EVALUACIÓN DEL POTENCIAL ANTI-ROTAVIRUS EJERCIDO POR PROTEÍNAS DEL SECRETOMA DE Enterococcus faecium
Paula Andrea Chacua Mojica
Director
Juan Carlos Ulloa Rubiano, M.Sc, PhD.
Pontificia Universidad Javeriana Bogotá-Colombia
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTA D.C 2015
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-ROTAVIRUS EJERCIDA POR PROTEÍNAS DEL SECRETOMA DE Enterococcus faecium
Paula Andrea Chacua Mojica
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946.
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”
Resumen
Rotavirus es la principal causa de gastroenteritis viral en el mundo, particularmente en los países en vía de desarrollo. Aunque se han desarrollado dos vacunas para su control, no hay ningún tratamiento específico para éste. En los últimos años se han estudiado los efectos de los probióticos sobre las enfermedades gastrointestinales y se ha comprobado que pueden contribuir en la reducción de infecciones tanto bacterianas como virales.
Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó un estudio exploratorio en el que se buscaba evaluar la actividad anti-rotavirus de las proteínas obtenidas del secretoma de Enterococcus faecium. Para llevarlo a cabo, se realizó la producción y separación de las proteínas de bajo peso molecular producidas por dicha bacteria mediante el método de concentración por ultrafiltración usando los tubos Amicon. Se concentraron por precipitación con polietilenglicol y se determinaron los pesos moleculares por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes, los cuales oscilaron entre los 26 y 37kDa.
Posteriormente, se realizaron ensayos de citotoxicidad en células Ma104 con concentraciones entre 250μg/ml y 0,06 μg/ml mediante la técnica de MTT (Sigma) y se determinaron las concentraciones atóxicas para la evaluación del potencial antiviral de dichas proteínas contra la cepa de rotavirus RRV. Como no se presentó un efecto significativo en la viabilidad de las células modelo, se evaluó el potencial antiviral desde 250μg/ml.
A partir de los resultados se pudo concluir que las proteínas de bajo peso molecular del secretoma de Enterococcus faecium pueden ejercer un potencial efecto anti rotavirus mediante el mecanismo de bloqueo.
Introducción
El tracto gastrointestinal es el órgano linfoide más grande del cuerpo humano, por lo tanto sirve como un indicador de infecciones bacterianas, víricas y/o protozoarias. La mayoría de infecciones microbianas se originan a partir del consumo de alimentos o fuentes hídricas contaminadas, lo que da lugar a enfermedades agudas, como es el caso de la diarrea. En casos más graves, se pueden presentar enfermedades crónicas que pueden llegar a ser una amenaza para la vida de los afectados. La Organización Mundial de la Salud estimó que las enfermedades entéricas causan entre el 15 y el 34% de las muertes, siendo las principales víctimas los niños en etapa preescolar, los adultos mayores y los pacientes inmunocomprometidos (Georgiev, 2009; Desselberger & Gray, 2013; Rheingans, et al.
2014; Dennehy, 2015).
Uno de los patógenos entéricos más prevalentes a nivel mundial es el Rotavirus, un virus no envuelto que es causante de alrededor del 5% de las muertes a nivel mundial. Esta infección se caracteriza por causar fiebre, vómito y diarrea, ocasionando la deshidratación del hospedero. Actualmente, hay dos vacunas para el control de esta enfermedad (Oliveira, et al. 2015) y el tratamiento en pacientes afectados se limita a rehidratación oral. Sin embargo, se han buscado diferentes alternativas a estos tratamientos tradicionales y los
probióticos han mostrado un potencial antiviral tanto in vitro como in vivo (Wang, et al.
2013).
Los probióticos son microorganismos que, al ser consumidos en concentraciones adecuadas, ejercen un efecto benéfico en la salud del hospedero. Los probióticos más comúnmente encontrados son las bacterias ácido lácticas como Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, entre otras. Estas bacterias han demostrado tener propiedades antivirales contra diferentes virus (Todorov, et al. 2005; Maragkoudakis, et al. 2010; Mi An, et al. 2012; Lee, et al. 2013; Vera Pingitore, et al. 2012; Serkedjieva, et al. 2000).
