el programa Graph-Pad Prism versión 4. 3DL50= 6ng/mL. a b F(ab)2 VEGF33-R4I F(ab)2 VEGF36-R4I
Tabla X. Comparación de las dosis inhibitorias medias (DI50) de las proteínas VHNAR contra la citocina VEGF165 en células HUVEC. Los datos fueron analizados por el programa Graph-Pad Prism versión 4.
F(ab)2 control VEGF33-R4I VEGF36-R4I DI50 (µg/mL) 3.06 109.5 6.32 R2 74.18% 59.26% 22.3% Grados de libertad 29 26 26 Número total de valores 33 30 30
VI.6 SECUENCIACION
Una vez analizadas las secuencias obtenidas, se realizó un alineamiento comparándolas con la secuencia reportada por Beltrán (2006) de la clona G4, que es un VHNAR dirigido contra la proteína DC-SIGN de linfocitos, empleando
el programa Mac Vector 7.2.2.
El análisis se realizó para las secuencias con las cuales se contaba en el momento de la escritura de la tesis. El alineamiento se muestra en la Figura 24. Como se puede observar, existen diferencias entre secuencias, ya sea en tamaño y/o composición de aminoácidos, sin embargo, existen cisteínas conservadas respecto a la proteína G4.
Figura 24. Alineamiento de secuencias de proteínas VHNAR seleccionadas contra la citocina TNF-α empleando el programa Mac Vector 7.2.2. Las flechas indican las cisteínas
conservadas. Formatted Alignments Clona G4 (Beltrán, 2006) TNF40-R3NI TNF43-R3NI TNF65-R3NI VEGF13-R3NI 10 20 30 A A S L D Q T P R T A T R E T G E S L T I N C V L T D N S Q A Q R V E Q T P R A A T R Q T G E S L T I N C V L T D S S Q G R S L D Q T L R T A T R E T G E S L T V N C V L V D A I Y A A S L D Q T P R T A T R E T G E S L T V N C V L V D A N Y A A S L D Q T P R T A T R E T G E S L S I N C V L T D T S H A A S L D Q T P R T A T R E T G E S L T I N C V L T D S Clona G4 (Beltrán, 2006) TNF40-R3NI TNF43-R3NI TNF65-R3NI VEGF13-R3NI 40 50 60 N L F S T K W F WH A P S S T D WK S I T I G G R Y V E S K N L F S T K W F WH A P S S T D WK S I T I G G R Y V E S K G L Y S T S W Y R N N P G S T D R EH I T I G G R Y V E S V G L Y N TS W Y R N N P G S T D R EH I T I G G R Y V E S V I L F G T K WL W N N P G S T D W E S I T I G G R Y A E S V . L F S T K W . W N N P G S T D W E S I T I G G R Y V E S V Clona G4 (Beltrán, 2006) TNF40-R3NI TNF43-R3NI TNF65-R3NI VEGF13-R3NI 70 80 90 N K Q S K S F S L Q V K D L T L E D S G T Y Y C K A K T I G N K Q S K S F S L Q V K D L T L E D S G T Y Y C K A K T I G N K G A K S F S L Q I K DM T F E D S G T Y Y C K A R - - - N K G A K S F S L Q I K DM T V E D S G T Y Y C K A R E S D N N Q A K S F S L Q I K D L T V E D S G T Y Y C K A Q T I G N K Q A K S F S L Q I K D L T . E D S G T Y Y C K A . T I G Clona G4 (Beltrán, 2006) TNF40-R3NI TNF43-R3NI TNF65-R3NI VEGF13-R3NI 100 110 120 K R R - - - P I H L I GG V MR S Y D G A G T V K R R - - - P I H L I GG V MR S Y D G A G T V - - - A T S G Y T P H D G S G T V Y N R - - - V G I R D Y K D Y D G A G T V R R K N L L P R P L V N G I A AM GY S S S D Y D G A G T V . R R N L L P R P L V N P I H . . G . . Y D G A G T V Clona G4 (Beltrán, 2006) TNF40-R3NI TNF43-R3NI TNF65-R3NI VEGF13-R3NI 130 140 150 L T V N L T V N G Q A G Q L T V N G Q A G Q Y L T V N G Q A G Q L T V N G Q A G Q L T V N G Q A G Q Y
VII. CONCLUSIONES
1. Se generaron Bibliotecas Inmunes del tiburón Heterodontus francisci dirigidas contra las citocinas recombinantes humanas TNF-α y VEGF165.
