EVALUACIÓN DEL POTENCIAL INMUNOGÉNICO IN SILICO DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ESTADIOS HUEVO Y ADULTO DE Taenia solium
JUANA CAMILA MUÑOZ RESTREPO
DIRECTORA: CLEMENCIA ELENA OVALLE BRACHO MSc. PhD CODIRECTOR: CARLOS ESTEBAN FRANCO MUÑOZ Msc.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA BACTERIOLOGÍA BOGOTÁ, D.C COLOMBIA
2020
EVALUACIÓN DEL POTENCIAL INMUNOGÉNICO IN SILICO DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ESTADIOS HUEVO Y ADULTO DE Taenia solium
JUANA CAMILA MUÑOZ RESTREPO
DIRECTORA:
CLEMENCIA ELENA OVALLE BRACHO Msc. PhD
CODIRECTOR:
CARLOS ESTEBAN FRANCO MUÑOZ Msc
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA BACTERIOLOGÍA BOGOTÁ, D.C COLOMBIA
DICIEMBRE 2020
EVALUACIÓN DEL POTENCIAL INMUNOGÉNICO IN SILICO DE LAS PROTEÍNAS DE LOS ESTADIOS HUEVO Y ADULTO DE Taenia solium
JUANA CAMILA MUÑOZ RESTREPO
JURADO:
JANNETH GONZALEZ SANTOS Msc. PhD
JURADO:
ALFONSO BARRETO PRIETO Msc. PhD
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA BACTERIOLOGÍA BOGOTÁ D.C COLOMBIA
2020
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
Una mujer con imaginación es una mujer que no sólo sabe proyectar la vida de una familia, la de una sociedad, sino también el futuro de un milenio.
Rigoberta Menchú
Este trabajo se lo dedico a mi abuela Ana Cecilia Rodríguez por su sabiduría, amor, compañía, apoyo incondicional y por ser la mujer que con su fuerza me ha inspirado siempre A mi padre, Carlos Muñoz por mostrarme el valor que tiene el esfuerzo, hacer de mí una mejor persona y apoyar cada paso que doy A mi madre, Yolanda Restrepo por ser mi amiga, creer en mi e impulsarme siempre a soñar A mi abuela Cecilia Hernández, hermanos y tíos por apoyarme con amor en cada etapa de la vida que me ha traído hasta acá.
A Carolina Andrade por su compañía, apoyo, cariño y recordarme cada día que puedo lograr todo aquello que me proponga.
AGRADECIMIENTOS
A mis padres, por brindarme su apoyo y motivación.
A María José, Tatiana, Stefania y compañeros de universidad por ser parte de esta etapa en mi vida.
A mi directora la Dra. Clemencia Ovalle, por su dedicación e inspiración, por ser el reflejo del compromiso como profesional con la sociedad y siempre impulsarme a trabajar por quienes nos necesitan.
Al Dr. Carlos Franco, por su inmensa paciencia y disposición para la realización de este trabajo.
A la Dra. Adriana Arévalo y la Dra. Sofia Duque y al Instituto Nacional de salud, por, acompañarme y guiarme a lo largo de este proyecto.
A mi maestra de bioinformática por inspirarme como mujer en la ciencia y creer en mí, a la Dra.
Claudia Cuervo, Dr. Jose Mateus e integrantes del semillero de Inmunoparasitologia por haberme acogido e incentivado en el campo de la investigación
A la Pontificia Universidad Javeriana, por brindarnos los espacios y los conocimientos para formarnos como profesionales íntegros.
A todos ustedes, infinitas gracias.
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ... 10
2. INTRODUCCIÓN ... 11
3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 13
4. MARCO TEÓRICO ... 16
4.1GENERALIDADES ... 16
4.2AGENTEETIOLÓGICOYCICLODEVIDADELPARÁSITO ... 16
4.2.1 Taxonomía agente etiológico ... 16
4.2.2 Morfología ... 16
4.2.3 Epidemiología... 18
4.2.4 Ciclo de vida teniasis/cisticercosis y transmisión ... 21
4.3ASPECTOSCLÍNICOSYTRATAMIENTO ... 23
4.3.1 Manifestaciones clínicas ... 23
4.3.2 Tratamiento ... 24
4.4.MÉTODOSDIAGNÓSTICOS ... 24
4.4.1 Examen macroscópico y microscópico ... 24
4.5ANTÍGENOSCARACTERIZADOS ... 28
4.5.1 Antígenos caracterizados para Taenia solium. ... 28
4.5.2 Antígenos recombinantes y péptidos sintéticos ... 31
4.6BIOLOGIACOMPUTACIONALYDATOSPOSTGENÓMICOS ... 32
5. ANTECEDENTES... 34
6. OBJETIVOS ... 36
6.1OBJETIVO GENERAL ... 36
6.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 36
7. METODOLOGÍA ... 37
7.1TIPO DE ESTUDIO... 37
7.2OBTENCIÓN SECUENCIAS Y BASE DE DATOS EXCEL... 37
7.2.1. Búsqueda y descarga secuencias de proteínas Taenia solium ... 37
7.2.2 Base de datos ... 37
7.3 OBJETIVO ESPECÍFICO 1: SELECCIONAR LAS PROTEÍNAS DE TAENIA SOLIUM CON POTENCIAL INMUNOGÉNICO A TRAVÉS DE LOS ÍNDICES DE ABUNDANCIA DE REGIONES ANTIGÉNICAS IN SILICO. ... 37
7.3.1 Identificación y predicción de regiones antigénicas ... 37
7.3.2 Depuración base de datos... 38
7.4 OBJETIVO ESPECÍFICO 2: SELECCIONAR LAS PROTEÍNAS DE LOS ESTADIOS HUEVO Y ADULTO DE TAENIA SOLIUM QUE PRESENTARON POTENCIAL INMUNOGÉNICO A TRAVÉS DE LOS ÍNDICES DE ABUNDANCIA DE REGIONES ANTIGÉNICAS IN SILICO. ... 39
7.4.1 Clasificación por estadios de las proteínas de Taenia solium ... 39
7.5 Objetivo específico 3: Predecir in silico la presencia de péptidos señal en las proteínas de mayor potencial inmunogénico seleccionadas. ... 40
7.5.1 Predicción péptido señal ... 40
7.5.2 Depuración base de datos... 40
8. RESULTADOS ... 41
8.1EVALUACIÓN POTENCIAL INMUNOGÉNICO ... 41
8.2.CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR ESTADIO PARASITARIO ... 44
8.3PREDICCIÓN DEL PÉPTIDO SEÑAL ... 44
9. DISCUSIÓN ... 46
10. CONCLUSIONES ... 49
11. RECOMENDACIONES ... 50
12. BIBLIOGRAFÍA ... 51
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Ventajas y desventajas diagnósticas reportadas en la literatura para teniasis
humana causada por Taenia solium. ... 14
Figura 2. Morfología estadio adulto y cisticerco de Taenia solium.. ... 18
Figura 3. Teniasis / cisticercosis por Taenia solium según la literatura de 1986 hasta abril del 2017 y cisticercosis porcina según los informes de la OIE de 2005 a 2016 en América Central y la cuenca del Caribe.. ... 19
Figura 4. Factores de riesgo relacionados con la presencia de cisticercosis. ... 21
Figura 5. Ciclo de vida teniasis/cisticercosis causado por Taenia solium. ... 22
Figura 6. Diagnóstico diferencial de las especies del género Taenia spp. ... 25
Figura 7. Fórmula cálculo de índice de abundancia de regiones antigénicas y regiones antigénicas continuas. ... 38
Figura 8. Proteínas de Taenia solium depuradas de la base de datos. ... 39
Figura 9. Distribución de las regiones antigénicas/ regiones antigénicas continúas predichas con el servidor BepiPred- 2.0. ... 41
Figura 10. Pipeline bioinformático. Análisis de secuencias reportadas en el NCBI para Taenia solium. ... 42
Figura 11. Clasificación de 190 proteínas de Taenia solium a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas. ... 43
Figura 12. Estadio parasitario de las proteínas de Taenia solium. ... 44
Figura 13.Proteínas incluidas y excluidas a partir del criterio establecido para el análisis realizado a través de SignalP- 5.0 ... 45
Figura 14. Proteínas vía de excreción/secreción de T. solium con potencial inmunogénico caracterizado in silico. ... 45
1. RESUMEN
La teniasis causada por T. solium es una infección intestinal que afecta al ser humano al ingerir carne contaminada con cisticercos. Sus larvas pueden infectar los tejidos, causando cisticercosis humana con progresión a neurocisticercosis. Esta constituye un problema de salud pública que prevalece en áreas urbanas y rurales, donde se asocia a diferentes determinantes sociales como lo son, las malas condiciones sanitarias e higiénicas y la pobreza, por lo que, se encuentra entre las principales enfermedades tropicales desatendidas. Sumado a lo anterior, los métodos diagnósticos disponibles presentan variaciones en el desempeño, algunos con baja sensibilidad y especificidad, reacciones cruzadas con otras enfermedades y entre especies de Taenia spp.