Enterococcus faecium es una bacteria ácido láctica potencialmente probiótica que tiene la capacidad de producir sustancias antimicrobianas llamadas enterocinas, caracterizadas por tener un bajo peso molecular. Estas enterocinas han demostrado tener una actividad antiviral contra los virus de Influenza, Herpes y Coronavirus (Wang, et al. 2013; Wachsman, et al. 1999; Wachsman, et al. 2003; Todorov, et al. 2010; Chai, et al . 2013). Sin embargo, aún no ha sido reportado una actividad antiviral contra rotavirus por parte de las proteínas de bajo peso molecular de esta bacteria.
Teniendo en cuenta lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la actividad anti- rotavirus de las proteínas obtenidas del secretoma de Enterococcus faecium en la línea celular Ma104 específica para rotavirus mediante la estrategia de bloqueo.
Justificación y planteamiento del problema
La infección con Rotavirus es la principal causa de gastroenteritis en niños menores de 5 años, tanto en países desarrollados como en países en vía de desarrollo. Según datos de estudios retrospectivos, del 3 al 18% de los casos de diarreas en adultos son causados por Rotavirus y este virus es responsable por la muerte de aproximadamente, 500.000 niños menores de 5 años por año (Anderson, et al. 2014; Yang, et al. 2010). En un estudio realizado por la Organización Mundial de la Salud en el año 2012, se pudo evidenciar que se presentaron 453.000 muertes al año asociadas a infección con Rotavirus, siendo India, Nigeria y Pakistán unos de los países más afectados. En Colombia, las cifras no son muy alentadoras. Según el Boletín Epidemiológico Semanal número 13 del año 2015 publicado por el Instituto Nacional de Salud, la mayor incidencia de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) se observó en niños menores de 1 año, con 48.1 casos por cada 1000 habitantes, seguidos por los niños entre 1 y 4 años. Por otro lado, también se estableció que durante las primeras 13 semanas del año se presentaron 38 decesos de menores de 5 años causados por dicha enfermedad (INS, 2015).
Para reducir estas cifras, en el año 2006 fueron licenciadas dos vacunas vivas atenuadas:
RotaTeq® (Merck and Co.), una vacuna bovina-humana oral pentavalente administrada en tres dosis; y Rotarix® (GSK Biologicals, Rixensart, Belgium), una vacuna humana oral
monovalente administrada en dos dosis (Oliveira, et al. 2015). Estas vacunas han sido consideradas seguras con base en diferentes estudios (Karafillakis, et al. 2015; Oliveira, et al. 2015; Paternina-Caicedo, et al. 2015; Parashar, et al. 2015). En el año 2009, la Organización mundial de la salud recomendó su inclusión en los programas de inmunización en todos los países, especialmente en aquellos con alta prevalencia de muerte por causa de enfermedades diarreicas en niños menores de 5 años (Oliveira, et al.
2015; Karafillakis, et al. 2015). A pesar de que se ha evidenciado una reducción significativa en los casos de EDA, algunos estudios recientes han demostrado que las vacunas pueden incrementar el riesgo de intususcepción en la población en la que se administra la vacuna, lo cual debe ser considerado frente a los beneficios ofrecidos por las vacunas (Weintraub, et al. 2014; Yih, et al. 2014). Por otro lado, como rotavirus tiene un genoma segmentado, si se presentan coinfecciones con diferentes genotipos se pueden generar reordenamientos genéticos, lo cual puede originar nuevas cepas virales (Glass, et al. 2014). Teniendo en cuenta que las vacunas van dirigidas a genotipos específicos de rotavirus, estas no serían efectivas contra las nuevas cepas virales. Otra de las preocupaciones con respecto a las vacunas contra este virus es el hecho que sea viva atenuada pues, al no estar inactivadas, las partículas virales presentes en las vacunas pueden llegar a generar la enfermedad debido a una reversión a una forma virulenta, como ha sido el caso de las vacunas contra el polio. Es por esto que se han desarrollado estudios en África y Asia, donde hay mayor prevalencia, para determinar si las vacunas pueden causar este efecto en la población (Parashar, et al. 2015).