2. Por medio de la selección contra las citocinas inmovilizadas y el despliegue en fagos, se logró aislar clonas positivas a inserto por PCR, positivas a expresión de fragmentos VHNAR y con capacidad de
reconocimiento de las citocinas; de la Biblioteca No Inmune: 3 clonas contra TNF-α y 3 clonas contra VEGF165 y; de las Bibliotecas Inmunes
se aislaron 4 clonas contra TNF-α y 4 clonas contra VEGF165.
3. Se obtuvieron clonas que tienen capacidad neutralizante in vitro de la acción biológica de las citocinas: 3 clonas de la Biblioteca No Inmune contra TNF-α y; de las Bibliotecas Inmunes se obtuvieron 2 clonas dirigidas contra TNF-α y 2 clonas contra VEGF165.
4. Las proteínas neutralizantes VHNAR podrían ser una opción de fácil
obtención para el tratamiento de enfermedades en humanos donde sea necesario bloquear los efectos de las citocinas TNF-α y VEGF165.
VIII. PERSPECTIVAS
1. Determinar la afinidad de las proteínas VHNAR contra las citocinas
para las que fueron seleccionadas.
2. Realizar ensayos de neutralización in vivo en mamíferos experimentales.
IX. LITERATURA CITADA
Abbas A., Lichman A. 2003. Cellular and Molecular Immunology. 5a edición. Saunders. USA. 552 pp.
Adelman M., Schluter S., Marchalonis J. 2004. The natural antibody repertoire of sharks and humans recognizes the potential universe of antigens. Protein Journal. 23: 103–118 p.
Anderson P. 2005. Tumor necrosis factor inhibitors: clinical implications of their different immunogenicity profiles. Seminars in arthritis and rheumatism. 34(suppl 1): 19-22 p.
Andreakos E., Foxwell B., Brennan F., Maini R., Feldmann M. 2002. Cytokines and anti-cytokine biologicals in autoimmunity: present and future. Cytokine and Growth Factor Reviews. 13: 299-313 p.
Atzeni F., Sarzi-Puttini P., Dell' Acqua D., de Portu S., Cecchini G., Cruini C., Carrabba M., Moroni P-L. 2006. Adalimumab clinical efficacy and anti-cyclic citrullinated peptide one-year prospective study. Arthritis Research and Therapy. 8:R3 (doi:10.1186/ar1851) p.
Barbas C., Burton D., Scott J., Silverman G. 2001. Phage Display: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA.
Beltrán S. 2006. Obtención de un vehículo de vacunación a partir de una biblioteca de anticuerpos de tiburón. Tesis de Doctorado. CICESE. Ensenada, México. 115 p.
Bernstein R., Schluter S., Shen S., Marchalonis J. 1996. A new high molecular weight immunoglobulin class from the carcharhine shark: Implications for the properties of the primordial immunoglobulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93: 3289–3293 p.
Bessis N., Boissier M-C. 2006. Gene therapy for patients with rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine. 73: 169–176 p.
Bodamyali T., Stevens C., Billingham M., Ohta S., Blake D., 1998. Influence of hypoxia in inflammatory synovitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 57: 703–710 p.
Breedveld F., Emery P., Keystone E., Patel K., Furst D., Kalden J., St Clair E., Weisman M., Smolen J., Lipsky P., Maini R. 2004. Infliximab in active early rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 63: 149–155 p.
Brenchley P. 2001. Antagonising angiogenesis in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 60: 71-74 p.
Bush K., Walker J., Frazier J., Kirkham B. 2002. Effects of a PEGylated soluble TNF receptor type 1 (PEGs TNF-R1) on cytokine expression in adjuvants arthritis. Scandinavian Journal of Rheumatology. 31(4): 198-204 p.
Capsoni F., Sarzi-Puttini P-C., Atzeni F., Minonzio F., Bonara P., Doria A., Charraba M. 2004. Effect of adalimumab on neutrophil function in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 7: 250-255 p.
