Caracterización molecular de cepas de rotavirus de origen humano y su significado epidemiologico

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(1)Ccn. ci Doc. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE ROTA VIRUS DE ORIGEN HUMANO Y SU SIGNIFICADO EPIDEMIOLOGICO. LILIANA AMELIA BERMEO IBAÑEZ. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANAFACULTAD DE CIENCIAS -PROGRAMA DE POSGRADO SANTAFE DE BOGOTA, D.C.-COLOMBIA 1995.

(2) 1Ç. de CE!SA. 1JC'EC ACPECUAPI. astwE.5999 CARACTERIZACION MOLECULAR DE CEPAS DE ROTA VIRUS DE ORIGEN HUMANO Y SU SIGNIFICADO EPIDEMIOLOGICO. TESIS DE GRADO "Presentada corno requisito parcial para optar el título de Magister en Microbiología". LILIANA AMELIA BERMEO IBAÑEZ. Directores: MARIA FERNANDA GUTIERREZ JOSE DARlO MOGOLLON.. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS-PROGRAMA DE POSGRADO SANTAFE DE BOGOTA, D.C.-COLOMBIA II,.

(3) Dr Q'ARLOS COJREDOR P. Decano Madérnico de/la Facultad de Ciencias U1versidad Javeriana.. Dra. MARIA FERNANDA GUTIERREZ E. Directora del Programa de Posgrado y Directora de tesis Facultad de Ciencias - Pontificia Universidad Javeriana. Director de Tesis Programa de Salud Animal CORPOICA.

(4) Dra. Lois Jerabek Jurado. iWV. _____. Dr. José del C. Barrera Jurado. Dr. Jorge Alnianza Jurado.

(5) AGRADECIMIENTOS. Quiero agradecer a la Corporacion Colombiana de Investigación Agropecuaria CORPOICA - CEISA, por la colaboración prestada tanto humana, como técnica y económica para la realización de este trabajo.. En especial, agradezco a mi director el Doctor José Darío Mogollón y a los Doctores Fernando Ariza y José Barrera por sus aportes científicos y técnicos, , ya que sin su ayuda no hubiese sido posible llevar a feliz término este trabajo.. Del mismo modo a la Doctora Maria Fernanda Gutierrez, por su invaluable colaboración e ¡condicional apoyo durante el transcurso de este trabajo.. Igualmente agradezco a la Pontificia Universidad Javeriana y a todas las personas que de una u otra forma permitieron el desarrollo de ésta investigación..

(6) "Los criterios expuestos, las opiniones expresadas y las conclusiones anotadas son responsabilidad sólo del autor, y no comprometen en nada a la Pontificia Universidad Javeriana." Artículo 9.18 del reglamento de los trabajos de grado y de investigación, Agosto de 1989..

(7) TABLA DE CONTENIDO. Pág RESUMEN INTRODUCCION. 1. 1.. REVISIÓN DE LITERATURA. 3. 1.1.. Características Generales. 3. 1.2. Clasificación. 3. 1.3.. Morfología. 5. 1.4.. Genoma. 5. 1.5.. Proteínas. 6. 1.6.. Patogénesis. 7. 1.7.. Epidemiología. 9. 1.8.. Inmunidad. 11. 1.9. Inmunoprofilaxis. 12. 2.. DIAGNOSTICO. 14. 2.1.. Cultivo Celular. 17. 2.2.. Técnicas de Biología Molecular en el Diagnóstico Viral. 18. 2.3.. Aplicación de Métodos Moleculares en la Epidemiología de la Infección por Rotavirus. 27.

(8) 3.. MATERIALES Y METODOS. 34. 3.1. Colección de Muestras. 34. 3.2.. Cepas de Referencia. 34. 3.3. Cultivos Celulares. 35. 3.4.. Extracción de ARN Viral. 36. 3.5. Análisis Electroforético. 38. 3.6.. Detección Viral por Ensayo Inmunoenzimático. 41. 4.. RESULTADOS. 43. 4.1.. Identificación de las Cepas Virales por Electroforésis. 43. 4.2. Hospital Lorencita Villegas de Santos. 44. 4.3.. Clínica David Restrepo. 48. 4.4.. Clínica del Niño del Seguro Social. 50. 4.5.. Hospital de Soacha. 53. 4.6.. Clínica del Seguro Social de Pereira. 56. 4.7.. Comparación entre los Electroferotipos observados en los diferentes centros estudiados. 56. 4.8.. Detección del antígeno viral por, ensayo inmunoenzim ático. 60. 5.. DISCUSION. 63. 6.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. 71.

(9) Docum0 Ccnr0 de CESA. LISTA DE TABLAS. Pág.. TABLA 1. Prueba X2 , para establecer el grado de relación que existe entre la técnica y el resultado en el diagnóstico de Rotavirus. 60. TABLA 2. Comparación entre las técnicas de Electroforésis y BioDot Rota para evaluar Co-positividad y Co-negatividad entre. 61. ellas.. TABLA 3. Comparación entre las técnicas de Electroforésis y Rotazyme II, con el fin de evaluar el grado de Co-positividad y Co-negatividad entre ellas.. 61. TABLA 4. Comparación entre los dos métodos ELISA (BioDot Rota y Rotazyme II), con el fin de establecer el grado de Copositividad y Co-negatividad que presentaron entre ellas.. 62.

(10) de Docum$(M. L. LISTA DE FIGURAS. Pág. FIGURA 1. Perfiles electroforéticos del ARN de las cepas de Rotavirus Bovino tipo Compton y porcino tipo Bohl's tomadas como cepas de referencia. 45. FIGURA 2. Comparación de los perfiles electroforéticos de las cepas de Rotavirus aisladas del Hospital Lorencita Villegas de Santos.. 47. FIGURA 3. Comparación de los perfiles electroforéticos de las cepas de Rotavirus aisladas de la Clínica David Restrepo.. 49. FIGURA 4. Comparción de los perfiles electroforéticos de Iacepas de Rotavirus aisladas de la Clínica del Niño del Seguro Social. 51. FIGURA S. Cepa de campo aislada en la Clínica del Niño del Seguro Social.. 52. FIGURA 6. Comparación de los perfiles electroforéticos de las cepas de Rotavirus, aisladas del Hospital del municipio de Soacha.. 54.

(11) FIGURA 7. Perfil electroforético de ARN con migración en dupleta, presentado por dos cepas aisladas del Hospital del municipio de Soacha.. 55. FIGURA 8. Comparación entre los electroferotipos encontrados en los diferentes centros estudiados.. 57. FIGURA 9. Comparación de los electroferotipos presentados por los cuatro centros asisitenciales estudiados.. 59.

(12) RESUMEN. El propósito de la presente investigación fué caracterizar por medio de la técnica de electroforésis de ARN, cepas de Rotavirus presentes en heces de infantes con sintomatología de enfermedad diarreica.. Un total de 328 muestras fecales fueron colectadas de los centros asistenciales perdiátricos Hospital Lorencita Villegas de Santos, Clínica David Restrepo, Clínica del Niño del Seguro Social, ubicados en la ciudad de Santafé de Bogotá, Hospital de Soacha y de la Clínica del Seguro Social de Pereira.. Las muestras fecales fueron sometidas a un proceso de extracción de ARN, por medio de una mezcla de Guanidina-Tiocianato-Fenol-Cloroformo, seguido por una precipitación con etanol; posteriormente el ARN extraído, fiié analizado utilizando un sistema de electroforésis unidimensional discontinuo en geles de poliacrilamida (PAGE).. Despúes de la electroforésis, los geles fueron sometidos a una tinción con nitrato de plata; la interpretación de los resultados consistió en el exámen visual de los perfiles electroforéücos de los segmentos de ARN de las cepas virales. Solamente, 56 cepas virales del total de rnuetras examinadas, fueron positivas para ARN genómico de Rotavirus, agrupándose en cuatro electrofero tipos diferentes. Los perfiles electroforéticos de estas cepas, fueron compatibles con el electroferotipo característico que presenta el Rotavirus del grupo A; también fueron clasificadas corno.

(13) patrón corto tomando como base la movilidad de los segmentos 10 y 11 del genoma. No se encontraron cepas con patrón largo.. Las variaciones genómicas que hicieron a los electroferotipos diferentes se correspondieron principalmente a los segmentos 7, 8 y 9 del grupo III del genoma.. De otro lado, las muestras fecales tanto positivas como negativas para la técnica de electroforésis, fueron analizadas por dos pruebas de ELISA comerciales dirigidas a la identificación de Rotavirus grupo A, encontrandose una correlación en los resultados obtenidos por ambas técnicas.. Este estudio permitió establecer una moderada variabilidad genómica, que presentaron las cepas de Rotavirus que afectaron la población infantil de estos centros pediátricos..