Enterococcus faecium ha sido ampliamente estudiado debido a su capacidad para sobrevivir en ambientes adversos, además de la producción de diferentes sustancias como bacteriocinas y enterocinas que generan un efecto benéfico para el hospedero (Jahan, et al. 2015), al inhibir el desarrollo de diferentes bacterias patógenas como es el caso de Listeria monocytogenes. Este efecto se atribuye a la cercanía filogenética que hay entre ambas especies bacterianas. Sin embargo, las enterocinas producidas por E. faecium presentan un amplio espectro de actividad, debido a su capacidad de afectar especies bacterianas sin proximidad filogenética, como es el caso de algunos patógenos de origen alimentario (Elotmani, et al. 2002).
La producción de bacteriocinas y enterocinas se lleva a cabo principalmente en la fase de crecimiento exponencial de las bacterias que las producen, por lo tanto están asociadas al metabolismo primario de éstas. Según diferentes estudios, estas sustancias pueden afectar a otros microorganismos, principalmente patógenos bacterianos hasta el punto de inhibir su desarrollo. Una de las primeras enterocinas descritas fue la E1146, producida por Enterococcus faecium DPC1146, y se caracteriza por presentar actividad antibiótica contra Listeria monocytogenes, además de tener un peso molecular de aproximadamente 3.0kDa (Parente, et al. 1992; Parente, et al. 1997).Wachsman y colaboradores (2003) describieron la capacidad de la enterocina CRL 35 producida por Enterococcus faecium para inhibir las etapas tardías de la replicación del virus del Herpes tipo I y tipo II, alterando la síntesis de proteínas virales necesarias para etapa de ensamblaje del virión.
En otro estudio realizado por Gupta y colaboradores (2010), se caracterizó y purificó la enterocina FH99, que se presume que tiene un efecto sobre las bacterias Gram positivas patógenas y causantes del daño en los alimentos. Esta enterocina se caracteriza por tener un peso molecular menor a 6.5kDa y por ser estable en un amplio rango de pH y temperatura. Wang y colaboradores (2013) comprobaron que Enterococcus faecium protege de manera efectiva a las células hospederas de la infección del virus porcino de la influenza A cuando el tratamiento se administró a las células en conjunto con el virus, causando la inhibición por competencia de la multiplicación viral. Ese mismo año, Chai y colaboradores (2013) evaluaron los efectos antivirales de una cepa de E. faecium contra Coronavirus, causante de gastroenteritis. Se pudo observar que el tratamiento de competencia, en el que se evalúa el efecto de la bacteria sobre el virus cuando ambos se ponen simultáneamente, presenta una mayor actividad antiviral con respecto a los ensayos de pretratamiento y post-infección.
Teniendo en cuenta que no se han desarrollado estudios recientes en los que se usen únicamente las proteínas del secretoma de Enterococcus faecium como posibles antivirales, este trabajo busca complementar la información que se tiene sobre estas bacterias y la aplicación de sus metabolitos primarios buscando una actividad anti- Rotavirus.
Particularmente, como se evidenció anteriormente, los estudios reportados sobre las proteínas con actividad antimicrobiana describen que las responsables son aquellas que tienen bajo peso molecular, aspecto que será tenido en cuenta en el presente trabajo.