Respondiendo a los problemas diagnósticos, se han desarrollado a partir de péptidos recombinantes diferentes pruebas que permiten superar las características operativa de las disponibles, sin embargo, aún existe la necesidad de contar con estudios que brinden más información de las características de las proteínas del parásito de tal forma que esta sirva para mejorar los métodos diagnósticos a partir de heces, que sean simples, costo-efectivos y rápidos, para detectar los portadores de T. solium en campo y de este modo apoyar la eliminación del complejo teniasis/cisticercosis. Las proteínas de excreción/secreción de T. solium podrían ser candidatas para ser identificadas en la materia fecal, empero es escasa la información que se tiene sobre estas proteínas principalmente sobre sus características inmunogénicas, razón por la cual este trabajo tuvo como objetivo, evaluar el potencial inmunogénico in silico de las proteínas del estadio huevo y adulto de Taenia solium.
Con este fin, se llevó a cabo la evaluación del potencial inmunogénico in silico de las secuencias de proteínas reportadas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) para Taenia solium y la identificación de las proteínas de excreción/secreción, se utilizaron los servidores BepiPred-2.0 y SignalP- 5.0 respectivamente. Se tuvo en cuenta la clasificación de las proteínas por estadio parasitario y la predicción del péptido señal para la identificación de proteínas de excreción/secreción. De las 586 secuencias de proteínas reportadas por el NCBI y evaluadas in silico se obtuvieron 88 secuencias con potencial inmunogénico equivalentes a 22 proteínas de T.
solium con sus respectivas variantes, que además pueden hacer parte del sistema de excreción/secreción del parásito.
2. INTRODUCCIÓN
La enfermedad gastrointestinal causada por los cestodos Taenia solium, Taenia saginata y Taenia asiática, se denomina teniasis, esta se transmite por el consumo de carne cruda o con poca cocción de cerdo y ganado vacuno respectivamente, los cuales son hospederos intermediarios del parásito (1,2).
La forma larvaria de la T. solium es el agente causal de la cisticercosis, enfermedad que se adquiere por heteroinfección al ingerir los huevos de un individuo infectado o por autoinfección al ingerir sus propios huevos a través de contaminación fecal-oral, alimentos y otros medios de transmisión indirectos. Esta enfermedad afecta principalmente al cerdo y al hombre en el cual se presenta compromiso a nivel del Sistema Nervioso Central (3,4).
Debido a los graves problemas que puede llegar a causar en la salud humana el complejo teniasis/
cisticercosis, representa un problema de salud pública en varios países, ya que es una de las principales causas de epilepsia y defunción por enfermedades de transmisión alimentaria. Esta prevalece tanto en áreas urbanas como rurales, donde se asocian a las prácticas tradicionales de crianza de cerdos, malas condiciones sanitarias e higiénicas, ignorancia y pobreza, afectando tanto la salud como el sustento de las comunidades rurales de los países en desarrollo (1,5). Por lo que, la OMS para el plan de acción 2016-2022 se propuso como objetivo eliminar el complejo teniasis/cisticercosis a través de la identificación de estrategias que lleven a la interrupción de la transmisión de T. solium (4,6).
Entre las estrategias se ha propuesto, diagnosticar con alta efectividad los pacientes portadores de tenia, dado que estos son fundamentales en la transmisión local de la enfermedad y por lo general se encuentran en zona rural (7). Entre los métodos diagnósticos disponibles, la prueba más utilizada es la microscopía, esta presenta sensibilidad del 38% en los portadores de tenia. Otra prueba es la ELISA de coproantígeno de la cual se reporta sensibilidad del 98% (8). A pesar de ello, a la fecha solo existen dos métodos capaces de distinguir entre infección por T. solium y T.
Saginata; el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas específicas de especie (ELISA) y la reacción en cadena de la polimerasa (coproPCR) (8,9). Sin embargo, a través de la ELISA no es posible identificar enfermedad activa. Respecto a la coproPCR , son pruebas de alto costo que
requieren de laboratorios bien equipados, lo que dificulta su implementación como pruebas de rutina en zonas rurales endémicas dónde se presenta la enfermedad (10, 11).
A partir de la necesidad de contar con pruebas diagnósticas rápidas que puedan ser utilizadas en campo y que posean buen desempeño diagnóstico, se ha resaltado la importancia de proteínas y péptidos recombinantes como insumo en pruebas para la inmunodetección de la teniasis (12). Una alternativa es el uso de proteínas de excreción/ secreción del parásito como posibles blancos diagnósticos (12,13). Es escasa la información que se tiene sobre las características inmunogénicas de este tipo de proteínas. Por lo anterior, este trabajo tuvo como objetivo evaluar el potencial inmunogénico in silico de las proteínas de estadio huevo y adulto de Taenia solium.
Para esto, se predijo el potencial inmunogénico de las proteínas disponibles en el NCBI para T.
solium, en donde se seleccionaron las proteínas de excreción/secreción más inmunogénicas que potencialmente se pudiesen encontrar en la materia fecal, dado que son las de mayor interés para desarrollar una prueba diagnóstica de campo a partir de este tipo de muestra.
3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El complejo teniasis/cisticercosis causado por Taenia solium y la enfermedad resultante, la neurocisticercosis (NCC) presenta una mayor prevalencia en África, América Latina y el Caribe (1,5), y se encuentra asociada con la presencia de portadores humanos de T. solium que, tras defecar al aire libre, diseminan huevos de tenia, que son infecciosos tanto para humanos como para cerdos (1,10). Esta enfermedad afecta 14.9 millones de personas produciendo manifestaciones clínicas que pueden ocasionar complicaciones neurológicas como episodios de epilepsia o muerte y se estima que estos últimos afectan entre 450,000-1,35 millones de personas, en dónde el 75%
de los pacientes no reciben tratamiento o este es insuficiente, debido al acceso limitado a los medicamentos por factores como pobreza, ignorancia de la enfermedad o una deficiente infraestructura sanitaria (1,5,10).
Con base en esto, la OMS se ha propuesto medidas destinadas a mejorar la detección con instrumentos simples, costo-efectivos y rápidos para la detección de los portadores de T. solium en los lugares dónde esta infección es endémica (1). A pesar de esto, las pruebas de diagnóstico disponibles actualmente dependen de la detección macroscópica o microscópica de las etapas del parásito en las heces, antígenos o del material genético.