(14) INTRODUCCION. La infección por Rotavirus, es una de las causas más importantes de diarrea aguda en niños; siendo responsable de aproximadamente 3.5 a 4 millones de muertes por año en paises en desarrollo.. Antes del año de 1973, estos agentes infecciosos sólo eran identificados en algunos de los casos, debido a la dificultad para ser diagnosticados; en ese año Ruth Bishop y colaboradores descubrieron por medio del microscopio electrónico partículas de 70 nm de diámetro con morfología similar ' a una rueda radiada, en la mucuosa intestinal de infantes con diarrea.. Investigaciones tempranas para el diagnóstico de Rotavirus, fueron encaminadas a establecer técnicas que permitieran evaluar la infección, ya sea determinando la presencia del antígeno viral ó por la medición de una respuesta serológica.. Una de las técnicas mas usadas para detectar el antígeno viral en materia fecal ha sido el ELISA (Enzyme Linked Imrnunosorbent Assay), que ofrece ventajas sobre otros ensayos del mismo género. Se han generado métodos de biología molecular tales corno Electroforésis de ARN, PCR (Reacción en Cadena Polimerasa) e Hibridación, de ácidos nucleicos, que permiten el análisis del genoma de las cepas de Rotavirus..

(15) Mediante la Electroforésis se ha logrado separar exitosamente el genoma del Rotavirus, el cual esta conformado por 11 segmentos de ARN bicatenario, generando así, un patrón de bandas característico conocido como electroferotipo.. El propósito de esta invesitigación fué determinar la presencia de cepas de Rotavirus en infantes con sintomatología de enfermedad diarreica que consultaron a centros de asistencia pediátrica en la ciudad de Santafé de Bogotá, Soacha y Pereira.. Se lógró determinar los electrofero tipos virales que predominaron en los infantes atendidos por estos centros; del mismo modo se establecieron las variaciones moleculares entre las cepas de Rotavirus con el fin de conocer, sí la población infantil examinada era afectada por una o más cepas virales.. Con la utilización de dos sistemas ELISA comerciales se estableció la presencia de Rotavirus grupo A, estos resultados fueron comparados con los obtenidos con la técnica de Electroforésis..

(16) 3. 1. REVISION DE LITERATURA. 1.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES El Rotavirus humano fué descubierto en 1973 por Bishop y colaboradores (citado por Kapikian y colaboradores), al observar por microscopio electrónico, biopsias duodenales de niños hospitalizados con gastroenteritis en Australia (70). Posteriormente, el virus fué detectado fácilmente por microscopio electrónico en preparaciones de materia fecal de infantes con enfermedad diarreica. Este hallazgo logró establecer al Rotavirus como el mayor agente etiológico viral de diarrea infantil (7, 12,35). A partir de 1973, se han realizado numerosos estudios a nivel de bioquímica, biología, de caracterización molecular y antigénica del Rotavirus que han llevado a un entendimiento detallado de su estructura, replicación y patogénesis (22, 30,85, 104). 1.2 CLASIFICACION Los Rotavirus se clasifican taxonómicamente como miembros de la familia Reoviridae. Esta familia contiene seis géneros distintos: Reoviridae, Orbivirus, Rotavirus, Phytoreovirus, Eijirus y Cypovirus (69, 124). Los Rotavirus como tales son clasificados serológicamente por un esquema que permite la presencia de múltiples grupos (serogrupos) y la existencia de serotipos con.

(17) 4. cada grupo. Los serotipos son designados con números arábigos y los subgrupos con números romanos (19, 88).. Los Rotavirus comprenden seis grupos distintos (A-F). Los grupos A, B y C comúnmente son encontrados en humanos y animales (10, 79,48,129). Los grupos D, E y F sólo incluyen los virus que afectan los animales (63, 65).. Los determinantes antigénicos de grupo o antígenos comunes, son encontrados en todas las proteínas estructurales de las partículas, virales (13, 103). Estos han sido reconocidos mediante la utilización de antisueros monoespecíficos y anticuerpos monoclonales específicos para cada polipéptido(14, 28).. El grupo A esta asociado a la mayoría de los brotes de diarrea aguda en hombres y animales(5, 21, 47). Es el único grupo que se ha clasificado en dos subgrupos 1, II, según los diferentes antígenos adicionales en la proteína interna del cápside (VP6) presentándose en mayor porcentaje el subgrupo 11(125).. Dentro del grupo A, los serotipos estan dados por dos proteínas de superficie, VP4 y VP7, las cuales contienen antígenos neutralizantes que son el blanco del sistema inmune; pueden ser compartidos tanto por cepas de origen animal como de origen humano (24).. Los serotipos determinados por la VP7, son denominados como tipo G; hasta el momento se han descrito 14 serotipos, de los cuales siete han sido aislados de humanos y los Gi, 02, G3 y 04, son responsables de un 95% de las infecciones en humanos(42, 44).. Los serotipos determinados por la VP4, son designados como tipo P y sólo cuatro serotipos han sido aislados de cepas de Rotavirus humano (49)..

(18) 5. El grupo B, ha sido identificado como agente etiológico en epidemias de adultos, causando diarrea severa (32, 33). El grupo C, se ha aislado principalmente de cerdos; también ha sido reportado esporádicamente en niños con diarrea, pero su significado clínico aún no está definido (8, 17, 61). El grupo D se ha identificado en aves, y el grupo E se ha asociado únicamente con cerdos (15, 46, 65, 83,115).. 1.3 MORFOLOGIA Los Rotavirus tienen una apariencia morfológica característica de rueda radiada al microscopio electrónico. Las partículas completas miden 70 nm de diámetro y tienen una doble cápside proteíca e icosahédrica que conforma la cubierta interna y externa (92). La cubierta interna es el nucleocápside y contiene 11 segmentos de ARN bicatenario. La partícula completa es lisa debido a que el borde exterior de la cubierta externa le da una apariencia uniforme bien definida (49).. Las partículas con una sola cubierta miden 55nm de diámetro y son designadas rugosas por la ausencia de la cubierta externa y los capsómeros de la cubierta interna se proyectan hacia la periferia dando una apariencia de circulo erizado. El nucleocápside tiene conformación hexagonal en la cubierta externa y mide 37nm de diámetro (149).. Se han encontrado estructuras tubulares de 54 -100 nm de ancho y de longitud variada; estas estructuras por inmuno-electro-microscopía han mostrado estar antigénicamente relacionadas con la cubierta interna del virión, esto sugiere, que puede ser el resultado de un ensamblaje aberrante del material de la cubierta viral (135).. 1.4 GENOMA El genoma del Rotavirus contiene 11 segmentos de ARN bicatenario, con un peso molecular de 2x105-2.2 x 106 Daltons (68, 102)..

(19) 6. Cuando la partícula viral se desproteiniza, el ARN de doble cadena se torna no infeccioso esto indica que las partículas vírales contienen su propia enzima ARNpolimerasa dependiente del ARN, para transcribir cada segmento genómico en ARN mensajero activo. El empaquetamiento de los segmentos de ARN en la cápside requiere de la interacción ARN-proteína. No se conocen las proteínas responsables del empaquetamiento, pero se consideran como candidatas las proteínas VP1, VP2 y VP3 por estar ubicadas en el núcleocápside (30). 1.5 PROTEINAS Los 11 segmentos génicos codifican los distintos polipéptidos que conforman la partícula viral (54). Para conocer cual gen codifica determinado polipéptido se han establecido diversas formas: Correlación de fenotipo y genotipo durante el rearreglo de genes en la coinfección con dos Rotavirus distintos; análisis de la reacción de anticuerpos monoclonales con el producto de varios genes; aislamiento de segmentos de ARN con posterior traducción In Vitro de la fracción de ARN denaturada y análisis del polipéptido transcrito por la ARN-polimerasa viral, seguido de la identificación del producto (56, 117). Se ha designado una nomenclatura para las proteínas vírales. Las proteínas estructurales son denomindas como proteína viral (VP) y va seguido de un número, que va de acuerdo a su peso molecular, es así, que la proteína de más alto peso es designada VP1 (41). Las proteínas que son generadas por el divaje de un gran precursor son indicadas por un asterisco, es el caso de VP4 que es civada para producir VP5* y VP8* (76). VP6 es la mayor proteína estructural y está kcalizada en la superficie de la cubierta interna, se considera altamente antigénica e inmunogénica, pero aún no es claro si interviene en la inducción de anticuerpos protectores (28)..