Marco teórico
El tracto gastrointestinal es una de las superficies del ser humano que se encuentra en constante contacto con diferentes agentes exógenos como bacterias, virus y algunas sustancias como los alérgenos, constituyéndose en un órgano muy importante para la defensa primaria del hospedero contra dichos agentes (Collado, et al. 2013). Las bacterias que constituyen la microbiota intestinal de los seres humanos son principalmente lactobacilos y bifidobacterias. Sin embargo, también se pueden encontrar bacteroides, clostridios, enterobacterias y estreptococos (Turroni, et al. 2014).
Los enterococos son bacterias Gram positivas pertenecientes al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL). Se caracterizan por ser esféricas u ovoides, catalasa negativas, anaeróbicas facultativas, no formadoras de esporas que se pueden encontrar tanto en cadenas como individualmente, y tienen la capacidad de producir bacteriocinas. Se encuentran principalmente en el tracto digestivo de los humanos, aunque pueden ser aislados también de muestras ambientales y animales (Fisher, Phillips. 2009; Díaz, et al, 2010). Originalmente los enterococos fueron clasificados como estreptococos debido a las similitudes que comparten ambos géneros. Gracias al estudio del 16S rRNA en los años
80, el género Streptococcus fue dividido en 3 géneros diferentes: Streptococcus, Lactobacillus y Enterococcus (Giraffa, 2002).
Las bacterias pertenecientes a este género tienen la capacidad de sobrevivir en ambientes adversos. Pueden crecer en temperaturas entre 10ºC y 45ºC, siendo su temperatura óptima de crecimiento es 37ºC; además pueden desarrollarse en medios con alto contenido de bilis (40%) e hidrolizan la esculina. Las colonias se caracterizan por ser puntiformes (2-3 mm de diámetro) y de color gris después de dos días de incubación (Díaz, et al. 2010).
En humanos, las especies más representativas son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium, pues se encuentran en el 90% de los aislamientos de muestras clínicas. Esto se debe a que los enterococos son constituyentes normales de la microbiota intestinal humana.
Sin embargo, estas bacterias también son conocidas por su alta resistencia a antibióticos, por lo que se han incrementado los casos de infección intrahospitalaria con estas bacterias.
Una de las especies más prevalentes es Enterococcus faecium, que representa el 35% de las infecciones nosocomiales asociadas a enterococos en Estados Unidos (Qin, et al. 2012).
Es por esto que su clasificación como probiótico no es totalmente aceptada pues, por definición, un probiótico es un microorganismo vivo que, al ser consumido en condiciones adecuadas, confiere un efecto en la salud del hospedero (Butel, 2014).
A pesar de lo anterior, al ser parte de la microbiota intestinal de los seres humanos, Enterococcus faecium tiene la capacidad de proteger al organismo hospedero de diferentes agentes infecciosos. Uno de los mecanismos para lograr este objetivo es la producción de bacteriocinas, sustancias proteicas sintetizados en el ribosoma que cumplen una función bactericida frente a bacterias que están relacionadas filogenéticamente. Estas sustancias son de gran importancia ya que se ha comprobado su actividad antibacteriana contra bacterias patógenas como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Bacillus spp.
(Ahmadova, et al. 2013)
Uno de los patógenos más representativos para el ser humano es el Rotavirus, un virus icosaédrico con 11 segmentos de RNA de doble cadena, no envuelto perteneciente a la familia Reoviridae. Su cápside se caracteriza por presentar tres capas, cada una constituida por proteínas virales (VP) diferentes. La capa interna y la del medio están constituidas por las VP2 y VP6 respectivamente, mientras que la capa externa se compone por las VP7 y VP4. Esta última sobresale del virión, lo que permite que los receptores de membrana reconozcan al virus para que se lleve a cabo la infección (Carter & Saunders, 2007;
Desselberger & Gray, 2013).
