EXTRACCIÓN DE ADN

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EXTRACCIÓN DE ADN

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Extracción del ADN

 Consta de 5 pasos o etapas

1. Ruptura de membranas (celular y nuclear)

2. Purificación 3. Precipitación 4. Lavado

5. Almacenamiento

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1. Ruptura membranas

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Lisis celular (hacer ADN/ARN accesible)

 Física

 Química

 Enzimática

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Física

 Congelar y descongelar

 Macerar en nitrógeno líquido

 Ultrasonicación

 “Beads”

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Congelar y descongelar

 Dendritas de hielo rompen la membrana celular

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Macerar con nitrógeno líquido

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Ultrasonicación

• Ondas ultrasónicas generan fuerzas de fricción que rompen membranas y pueden romper moléculas

biológicas grandes

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“Beads”

 Colisión rompe membrana celular

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Química

 Detergentes iónicos como SDS, PEX, CTAB

 Interacción con lípidos, desnaturalizan proteínas, inhiben enzimas

 Membrana se deshace

 Solventes no iónicos como butanol

 Disuelve ciertas estructuras moleculares de la célula e inicia un “leak”

 Buffers especiales como en el método sucrosa

 Cambio drástico en ambiente osmótico, “leaking” de membranas

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Disrupción enzimática

 Lisozima

 Hidroliza enlaces glucosídicos

 Liticasa

 Hidroliza poli-B(1-3) glucosa

 Otras enzimas

 Extraídas de bacterias

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2.Purificación

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Purificación química de ADN

 Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1;

pH>7.4)

 Fenol

 Separa proteínas de ADN (dependiente de pH)

 Cloroformo

 Disuelve proteínas y lípidos

 Hace al ADN menos soluble en la fase orgánica/fenólica

 Alcohol isoamílico

 Evita que se forme espuma

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Método clásico con fenol-cloroformo

 Aprovecha que lípidos y proteínas se disuelven en cloroformo (fase orgánica) y el ADN se disuelve en la fase acuosa

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Otros reactivos

 Segundo lavado con cloroformo:eliminar restos de fenol para que no se degraden enzimas que se usan después

 B-mercaptoetanol: fuerte agente reductor, eliminar taninas y otros polifenoles, rompe puentes disulfuro

 Proteinasa K, jugo papaya/piña: degrada proteínas

 Octanol: evita espuma (como alcohol isoamílico)

 PVP: adsorbe polifenoles e impide que haya interacción con ADN

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Las plantas son más complicadas (no siempre)

 Metabolitos presentes en las células pueden contaminar el ADN

 Ej: agregar B-mercaptoetanol para eliminar taninas y otros polifenoles (también rompe puentes disulfuro).

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3.Precipitación

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Precipitación con alcohol

 Sales de ácidos nucleicos y cationes monovalentes son prácticamente insolubles en una mezcla alcohol- agua y precipitan

 Alcoholes usados

 Isopropanol (más eficiente pero precipita más sal)

 Etanol (95% o absoluto)

 Sales catiónicas monovalentes

 Acetato de amonio

 Cloruro de Litio

 Cloruro de Sodio

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4.Lavado

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Lavado de ADN

 Casi siempre con etanol 70%

 Elimina sales

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5. Almacenamiento

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• Se resuspende en agua o TE 1x (pH 8, mejor para almacenamiento a largo plazo)

• Tris: estibiliza pH ; EDTA: quela iones que son cofactores de ADNasas

• Se guarda a 4°C (o algunas veces a -20°C)

Almacenamiento

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Cuantificación ADN

 Método común: absorbancia o densidad óptica

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Espectrofotómetro

 Con luz UV

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Determinación de concentración

 Medida de aborbancia a 260nm

 Donde ADN absorbe la luz más fuertemente

 Permite estimar concentración

 Se sabe que: A₂₆₀ de 1.0 = 50µg/ml ADN puro Concentración ADN (µg/ml) =

A₂₆₀ medida × factor de dilución × 50µg/ml

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Pureza del ADN

 Razón de las absorbancias a 260 y 280nm (donde absorben más luz las proteínas)

Pureza ADN = A₂₆₀/A₂₈₀

Valores entre 1,7 y 2 , ideal: 1.8

 Razón de las absorbancias a 260 y 230nm (donde absorben otros contaminantes )

Valores entre 2 y 2.2

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Espectro típico

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Contaminación con trizol

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Integridad del ADN

degradado bien

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Integridad depende en parte de la fuente

ADN de sangre o

tejido congelado

ADN de tejido en parafina