(20) 7. La proteína VP4 es producida por el segmento 4 del genoma y está localizada en la cubierta externa, es divada por enzimas proteolíticas como la tripsina para producir VP5* y VP8* con pesos moleculares de 60.000 Daltons y 20.000 Daltons respectivamente (48,56).. El rompimiento proteolítico de la proteína VP4 potencia la infectividad, mejorando la penetración del virus a las células. Se considera que la VP4 es una proteína multifuncional debido a que es responsable de la hemaglutinación de ciertos Rotavirus, además, desempeña un importante papel en la virulencia de Rotavirus heterólogos de ratones y es inductor de anticuerpos neutralizantes que pueden proteger en la enfermedad causada experimentalmente por Rotavirus (95).. La proteína VP7 es una glicoproteína de la cubierta externa y es la segunda más abundante en el virión, además, se ha determinado que es la responsable de la especificidad de serotipo (44, 93).. Hasta el presente, las proteínas del nucleocápside (VP1, VP2, VP3) no han sido bien caracterizadas, se sabe que su función depende de la enzima ARN polimerasa (transcriptasa) que está presente en las partículas vírales (96).. El segmento 11 codifica para un polipéptido de localización incierta, pero puede ser precursor del polipéptido VP9 o de una proteína no estructural. De otro lado, los segmentos 5, 7, 8 y 10 codifican para proteínas no estructurales (25).. 1.6 PATOGENESIS La información acerca de la patogénesis dé la infección por Rotavirus, ha sido obtenida mediante la infección de animales experimentales, que desarrollan la enfermedad después de ser administrado el Rotavirus humano (20, 138, 146)..

(21) 8. Los cambios asociados con la infección, se manifiestan en las células epiteliales de las vellosidades intestinales, en las cuales se lleva a cabo la multiplicación viral. Este epitelio se degenera y es reemplazado por células cúbicas que se desarrollan a partir de las criptas de Lieberkhun (77).. El establecimiento de la diarrea, se debe a una alteraión en el transporte de electrólitos como consecuencia de la destrucción de los enterocitos y el reemplazo por células inmaduras del fondo de las criptas. El bajo nivel de disacaridasas presentes en las células entéricas inmaduras (cúbicas), trae como resultado la disminución en la absorción de lactosa y un aumento en el peristaltismo intestinal (133, 143).. Los Rotavirus tienen dos mecanismos que les permite entrar a la célula, por penetración directa de la membrana celular ó por endocitosis, y son liberados directamente dentro de vesículas que al fusionarse con los lisosomas primarios constituyen el fagolisosoma; en cuyo interior se remueve la cápside externa, resultando así, partículas de 55 nm de diámetro, lo cual activa la ARN polimerasa endógena del virus (62, 107).. De dicha actividad resulta la síntesis de ARN mensajero viral, de proteínas vírales y el ARN de doble cadena. Estos productos se acumulan en el citoplasma de la célula en forma de viroplasma, fenómeno que se observa a las 6 horas después de la infección. El ARN se va empaquetando en el nucleocápside, y las proteínas se van ensamblando a su alrededor, formando partículas de una sola cápside que migran hacia las vesículas dilatadas del retículo endoplasmático rugoso y se cree que en el paso a través de la membrana citoplasmática, adquiere su cápside externa, convirtiéndose en forma infecciosa; el mecanismo de liberación se presume que es por lísis celular (9, 84).. ~UOTECA AGOPECUARI4.

(22) 9. El mecanismo de infección causa alteraciones en la integridad celular especialmente entre la octava y doceava hora post-infección, las células epiteliales comienzan a mostrar granulaciones en el citoplasma que van progresando hasta producirse el desprendimiento celular (efecto citopático). Se acumulan numerosas partículas virales en el citoplasma llevándose a cabo la replicación viral. La membrana nuclear se presenta discontínua, con una marcada dilatación en algunas áreas de las cisternas perinucleares (29, 86).. Entre las horas 12 y 13 post-infección, la eucromatina nuclear se presenta agregada o en la periferia del núcleo. Se han reportado en algunos casos la presencia de partículas virales de Rotavirus dentro de las crestas mitocondriales hinchadas o rotas (128).. 1.7 EPIDEMIOLOGIA Los Rotavirus son trasmitidos por la vía oro-fecal. Estudios en humanos voluntarios han demostrado claramente, que la administración de materia fecal confirmada positiva para Rotavirus induce la enfermedad diarreica (4, 67).. La fuente de infección de niños que no están en contacto con niños con gastroenteritis, no ha sido bien documentada; una posibilidad puede ser el padre o la madre con enfermedad subclínica (71).. Dentro de la cadena de infección, se debe incluir la presencia del virus en algunas enfermeras al cuidado de salas pediátricas, produciendo una alta frecuencia de infección nosocomial en hospitales y guarderias (39, 81, 127).. El período de incubación del Rotavirus para producir la enfermedad diarreica ha sido estimado ser menor de 48 horas; sin embargo, estudios en adultos voluntarios después de el sumunistro del inóculo, desarrollan la enfermedad entre el segundo y cuarto día; el virus se excreta en la heces hasta el sexto día de la enfermedad diarréica (70).

(23) lo. En el caso de los niños, se ha observado que el grupo comprendido entre los 6 y 24 meses de edad presenta con mayor frecuencia, la gastroenteritis por Rotavirus. A partir de los 2 años de edad la gastroenteritis por Rotavirus declina rápidamente y sólo en raras ocasiones se presenta en niños mayores de 5 años (69). También, se han descrito gastroenteritis por Rotavirus en adultos, aunque es poco común ya que se ha adquirido inmunidad por infecciones previas con Rotavirus en la infancia. Esta patología se puede observar con mayor frecuencia en pacientes geriátricos debido, a su estado de inmunodeficiencia (32, 33).. En general, las tres mayores manifestaciones clínicas observadas en la gastroenteritis por Rotavirus son vómito, diarrea y deshidratación. La principal causa de muerte es la deshidratación, la cual es producida por un imbalance electrolítico (7).. En los países desarrollados esta enfermedad diarreica ocurre con alta frecuencia, presentando una alta morbilidad pero con una baja mortalidad. Esto se debe a la aplicación de medidas efectivas para reemplazar la perdida de líquidos y electrolítos durante la enfermedad. En contraste, en los países subdesarrollados la infección por Rotavirus es una amenaza para la población infantil, debido, a las condiciones de saneamiento deficientes, bajos recursos económicos y carencias nutricionales que influyen en el incremento de la severidad de las manifestaciones clínicas (40, 59, 145).. En Colombia, se han reportado pocos estudios epidemiológicos sobre Rotavirus; entre ellos está, un estudio realizado en el Hospital Lorencita Villegas de Santos, de la ciudad de Santafé de Bogotá, donde se evaluó la enfermedad diarreica aguda por Rotavirus en el período comprendido de mayo 15 de 1983 a mayo 15 de 1984.. Se tomaron 180 casos de 5000 niños menores de 5 años que consultaron por diarrea aguda al servicio de urgencias. El 51.1% de los casos fueron positivos para Rotavirus;.

(24) 11. para el diagnóstico del agente viral, se utilizó la microscopía electrónica y la prueba de ELISA. Los investigadores concluyeron que más de la mitad de los casos de enfermedad diarreica aguda (EDA) era causada por Rotavirus (38). 1.8 INMUNIDAD Tanto observaciones epidemiológicas como los estudios experimentales en humanos y animales, han ayudado a entender ciertos mecanismos involucrados en la inmunidad por Rotavirus (20).. Experimentos realizados en animales recién nacidos, alimentados en las primeras 24 horas con calostro, que contenían anticuerpos contra Rotavirus, también desarrollaron enfermedad diarreica al estar expuestos con otros animales infectados con Rotavirus (120). Otros estudios sugieren que después de una primoinfección se produce una respuesta primaria que confiere protección inmunológica contra éste agente (111).. Estos hallazgos demuestran que el efecto protector de los anticuerpos circulantes es incierto, puesto que tanto los humanos como animales pueden ser infectados con Rotavirus, aún cuando existan anticuerpos séricos detectables (28). Aunque no es claro el papel de la inmunización pasiva, adquirida através de la leche materna en la prevención de infección por Rotavirus, se ha demostrado que la leche materna contribuye a la disminución de los síntomas clínicos en el niño haciendolo menos propensos a contraer la diarrea que los niños alimentados con leche de Otro origen (96). Es claro entonces, que los anticuerpos en el lumen intestinal son el mayor determinante de resistencia a la enfermedad por Rotavirus; por lo tanto los anticuerpos séricos parecen ser signo de infección y los anticuerpos locales median cierta protección (3)..