Las pruebas de detección macroscópica y microscópica son las más utilizadas en el diagnóstico, la detección se hace a partir de las proglótides expulsadas por los portadores o la búsqueda de los huevos de Taenia spp en las heces respectivamente. la sensibilidad diagnóstica de estas técnicas se ha reportado entre el 38 y el 69% (8,13), ya que un diagnostico basado en características morfológicas del parásito, tiene limitantes como similitud de los huevos entre especies, necesidad de profesionales expertos en la identificación, intermitencia en la liberación de proglótides y huevos (10,14). Por otro lado, las pruebas de coproantígeno, se encuentran asociadas a productos del metabolismo del parásito y son independientes de la presencia de huevos o proglótides, esto produce que la prueba sea útil para la detección temprana y la evaluación de la eficacia del tratamiento. Sin embargo, son pruebas específicas de género, pero no se puede diferenciar entre T.
solium y T. saginata, esto lleva a implicaciones para la salud pública como la transmisión local de la enfermedad mediante portadores no identificados de Taenia solium (10,15).
Las pruebas inmunológicas evitan la exposición a posibles riesgos biológicos asociados a la manipulación de muestras fecales y tienen la capacidad de identificar entre especies, a pesar de ello, se han reportado falsos positivos por la permanencia de los anticuerpos tiempo después de que se da tratamiento a la infección, de tal forma que la prueba no detecta enfermedad activa (10,14). Entre otras pruebas que se han venido desarrollando se encuentran las de diagnóstico con base en la detección del ADN de T. solium mediante PCR, para esta se ha reportado una especificad de 94% y sensibilidad de 99% (14), estas características la hacen útil en el diagnóstico. Sin embargo, es una metodología costosa y requiere de laboratorios bien equipados. Es por esto, que su implementación como prueba rápida y de rutina en zonas endémicas es su principal limitante (10,16). A pesar de la baja sensibilidad que presenta la microscopia, esta se ha posicionado como la prueba más accesible para el diagnóstico de teniasis (9).
Una estrategia para el desarrollo de pruebas diagnósticas actualmente es la biosíntesis de péptidos recombinantes como insumo para pruebas en campo, la utilización de estos péptidos derivados de antígenos previamente caracterizados evitaría la necesidad de purificación de los antígenos y podría asegurar la reproducibilidad de los ensayos (17). A la fecha se han anotado más de 600 proteínas de T. solium las cuales están disponibles en el NCBI, sin embargo, hay escasa información de las características inmunogénicas de las proteínas excretoras/ secretoras del Figura 1. Ventajas y desventajas diagnósticas reportadas en la literatura para teniasis humana causada por Taenia solium. Elaboración propia, Adaptado de:
Mwape, K. E., & Gabriël, S et al (10).
parásito, que podrían ser potenciales blancos para la identificación del estadio huevo o adulto de T. solium y la interrupción del ciclo de vida del parásito mediante pruebas diagnósticas portables realizadas en heces. Por lo anterior, se hace necesario evaluar proteínas de Taenia solium que sean potencialmente inmunogénicas a través de estudios in silico con herramientas bioinformáticas (9,14).
De este modo, es pertinente de acuerdo con el plan propuesto por la OMS para combatir y erradicar la teniasis/cisticercosis por T. solium proponer nuevas pruebas diagnósticas (6). La evaluación del potencial inmunogénico in silico de las proteínas del estadio huevo y adulto de Taenia solium, puede brindar información para investigaciones futuras, en la generación de nuevos antígenos específicos de Taenia solium y su uso en estrategias inmunodiagnósticas portables para la detección del parásito en las heces. De igual manera, el uso de herramientas bioinformáticas para análisis computacionales son rentables y permiten priorizar el análisis de posibles blancos diagnósticos previo a la realización experimental, evitando el uso de animales, asegurando mejores predicciones y resultados (17).
4. MARCO TEÓRICO 4.1 GENERALIDADES
La infección causada por Taenia solium afecta principalmente la salud, el sustento de las comunidades rurales de los países en desarrollo y se encuentra entre las principales enfermedades tropicales desatendidas.
La teniasis es causada por el estadio adulto del cestodo Taenia solium y se conoce como cisticercosis a la enfermedad zoonótica causada por la larva cuando esta llega al humano a infectar tejidos como músculos, piel, ojos y su mayor complicación es la neurocisticercosis, esta afecta el sistema nervioso central a partir de la formación de quistes en el cerebro originando epilepsia y otras afecciones neurológicas (1,18).
4.2 AGENTE ETIOLÓGICO Y CICLO DE VIDA DEL PARÁSITO
4.2.1 Taxonomía agente etiológico
Taenia solium se clasifica de esta manera (19):
Familia: Platyhelminthes Orden: Taeniidae
Clase: Cestoda
Género: Taenia
Especie: Taenia solium
4.2.2 Morfología
Taenia solium, al igual que las otras especies pertenecientes del género Taenia son gusanos planos que normalmente miden entre 1 y 8 metros. T. solium es un parásito hermafrodita que no posee cavidad celómica ni aparato digestivo, por lo que, la nutrición se realiza a través de su superficie. Desarrollan tegumento, microtricas y estructuras que se asemejan a las vellosidades del intestino, estas poseen una capa de mucopolisacáridos que impiden que las enzimas del huésped digieran al parásito. El sistema excretor es de tipo protonefridial con canales longitudinales (11,19).
El escólex posee cuatro ventosas y un rostelo que contiene dos hileras de ganchos, la cantidad de ganchos puede oscilar entre 22 y 32. Las ventosas y el rostelo son estructuras de fijación que le dan la capacidad a Taenia solium de anclarse en la pared del yeyuno (19,20). El cuello es corto, tiene actividad biosintética e inicia una cadena de segmentos o proglótides que se encuentran en diferentes estadios de desarrollo de acuerdo con su ubicación.
Las proglótides más cercanas al cuello son inmaduras y los segmentos más distales son grávidos, constituyen individualmente un saco de huevos y presentan desarrollo completo de los órganos sexuales femeninos y masculinos. Los genitales masculinos son los primeros en desarrollarse y están constituidos por un gran número de testículos dispersos pero conectados por medio de túbulos finos que confluyen en un ducto genital que a su vez desemboca por un costado de la proglótide en el atrio genital. El espermoducto llega al poro genital en el cual, también desemboca la vagina, este conducto femenino recibe los espermatozoides y los conduce al receptáculo seminal que se conecta con el oviducto (4,11,19,21).
La fertilización se puede dar al interior de cada proglótide, entre los diferentes segmentos del parásito o entre proglótides de diferentes gusanos. Esta se produce cuando el ovario, formado por dos lóbulos grandes y uno pequeños libera los óvulos hacia el oviducto. Una vez se realiza la fertilización, los huevos se acumulan en el útero ,maduran y se vuelven infectantes.
Estos huevos miden entre 20-40 µm y son indistinguibles entre especies. Los huevos maduros poseen una estructura rígida, conocida como embrióforo que está constituido por pequeños bloques proteicos unidos entre sí y constituyen la estructura más importante de protección de la oncosfera, además le atribuyen la apariencia estriada (15,16). Las proglótides grávidas contienen miles de huevos que pueden dar lugar a cientos de cisticercos en el huésped intermediario (cerdo) una vez se ingiere la proglótide o parte de esta (4,19,22).
El cisticerco es una vesícula de 0.5 a 2 cm de diámetro, posee paredes traslúcidas de forma redondeada o ligeramente oval, se encuentran llenas de líquido y contienen un escólex invaginado con morfología semejante al adulto. Este cisticerco presenta porfirinas de tipo
coproporfirinas y pentacarboxiladas en su mayoría. Además, presentan colinesterasas, proteasas, colesterol, glucógeno, glucoproteínas, calcio y hierro (4,19,22).