El genoma viral de Rotavirus codifica para 6 proteínas estructurales y 6 proteínas no estructurales. Según la ICTV, Rotavirus presenta 8 especies (A - H), siendo Rotavirus A el más prevalente en las infecciones humanas. Después se encuentran los genotipos, que se clasifican de acuerdo con la presencia de dos proteínas externas de la cápside, las cuales inician la actividad de neutralización: VP7 y VP4, correspondientes a los genotipos G (glicoproteínas) y P (sensibles a las proteasas) respectivamente. Dichas proteínas son muy
importantes para la epidemiología de este virus, así como para la eficacia de las vacunas (Velásquez, et al. 2014).
Este virus presenta afinidad por los enterocitos del epitelio intestinal causando diarrea, fiebre y vómito, principalmente, en la población de niños menores de 2 años. La entrada de este virus a los enterocitos está mediada por tripsina, la cual cliva la proteína de la cápside VP4 a VP5 y VP8, las cuales facilitan la entrada del virus. Hay dos posibles mecanismos de entrada del virus: mediante entrada directa o mediante endocitosis. Posteriormente, se lleva a cabo la transcripción temprana de los genes que codifican para la polimerasa y las proteínas de las dos primeras capa de la cápside. Luego, se da la transcripción de genes tardíos, originando las proteínas faltantes de la cápside en el retículo endoplasmático rugoso. El virión inmaduro se adhiere a estas proteínas e ingresa al organelo en una vesícula donde se lleva a cabo la maduración viral completando las tres capas de la cápside. Finalmente, las partículas virales salen de la célula hospedera mediante exocitosis o lísis celular (Carter & Saunders, 2007).Para el estudio del comportamiento de este virus se utiliza la línea celular Ma104, las cuales presentan receptores específicos para este virus (Beau, et al. 2007; Knipping, et al. 2012).
Aunque rotavirus es uno de los virus de mayor impacto en la salud, hay otros virus de origen entérico causantes de enfermedades asociadas al consumo de agua contaminada, como es el caso de astrovirus, adenovirus, enterovirus, virus de Hepatitis A y E, entre otros (Prevost, et al. 2015).
En estudios realizados previamente, se ha comprobado que las bacteriocinas producidas por algunas especies bacterianas ácido lácticas tienen un potencial antibiótico y antiviral.
Por ejemplo, la bacteriocina producida por Enterococcus mundtii presenta un efecto inhibitorio significativo contra Listeria monocytogenes, lo que puede ser potencialmente usado para biopreservación de alimentos fermentados de origen lácteo (Vera Pingitore, et al. 2012). Por otro lado, se ha evidenciado que la bacteriocina purificada producida por Lactobacillus delbrueckii tiene la capacidad de generar un efecto anti-Influenza principalmente en el tratamiento post-infección, sin embargo dicho efecto no se evidenció en los virus encontrados extracelularmente (Serkedjieva, et al. 2000).
Objetivos
General
Evaluar la actividad anti-rotavirus de las proteínas obtenidas del secretoma de Enterococcus faecium.
Específicos
● Obtener proteínas de bajo peso molecular a partir del secretoma de E. faecium.
● Evaluar la citotoxicidad que ejercen las proteínas de bajo peso molecular obtenidas sobre la línea celular Ma104, susceptible de infección por Rotavirus.
● Evaluar si las proteínas obtenidas pueden tener un efecto de bloqueo contra Rotavirus que sugiera una actividad antiviral.
Metodología
Cepa bacteriana y condiciones de cultivo
La cepa utilizada en este estudio fue Enterococcus faecium ATCC 35667, donada por el cepario de bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana en Bogotá (2015).
A partir del aislamiento de la bacteria se reconstituyó en medio MRS durante 24h a 37ºC. A partir de una alícuota de medio MRS, después de incubación, se preservaron las células a -80ºC con 20% de glicerol. La viabilidad del banco se verificó por recuperación metabólica en caldo MRS incubado a 37ºC durante 24h y su posterior siembra en agar MRS. Se realizó una siembra masiva en agar MRS y se incubó a 37ºC durante 24h. A partir del masivo, se realizó el preinóculo en 3 ml en medio MRS que coincida con el tubo 0.5 de la escala de McFarland y se incubó durante 2 horas a 37ºC.