(25) 12. Las infecciones con Rotavirus, comúnmente ocurren en adultos que tienen contactos con pacientes con enfermedad por Rotavirus; sin embargo, casi todas estas reinfecciones son subclínicas. Recientemente, se ha sugerido que niveles séricos de Ig A contra el Rotavirus podrían ser primordiales en el estado inmune del intestino contra el Rotavirus (49, 105).. 1.9 INMUNOPROFILAXIS Debido al impacto de ésta enfermedad, ha sido necesario establecer medidas preventivas a nivel mundial. El principal propósito es la obtención de una vacuna contra los Rotavirus, con el fin de prevenir la gastroenteritis aguda producida por este agente viral, durante los dos primeros años de vida.. Una vacuna efectiva, depende en gran parte en la habilidad para estimular la inmunidad local tipo IgA en el intestino (6). Se han aplicado varias estrategias para el desarrollo de una vacuna óptima; inicialmente, se utilizó la inmunización oral con cepas de Rotavirus vivas atenuadas tanto de origen animal como humano, pero no se obtuvieron los resultados deseados, debido a la baja inmunogenicidad producida en animales experimentales (3, 43).. También, se ha logrado obtener vacunas a partir de proteínas recombinantes expresadas en vectores tales como la Escherichia coli, virus de Vaccinia, baculovirus, Salmonella typhi, capaces de producir una replicación no virulenta en los animales que se les ha suministrado el inóculo; sin embargo, la utilización de vectores recombinantes es de uso limitado por ser poco práctico en la vacunación (109).. De otro lado, se han empleado péptidos sintéticos que abarcan casi toda la secuencia de aminoácidos del gen que codifica para la VP7; no obstante, ha sido muy pobre la estimulación en la formación de anticuerpos neutralizantes cuando son suministrados a animales de experimentación (6)..

(26) 13. Otra forma de prevención, es la desinfección efectiva del material contaminado y un cuidadoso lavado de las manos para contrarrestar la infección por Rotavirus, especialmente en hospitales, guarderías. y sitios de concentración de poblaciones en donde existe un mayor riesgo de infección. (141)..

(27) IN. 14. .ÇÇpÇ1ÇØ Centr o de Docurnentucl CE1'. 2. DIAGNOSTICO. Durante mucho tiempo, se pensó en los virus como agentes etiológicos de diarrea unicamente por exclusión, al no poder encontrar un germen o parásito responsable; sin embargo, las manifestaciones clínicas de la enfermedad por Rotavirus no son suficientemente explícitas para permitir el diagnóstico por sí solo, por lo tanto se requiere del agente viral yio la demostración de una respuesta serológica (23, 28).. Son ideales las muestras del primer al cuarto día de enfermedad para la identificación del virus, no obstante, se puede extender de 9 a 21 días dependiendo de la duración de los síntomas (84).. Se han desarrollado muchas pruebas para la detección de Rotavirus en heces; inicialmente, se empleó la visualización directa de materia fecal por microscopía electrónica para la determinación del virus, ésta tiene la ventaja de tener una alta especificidad debido, a que los Rotavirus tienen una apariencia morfológica típica, lo cual permite su propia identificación.. La microscopía electrónica se considera como una técnica decisiva en el diagnóstico de Rotavirus y es frecuentemente usada, cuando se presentan discrepancias, con otras técnicas (36).. El estudio de la materia fecal por microscopía electrónica permite la detección de alrededor del 90% de las muestras positivas para el virus, también se ha usado la inmuno electro-microscopía, la cual involucra la unión de un antisuero especifico.

(28) 15. contra Rotavirus a las partículas virales presentes en la materia fecal a examinar; sin embargo, este método requiere de mucho tiempo para su realización y unicamente un número limitado de muestras podría ser examinado por día (91).. En los últimos años se han utilizado numerosas pruebas inmunoenzimaticas para la detección de Rotavirus en muestras fecales. Kits comerciales ( VIDAS Rotavirus, Rotaclone, Rotazyme, etc ), para este objetivo se encuentran disponibles tanto a nivel de hospitales como de laboratorios de investigación, su escogencia para la determinación del virus se hace basándose en los requerimientos del laboratrio ya que éste debe considerar la población de pacientes, costo y ayudas técnicas para determinar cual es el mejor para su objetivo especifico (23).. El método preferido en muchos laboratorios es ELISA (Enzyme Linkd Immunosorbent Assay) debido a su alta sensibilidad, rapidéz y el no requerimiento de equipo especializado (36); del mismo modo, dentro de estos procedimientos se emplean técnicas de cáptura de antígeno como el radioinmunoensayo y aglutinación en látex (64, 111, 144); por medio de la técnica de ELISA se ha logrado caracterizar muy bien el Rotavirus grupo A, incluyéndose también muchos de los virus estudiados desde 1973(5).. De otro lado también se ha establecido un ELISA para la detección de Rotavirus de grupo B, sin embargo, la carencia de reactivos específicos que permitan su caracterización, es uno de los mayores problemas para ser utilizados en programas de vigilancia epidemiológica; por esta razón el désarroilo y uso de anticuerpos monoclnales para detectar el virus ha ofrecido una mayor sensibilidad, especificidad y rapidez para la detección de Rotavirus humano del grupo B; no obstante, debido a la variación antigénica y rearreglos genéticos que pueden ocurrir entre los virus, el uso de un sólo anticuerpo monoclonal en el tamizaje de las muestras fecales puede presentar ciertas limitaciones (14, 139)..

(29) 16. En relación con los procedimientos de diagnóstico para Rotavirus grupo C humano, se han tenido dificultades; la identificación del virus por inmuno electro-microscopfa, usando antisueros de referencia hiperimune, podria ser la mejor vía para el diagnóstico específico, sin embargo, no existe ningún antisuero para monitorear los casos de gastroenteritis viral (37).. Se ha utilizado una prueba de ELISA en sandwich, usando un anticuerpo monoclonal - sin purificación adicional para el diagnóstico de Rotavirus grupo C en materia fecal; este procedimiento podría ser usado no solamente para el monitoreo de propagación de gastroenteritis viral en estudios epidemiológicos, también para el diagnóstico rápido de pacientes hospitalizados (97).. Existen muchas técnicas para medir la repuesta serológica a la infección por Rotavirus tales como: Inmuno electro-microscopía, Fijación de Complemento, Inmunofluorescencia, ELISA, Inhibición de la Hemaglutinación, Neutralización. La fijación de complemento es tan eficiente como otros métodos para la detección de anticuerpos en pacientes entre 6 y 24 meses de edad pero no en los pacientes adultos o en niños menores de 6 meses. En el grupo de esa edad la Inmunoflurescencia, ELISA IgG, ELISA IgM y ELISA IgA son las más eficientes (26).. La prueba de ELISA IgA ha sido particularmente útil en demostrar la repuesta serológica en infantes jovenes, quienes poseen anticuerpos IgG maternos adquiridos pasivamente puesto que la IgA no atravieza la placenta (99).. La Hemaglutinación e Inhibición de la Hemaglutinación, han permitido demostrar que cepas de Rotavirus humano aislados de infantes poseen hemaglutininas capaces de aglutinar eritrocitos de varias especies de animales, permitiendo concluir que un Rotavirus animal puede infectar a humanos (82, 89, 90)..