4.2.3 Epidemiología
El complejo teniasis/ cisticercosis causado por Taenia solium afecta a los seres humanos a partir del establecimiento del parásito adulto después de ingerir carne de cerdo con cisticercos. La cisticercosis afecta al hombre y al cerdo a través del establecimiento de la fase larval, posterior a la ingestión de huevos de tenia presentes en las heces de humano con teniasis. De esta manera, el complejo teniasis/cisticercosis se ha convertido en un objetivo de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para su eliminación en áreas endémicas de África, América Latina y algunas partes de Asia (1,4). Este complejo se Figura 2. Morfología estadio adulto y cisticerco de Taenia solium. Tomado de: Saredi, D. et al (23).
encuentra ampliamente distribuido en países de ingresos bajos, donde el saneamiento es insuficiente y los cerdos se mantienen en sistemas de producción extensivos. Por lo que, ha sido catalogada como el peligro parasitario transmitido por los alimentos más importante a nivel mundial, ya que dentro de las áreas endémicas es una causa común de epilepsia prevenible y causa un impacto económico significativo en los sectores agrícolas (1,24).
En Europa, EE. UU y Asia (Japón, Singapur, países islámicos o áreas musulmanas, donde no se consume carne de cerdo por razones religiosas) han presentado una reducción en la prevalencia de cisticercosis, debido a mejoras en los sistemas de salud pública y altos estándares de vida. A pesar de esto, el aumento en el turismo y la inmigración masiva de individuos provenientes de las áreas endémicas han llevado a un incremento en la incidencia de la enfermedad en países desarrollados. Manteniendo como zonas endémicas, India, China, Indonesia y Vietnam (25).
Este parásito zoonótico es endémico en la mayor parte de América Latina, central y la cuenca del caribe. Entre los que se destacan, México, Perú y Brasil. También hay algunos estudios de países como Guatemala, Honduras, Bolivia, Ecuador y Colombia (25).
Figura 3. Teniasis / cisticercosis por Taenia solium según la literatura de 1986 hasta abril del 2017 y cisticercosis porcina según los informes de la OIE de 2005 a 2016 en América Central y la cuenca del Caribe. Tomado de: Braae, U. C & colaboradores (27).
En Colombia, los estudios epidemiológicos se iniciaron desde 1.944 con un estudio que durante 20 años recogió información de autopsias de un hospital universitario en Medellín, encontrando una prevalencia de neurocisticercosis de 0,7% (26), desde entonces se han desarrollado estudios en poblaciones específicas sin llegar a conocer como tal la situación seroepidemiológica de la cisticercosis en la población general. Sin embargo, en 2006 un estudio reportó una seroprevalencia para neurocisticercosis de 14,9% para el periodo comprendido entre 1995 y 2005. En este estudio los departamentos con mayor frecuencia de seropositividad fueron Nariño, Huila, Caldas, Bolívar, Antioquia, Santander y Cundinamarca (22).
Entre 2008- 2010 se realizó un estudio que permitió estimar una seroprevalencia para cisticercosis de 8.55%, en donde la seroprevalencia más alta se presentó en el departamento de Vaupés (40,19%) y la menor en el departamento de Caldas (0,53%), además de evaluar la asociación de criterios ambientales, culturales y socioeconómicos como se muestra en la figura 3 (28).
Con relación a los factores ambientales, la eliminación de heces al aire libre y otros factores, conforman un riesgo cinco veces mayor para la infección por cisticercosis. En cuanto a los factores socioeconómicos, pertenecer al género femenino mostró un mayor riesgo para adquirir la infección, así como el no pertenecer a ningún régimen de salud . Entre los factores culturales se estableció mayor riesgo de infección por cisticercosis, no lavar los alimentos antes de su consumo y la ausencia de lavado de manos (28).
Los estudios previamente mencionados demuestran la necesidad de realizar procesos de intervención epidemiológica, que incluya notificación, búsqueda y tratamiento de portadores de Taenia solium en su entorno, capacitación de la población sobre transmisión y síntomas. En el ámbito veterinario, implementación de políticas de inspección de carnes de cerdo y la restricción de la crianza doméstica o de traspatio (28).
4.2.4 Ciclo de vida teniasis/cisticercosis y transmisión
La teniasis ocurre solo en el huésped humano, después de la ingestión de carne de cerdo cruda o poco cocida infectada con cisticercos. Las larvas evaginan en el intestino delgado; la cabeza (escólex) se adhiere a la mucosa por medio de sus ventosas y ganchos.
Aproximadamente 2 meses después de la infección se empiezan a formar las proglótides, al volverse grávidas se desprenden del extremo distal y se excretan en las heces; cada uno de los segmentos contiene entre 50.000 y 300.000 huevos con capacidad infectiva (4,19).
La infección causada por la etapa larvaria del parásito , denominada cisticercosis afecta principalmente el músculo esquelético, tejido subcutáneo y sistema nervioso central en el humano. El humano adquiere cisticercosis por contaminación fecal-oral con huevos de portadores infectados con T. solium, como consecuencia de mala higiene de las manos, ingestión de alimentos contaminados con heces que contienen huevos o proglótides. De igual modo, los vegetarianos y otras personas que no comen cerdo pueden adquirir Figura 4. Factores de riesgo relacionados con la presencia de cisticercosis. Tomado de:
Flórez, A. & colaboradores (28).
cisticercosis por medio del agua, viento, las moscas y otros medios indirectos de infección.
(2,4,19).
La enfermedad causada por este parásito en el sistema nervioso central se conoce como neurocisticercosis (NCC). En la NCC, se encuentran cisticercos de tipo celuloso y racemoso el cerebro humano. El tipo celuloso es pequeño, esférico y ovalado blanco o amarillento. Estos cisticercos se encuentran separados del tejido del huésped por una cápsula fina de colágeno y se encuentran en los espacios subaracnoideos o se encapsulan dentro del tejido cerebral. Mientras que, el cisticerco racemoso es una vesícula grande que se caracteriza por la ausencia del escólex y se localizan en áreas con más espacio de transformarse en racemosos (19,22).
Teniendo en cuenta que la progresión de la teniasis a cisticercosis/neurocisticercosis se considera como una de las enfermedades parasitarias con mayor carga de enfermedad y Figura 5. Ciclo de vida teniasis/cisticercosis causado por Taenia solium.
Tomado de: CDC. Centro para el control y prevención de enfermedades. (4)
que generan más pérdida de años de vida ajustados por discapacidad, la OMS tiene como objetivo y prioridad para el plan de acción 2016-2022 eliminar el complejo teniasis/cisticercosis en diferentes países (6), apuntando a realizar diagnóstico para la identificación de estadios tempranos del parásito, ya que un buen diagnóstico de la etapa adulta de Taenia solium (fase intestinal) por ejemplo, podría disminuir significativamente la incidencia de la cisticercosis en población humana y porcina (7), brindar tratamiento oportuno, interrumpir el ciclo de vida de Taenia y prevenir los efectos devastadores que conlleva la progresión de esta enfermedad (28).
4.3 ASPECTOS CLÍNICOS Y TRATAMIENTO 4.3.1 Manifestaciones clínicas
4.3.1.1 Teniasis
La teniasis sigue un curso benigno o asintomático; cuando se presentan síntomas, estos pueden ser leves o moderados. Por lo general, el paciente teniasico no recurre al médico, lo que los lleva a mantener la infección durante varios años. La principal manifestación clínica es la eliminación frecuente de proglótides ya sea espontáneamente o al defecar (1,2,3).
4.3.1.2 Cisticercosis
Entre los síntomas más comunes se encuentran: convulsiones, dolor de cabeza, confusión, desconexión con la gente y el ambiente circundante, problemas de equilibrio y acumulación excesiva de líquido en el cerebro (hidrocefalia). Esta enfermedad puede conducir a la muerte (4).
4.3.1.3 Neurocisticercosis
Las manifestaciones clínicas en la neurocisticercosis varían, sin embargo, es común observar crisis convulsivas, cefalea, hipertensión endocraneana, déficit motor o síntomas psiquiátricos. El quiste intraparenquimatoso usualmente tiene un curso benigno, en tanto que la localización extraparenquimatosa (subaracnoidea, ventricular, cisternal) tiene un
pronóstico más serio. Las presentaciones menos frecuentes incluyen encefalitis cisticercósica, cisticercosis cerebral masiva no encefálica, cisticercosis diseminada con pseudohipertrofia muscular y cisticercosis espinal (29).