Después del tiempo de incubación, se inocularon los 3ml del preinóculo en 27ml de medio MRS y se incubó a 37ºC durante 5 horas. Luego, se adicionaron 20ml de la suspensión celular en 180ml de medio MRS y se llevó a incubar a 37ºC. La incubación se llevó a cabo durante 15h, durante las cuales se realizaron 10 muestreos, incluida la hora 0. En cada muestreo se extrajeron 2ml de medio, los cuales fueron utilizados para realizar recuentos (viabilidad) y determinar la densidad óptica del cultivo a 600nm. A partir de los resultados, se graficó la curva de crecimiento de Enterococcus faecium, identificando el final de la fase exponencial. Estos ensayos se realizaron 3 veces independientemente.
Obtención de proteínas del metabolismo primario de E. faecium
Para la obtención de las proteínas resultado del metabolismo primario de Enterococcus faecium ATCC 35667 se realizaron cultivos en caldo MRS a 37ºC, teniendo en cuenta el tiempo en el cual se evidenció el máximo punto de la fase de crecimiento exponencial de esta bacteria. Los cultivos fueron centrifugados a 800xg por 5 minutos a 4ºC y se recuperó el sobrenadante, se pasó a través de un filtro con poros de 0.22μm y se incubó en un baño termostatado a 55ºC durante 15 minutos para desactivar las proteasas. Estos ensayos se realizaron 3 veces independientemente, dando lugar a tres lotes denominados L1, L2 y L3 respectivamente.
Separación de las proteínas de bajo peso molecular
La separación se llevó a cabo mediante el método de ultrafiltración utilizando los tubos Amicon. Un tubo con un cut-off de 50kDa permitió recuperar la fase donde estaban las proteínas de bajo peso molecular, denominado L Amicon F, después de centrifugar 11ml de la muestra a 4000xg durante 15 minutos a 4ºC. La fase que quedó retenida en el filtro también fue recuperada y se denominó L Amicon R. Cabe resaltar que este procedimiento se llevó a cabo con cada lote de proteínas, obteniendo así 3 muestras del filtrado y 3 del retenido en el filtro.
Concentración de metabolitos primarios a partir del cultivo de Enterococcus faecium ATCC 35667
Para poder obtener la mayor cantidad de proteínas presentes en el extracto crudo resultado del cultivo de Enterococcus faecium ATCC 35667, se utilizó el método de concentración de proteínas con polietilenglicol. A la muestra del sobrenadante se le agregó polietilenglicol 8000 hasta alcanzar una concentración de 10% (m/v). Tras agitación durante toda la noche a 4ºC y luego se centrifugó a 16.000xg durante 1.5h. El sobrenadante fue descartado y el pellet obtenido se resuspendió en 1ml de Tris 50mM (pH 7,01). La muestra resultante fue filtrada nuevamente a través de un poro de 0.22μm y fue almacenada a -20ºC en alícuotas de 500μl, denominadas PEG R para la muestra de las proteínas retenidas en el filtro y PEG F para la muestra de las proteínas de bajo peso molecular para cada uno de los lotes.
Cuantificación de proteínas en las muestras obtenidas y aproximación de su peso molecular Para cuantificar las proteínas presentes en las muestras obtenidas del metabolismo primario de Enterococcus faecium ATCC 35667 se llevó a cabo la técnica de Ácido Bicinconínico utilizando un estuche comercial (Pierce® BCA Protein Assay Kit), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Para determinar el peso molecular de dichas proteínas se realizó una electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida bajo condiciones denaturantes (SDS – PAGE) y posteriormente, se realizó una tinción con azul de Coomassie G250 y con Nitrato de Plata (AgNO3) para revelar las proteínas.