(30) 17. 2.1 CULTIVO CELULAR Aunque los Rotavirus son bien reconocidos como el agente etiológico viral causante de diarrea en animales y niños, las investigaciones de este virus son frecuentemente impedidas por la incapacidad de propagar este virus In vitro. En general, se requieren técnicas de rutina para la propagación de virus In vitro para facilitar la preparación de grandes cantidades de estos virus, que permitan estudios comparativos y de caracterización (2, 130). En un intento por encontrar eficientes condiciones para la propagación de estos virus en cultivo celular, se han hecho numerosos estudios con diferentes tipos de células de riñon de mono, incluyendo líneas continuas y células primarias para establecer su habilidad para sostener el crecimiento de Rotavirus humano de muestras fecales (1,142). En 1980, la cepa Wa de Rotavirus humano tipo 2, fué la primera cepa adaptada a crecimiento en células de rifion de mono despúes de hacer pases en lechones gnotobió ticos recién nacidos (118). Recientemente, se ha demostrado exitosos sistemas de cultivo In vitro para Rotavirus humano directamente en células MA- 104 de riñón de mono Rhesus, sin tener que hacer pases en animales (72). Todos los aislamientos de Rotavirus en cultivo celular se han logrado con un esencial requisito que es la tripsinización del inóculo (10 .tg/ml) y la incorporación de tripsina (1 pg/ml) en el medio de mantenimiento durante los pases; también es importante el uso de tubo Roller para el cultlivo celular ya que permite un efecto citopático más evidente que en un cultivo estacionario y la incubación del inóculo a 37°C. Se ha concluído que la concentración y la integridad de las partículas virales en las muestras son los factores más decisivos para intentar adaptar cepas de Rotavirus de una forma exitosa (130)..

(31) 18. El efecto citopático causado en la monocapa celular se caracteriza por la presencia de bordes celulares oscuros, fusión celular, redondeamiento de las células, desprendimiento de la superficie del tubo y degeneración granular. La apariencia del efecto citopático, con las cepas de Rotavirus, es fácilmente reconocida en el cultivo celular pero su naturaleza no esta aún bien definida (131). El método de cultivo celular se ha considerado como prerequisito básico en el estudio de propiedades genéticas y antigénicas de las diferentes cepas de Rotavirus aisladas, además, de la preparación de antígenos y sueros inmunes para el posterior diagnóstico de Rotavirus (134). 2.2 TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR EN EL DIAGNOSTICO VIRAL En los últimos años, se han empleado técnicas de biología molecular, que permiten la identificación de microorganismos tales como hongos, bacterias y virus por medio del análisis de su material genético (41, 99). Estás técnicas, se han empleado con fines en investigaciones epidemiológicas, las más empleadas son la Electroforésis, Reacción en Cadena Polimerasa (PCR), Dot Hibridización y Huella genómica (89, 101, 148). La base de las técnicas de biología molecular es una buena extracción y purificación de los ácidos nucléicos de los diferentes materiales biológicos. Hasta el presente se han descrito diversos procedimientos para la extracción de ARN del Rotavirus en muestras fecales (116). Generalmente, se busca un método que proporcione una buena calidad del ARN sin degradarlo, con una efectiva desproteinización. El método más comúnmente empleado, es la extracción con fenol; el cual disocia las proteínas de el ácido nucléico.

(32) 19. formandose dos fases después de una centrifugación: Una fase inferior orgánica con fenol que contiene proteínas, restos celulares y otros sólidos, y la fase acuosa que contiene el ARN (140).. Además, se utiliza una mezcla de fenol-cloroformo para una mayor eficiencia de la extracción. La alta densidad del cloroformo también mejora la separación de las dos fases, facilitando la remoción de la fase acuosa con muy poca contaminación de material orgánico.. Generalmente, se adiciona alcohol isoamílico a la mezcla fenol-cloroformo, para prevenir la formación de espuma; se han realizado apropiadas modificaciones al método de extracción con fenol, utilizando denaturantes más efectivos como es el Tiocinato de Guanidina.(18).. Cox y Colaboradores 1968 (citado por Chomczynski y Col 1987), fueron los primeros en emplear el Tiocianato de Guanidina como un agente desproteinizante ya que era utilizado inicialmente como un fuerte inhibidor de ribonucleasas. Existe un procedimiento, el cual combina el Tiocinato de Guanidina con el fenol-cloroformo, esta mezcla se usa para procesar un gran número de muestras en muy poco tiempo, con una buena recuperación de ARN de la muestra (18).. De otro lado, la precipitación con etanol, es probablemente el método más versátil para concentrar los ácidos nucléicos; se usa con frecuencia para recuperar ADN o ARN despúes de la extracción con fenol, generalmente la precipitación se realiza a bajas temperaturas (-20°C o más baja) (140).. En el pasado, el aislamiento de ARN era realizado en presencia de altas concentraciones de sal (0.2 - 0.5 M NaC1) para reducir el efecto de las ribonucleasas endógenas; sin embargo, ya se disponen de inhibidores de ribonucleasas más efectivos,.

(33) 20. el más usado, es el Dietil Pirocarbonato (DEPC) como inhibidor de enzimas ARNasas (116).. La identificación molecular de Rotavirus humano por hibridización ARN-ARN dentro de estrictas condiciones provee las condiciones ideales para estudiar las relaciones génicas entre los Rotavirus humano y animal. El término genogrupo ha sido utilizado para describir cepas de Rotavirus que pueden ser ubicadas como similares, con base en la homología génica (117).. El compartir un genogrupo, por dos cepas de Rotavirus derivadas de diferentes animales, podría ser interpretado como una consecuencia de transmisión interespecies de un Rotavirus animal a otro, como resultado de poseer un ancestro (origen) en común. Así por ejemplo, Nakagomi y colaboradores (89), utilizaron la técnica de hibridización ARN .-ARN y demostraron que la cepa AU228 de Rotavirus humano aislado de un niño sintomático con una historia de , contacto con un gato, estaba estrechamente relacionada genéticamente con la cepa de Rotavirus felino FRV- 1.. En el proceso de caracterización molecular de Rotavirus también se ha utilizado el análisis de huella genómica terminal, examinando el grado de diferencias entre los grupos de virus típicos y atípicos con el objetivo de establecer si cada uno lleva un grupo antigénico diferente e investigar el nivel de divergencia en su genóma. Este tipo de análisis se basa en hallazgos previos en que cada especie de ARN de Rotavirus típico genera un patrón de huella genómica terminal de 40 nucleótidos en el ARN, lo cual es conservado y por lo tanto diagnóstico para el ARN, siendo esto de interés para determinar si una situación similar ocurre con el virus grupo C (54).. La aplicación de esta técnica a los aislamientos atípicos, indicó que ninguno de los segmentos presentes en Rotavirus típicos estuvo presente en uno u otro de los grupos.

(34) 21. atípicos; estas observaciones dieron base para dividir los Rotavirus dentro de tres grupos los cuales han sido descritos como A, B y C (101,103).. El análisis secuencial del gen que codifica para la glicoproteína de la cápside externa es específica para cada serotipo VP7, permite determinar nuevos serotipos de Rotavirus humano; por medio del estudio comparativo de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos de cepas de referencia de serotipos conocidos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 con nuevas cepas halladas, para determinar el grado de diferencia o similitud entre ellas.. El análisis se efectúa en dos regiones del gen que codifica para la glicoproteína VP7 (aminoácidos 87-101 y 208-221), investigando sustituciones de aminoácidos o la conservación de la secuencia y de esta forma clasificar la cepa en estudio como un nuevo serotipo o incluyendola dentro de los ya establecidos (54, 112).. De otro lado, los Rotavirus del grupo B han sido detectados en muestras fecales por Dot hibridización utilizando sondas de cADN donado que son altamente específicos para este tipo de Rotavirus y tan sensibles como la inmuno electro-microscopía o inmunoensayos para la detección de este virus en las muestras investigadas. La prueba de Dot hibridización puede ser empleada como un medio primario para la detección de Rotavirus grupo B y también como confirmatoria en muestras identificadas por otras técnicas (27).. Las sondas de cADN correspondientes a segmentos de ARN de doble cadena, ofrecen alta sensibilidad y especificidad para detectar Rotavirus. La mayoría de los estudios involucran el uso de ARN o sondas de cADN marcadas con isótopos radiactivos. La purificación de sondas donadas es dispendioso, de alto costo y se requiere de mucho tiempo para su realización, además el uso de isótopos radiactivos para marcar las sondas es inadecuado en el uso clínico de rutina particularmente en países en desarrollo (98)..