4.3.2 TRATAMIENTO
Los únicos tratamientos disponibles eran la cirugía para la escisión del quiste, las derivaciones ventriculares o los esteroides para disminuir la inflamación. A partir de 1978 surgieron medicamentos como la niclosamida , que es un fármaco de elección ya que no se absorbe en la luz intestinal.
El praziquantel presenta un pequeño riesgo de que los quistes cerebrales viables asintomáticos se vean afectados, provocando síntomas neurológicos (dolor de cabeza, convulsiones). Ambos medicamentos tienen una comercialización muy limitada y son difíciles de encontrar.
El albendazol es más barato y eficaz. Sin embargo, se puede esperar un empeoramiento transitorio de los síntomas neurológicos durante la terapia antiparasitaria, secundario a una reacción inflamatoria. Por otro lado, la cisticercosis fuera del sistema nervioso es un trastorno benigno y no amerita un tratamiento específico (29,30).
4.4. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Se ha identificado que la manera más viable de controlar la infección por Taenia solium y la eliminación del complejo teniasis/ cisticercosis consiste en la identificación de los teniasicos a través de la detección de formas adultas del parásito. Por lo que, la Organización Mundial de la Salud ha enfocado los esfuerzos a la mejoría de los métodos diagnósticos disponibles actualmente (1,7).
4.4.1 Examen macroscópico y microscópico
4.4.1.1 Examen macroscópico
Este examen macroscópico consiste en la autodetección de los portadores mediante identificación de proglótides expulsadas en muestras fecales, examinación de las ramificaciones uterinas laterales presentes en las proglótides grávidas y la morfología de
los genitales del parásito. Para Taenia solium, las proglótides son más largas que anchas, presentan un útero grande con una rama central a lo largo del anillo con 7 a 13 ramificaciones, mientras que, Taenia saginata presenta entre 15 a 20 ramificaciones laterales, permitiendo de esta forma realizar un diagnóstico diferenciado entre especies (3,7). Sin embargo, este método presenta falencias como, la excreción intermitente de elementos parasitarios, ausencia de eliminación dentro de los primeros tres meses de la infección, desintegración de la parte proximal del gusano como consecuencia del uso de medicamentos cestocidas y la necesidad de experticia por parte del observador (7,31).
4.4.1.2 Examen microscópico
Los exámenes microscópicos se basan en el estudio de la morfología de los huevos. Por lo que, existen diferentes métodos como: examen directo en las heces (visualización con solución salina o Lugol), frotis fecal cuantitativo en capa gruesa sobre celofán ,conocido como método de Kato-Katz y métodos de concentración que mejoran las posibilidades de encontrar huevos en la materia fecal. Estos métodos de diagnóstico por microscopia se consideran de rutina para el diagnóstico de teniasis por su simplicidad y bajo costo (7,31).
Figura 6. Diagnóstico diferencial de las especies del género Taenia spp.
Tomado de: Orta, Nieves & colaboradores (31)
A pesar de esto, poseen sensibilidad que varía entre 3.9% y 52.5% (8, 33), debido a las características biológicas de la liberación de huevos de T. solium en las heces y la similitud morfológica de los huevos entre especies. Por lo que, se podría estimar entre el 47.4% y el 96.1% corresponden a falsos negativos.
4.4.2 Diagnóstico serológico
Los métodos inmunológicos se han propuesto para el diagnóstico de teniasis y cisticercosis, estos se basan en la detección de anticuerpos estimulados por los estadios del parásito y algunos otros en la detección de antígenos del parásito.
Se ha encontrado que en la teniasis los individuos poseen títulos altos de anticuerpos de tipo IgA e IgE no especificas (7). Las pruebas como la electroinmunotransferencia (EITB) y Western Blot son las pruebas más utilizadas dentro de las pruebas disponibles para inmunodiagnóstico de neurocisticercosis, dado que poseen una sensibilidad del 98% y una especificidad del 100%. A pesar de ello, solo detectan la presencia de anticuerpos contra el antígeno larvario y no necesariamente indica la presencia de enfermedad activa (9).
Sumado a esto, en la práctica clínica algunas de las pruebas inmunológicas no se encuentran disponibles comercialmente o sus costos son elevados como en el caso del western blot, además pueden presentarse reacciones cruzadas con otros parásitos. Después del tratamiento los anticuerpos pueden permanecer, por lo que, se pueden producir falsos positivos y variaciones en los lotes de producción del antígeno total que pueden llevar a modificaciones en el desempeño de la prueba, limitación que se supera usando antígenos recombinantes específicos (7,9).
4.4.3 Detección de coproantígenos
La detección de coproantígenos consiste en la identificación de antígenos específicos del parasito en las heces de los portadores, estas pruebas se han venido desarrollando en placas
en las que se encuentran anticuerpos parasitarios que tienen la capacidad de capturar antígenos presentes en materia fecal (7).
Esta técnica, permite detectar una infección en curso y se ha reportado que su desempeño diagnostico puede variar dependiendo de su realización en microplaca o dipstick y la calidad del suero de conejo usado en su producción. Estas pruebas diagnósticas presentan mayor utilidad en la detección por infección de T. solium, ya que para T. saginata el diagnostico por métodos microscópicos tiene mayor efectividad.
La prueba de coproantígeno, detecta alrededor de 2,5 veces más casos de teniasis que la microscopía (33,34). Los antígenos somáticos se liberan incluso en las etapas inmaduras de tenia y pueden detectarse desde la primera semana después de la infección (7,31). Hasta el día de hoy, los ensayos desarrollados a partir de proteínas de excreción y secreción en pruebas coproantigénicas han presentado un 95% de sensibilidad y 100% de especificidad.
(14,31). Agregado a esto, se ha establecido que el ensayo coproantigénico de ELISA es útil en la detección y determinación del éxito o fracaso del tratamiento en los portadores de tenia (35).
Sin embargo, estas pruebas presentan dificultades en el diagnóstico especie-específico, por los antígenos utilizados en estas. Razón por la cual, se ha planteado el uso de proteómica para la búsqueda de nuevos antígenos especie específicos que puedan ser reconocidos por portadores de tenia y que puedan ser estadio-específicos. Sin embargo, se presentan otros retos como lo son la permanencia de anticuerpos después del tratamiento y la necesidad de pruebas rápidas (14).
4.4.4 Pruebas moleculares
Recientemente, se han implementado protocolos de pruebas de PCR que son rápidos, sensibles y específicos que nos permite la diferenciación entre especies mediante PCR multiplex y PCR-RFLP. Estos métodos también se han utilizado para estudios filogenéticos además de ser un gran avance en el diagnóstico especie-específico de teniasis.
Sumado a esto, la aplicación de pruebas moleculares sería útil en la vigilancia, control y estudio epidemiológico de las infecciones por estos cestodos (36). Sin embargo, para su realización se necesita la presencia de huevos y/o proglótides, requieren de instrumentos robustos para su realización y son costosas, por lo que, se dificulta su uso diagnóstico en zonas endémicas (18,31).
Por esta razón, se han venido desarrollando métodos de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que es una herramienta de amplificación de ADN que podría ser utilizada en campo y usarse en diagnostico diferencial entre especies. A pesar de esto, estas pruebas requieren de validación en campo y es posible encontrar inhibidores en las heces (37).
4.4.5 Pruebas imagenológicas en neurocisticercosis
El diagnóstico para neurocisticercosis se realiza mediante neuroimagen como la tomografía computarizada con contraste (CECT) para la detección de calcificaciones parenquimatosas o resonancia magnética, para lesiones parenquimatosas, quistes intraventriculares. Las técnicas imagenológicas son de alto costo, difícil acceso para las personas que padecen de esta enfermedad en regiones endémicas y pueden causar efectos adversos por el uso de estos agentes y medios de contraste. Sumado a lo anterior, se pueden presentar dificultades diagnósticas a la hora de diferenciar neurocisticercosis de otras lesiones, quistes parasitarios u otras patologías (9).