Evaluación de la citotoxicidad de las proteínas obtenidas en células Ma104
Para determinar si las proteínas tienen un efecto citotóxico se evaluó el efecto que generan diferentes concentraciones de éstas en la línea celular Ma104, mediante la técnica de MTT (Sigma) para verificar respiración celular. Inicialmente, se realizó un cultivo de la línea celular Ma104 en medio DMEM (Thermo) suplementado con 5% de suero fetal bovino (SFB), 2mM de L - glutamina, antibiótico y antimicótico, en una placa de 96 pozos (10.000 células/pozo) y se llevó a incubar hasta que se presentara una confluencia del 90%
aproximadamente. En este punto, se agregaron 50μl de la muestra de las proteínas obtenidas a diferentes concentraciones en cada pozo, empezando desde 500 μg/ml hasta llegar a una concentración de 0,06 μg/ml y se llevó a incubar durante 24h a 37ºC y con 5%
de CO2. Después de la incubación, se agregaron 30μl de MTT en cada uno de los pozos y se incubó bajo las mismas condiciones mencionadas anteriormente durante 4h.
Posteriormente, se retiró el volumen de líquido de cada pozo y se agregaron 100μl de Dimetil sulfóxido y se llevó a agitación durante 15 minutos a 60 rpm. Por último, se determinó la densidad óptica de cada una de las muestras evaluadas mediante espectrofotometría, a una longitud de onda de 540nm.
El control de viabilidad correspondió a aquellas células que no fueron enfrentadas a ninguna concentración de proteínas y, a partir de éstas, se pudo determinar el porcentaje de viabilidad de las células en función de la concentración de proteínas mediante la fórmula:
%𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =𝐴𝑏𝑠540𝑛𝑚𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝐴𝑏𝑠540𝑛𝑚𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 × 100
Evaluación de la actividad directa por parte de las proteínas obtenidas con las partículas infecciosas de Rotavirus.
Para la evaluación del efecto anti rotavirus por parte de las proteínas de bajo peso molecular provenientes del secretoma de E. faecium, 50μl de las concentraciones atóxicas de las proteínas fueron puestas en contacto durante una hora con las células Ma104 cultivadas en Advanced DMEM (Invitrogen) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 5%, L- glutamina 2mM, antibiótico y antimicótico. Antes de llevar a cabo la infección, se descongeló Rotavirus cepa RRV a temperatura ambiente y se llevó a centrifugar a 13.000rpm durante 45 segundos. Después se reactivó el virus agregando tripsina (10 μg/ml) e incubándolo durante una hora a 37ºC y posteriormente se agregó un inhibidor de tripsina a base de soya (5X) durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se prosiguió con la infección de las células Ma104 con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 y se llevaron a incubar a 37ºC durante 1h para favorecer la adhesión de los virus a los receptores de la célula. Luego se retiró el virus, se lavaron las células con PBS y se llevaron a incubar durante 10 horas con medio Advanced DMEM sin SFB a 37ºC.
Al cabo de las 10 horas de incubación, las células fueron fijadas con Acetona (80% v/v) y el número de Unidades formadoras de foco por mililitro (UFF/ml) fue determinado mediante la técnica de inmunocitoquímica.
El control positivo de infección correspondió a las células infectadas sin tratamiento con las proteínas, y el control negativo fueron las células Ma104 sin infectar con Rotavirus. Los ensayos se realizaron 3 veces por triplicado.
Resultados y Discusión
Principalmente, se buscaba establecer la cinética de Enterococcus faecium ATCC 35667 para poder determinar la fase de crecimiento exponencial y, a su vez, el tiempo durante el cual se llevará a cabo la producción de las proteínas generadas a partir del metabolismo primario de la bacteria evaluada. En la Figura 1 se puede evidenciar la curva de crecimiento resultante después de 15 horas de incubación bajo las condiciones establecidas previamente.
Fig. 1: Gráfico resultante del promedio de las absorbancias obtenidas después del montaje de tres réplicas de la curva de crecimiento de Enterococcus faecium ATCC 35667. Como se puede
evidenciar, la fase exponencial tuvo lugar hasta las 9 horas aproximadamente.