(35) 'Y). También se ha utilizado la síntesis de oligonucleótidos para producir sondas y luego conjugarlas con fosfatasa alcalina utilizando una purificación cromatográfica para remover el exceso de pigmentos, este método constituye un ensayo sensible y específico para la detección de Rotavirus en muestras fecales (99).. La técnica PCR (Reacción en Cadena Polimerasa) que originalmente fué descrita para la ampliación de segmentos de ADN, ha sido adaptada para obtener la amplificación de ARN de Rotavirus obtenido directamente de materia fecal y de esta forma lograr el diagnóstico viral y la identificación del serotipo (53, 100, 126, 147).. Además, de la detección de Rotavirus y la tipificación directa apartir de heces, el método de PCR provee un rápido y eficiente medio de obtener gran cantidad de cADN disponible para la secuenciación de nucleótidos, donación y otros estudios genéticos evitando la necesidad del cultivo celular y la purificación del virus. (50, 52).. Procedimientos similares también pueden usarse para identificar la secuencia viral específica o marcadores asociados con virulencia, origen de especie y habilidad para crecimiento. De esta forma, PCR constituye una técnica que permite la caracterización completa de cepas de Rotavirus de interés epidemiológico o relacionadas con vacunas (109).. Otro de los métodos moleculares que se emplean con frecuencia en el estudio de los Rotavirus es la electroferotipificación. La electroforésis, es un método utilizado por medio del cual moléculas cargadas en solución, principalmente proteínas y ácidos nucléicos migran en respuesta a un campo electrico. Esta técnica es simple, rápida y altamente sensible, es utilizada para determinar pesos moleculares o como técnica de separación (119)..

(36) 23. Usualmente, la electroforésis se realiza en geles de poliacrilamida o agarosa. Generalmente los geles de poliacrilamida son utilizados en forma vertical y los geles de agarosa en forma horizontal. Para el análisis del ARN del Rotavirus comúnmente son más empleados los geles de poliacrilamida. Se utiliza un sistema de electroforésis unidimensional-discontinuo, descrito por Laemmli (74, 132).. Posterior a la electroforésis las bandas de ARN pueden ser visualizadas con luz ultravioleta después de una tinción con bromuro de etidio o con tinción con nitrato de plata (16, 58). La, autoradiografia también ha sido usada para la detectar segmentos de ARN marcado con P32 radiactivo (Clarke y colaboradores), citado por Estes y col. 1984 (31).. El orden de migración y separación de los segmentos del genoma es característico para una cepa viral y es conocido con el nombre de patrón electroforético o electroferotipo (34).. Casi todos los estudios descritos en la literatura sobre epidemiología molecular de los Rotavirus, han empleado el análisis de electroferotipos, debido a que este marcador proporciona caracteristicas para una cepa viral siendo además reproducible (106, 137).. El esquema para caracterizar y clasificar los electroferotipos de Rotavirus han sido propuestos por Lourenco y colaboradores, 1981 (citado por Estes y Col 1984). Este esquema divide los 11 segmentos de ARN en 4 grupos. Las bandas 1-4 de los segmentos de ARN son denotados como grupo 1, bandas 5 y 6 como grupo II; bandas 7 a 9 como grupo III y las bandas 10 y 11 como grupo IV. Las diferencias en la migración de las bandas de ARN en un grupo son identificadas por letras minúsculas del alfabeto (31)..

(37) 24. Estudios recientes, no utilizan el anterior esquema de clasificación, para identificar los 11 segmentos de ARN del Rotavirus. Generalmente los segmentos son numerados de 1 a 11 y esta numeración se ubica al lado izquierdo del perfil electroforético; a cada electroferotipo se le asigna una letra mayúscula del alfabeto ubicada en la parte superior de cada uno. También son utilizados números arábigos en lugar de letras (51, 60).. Existe además, otra clasificación que va depender de la migración de los segmentos 10 y 11 produciéndose dos patrones; es denominado patrón corto cuando la migración de los segmentos 10 y 11 es más corta que la distancia de migración del segundo patrón que es denominado patrón largo. El patrón corto (short) es designado con la letra S y el patrón largo (long) con la letra L (5).. También existe un patrón super-corto (super-short), en el cual la velocidad de migración es más lenta que el segmento 10 y 11 del patrón corto (1).. De otro lado, Tom y colaboradores, 1986 (citado por Rasool y Col 1989) adoptaron otro sistema de clasificación; en este sistema el patrón electroforético largo fiié designado II y el patrón electroforético corto fué designado 1(108).. En general, no existe un esquema de clasificación, el cual sea aplicado en todos los análisis de los patrones electroforéticos, casi siempre se emplean diferentes convenciones ya sean números o letras dependiendo de la clasificación que crea conveniente el investigador.. Con base en los resultados obtenidos de los -distintos electroferotipos, se ha logrado establecer una relación entre la variabilidad genética del Rotavirus con diversos factores, tales como: El clima, un área geográfica determinada, una comunidad y un período de tiempo establecido (45, 75, 78).

(38) 25. Esta relación ha sido demostrada por Spencer y colaboradores (122), cuando fueron analizados los distintos electroferotipos de Rotavirus, aislados de las heces de niños hospitalizados y ambulatorios que presentaban un cuadro agudo de diarrea. El estudio, fué realizado en Chile durante un periodo de 3 años (1979 a 1981) y los resultados fueron analizados dependiendo de la variación climática.. La distribución de los electroferotipos cortos y largos fueron similares tanto en verano como en invierno, excepto para el invierno de 1981, en el cual se presentó con mayor frecuencia el electroferotipo Corto. Los electroferotipos cortos y largos, diferian en la movilidad electroforética de algunos de sus segmentos, por ejemplo, los segmentos 1 y 4 mostraron una mayor movilidad en los electroferotipos cortos.. Se presentó una mayor detección de Rotavirus, durante el invierno (Mayo a Agosto) que en el verano (Enero a Marzo), aunque las admisiones por diarrea fueron más numerosas durante el verano que en el resto del año; solo se presentó un pico de diarrea en el invierno de 1981. De otro lado, cuando se compararon los electroferotipos de los pacientes hospitalizados y ambulatorios, se encontró que ambos grupos presentaron electroferotipos similares.. Resultados semejantes, fueron obtenidos en una comunidad de la ciudad de Tiberias Israel, donde se analizaron los patrones electroforéticos de Rotavirus humano durante tres sucesivas estaciones de invierno. Todos los Rotavirus aislados, durante cierta estación de invierno mostraron patrones de migración idénticos (121).. Existen múltiples factores que podrían conllevar a cambios en el genoma del Rotavirus, tales como el medio ambiente lo cual se reflejaría con un patrón climático; la baja temperatura y la humedad relativa han sido postuladas para facilitar la transmisión del Rotavirus y por ende prolongar la supervivencia del virus en fómites (11,66)..

(39) 26. En otros estudios, se ha encontrado transmisión nosocomial de Rotavirus humano en salas pediátricas mediante el análisis de los perfiles electro foréticos de las cepas aisladas en las heces de los niños hospitalizados (94, 123).. En otra investigación realizada por Gaggero y colaboradores (39), se encontrarón diferencias electroforéticas en la migración de los segmentos de ARN, de muestras fecales de pacientes de 2 años de edad que fueron hospitalizados por diarrea en Santiago, Chile; fué encontrado en alto porcentaje el electroferotipo largo y solo unos pocos presentaron el electroferotipo corto.. Algunos electroferotipos se presentaron por cortos períodos, mientras que otras cepas fueron más endémicas. El análisis de esta transmisión nosocomial, indicó que las cepas prevalentes en cierto período de tiempo son responsables de la infección tanto en la comunidad como la adquirida en hospitales; además se concluyó que los hospitales no son un reservorio para el Rotavirus, como si ocurre con algunas bacterias. Se cree que los casos de diarrea y las infecciones subclínicas presentes en la sala pudieron haber sido la fuente de infección (39).. La variabilidad en la migración de los segmentos de ARN del Rotavirus, en estudios epidemiológicos, han demostrado la coexistencia de cepas diferentes en una epidemia de diarrea, la aparición de nuevas cepas y la desaparición de otras, muestran la gran diversidad genética del Rotavirus, durante una epidemia.. El significado de esta variación genética no ha sido completamente entendida, pero probablemente la variación en ciertas secuencias del ácido nucléico puede producir las diferencias antigénicas; sin embargo, las variaciones electroforéticas, no necesariamente significan diferencias antigénicas, ya que pueden corresponder a.