Chang J., Kavanaugh A. 2005. Novel therapies for rheumatoid arthritis. Pathophysiology. 12: 217-225 p.
Chen Y., Jobanputra P., Barton P., Jowett S, Bryan S., Clark W., Fry- Smith A., Burls A. 2006. A systematic review of the effectiveness of adalimumab, etanercept and infliximab for the treatment of rheumatoid arthritis in adults and an economic evaluation of their cost-effectiveness. Health Technology Assessment. 10(42): 1-248 p.
Cho M-L., Jung Y-O., Moon Y-M., Mina S-Y., Yoon C-H., Lee S-H., Park S-h., Cho C-H., Jue D-M., Kima H-Y. 2006. Interleukin-18 induces the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) in rheumatoid arthritis
synovial fibroblasts via AP-1-dependent pathways. Immunology Letters. 103: 159–166 p.
Choy E., Kingsley G., Panayi G. 1998. Monoclonal antibody therapy in rheumatoid arthritis. British Journal of Rheumatology. 37: 484-490 p.
Cooke S., Boxer G., Lawrence L., Pedley R., Spencer D., Begent R., Chester K. 2001. A strategy for antitumor vascular therapy by targeting the vascular endothelial growth factor:receptor complex. Cancer Research. 61: 3653-3659 p.
de Bandt M., ben Mahdi M., Ollivier V., Grossin M., Dupuis M., Gaudry M., Bohlen P., Lipson K., Rice A., Wu Y., Gougerot-Pocidalo M-A., Pasquier C. 2003. Blockade of vascular endothelial growth factor receptor I (VEGF-RI), but not VEGF-RII, suppresses joint destruction in the k/bxn model of rheumatoid arthritis. The Journal of Immunology. 171: 4853– 4859 p.
den Broeder A., Joosten L., Saxne T., Heinegård D., Fenner H., Miltenburg A., Frasa W., van Tits L., Buurman W., van Riel P., van de Putte L. 2002. Long term anti-tumor necrosis factor α monotherapy in rheumatoid arthritis: effects on radiological course and prognostic value of markers of cartilage turnover and endothelial activation. Annals of the Rheumatic Diseases. 61: 311-318 p.
Diaz M., Greenberg A., Flajnik M. 1998. Somatic hypermutation of the new antigen receptor gene (NAR) in the nurse shark does not generate the repertoire: possible role in antigen-driven reactions in the absence of germinal centers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95: 14343-14348 p. Diaz M., Stanfield R., Greenberg A., Flajnik M. 2002. Structural analysis, selection, and ontogeny of the shark new antigen receptor (IgNAR): identification of a new locus preferentially expressed in early development. Immunogenetics. 54: 501–512 p.
Diaz M., Velez J., Singh M., Cerny J., Flajnik M. 1999. Mutational pattern of the nurse shark antigen receptor gene (NAR) is similar to that of mammalian Ig genes and to spontaneous mutations in evolution: The translesion synthesis model of somatic hypermutation. International Immunology. 11: 825–833 p.
Dooley H., Flajnik M., Porter A. 2003. Selection and characterization of naturally occurring single-domain (IgNAR) antibody fragments from immunized sharks by phage display. Molecular Immunology. 40: 25-33 p.
Dooley H., Flajnik M. 2005. Shark immunity bites back: Affinity maturation and memory response in the nurse shark, Ginglymostoma cirratum. European Journal of Immunology. 35: 936–945 p.
Dumoulin M., Conrath K., van Mierhaeghe A., Meersman F., Heremans K., Frenken L., Muyldermans S., Wyns L., Matagne A. 2002. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11: 500- 515 p.
Economides A., Carpenter L., Rudge J., Wong V., Koehler-Stec E., Hartnett C., Pyles E., Xu X., Daly T., Ypung M., Fanal J., Lee F., Carver S., McNay J., Bailey K., Ramakanth S., Hutabarat R., Huang T., Radziejewski C., Yancopoulos G., Stahl Y. 2003. Cytokine traps: multi-component, high-affinity blockers of cytokine action. Nature Medicine. 9(1): 47-52 p.
Ellerin T., Rubin R., Weinblatt M. 2003. Infections and anti-tumor necrosis factor α therapy. Arthritis and Rheumatism. 48(11): 3013-3022 p.
