AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO DE AMOSTRAS DE SÊMEN OVINO CRIOPRESERVADAS COM RETIRADA DO PLASMA SEMINAL

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(1)AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO DE AMOSTRAS DE SÊMEN OVINO CRIOPRESERVADAS COM RETIRADA DO PLASMA SEMINAL. Gabriel Maggi 1 Lucas Dalle Laste Dacampo 2 Natan da Cruz de Carvalho 3 Lucio Pereira Rauber 4 Francielli Weber Santos Cibin 5 Daniela Dos Santos Brum 6. Resumo: A ovinocultura brasileira passa por um processo de desenvolvimento. Com isso a implementação de biotecnologias da reprodução também cresceu a fim de obter melhoramento genético e otimizar a eficiência reprodutiva desses animais. A inseminação artificial (IA) e a criopreservação de sêmen são biotecnologias que auxiliam o melhoramento genético, porém são limitadas devido ao fato do sêmen criopreservado ovino ser ineficiente nas técnicas de IA. A ineficácia da criopreservação do sêmen ovino pode ter como justificativa o estresse oxidativo (EO) que se caracteriza como uma condição associada ao aumento de danos celulares induzidos pelo oxigênio e por suas formas oxidantes. Os espermatozoides ovinos têm grande propensão a sofrer com os efeitos do EO. Com isso avaliou-se o EO e a capacidade antioxidante de amostras de sêmen ovino com e sem plasma. Para o desenvolvimento do projeto coletou-se sêmen de um carneiro, utilizando o método da vagina artificial. Posteriormente o sêmen foi diluído nas proporções de 1:1 utilizando o diluente Bovimix®, distribuído em dois grupos: controle, onde sêmen diluído foi envazado em palhetas de sêmen de volume 0,25 mL. E grupo tratamento, que passou por centrifugação, para remoção do plasma seminal. A amostra foi novamente diluída e envazada em palhetas de sêmen de 0,25 mL. Doze palhetas de cada grupo foram refrigeradas a 5°C e posteriormente expostas ao vapor de nitrogênio líquido, submersas no nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criogênico. Para mensurar o EO do sêmen criopreservado avaliouse a produção de EROs através do método espectrofluorimétrico. Os resultados foram expressos em unidades de fluorescência. A avaliação do poder antioxidante foi determinada através do potencial antioxidante redutor férrico (FRAP). Os dados obtidos foram aplicados a análise estatística. A produção de EROs, mostrou diferença estatística entre os grupos avaliados e observou-se maior produção no grupo controle quando comparado ao grupo tratamento. Os resultados corroboram com a literatura onde ressaltasse que o sêmen ovino apresenta grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados, estes são os principais alvos da lipoperoxidação induzida pelas EROs. Ao se analisar a produção de EROs utilizando o método de regressão, observa-se que o grupo controle apresentou uma produção superior a encontrado para o grupo tratamento. O FRAP também apresentou diferença estatística, o sêmen onde o plasma foi mantido para a realização da criopreservação tem maior poder antioxidante quando comparado como o sêmen sem plasma. Através desta quantificação podemos estimar uma medida indireta do EO.. Palavras-chave: Plasma seminal, estresse oxidativo, criopreservação.

(2) Modalidade de Participação: Iniciação Científica. AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO DE AMOSTRAS DE SÊMEN OVINO CRIOPRESERVADAS COM RETIRADA DO PLASMA SEMINAL 1 Aluno de graduação. [email protected]. Autor principal 2 Aluno do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal . [email protected]. Co-autor 3 Aluno do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal. [email protected]. Co-autor 4 Docente do Instituto Federal Catarinense - Campus Concórdia . [email protected]. Co-autor 5 Docente Universidade Federal do Pampa. [email protected]. Co-autor 6 Docente. [email protected]. Orientador. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE.