(40) 27. cambios en secuencias no relacionadas con la región codificable del gen y por tanto no afectaran los determinantes antigénicos de la proteína codificada (73, 122).. 2.3 APLICACION DE METODOS MOLECULARES EN LA EPIDEMIOLOGIA DE LA INFECCION POR ROTA VIRUS La epidemiológia de la gastroenteritis causada por Rotavirus fué investigada en dos estaciones climáticas consecutivas (1987-1989), en siete localidades ubicadas en los Estados Unidos. Un total de 281 muestras fecales fueron obtenidas de niños con diarrea, 1as cuales se analizaron por la técnica electroforésis; posteriormente las muestras positivas para Rotavirus fueron serotipificadas por medio de un inmunoensayo enzimatico, con anticuerpos monoclonales y luego se amplificaron las cepas virales por la técnica Reacción en Cadena Polimerasa (PCR), con cebadores (primers) específicos para cada serotipo. Las cepas de Rotavirus encontradas fueron agrupadas en cinco electroferotipos, cuatro de los cuales presentaron patrón largo y sólo uno presentó patrón corto. Con base a la migración de los segmentos 7,8 y 9, los perfiles fueron clasificados como grupo A; sólo se observaron pequeñas variaciones en la migración de los segmentos. 2,5,7,8,9. Cada electroferotipo correspondía a un único serotipo, el patrón corto se asoció con el subgrupo 1 y el serotipo 2; esta observación ha sido reportada por diversos investigadores; cada electroferotipo estuvo confinado a determinada área geográfica (51). La técnica PCR permitió la tipificación del 17% de las muestras positivas que no pudieron ser tipificadas por pruebas serológicas; este estudio no logró obtener mas información sobre la circulación, persistencia y evolución de las cepas debido a que el muestreo sólo se limitó a niños hospitalizados y no se tuvo en cuenta la comunidad, lo cual es un factor indispensable para el entendimiento de la transmisión viral (51)..

(41) 28. De otro lado, en Valladolid, España se realizó un estudio sobre los distintos perfiles genómicos de ARN de Rotavirus, obtenidos en 104 muestras fecales colectadas de dos hospitales de la región. Inicialmente, los especímenes fueron analizados mediante la técnica de Aglutinación en Látex y las positivas se confirmaron mediante un ELISA comercial y microscopía electrónica.. Por electroforésis se encontraron ocho perfiles electroforéticos diferentes a lo largo de los tres años del estudio; dos de ellos presentaron patrón corto y seís patrón largo, el electroferotipo denominado con la letra A, fué el mas prevalente durante el estudio (72%); el electroferotipo B, se encontró en un 20%, mientras que los demás aparecieron ocasionalmente.. No se observó una asociación con las edades medias de los niños con los distintos patrones electrofor&icos; la distribución anual y estacional de los perfiles genómicos de las cepas de Rotavirus en este estudio reveló la existencia de un patrón muy prevalente (patrón A) en todas las estaciones climáticas (110).. No obstante Unicomb y Bishop (136), llevaron a cabo una investigación sobre los electroferotipos y serotipos de cepas de Rotavirus que infectaron a niños en Australia, durante el invierno de 1986-1987. Para esto se examinaron 344 muestras fecales positivas para Rotavirus en infantes menores de cinco años, los cuales consultaron por diarrea en los hospitales de seis ciudades ubicadas en diferentes areas de Australia; inicialmente se identificaron 299 serotipos (66.6%) de las 344 muestras analizadas, el serotipo 1 fué el que predominó en 218 de las 299 especímenes tipificables, el resto presentaron ser el serotipo 2.. En el análisis electroforético se identificaron 30 perfiles distintos que al ser comparados se encontraron mínimas variaciones entre ellos. Estos resultados sugieren.

(42) 29. una notable uniformidad serológica, asociada con la diversidad genética, encontrada en las cepas de Rotavirus que fueron identificadas en areas geográficas ampliamente distribuidas en Australia, durante una estación de invierno.. En otro estudio realizado en Roma por un período de cuatro años, se analizaron los electroferotipos del ARN de cepas de Rotavirus, aisladas de las heces de niños con enfermedad diarreíca. De un total de 675 muestras fecales solamente 210 fueron positivas para Rotavirus; casi todos los pacientes infectados con este agente viral fueron admitidos al hospital durante las estaciones de invierno de 1982 y 1985, mientras que en los años intermedios la infección ocurrió en todos los meses.. Por electroforésis, fueron detectados 14 electroferotipos, de los cuales, dos predominaron más sobre los otros a lo largo del período de estudio, sin embargo todos presentaron la característica de migración de patrón largo; sólo un perfil mostró tener más de 11 segmentos genómicos lo que indicó infección por más de una cepa viral. En esta investigación un dato muy importante fué la rata de hospitalización durante las estaciones de invierno y la prevalencia de la infección en todos los meses de 1983 y 1984 ya que este patrón epidemiológico es típico en los países con clima templado, no obstante esta prevalencia indica una persistencia endémica del Rotavirus en la población (113).. Otro estudio realizado en Indonesia, reportó 16 cepas de Rotavirus, aisladas de niños y presentó perfiles electroforéticos distintos a los descritos en ese país. Las muestras fueron colectadas de infantes con diarrea, en un período comprendido de Agosto de 1979 a Septiembre de 1981 en Jakarta, Medan.. Inicialmente los especímenes fueron evaluados por test de Hemaglutinacíon Pasiva Reversa, con el fin detectar al antígeno viral y las muestras positivas por este ensayo fueron adaptadas en cultivo celular para set' analizadas posteriormente por.

(43) OE. electroforésis, en donde se encontraron 16 electrofero tipos con patrones tanto largos como cortos; sólo un perfil mostró ser patrón supercorto lo que representó el hailázgo más importante para este estudio (57).. Un grupo de investigadores (Rasool y colaboradores. 1989), realizó un análisis de los electroferotipos que circulaban en Kuala Lumpur, Malasia en los últimos siete años (1978-1988).. Los 360 perfiles electro foréticos encontrados eran característicos del grupo A, excepto uno; el patrón largo fué el que predominó anualmente y ocasionalmente el patrón corto, no obstante, se observó una gran variabilidad genómica con la cocirculación de electroferotipos distintos cada año, la variación más notable en la movilidad de los perfiles genómicos ocurrió a nivel de los fragmentos 7,8, y 9. Estos resultados sugieren una muy baja frecuencia de infecciones duales en los casos encontrados (108).. Resultados similares fueron encontrados en otra investigación realizada en Malasia durante 1991. Se analizaron por electroforésis 973 muestras diarreicas de niños hospitalizados, de los cuales 268 fueron positivas para Rotavirus; todas las cepas virales pertenecieron al grupo A y fueron agrupadas en 22 electroferotipos, 16 con patrón largo y 6 con patrón corto; en esta investigación el patrón largo también predominó durante los doce meses del estudio, además se encontró una asociación entre los perfiles con patrón corto con niños mayores de 5 años (148).. Con el propósito de estudiar la correlación entre el serotipo y el patrón de migración electroforética del ARN en cepas de Rotavirus humanos, aisladas en un lapso de cuatro años, en dos poblaciones de México las cuales habian sido serotipificadas previamente, se identificaron 17 electroferotipos distintos, cuatro asociados al serotipo 01, dos al serotipo 02, seis al serotipo G3 y cinco al serotpio G4..

(44) 31. No se encontraron cepas que presentando el mismo electroferotipo tuvieran serotipo distinto, además se observaron mayores variaciones en los segmentos de ARN de cepas de Rotavirus de distinto serotipo que entre cepas del mismo serotipo.. La migración relativa de los segmentos 7,8 y 9 permaneció constante entre virus pertenecientes al mismo serotipo; sin embargo los investigadores recomiendan emplear técnicas como la Hibridización con el fin de obtener resultados más precisos (78).. En una investigación realizada en Bangladesh, se llevó a cabo una caracterización genómica de cepas de Rotavirus obtenidas de muestras fecales de 111 niños hospitalizados con gastroenteritis aguda. El estudio tuvo un período de duración de 12 meses (Enero-Diciembre 1989). Solamente 35 especímenes presentaron el virus, los cuales mostraron 11 electroferotipos diferentes, cinco con patrón largo y seis con patrón corto. Los cuatro serotipos O fueron identificados por PCR, amplificando el gen VP7; solamente a 32 cepas virales se les pudo asignar el serotipo.. El 11% presentó el serotipo Gi, el 37% el serotipo G2, 11% el serotipo G3, 23% el serotipo 04 y el 9% mostraron serotipos mixtos. Todos los perfiles con patrones cortos pertenecieron al serotipo G2, mientras que todos los patrones largos a los serotipos G1,G3 ó 04; además el 02 predominó a comienzo del año, el Gi tuvo una distribución esporádica, el G3 sólo se observó en Diciembre, y el G4 apareció en Octubre y pesistió hasta Diciembre. Con base a estos resultados se demostró la existencia de los cuatro serotipos mayores de Rotavirus en Bangladesh, por lo tanto una vacuna efectiva debería proteger contra estos cuatro serotipos en esta área geográfica (127).. En un estudio realizado por Guerrero y colaboradores (55), sobre la caracterización electroferotípica de Rotavirus, aislados de muestras diarreicas de infantes atendidos.