4.5 ANTÍGENOS CARACTERIZADOS
4.5.1 Antígenos caracterizados para Taenia solium.
4.5.1.1 Paramiosina
Entre las proteínas mejor caracterizadas del cisticerco de T. solium se encuentra el antígeno B asociado al músculo tegumento del cisticerco. Este antígeno hace referencia a una proteína de 100 kDa similar a las fibronectinas, denominada paramiosina (TPmy). Posee
una estructura alfa-hélice superenrollada, se encuentra en pacientes con neurocisticercosis y tiene la propiedad de unirse al C1q e inhibir la cascada del complemento (14).
Adicionalmente, juega un papel modulador de la respuesta inflamatoria, por lo que, se ha postulado su posible uso en el desarrollo de una vacuna contra de la cisticercosis(38).
Se ha descrito, además, que el método de purificación es complejo, laborioso y se obtiene poca cantidad de proteína (38). Es útil en el diagnóstico de neurocisticercosis, ya que es posible predecir la presencia de parásitos viables en el cerebro, niveles de antígenos y localización de las lesiones. Sin embargo, estas proteínas son útiles cuando los cisticercos están viables en el cerebro. Por lo que, no se podría usar de rutina en diagnóstico dado que únicamente detectan estadios avanzados de la enfermedad (39).
4.5.1.2 Cisteinoproteasas catepsina L
Estas se encuentran entre las proteínas de secreción importantes en el ciclo de vida y patogenicidad descritas para helmintos. Se destacan la L, F, C y B que se expresan en forma de zimógenos. En el desarrollo de vacunas e inmunodiagnóstico de neurocisticercosis se ha resaltado el papel de la catepsina L, ya que esta proteína en ensayos de western blot, ELISA y dot-ELISA arrojó resultados de desempeño diagnóstico óptimos en pacientes que presentaban múltiples quistes. Sin embargo, es una endopeptidasa secretada por diferentes parásitos, razón por la cual esta proteína presenta reacciones cruzadas con Echinococcus granulosus, (40).
4.5.1.3 Glicoproteínas
Existen 7 glicoproteínas (GP13, GP14, GP18, GP21, GP24, GP39-42, GP50), dado que se conocen que tres de estas glicoproteínas se expresan durante la embriogénesis y se consideran específicas para el diagnóstico de neurocisticercosis, la Organización Panamericana de Salud (OPS) las reconoció como método de elección en el inmunodiagnóstico de la neurocisticercosis, por lo que se han venido usando en ensayos como EITB o western blot. De acuerdo con la literatura, estas tres glicoproteínas también están presentes en diferentes estructuras a lo largo del desarrollo de T. solium (39, 41).
Adicionalmente, se ha reportado que las personas con teniasis tienen anticuerpos de reacción cruzada contra las glicoproteínas de diagnóstico de neurocisticercosis y viceversa.
Se ha encontrado que su sensibilidad al igual que con las catepsinas depende del número de cisticercos en el cerebro del paciente, la obtención de estas proteínas requiere de experticia, laboratorios especializados, presentan altos costos y son de acceso limitado en áreas endémicas (39).
4.5.1.4 Antígenos de excreción/secreción
Con la finalidad de comprender mejor la interacción entre T. solium y su huésped, se han estudiado las proteínas liberadas por el parásito y se ha encontrado actúan como factores de virulencia, reguladores inmunes en el control del reconocimiento inmunológico, promueven la supervivencia del parásito dentro y fuera del huésped y representan una fuente importante de proteínas inmunogénicas debido a la accesibilidad que tienen para ser reconocidas por el sistema inmunológico en el hospedador (51). De este modo, se ha hecho uso de extractos crudos de proteínas excretoras/secretoras obtenidas a partir de oncosferas provenientes de cerdos infectos de T. solium para el avance en inmunodiagnóstico, ya que presentan potencial como biomarcadores en la detección del parásito y / o el estado de la infección. Por lo que, se hace importante caracterizar mejor estas proteínas (42,43,44).
Aunque se han realizado múltiples estudios sobre antígenos específicos de excreción/
secreción para el diagnóstico de la enfermedad, la purificación de éstos requiere gran cantidad de material parasitario, además de equipos sofisticados y técnicas laboriosas. Por lo que, se ha planteado el uso de proteómica y tecnologías e ADN recombinante (14).
4.5.1.5 Proteínas mitocondriales
Los genomas mitocondriales se han utilizado a menudo en estudios filogenéticos y como marcadores moleculares para estudiar las relaciones evolutivas entre taxones (45).
4.5.2 Antígenos recombinantes y péptidos sintéticos
4.5.2.1 Antígenos recombinantes
La tecnología del ADN recombinante para la clonación de a partir de genes de T. solium han permitido estudiar el valor diagnóstico de proteínas clave principalmente de excreción/secreción y comprender hacia cual región de la proteína se dirige la respuesta inmune del hospedador. Entre las proteínas obtenidas a través de esta metodología, se encuentran TSOL14 y TSOL18 glicoproteínas que son reconocidas por sueros de pacientes con cisticercosis (14).
Entre otras encontradas están Ag1, Ag1V1, Ag2 y Ag2V1, estas 4 moléculas de bajo peso molecular, al implementarlas en un ensayo de ELISA mostraron una sensibilidad de 89,7%
y especificidad del 100%. Se ha clonado también la proteína F18 y una enolasa, útiles para el diagnóstico de cisticercosis/ neurocisticercosis respectivamente. A pesar de las características operativas que mostraron las pruebas, es necesario de más estudios para la producción de proteínas especie- específicas para el diagnóstico de teniasis (14,46).
En estudios realizados recientemente, se ha hecho uso de la proteómica para la búsqueda de nuevas proteínas como TSES33 y TSES38 que permiten identificar teniasicos mediante métodos serológicos y son estadio- específicos (48). Sin embargo, no son especie- especifico y presentan como desventaja que después del tratamiento los anticuerpos permanecen, produciendo falsos positivos. Por lo que, se requieren más estudios (14).
4.5.2.2 Péptidos sintéticos
Los péptidos sintéticos derivados de antígenos son un método que evita el proceso de purificación de antígenos y aseguran la reproducibilidad de los ensayos. Se han evaluado péptidos como los derivados de oncosferas para T. saginata (GK1, GK2, GK3, TS14, TS18var1, TSRS1, y TSRS2var1, entre otros) presentando un buen desempeño diagnóstico. Adicionalmente, en el desarrollo de vacuna sintética se han construido péptidos como Ketc-1 Ketc-12 y Gk-1, (47). Sin embargo, se sugiere que para el
funcionamiento óptimo de estos péptidos en el inmunodiagnóstico es necesario usar varios de los péptidos ya descritos en una misma prueba, así mismo, estudios que permitan considerar su implementación en pruebas diagnósticas y vacunas sintéticas (14).
4.6 BIOLOGIA COMPUTACIONAL Y DATOS POSTGENÓMICOS
Como consecuencia de los problemas diagnósticos y la ausencia de proteínas especificas caracterizadas para Taenia solium, se le ha apostado al uso de herramientas bioinformáticas y biología computacional para la búsqueda de nuevos biomarcadores para el diagnóstico, dónde, por ejemplo, el proyecto genoma para T. solium (49), pretende entender mejor la relación parásito- hospedero mediante datos postgenómicos, que incluyan genómica funcional, metabolómica, interactómica, proteómica y transcriptómica (50).
Las interacciones entre el hospedero y el patógeno reflejan el equilibrio de los mecanismos de defensa y la virulencia. Sin embargo, los mecanismos que el patógeno emplea para superar la reacción inmunitaria del hospedero y alterar otros procesos celulares se comprende en escasa medida. Con los avances de la tecnología proteómica, es posible caracterizar la interacción patógeno-hospedero en función de las alteraciones de la expresión proteica. De esta manera, la proteómica es una herramienta fundamental en salud pública, ya que permite el estudio de proteínas en su totalidad que sean determinantes en una enfermedad (17).