Fan P-T., Leong K-H. 2007. The use of biological agents in the treatment of rheumatoid artritis. Annals Academy of Medicine. 36(2); 128-134 p.
Feldman M., Taylor P., Paleolog E., Brennan F., Maini R. 1998. Anti-TNF Therapy is useful in rheumatoid arthritis and Crohn’s disease: analysis of the mechanism of action predicts utility in other diseases. Transplantation Proceedings. 30: 4126–4127 p.
Ferrara N., Davis-Smyth T. 1997. The biology of vascular endotelial growth factor. Endocrine Reviews. 18(1): 4-22 p.
Ferrara N., Hillan K., Novotny W. 2005. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333: 328–335 p.
Firestein G. 1999. Starving the synovium: angiogenesis and inflammation in rheumatoid arthritis. The Journal of Clinical Investigation. 103(1): 3-4 p.
Fleischmann R., Shealy D. 2003. Developing a new generation of TNFα antagonists of rheumatoid arthritis. Molecular Interventions. 3(6): 310-317 p.
Flendrie M., Creemers M., Welsing P., den Broeder A., van Riel P. 2003. Survival during treatment with tumour necrosis factor blocking agents in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 62(Suppl II): 30–33 p.
Genovese M., Becker J-C., Schiff M., Luggen M., Sherrer Y., Kremer J., Birbara C., Box J., Natarajan K., Nuamah I., Li T., Aranda R., Hagerty D., Dougados M. 2005. Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor α inhibition. The New England Journal of Medicine. 353(11): 1114-1134 p.
Goldblatt F., Isenberg D. 2005. New therapies for rheumatoid arthritis. Clinical and Experimental Immunology. 140: 195–204 p.
Greenberg A., Avila D., Hughes M., Hughes A., McKinney E., Flajnik M. 1995. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversifications in sharks. Nature. 374(6518): 168-173 p.
Griffioen A., Molema G. 2000. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases and chronic inflammation. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics. 52(2): 237-268 p.
Hamers-Casterman C., Atarhouch T., Muyldermans S., Robinson G., Hamers C., Songa E., Bendahman N., Hamers R. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363: 446–448 p.
Hochberg M., Tracy J., Hawkins-Holt M., Flores R. 2003. Comparison of the efficacy of the tumor necrosis factor α blocking agents adalimumab, etanercept and infliximab when added o methotrexate in patients with active rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 62(suppl II): 13-16 p.
Holliger P., Hudson P. 2005. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23(9): 1126-1136 p.
Honorati M., Cattini L., Facchini A. 2004. IL-17, IL-1b and TNF-α stimulate VEGF production by dedifferentiated chondrocytes. Osteoarthritis and Cartilage. 12: 683-691 p.
Horai R., Nakajima A., HAbiro K., Kotani M., Nakae S., Matsuki T., Nambu A., Saijo S., Kotaki H., Sudo K., Okahara A., Tanioka H., Ikuse T., Ishii N., Schwartzberg P., Abe R., Iwakura Y. 2004. TNF-α is crucial for the development of autoimmune arthritis in IL-1 receptor antagonist-deficient mice. The Journal of Clinical Investigation. 114(11): 1603-1611 p.
Kirstein M., Fiers W., Baglioni C., 1986. Growth inhibition and cytotoxicity of tumor necrosis factor in L929 cells is enhanced by high cell density and inhibition of mRNA synthesis. The Journal od Immunology. 137 (7): 2277-2280 p.
Klimiuk P., Sierakowski S., Latosiewicz R., Cylwik J., Cylwik B., Skowronski J., Chwiecko J. 2002. Soluble adhesion molecules (ICAM-1, VCAM- 1, and E-selectin) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in patients with distinct variants of rheumatoid synovitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61: 804–809 p.
Koch A. 2005. Angiogenesis as a target in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 62(Suppl II): 60–67 p.
Lee S., Fitch D., Flajnik M., Hsu E. 2000. Rearrangement of Immunoglobulin genes in shark germ cells. The Journal of Experimental Medicine. 191: 1637-1648 p.