(3) AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO DE AMOSTRAS DE SEMEN OVINO CRIOPRESERVADAS COM A RETIRADO DO PLASMA SEMINAL 1 INTRODUÇÃO Após um período desfavorável, a ovinocultura brasileira passa por um processo de desenvolvimento que foi retomado em 2013 e perdura até os dias atuais (SOUZA et al., 2017), possuindo um rebanho de aproximadamente 18,4 milhões de cabeças (IBGE, 2017). Com este crescimento apresentado pelo setor da ovinocultura, a implementação de biotecnologias da reprodução também se mostrou crescente nos últimos anos, a fim de obter melhoramento genético do rebanho nacional além de melhorar e otimizar a eficiência reprodutiva desses animais (PEREIRA et al., 2017), visando com isso a valorização do produto nacional, tornado esta atividade competitiva no mercado exterior. A inseminação artificial (IA) e a criopreservação de sêmen são biotecnologias que auxiliam o melhoramento genético, porém estas técnicas se tornam limitadas devido ao fato do sêmen criopreservado ovino ser ineficiente na inseminação artificial cervical e limitado na inseminação por laparoscopia, apresentando baixos índices de prenhez (MAXWELL & SALAMON, 1993), além do alto custo e da falta de mão de obra especializada. A ineficácia da técnica de congelamento do sêmen ovino pode ter como possível justificativa o estresse oxidativo (EO) resultante da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante o processo de criopreservação, podendo estar associadas com a baixa capacidade fecundante (SOUZA et al. 2016). O estresse oxidativo se caracteriza como uma condição associada ao aumento de danos celulares induzidos pelo oxigênio e por suas formas oxidantes. Estes prejuízos aos espermatozoides se dão principalmente: através do dano à membrana do espermatozoide, reduzindo a motilidade e a habilidade de fusão com o óocito, por meio dos danos diretos ao DNA espermático e também pode afetar o metabolismo de energia destas células (CIATTEI, 2016). Os espermatozoides ovinos têm grande propensão a sofrer com os efeitos do EO devido ao fato das células espermáticas desta espécie ter uma grande concentração de ácidos graxos poli-insaturados em sua membrana plasmática (BUCAK et al. 2007). Com isso este trabalho tem como objetivo avaliar o EO e a capacidade antioxidante de amostras de sêmen ovino com e sem plasma, afim de identificar uma possibilidade de reduzir o mesmo, com a retirada do plasma durante o processo de criopreservação, para obter-se melhor qualidade do sêmen. 2 METODOLOGIA O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologias da Reprodução (BIOTECH) da Universidade Federal do Pampa (Unipampa) - Campus Uruguaiana, sendo parte de um projeto de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. O experimento apresenta aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) pelo protocolo 012/2016. O sêmen de um carneiro da raça Ile de France de 4 anos de idade foi coletado. pelo método da vagina artificial aquecida a 42°C. Imediatamente após a coleta a mostra foi avaliada, sendo observado um volume de 0,5 mL e coloração marfim, A seguir a o sêmen foi analisado com auxílio de microscópio óptico, sendo observada uma concentração de 6,2 x 109 sptz por mL, motilidade de 95% e vigor 3. Posteriormente o sêmen foi diluído em diluente Bovimix® até atingir uma concentração final de 200 x106 sptz/mL, sendo a seguir dividido em 2 tratamentos. No grupo controle, o sêmen foi imediatamente envasado em palhetas de 0,25mL (concentração 50 x106 sptz/palheta) no grupo tratamento, o sêmen foi previamente centrifugado em tubos de 1,5mL pelo período de Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE 8QLYHUVLGDGH )HGHUDO GR 3DPSD œ 6DQWDQD GR /LYUDPHQWR D GH QRYHPEUR GH.

(4) 10 minutos a uma força de 5000 x g para remoção do plasma seminal. O sobrenadante foi descartado e o pallet formado resuspendido em 1mL do diluente. A amostra foi novamente diluída a concentração de 50 x106 sptz/palheta e envazado em palhetas de sêmen de 0,25 mL. Doze palhetas de cada grupo foram refrigeradas a 5°C por 4 horas e posteriormente expostas ao vapor de nitrogênio líquido por 15 minutos, após este processo foram submersas no nitrogênio líquido a -196°C e armazenadas em botijão criogênico. Uma palheta de cada grupo foi descongelada em banho maria a 36ºC por 20 segundos, e submetida a avaliação após a refrigeração. O grupo controle apresentou motilidade e 50% e vigor 2 e o grupo tratamento teve motilidade de 40% e vigor 1. Para mensurar o EO do sêmen congelado/descongelado avaliou-se a produção de EROs através do PpWRGR HVSHFWURIOXRULPpWULFR XVDQGR ¶ ¶-diclorofluoresceína diacetato (DCF-D) (LOETCHUTINAT et al., 2005). As amostras foram incubadas no escuro com 5 µL de DCF-C (1mM) e monitorou-se a oxidação da DCF-D para diclorofluoresceína (DCF) fluorescente pelas espécies reativas. A emissão da intensidade de fluorescência foi realizada em 520 nm (com excitação de 488 nm) nos tempos 0, 60 e 120 minutos após a adição da DCF-D, em Espectrofluorímetro Shimadzu modelo RF-5301PC. Os resultados foram expressos em unidades de fluorescência (UF). A avaliação do poder antioxidante foi determinada através do potencial antioxidante redutor férrico (FRAP). Neste ensaio, os antioxidantes presentes na amostra são avaliados como redutores do Fe+3 a Fe+2, o qual é quelado pela 2,4,6-Tri(2-piridil) -s- triazina (TPTZ) para formar o complexo Fe+2-TPTZ com absorção máxima em 593 nm (Benzie & Strain, 1996). Os dados obtidos para os valores de EROs foram aplicados aos testes T student e de regressão, com significância de 5%. Os parâmetros de FRAP foram avaliados apenas pelo teste estatístico T student. 3 RESULTADOS e DISCUSSÃO O estresse oxidativo, quando avaliado através da produção de EROs, mostrou diferença estatística entre os grupos avaliados, sendo observada uma maior produção de EROs no grupo controle quando comparado ao grupo tratamento. Tabela 1 ± Produção de espécies reativas do oxigênio, determinação por método espectrofluorimétrico nos diferentes grupos.. Controle Tratamento EPM. 0 11,340a 8,763b 0,510. Tempo após a adição da DCF-D (minutos) 60 120 a 15,421 28,821a b 12,823 19,406b 0,508 0,509. Os resultados corroboram com o que foi anteriormente apresentado por Lenzi et al, 2002 e posteriormente complementado por Souza et al, 2016. Estes autores ressaltaram que o sêmen ovino apresenta grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados na membrana plasmática dos espermatozoides, estes ácidos são os principais alvos da lipoperoxidação induzida pelas EROs, podendo resultar em alterações estruturais e funcionais das membranas celulares e das organelas (SIKKA, 1996). A retirada do plasma em outras espécies já é considerada benéfica como mostra o trabalho de Almeida et al, 2006 que realizaram estudos com equinos e concluíram que concentrações acima de 25% de plasma seminal podem ser prejudiciais a qualidade do espermatozoide. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE 8QLYHUVLGDGH )HGHUDO GR 3DPSD œ 6DQWDQD GR /LYUDPHQWR D GH QRYHPEUR GH.