En el estudio de T. solium desde la proteómica, se pretende avanzar en investigaciones que permitan comprender el patrón de proteínas que expresa el parásito en sus diferentes etapas del ciclo de vida, identificar nuevos blancos para el diagnóstico y así mismo, tener la posibilidad de priorizar desde metodologías computacionales nuevos blancos para el diagnóstico, evitando las dificultades y costos que representan las metodologías experimentales (17). De modo que, para T.
solium lo estudios de proteómica se han enfocado en las proteínas excretoras/ secretoras, teniendo en cuenta que pueden circular en el espacio extracelular del organismo, se consideran atractivas como insumo en la generación de nuevas estrategias de diagnóstico (51).
A pesar de ser más fácilmente reconocidas por el sistema inmune del huésped, existe escasa información de las características inmunogénicas de las proteínas excretoras/secretoras del parásito, por lo que, se han venido desarrollando análisis bioinformáticos y la implementación
servidores disponibles que permitan determinar la capacidad de las proteínas de activar el sistema inmunitario e inducir una respuesta inmune (51). Además, la determinación de estas señales intrínsecas, conocidas como péptido señal que nos permiten detectar proteínas de la vía de excreción/secreción en proteínas eucariotas y procariotas, se ha convertido en foco de investigación que facilitaría, la predicción in silico de la ubicación subcelular de las proteínas a partir de secuencias de aminoácidos, permitiendo la detección de este tipo de proteínas con mayor facilidad y rentabilidad que las metodologías experimentales (52,53).
5. ANTECEDENTES
Similares a este trabajo se han realizado estudios como el de Liu, W. & Chen, Y.H, en dónde se establece que la alta densidad de epitopes en una sola molécula de proteína mejora significativamente su antigenicidad e inmunogenicidad (56).
Con base en lo anterior, en el estudio de Gómez S y colaboradores, se midió la densidad a través del número de regiones antigénicas por longitud de secuencia denominado AAR (Abundancia de regiones antigénicas), al realizar la evaluación del potencial antigénico del secretoma de T. solium, el valor AAR para secretoma mostró un valor similar al obtenido para un conjunto de proteínas antigénicas determinadas experimentalmente y fue diferente al valor calculado para las proteínas no excretoras/secretoras (ES) del genoma de T. solium. Además, los conjuntos de datos de proteínas ES tenían dos veces más regiones antigénicas en comparación con las proteínas no ES del genoma de T. solium. Por tanto, la densidad de epítopos en las proteínas ES fue más alta que en las proteínas no ES (51).
Finalmente, calcularon los valores de AAR para secretomas de helmintos conocidos y fueron similares a los obtenidos para T. solium. Los resultados revelan la utilidad del valor AAR como una nueva medida genómica para evaluar la potencial antigénico. Este análisis exhaustivo proporciona información para la identificación de nuevas proteínas de interés terapéutico, diagnóstico e inmunológico. Siendo el primer ejemplo de una herramienta que permite estimar el potencial inmunogénico a nivel genómico de una proteína a través de la implementación de regiones antigénicas y longitud de secuencia, demostrando que ésta es una métrica manejable que refleja la densidad de epítopos de una proteína (51). Cabe resaltar que Gómez y colaboradores utilizaron el servidor BepiPred-1.0, mientras que en este trabajo de grado se utilizó Bepi-Pred-2.0 el cual tiene la ventaja de predecir la accesibilidad de la superficie del antígeno y la estructura secundaria. Lo anterior con el fin de encontrar el número de regiones antigénicas con epitopes continuos y discontinuos en las secuencias de las proteínas (58).
De acuerdo con un estudio realizado por Cornejo- Granados El AAR ha sido rápidamente aceptado por otros grupos de investigación para identificar proteínas antigénicas (57). Así mismo, entender la interacción huésped-patógeno en la evaluación de la antigenicidad de proteínas en enfermedades tropicales desatendidas y correlacionar la densidad antigénica con las propiedades inmunogénicas
de las proteínas. El AAR también se aplica para demostrar que el secretoma es significativamente mucho más antigénico que el proteoma completo de organismos tales como Taenia crassiceps (3), Echinococcus multilocularis (56).
Este estudio y los descritos previamente, se correlacionan con las estrategias en el fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica, diagnóstico y prevención propuestas en el plan de la OMS para la eliminación de las enfermedades infecciosas desatendidas y las medidas posteriores a la eliminación 2016-2022, a través de medidas integradas para la eliminación y control de manera oportuna y costo-eficiente. (6). Por lo que, desde el Instituto Nacional de Salud se plantea el proyecto Biosíntesis de antígenos recombinantes de Taenia solium, este consiste en sintetizar antígenos recombinantes de T. solium en un sistema eucariótico que sea utilizable en tecnologías inmunodiagnósticas. En este, se seleccionarán antígenos de T. solium utilizando herramientas de bioinformática que lleven al desarrollo de una tecnología que llegue a cualquier punto de atención, área geográfica del país y se realice en heces (54). Dado lo anterior, a partir de este proyecto se origina este trabajo de grado con el que a partir de la evaluación in silico del potencial inmunogénico de las proteínas excretoras/secretoras de T. solium se espera contribuir en la selección de antígenos.
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo general
Evaluar el potencial inmunogénico in silico de las proteínas del estadio huevo y adulto de Taenia solium
6.2 Objetivos específicos
● Seleccionar las proteínas de Taenia solium con potencial inmunogénico a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas in silico
● Seleccionar las proteínas de los estadios huevo y adulto de Taenia solium que presentaron potencial inmunogénico a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas in silico.
● Predecir in silico la presencia de péptidos señal en las proteínas de mayor potencial inmunogénico seleccionadas.
7. METODOLOGÍA 7.1 Tipo de estudio
Se realizó un estudio descriptivo
7.2 Obtención secuencias y base de datos Excel
7.2.1. Búsqueda y descarga secuencias de proteínas Taenia solium
La búsqueda y descarga de las secuencias de proteínas reportadas para Taenia solium se realizó ingresando a la página principal del National Center for Biotechnology Information (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Se buscó “Taenia solium” y se cambió la opción predeterminada “All Databases” en el menú desplegable a “Proteins”. Hasta el 06 de febrero del 2020, se encontraron reportadas 586 secuencias de proteínas, estas se obtuvieron en formato FASTA y se importaron en el programa Geneious prime, se guardaron las secuencias por separado, para finalmente exportarlo a un documento de Excel en formato .XML, generando de este modo la base de datos.
7.2.2 Base de datos
Una vez se generó la base de datos con las secuencias, se agregaron las columnas para registrar el número de regiones antigénicas, regiones antigénicas continuas, índices calculados para cada secuencia y finalmente columnas donde se anote la secuencia de las regiones antigénicas continúas encontradas, seguida de cantidad de aminoácidos que tiene esa secuencia y su estructura.
7.3 Objetivo específico 1: Seleccionar las proteínas de Taenia solium con potencial inmunogénico a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas in silico.
7.3.1 Identificación y predicción de regiones antigénicas
El análisis se llevó a cabo a través de la herramienta BepiPred-2.0 disponible en:
http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/. Este es un servidor web para la predicción de epítopos de células B a partir de una secuencia de aminoácidos. Se utilizarán las opciones
avanzadas de la herramienta Bepi-Pred-2.0 que predice la accesibilidad de la superficie del antígeno y la estructura secundaria.
Lo anterior con el fin de encontrar, el número de regiones antigénicas. Una región antigénica se define como una fracción de la secuencia con 6 o más aminoácidos marcados con epitopes y regiones antigénicas continuas, hace referencia a una fracción de la secuencia que cumple la misma condición ya mencionada y sumado a eso, su superficie debe estar expuesta en al menos 6 de los aminoácidos. De esta manera, se realizó la recopilación de la información en una base de datos construida en Excel y el cálculo de IAAR (Índice de abundancia de regiones antigénicas), IAARc (Índice de abundancia de regiones antigénicas continuas). Como resultado, se obtuvo el potencial inmunogénico in silico de cada secuencia de proteína de T. solium.