Lu J., Kasama T., Kobayashi K., Yoda Y., Shiozawa F., Hanyuda M., Negishi M., Ide H., Adachi M. 2000. Vascular endothelial growth factor expression and regulation of murine collagen-induced arthritis. The American Association of Immunologists. 164: 5922–5927 p.
Mackay F., Loetscher H., Stueber D., Gehr G., Lesslauer W. 1993. Tumor necrosis factor α (TNF-α)-induced cell adhesion to human endothelial cells is under dominant control of one TNF receptor type, TNF-R55. The Journal of Experimental Medicine. 177: 1277-1286 p.
Miao H-Q., Hu K., Jiménez X., Navarro E., Zhang H., Lu D., Ludwig D., Balderes P., Zhu Z. 2006. Potent neutralization of VEGF biological activities with a fully human antibody Fab fragment directed against VEGF receptor 2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 345: 438–445 p.
Middleton J., Americh L., Gayon R., Julián D., Aguilar L., Amalric F., Girard J-P. 2003. Endothelial cell phenotypes in the rheumatoid synovium: activated, angiogenic, apoptotic and leaky. Arthritis Research and Therapy. 6 (2): 60-72 p.
Mukherjee K., Rowe D., Watkins N., Summers D. 2004. Studies of single-chain antibody expression in quiescent Escherichia coli. Applied and Enviromental Microbiology. 70(5): 3005-3012 p.
Muyldermans S. 2001. Single domain camel antibodies: Current status. Journal of Biotechnology. 74: 277–302 p.
Nagashima M., Wauke K., Hirano D., Ishigami S., Aono H., Takai M., Sasano M., Yoshino S. 2000. Effects of combinations of anti-rheumatic drugs on the production of vascular endotelial growth factor in cultured synoviocytes and patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology. 39: 1255-1262 p.
Ng Y-S., Krilleke D., Shima D. 2006. VEGF function in vascular patogenesis. Experimental Cell Research. 312; 527-537 p.
Nuttall S., Irving R., Hudson P. 2000. Immunoglobulin VH domains and beyond: desing and selection of single-domain binding and targeting reagents. Current Pharmaceutical Biotechnology. 1(3): 253-263 p.
Nuttall S., Humberstone K., Krishnan U., Carmichael J., Doughty L., Hattarki M., Coley A., Casey J., Anders R., Foley M., 2004. Selection and affinity maturation of IgNAR variable domains targeting Plasmodium falciparum AMA1. Proteins. 55: 187–197 p.
Nuttall S., Krishnan U., Hattarki M., de Gori R., Irving R., Hudson P. 2001. Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries. Molecular Immunology. 38: 313- 326 p.
Nuttall S., Krishnan U., Doughty L., Nathanielsz A., Ally N., Pike R., Hudson P., Kortt A., Irving R. 2002. A naturally occurring NAR variable domain binds the kgp protease from Porphyromonas gingivalis. Federation of European Biochemical Societies. 516: 80-86 p.
Nuttall S., Krishnan U., Doughty L., Pearson K., Ryan M., Hoogenraad N., Hattarki M., Carmichael J., Irving R., Hudson P. 2003. Isolation and characterization of an IgNAR variable domain specific for the human mitochondrial translocase receptor Tom70. European Journal of Biochemistry. 270: 3543–3554 p.
Olichon A., Schweizer M., Muyldermans S., de Marco A. 2007. Heating as a rapid purification method for recovering correctly-folded thermotolerant VH and VHH domains. BMC Biotechnology. 7: 7.
Paleolog E. 2002. Angiogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis Research and Therapy. 4(suppl 3): 81-90 p.
Paleolog E. 2004. Hypoxia: not merely a regulator of angiogenesis?. Arthritis Research and Therapy. 6:75-77 p.
Pandya N., Dhalla N., Santani D. 2006. Angiogenesis-a new target for future therapy. Vascular Pharmacology. 44; 265-274 p.
Padyukov L., Lampa J., Heimburger M., Ernestam S., Cederholm T., Lundkvist I., Andersson P., Hermansson Y., Harju A., Klareskog L., Bratt J. 2003. Genetic markers for the efficacy of tumour necrosis factor blocking therapy in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 62: 526-529 p.