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(6) um método eficiente e acessível para aplicação em larga escala, contribuindo para o melhoramento genético do rebanho ovino brasileiro. REFERÊNCIAS ALMEIDA, J.L. Efeito de diferentes concentrações de plasma seminal na criopreservação do sêmen equino. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia-Tese/dissertação (ALICE), 2006. %8&$. 0 1 $7(ùù$+,1 $ 9$5,ù/, g <h&( $ 7(.,1 1 $.d$< $ (2007). The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen: microscopic and oxidative stress parameters after freeze±thawing process. Theriogenology, 67(5), 1060-1067. CIATTEI, A. P. (2016). Micronutrient and Reduction of Oxidative Stress in Spermatozoas. International Journal of Nutrology, 9(1), 153-159. IBGE, Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, 2017. LENZI A, GANDINI L, LOMBARDO F, PICARDO M, MARESCA V, PANFILI E, TRAMER F, BOITANI C, DONDERO F. Polyunsaturated fatty acids of germ cell membranes, glutathione and blutathione-dependent enzyme-PHGPx: from basic to clinic. Contraception, v.65, p.301-304, 2002. LOETCHUTINAT, C.; KOTHAN, S.; DECHSUPA, S.; MEESUNGNOEN, J.; JAY-GERIN, J. P.; MAKHETKORN, S. Spectrofluorometric determination of intracellular levels of reactive oxugen species in drug-sensitive and drug-resistant cancer cells using the 2',7' dicholofluorescein diacetate assay. Radiat. Phys. Chemical. 72, p. 323-331, 2005. MAXWELL WM SALAMON S (1993) Liquid storage review. Reproduction, Fertility and Development 5, 613-638.. of. ram. semen:. a. PAHUNE, P. P., CHOUDHARI, A. R., & MULEY, P. A. (2013). The total antioxidant power of semen and its correlation with the fertility potential of human male subjects. Journal of clinical and diagnostic research: JCDR, 7(6), 991. PEREIRA, L. M. C., DA SILVA, B. P. A., SOUZA, L. E., DAMASCENO, L. R., & DE OLIVEIRA, B. M. (2017). Inseminação artificial em ovinos e caprinos. Anais da Semana do Curso de Zootecnia-SEZUS, 11(1). SIKKA SC. Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Front Biosci, v.1, p.78-86, 1996. de SOUZA, J. D. F., MAGALHAES, K., de LUCENA, C. C., GUIMARAES, V., & MARTINS, E. Evolução do rebanho ovino entre 2007 e 2016. Embrapa Caprinos e OvinosArtigo de divulgação na mídia (INFOTECA-E). SOUZA, W.L.; MORAES, E.A.; TONIOLLI, R. Adição de antioxidantes ao sêmen de carneiros e seus efeitos após a descongelação. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 37, n. 5, p. 471-478, 2018. SOUZA, W. L., MORAES, E. A., COSTA, J., SOUSA, P. H., LOPES JUNIOR, E. S., OLIVEIRA, R. P., & TONIOLLI, R. (2016). Effect of different concentrations of melatonin to ram spermatozoa on oxidative stress after cryopreservation. Pesquisa Veterinária Brasileira, 36(7), 657-664.. Anais do 10º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE 8QLYHUVLGDGH )HGHUDO GR 3DPSD œ 6DQWDQD GR /LYUDPHQWR D GH QRYHPEUR GH.

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