7.3.2 Depuración base de datos
Se excluyeron las proteínas que no presentaron regiones antigénicas en la predicción in silico y se realizó un análisis descriptivo de los valores de IAAR e IAARc de las proteínas de Taenia solium para determinar los valores promedios, los rangos intercuartílicos y la variación de los índices de abundancia de regiones antigénicas totales y continuas.
Adicionalmente, se depuraron las proteínas mitocondriales, parciales, hipotéticas y putativas, ya que falta evidencia experimental o información completa sobre la proteína.
Figura 7. Fórmula cálculo de índice de abundancia de regiones antigénicas y regiones antigénicas continuas. Tomado de: Gomez et al. (51)
7.4 Objetivo específico 2: Seleccionar las proteínas de los estadios huevo y adulto de Taenia solium que presentaron potencial inmunogénico a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas in silico.
7.4.1 Clasificación por estadios de las proteínas de Taenia solium
A partir de las 190 secuencias de proteínas que se obtuvieron luego de haber depurado la base de datos, se hizo revisión de la literatura para determinar en qué estadio o estadios se encontraba expresada cada una de las proteínas. Se dividieron en adulto, oncosfera o cisticerco y las que se expresaban en todos los estadios. De este conjunto, se escogieron aquellas con información reportada en el GeneBank derivadas de los estadios huevo o adulto según la metadata de las secuencias.
Figura 8. Proteínas de Taenia solium depuradas de la base de datos. Elaboración propia
7.5 Objetivo específico 3: Predecir in silico la presencia de péptidos señal en las proteínas de mayor potencial inmunogénico seleccionadas.
7.5.1 Predicción péptido señal
Las 190 secuencias de proteínas, fueron analizadas a través de una predicción in silico con el servidor SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), este servidor predice la presencia de péptidos señal en una secuencia de proteínas a través de : la discriminación de entre proteínas con péptidos señal, las no-secretoras y la predicción del sitio de clivaje del péptido señal en proteínas de Archaea, bacterias Gram-positivas, bacterias Gram- negativas y Eukarya a través de Signal Peptidasa I y Signal Peptidasa II (52).
Se recopilo la información sobre la probabilidad de la presencia de Signal Peptidasa I o II y la probabilidad de que realmente se encontrara el sitio de clivaje en la base de datos generada en Excel.
7.5.2 Depuración base de datos
Se depuraron las secuencias que en la probabilidad de sitio de clivaje o de Signal Peptidasa I o II se encontraba por debajo del treshold predeterminado por el servidor (<0,5) y se filtró la información para obtener aquellas secuencias con probabilidades (> 0,5).
8. RESULTADOS
8.1 Evaluación potencial inmunogénico
Para evaluar el potencial inmunogénico de las 586 secuencias reportadas en el NCBI para T.
solium, se realizó el análisis a través del predictor de epítopos de células B. Después de recopilar la información obtenida con el servidor y analizar los resultados obtenidos, las proteínas se agruparon de acuerdo con el número de regiones antigénicas incluyendo las que no presentaron regiones antigénicas (RAc= 0) en su secuencia. Así, en la figura 9 se muestra que 172 proteínas equivalentes al 29,35% del conjunto de datos analizados no presentaron regiones antigénicas, ni regiones antigénicas continuas. De forma interesante, 163 proteínas de las 172 se encontraban de forma parcial, es decir que, la información de estas se encontraba incompleta y pertenecían al grupo de proteínas mitocondriales, utilizadas y caracterizadas principalmente en estudios de filogenia (45).
A. Clasificación de proteínas por número de regiones antigénicas. B. Clasificación de proteínas por número de regiones antigénicas continuas.
A
B
Figura 9. Distribución de las regiones antigénicas/ regiones antigénicas continúas predichas con el servidor BepiPred- 2.0.
Una vez evaluada in silico la abundancia de las regiones antigénicas se procedió a depurar la base de datos como se muestra en el pipeline bioinformático en la Figura 10. Además de las 172 proteínas sin regiones antigénicas continuas, se descartaron 116 proteínas mitocondriales, 79 proteínas parciales, 12 putativas, 14 proteínas hipotéticas y 3 sin nombre o desconocidas. En total 396 proteínas fueron excluidas.
Se continuó el análisis con 190 proteínas equivalentes al 32.42% del conjunto de datos se clasificaron de acuerdo con los Índices de abundancia de regiones antigénicas (IAAR) e índices de abundancia de regiones antigénicas continuas (IAARc) con respecto al número de proteínas como se muestra en la figura 11 A y B. En la figura 11A Se encontró que la distribución de los rangos intercuartílicos de los IAAR e IAARc se encontraron entre 36,75 y 102,83 (figura 11A,) lo cuales son similares a los reportados por Gómez et al en el que se encontraron a través de tres métodos de predicción valores de IAAR entre 42.1 y 126.5 para el conjunto de proteínas no excretoras/secretoras, además de resultados cercanos a los reportados para otros helmintos(51) . Figura 10. Pipeline bioinformático. Análisis de secuencias reportadas en el NCBI para Taenia solium. Elaboración propia
Con base en la distribución de los IAAR e IAARc y considerando la cercanía con lo reportados por otros autores, se estableció punto de corte de 81,3 en el IAARc para seleccionar las proteínas con mayor potencial inmunogénico (figura 11B,). Este punto de corte es congruente con el trabajo de Gómez et al, en el que los autores encontraron que las proteínas con mayor densidad de epitopes superaban este punto de corte usando la predicción de epitopes mediante el servidor BepiPred en su versión 1.0. Es importante resaltar que el presente trabajo se utilizó la versión 2.0 del servidor que permitió complementar la predicción de epitopes con un análisis de conformación de las proteínas para identificar los epitopes expuestos para calcular el IAARc (51).
Por lo que posteriormente, se clasificaron las proteínas teniendo en cuenta IAAR e IAARc mayores y menores que 81.3, valor promedio demostrado por Gómez et al a través del método de predicción de BepiPred para las proteínas determinadas experimentalmente como excretoras/secretoras (51), encontrando que del conjunto de 190 proteínas el 52.02% presentaron mayor densidad de epitopes representado por valores de IAARc menores y a su vez, estos fueron similares a los identificados para proteínas de diagnóstico.
A
B
Figura 11. Clasificación de 190 proteínas de Taenia solium a través de los índices de abundancia de regiones antigénicas.
A. Distribución por rangos intercuartílicos de las proteínas de acuerdo con IAAR e IAARc. B.
Clasificación proteínas de T. solium por valores de IAAR e IAARc menores o mayores a 81,3.
8.2. Clasificación de las proteínas por estadio parasitario
Teniendo en cuenta el interés a futuro del uso de estas proteínas en la identificación de pacientes teniasicos, se buscó entre las 190 proteínas que presentaron la mayor abundancia de regiones antigénicas aquellas asociadas con el estadio huevo o adulto, se identificaron 9 proteínas asociadas a estadio adulto mientras que 102 proteínas hacían parte del estadio cisticerco y 22 no se les pudo identificar el estadio parasitario.
8.3 Predicción del péptido señal
Considerando el bajo número de proteínas del estadio adulto se continuó la selección de proteínas con base en el análisis de la presencia de péptido señal utilizando el servidor SignalP- 5.0 para la predicción in silico del péptido señal I y II junto con el sitio de clivaje, a partir de las 190 proteínas.
Se encontraron 88 secuencias de proteínas para las cuales existían según el análisis una probabilidad mayor a 0.5 de la presencia del péptido señal y sitio de clivaje cómo se muestra en la
Figura 12. Estadio parasitario de las proteínas de Taenia solium.