(45) 32. por gastroenteritis en diferentes centros asistenciales pediátricos de la ciudad de Bogotá, fueron sometidos al análisis electroforético de patrones de ARN de Rotavirus.. La movilidad electroforética de estos fragmentos genómicos permitió agrupar los Rotavirus examinados en seis electro ferotipos correspondientes al grupo A y a los tipos generales corto y supercorto aparentemente diferente a los informados hasta ahora para Latinoamérica.. En los patrones cortos se observó variación en los fragmentos genómicos 2,3,5,6,7,8,9; con base en estas diferencias se establecieron cinco perfiles genómicos, además se presentó un patrón supercorto que mostró variación en las regiones 1, II. El número de muestras positivas encontradas en este estudio, el corto intervalo en que fueron tomadas y su heterogeneidad electroforética sugieren una variabilidad genética relativamente alta en los Rotavirus que afectan a la población infantil de Bogotá.. En Colombia se desconocen muchos aspectos epidemiológicos de la enfermedad diarreica causada por Rotavirus. En los estudios realizados, las cepas virales sólo han sido identificadas por técnicas inmunoenzimáticas obteniendose resultados limitados sobré el comportamiento del Rotavirus (38, 87).. Existe la necesidad de aplicar técnicas de biología molecular, con el fin de obtener una caracterización genética del Rotavirus, entre ellas la separación electroforética del genoma del Rotavirus humano, que ha permitido a muchos investigadores conocer las diferencias y similitudes en el ARN de cepas de Rotavirus extraídas de las heces de pacientes con sintomatología de enfermedad diarreica... El desarrollo de éste proyecto, se basó en el análisis por electroforésis de cepas de Rotavirus presentes en la población infantil asistida por los diferentes centros pediátricos estudiados. Para lograr este objetivo, se empleó un método de extracción. eUO TECAGOPECUAflM ?•. -.

(46) 33. de ácidos nucleícos (ARN) de muestras fecales y se analizó el patrón electroforético que se detectó en geles de poliacrilamida; con el fin de compararlos perfiles obtenidos con los de cepas de referencia, se hizo necesario replicar éstas en cultivo celular.. También se empleó un ELISA dirigido al grupo A de Rotavirus, con el fin reconfirmar la presencia de éste en las muestras analizadas previamente por electroforésis.. El propósito de esta investigación, fué determinar los posibles electrofero tipos de cepas de Rotavirus aisladas de las heces de los niños examinados y con base en la literatura reportada sobre investigaciones realizadas con este mismo objetivo, inferir el posible nivel de subespeciación al que pertenecen. Con base en esto se logró identificar los patrones electroforéticos característicos de las cepas encontradas para el área geográfica en la que se encuentran los centros asistenciales pediátricos estudiados.

(47) 34. 3. MATERIALES Y METODOS'. 3.1 COLECCION DEMUESTRAS -. Las muestras estudiadas en el presente trabajo fueron obtenidas de niños con edades entre seis meses y cinco años que ingresaron con signos de enfermedad diarreica a diferentes hospitales de Santafé de Bogotá. Se colectaron un total de 328 muestras fecales, de las cuales 168 provenían del Hospital Lorencita Villegas de Santos; 60 de la Clínica David Restrepo; 45 de la Clínica del Niño del Seguro Social y 30 muestras procedentes del Hospital de Soacha.; además, de la Clínica del Seguro Social de Pereira se colectaron 25 muestras de pacientes tanto adultos como niños con enfermedad diarreica. La colección de muestras se realizó durante un periodo de siete meses a partir de Mayo 1994 a Noviembre 1994 y fueron almacenadas a -20°C hasta su procesamiento en el laboratorio. 3.2 CEPAS DE REFERENCIA Se utilizaron como cepas de referencia para el presente estudio, la cepa de Rotavirus bovino tipo Compton del Laboratorio Central Veterinario de Weybridge, Inglaterra y la cepa de origen porcino tipo Bohl's, obtenida del Laboratorio Central Veterinario AMES Iowa U.S.A.

(48) 35. 3.3 CULTIVOS CELULARES Las dos cepas fueron cultivadas en la línea celular MA-104 (riñón de feto de mono Rhesus), obtenida del departamento de Virologia del Instituto Nacional de Salud (INS) de la ciudad de Santafé de Bogotá. A partir de la monocapa celular, se realizaron sucesivos pases en Kimax de 75 cm 2 con el fin de replicar la monocapa hasta obtener la suficiente cantidad, para infectar con cada una de las cepas de referencia. Para la realización de los pases, inicialmente se efectuó un lavado de la monocapa con diluyente tripsina ( 40gr NaCL, 2gr KCL, 0,24gr Na 2 HPO4 anhidro, 0,300gr KH2PO4, 2.5gr Glucosa, 500 ml de agua destilada). Posteriormente fueron adicionados 2.0 ml de tripsina pH 8.5, la cual se dispersó por toda la monocapa, se incubó a 37°C por 5 minutos, pasado este tiempo se observó al microscopio de luz invertida el desprendimiento de las células. Luego se adicionaron 2.0 ml de una suspensión de MEM Eagle, suero fetal bovino 10 %, L-glutamina 2%, aminoácidos no esenciales 1%, penicilina (100 UIJml), estreptomicina (100 iWml), con el fin detener el efecto de la tripsina. Seguidamente, se colocó una pipeta de vidrio contra el fondo del Kimax y se succionó y expulso la suspensión de células 3 ó 4 veces hasta lograr la disgregación de las células. Posteriormente se pasó todo el contenido al medio de crecimiento (MEM Eagle, suero fetal bovino 10 %, L-glutamina 2%, aminoácidos no esenciales 1%, penicilina (100 UIJml), estreptomicina (100 mglml)), y se llevó a incubación " a 37°C. Una vez que se logró estabilizar la monocapa se procedió a infectarla; para esto se preparó un stock de tripsina con una concentración 634 mg/ml ( 0,317gr tripsina, 0,125gr EDTA, 50 ml sales para tripsina, agua destilada 500ml). Posteriomente se realizó una dilución (9.7 ml de MEM-Eagle más 0.3 ml de tripsina 634 Rml) para.

(49) 36. obtener una concentración de 20 ptglml. Seguidamente, se enfrentó imi de la solución anterior con imi del virus y se incubó 30 minutos a 37°C en baño maría.. Pasado este tiempo, se lavó la monocapa con diluyente tripsina , posteriormente fué adicionado el inóculo, el cual cubrió toda la monocapa; se incubó 1 hora a 37°C y cada 10 minutos se agitó el Kimax, con el fin de que el inóculo cubriera toda la monocapa. Luego, se descartó el inóculo y se adicionaron 10 ml de ,medio MEM-Eagle suplementado con medio hepes 1%, L-glutamina 2%, aminoácidos no esenciales 1%, penicilina (100ULIm1), estreptomicina (100 ig/ml y se llevó nuevamente a 37°C.. Las monocapas inoculadas se observaron diariamente hasta evidenciar el efecto citopático. El resultado del efecto citopático consistió en: Oscurecimiento y agrupamiento de las membranas celulares que tomaron forma redondeada; luego ocurrió desprendimiento celular y por último lísis celular (31). Como control negativo se utilizó un inóculo que constó de imi de MEM-Eagle más imi de la dilución de tripsina 20 ptglml.. Finalmente, después de la aparición del efecto citopático, los cultivos se congelaron y descongelaron tres veces para usar las células y liberar los virus, luego se centrifugó a 2500 g. durante 15 minutos. El sobrenadante de cada cepa fué alicuotado y congelado a -70°C.. 3.4 EXTRACCION ARN VIRAL Inicialmente, se utilizó un protocolo semejante al descrito por Herring y Colaboradores (58 ) el cual fué realizado a partir de las heces y del sobrenadante obtenido de los cultivos de las cepas de referencia..