Pan B., Li B., Russell S., Tom J., Cochran A., Fairbrother W. 2002. Solution structure of a phage-derived peptide antagonist in complex with vascular endotelial growth factor. Journal of Molecular Biology. 316: 769-787 p.
Paul W. 2003. Fundamental Immunology. Lippincott Williams and Wilkins. 4a edición. USA. 1659 pp.
Peng-Thim F., Keng-Hong L., 2007. The use of biological agents in the treatment of rheumatoid artritis. Annals Academy of Medicine. 36(2): 128-134 p.
Phillips K., Weinblatt M. 2005. Granulomatous lung disease ocurring during etanercept treatment. Artritis and Rheumatism. 53(4) 618-620 p.
Pittoni V., Bombardieri M., Spinelli F., Scrivo R., Alessandri C., Conti F., Spadaro A., Valesini G. 2002. Anti-tumour necrosis factor (TNF) a treatment of
rheumatoid arthritis (infliximab) selectively down regulates the production of interleukin (IL) 18 but not of IL12 and IL13. Annals of the Rheumatic Diseases. 61: 723–725 p.
Roberts L., McColl G. 2004. Tumour necrosis factor inhibitors: risks and benefits in patients with rheumatoid arthritis. Internal Medicine Journal. 34: 687–693 p.
Richter W., Gallati H., Schiller C-D. 1998. Animal pharmacokinetics of the tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin fusion protein lenercept and their extrapolation to humans. Drug Metabolism and Disposition. 27(1): 21-25 p.
Riechmann L., Muyldermans S. 1999. Single domains antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. Journal of Immunological Methods. 231: 54-38 p.
Roux K., Greenberg A., Greene L., Strelets L., Avila D., McKinney E., Flajnik M. 1998. Structural analysis of the nurse shark (new) antigen receptor (NAR): Molecular convergence of NAR and unusual mammalian immunoglobulins. Proceeding of the National Academy of Sciences. 95: 11804–11809 p.
Rueda B., Gonzalez-Gay M., Lopez-Nevot M., Garcia A., Fernandez- Arquero M., Balsa A., Pablos J., Pascual-Salcedo D., Gomez de la Choncha E., Gonzalez-Escribano M., Martin J. 2005. Analysis of vascular endotelial growth factor (VEGF) funcional variants in rheumatoid arthritis. Human Immunology. 66: 864-868p.
Rumfelt L., Lohr R., Dooley H., Flajnik M. 2004. Diversity and repertoire of IgW and IgM VH families in the newborn nurse shark. BCM Immunology. 5(8) doi: 10.1186/1471-2172-5-8.
Rumfelt L., McKinney E., Taylor E., Flajnik M. 2002. The development of primary and secondary lymphoid tissues in the nurse shark Ginglymostoma
cirratum: B-cell zones precede dendritic cell immigration and T-cell zone formation during ontogeny of the spleen. Scandivavian Journal of Immunology. 56: 130–148 p.
Schwartzman S., Fleischmann R., Morgan G-Jr. 2003. Do anti-TNF agents have equal efficacy in patients with rheumatoid arthritis?. Arthritis Research and Therapy. 6(Suppl 2): 3-11 p.
Schwartzman S., Morgan G-Jr. 2004. Does route of administration affect the outcome of TNF antagonist therapy?. Arthritis Research and Therapy. 6(Suppl 2): 19-23 p.
Smith J., Kontermann R., Embleton J., Kumar S. 2005. Antibody phage display technologies with special reference to angiogenesis. The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19: 331-341 p.
Stanfield R., Dooley H., Flajnik M., Wilson I. 2004. Crystal structure of a shark single-domain antibody with lysozyme. Science. 304(5691): 1770-1773 p.
Sone H., Kawakami Y., Sakauchi M., Nakamura Y., Takahashi A., Shimano H., Okuda Y., Segawa T., Suzuki H., Yamada N. 2001. Neutralization of vascular endothelial growth factor prevents collagen-induced arthritis and ameliorates established disease in mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 281(2): 562-568 p.
Spencer-Green G. 2000. Etanercept (Enbrel): update on therapeutic use. Annals of the Rheumatic Diseases. 59(suppl I): 46-49 p.
Streltsov V., Carmichael J. y Nuttall S. 2005. Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype. Protein Science. 14: 2901-2909 p.