Como se puede observar, la fase de adaptación de la bacteria evaluada se presentó durante las dos primeras horas y, posteriormente, la fase de crecimiento exponencial se evidenció hasta la hora 9 aproximadamente, seguida por la fase estacionaria hasta el final del experimento. Estos resultados fueron los esperados, teniendo en cuenta los estudios de Parente y colaboradores (1997), Martínez y colaboradores (2003) y Vallejo y colaboradores (2008); así mismo, pueden ser comparados con los obtenidos en trabajos anteriores del laboratorio de Virología de la Pontificia Universidad Javeriana, en los que se evidencia que la fase exponencial de E. faecium llega a su fin entre la hora 8 y 9.
A partir de la curva obtenida, fue posible determinar el tiempo durante el cual se llevó a cabo la producción de proteínas del metabolismo primario de la bacteria evaluada. Para evitar la formación de metabolitos secundarios que pudieran generar un efecto tóxico en las células utilizadas en los experimentos siguientes, se detuvo el proceso a la hora 7.
Después de realizar cada etapa del proceso de producción de proteínas del secretoma de Enterococcus faecium ATCC 35667, se llevó a cabo la cuantificación de las proteínas por medio de la técnica de Ácido Bicinconínico (Pierce® BCA Protein Assay Kit). Para esto, inicialmente se realizaron dos curvas patrón para poder determinar la concentración de las proteínas en las muestras analizadas. La primera curva patrón (Figura 2a) corresponde a la curva patrón utilizada para determinar la concentración de proteínas de las muestras obtenidas a partir de los lotes 1 y 2, mientras que la segunda curva patrón (Figura 2b) corresponde a la curva patrón utilizada para cuantificar las proteínas obtenidas en el lote 3.
Cabe resaltar que, aunque las producciones de las proteínas se realizaron independientes en el tiempo, la cuantificación de los lotes 1 y 2 se hizo simultáneamente.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Abs 600nm
Tiempo (h) Abs 600nm
a) b)
Fig. 2: Curvas patrón de la técnica de BCA (Pierce® BCA Protein Assay Kit) utilizadas para determinar la concentración de proteína obtenida en los lotes 1, 2, (a) y 3 (b).
Los resultados de la cuantificación se pueden evidenciar en la Tabla 1. Para cada lote se realizó la cuantificación de las muestras obtenidas en las diferentes etapas de la producción.
Muestra Concentración (µg/ml)
L1 5162,92
L1 AMI F 5950,83
L1 AMI R 550,42
L1 PEG F 357,08
L2 5124,17
L2 AMI F 5291,67
L2 AMI R 5275,83
L2 PEG F 821,25
L2 PEG R 2437,08
L3 5765,48
L3 AMI F 5797,38
L3 AMI R 6013,10
L3 PEG F 674,52
L3 PEG R 371,19
Tabla 1: Resultados de la cuantificación de proteínas obtenidas en cada etapa de la producción:
Terminadas las 7 horas (L1, L2, L3), después de la separación con el método Amicon (AMI F, AMI R) y después de la precipitación con Polietilenglicol (PEG F, PEG R).
A su vez, para poder conocer los pesos moleculares aproximados de las proteínas obtenidas se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% en condiciones denaturantes (SDS – PAGE), y posteriormente se tiñeron mediante las técnicas de Azul Coomassie G250 (Figura 3a) y Nitrato de Plata (Figura 3b).
a)
b)
Fig. 3: Electroforesis SDS – PAGE para la determinación del peso molecular de las proteínas del secretoma de Enterococcus faecium ATCC 35667. (a) Tinción con azul Coomassie G250: para esta electroforesis se sembraron 20μl de muestra en cada pozo con las concentraciones iniciales
en los primeros 4 carriles después del marcador y con una dilución ½ en los siguientes 3. La albúmina es un control no pegilado. (b) Tinción con Nitrato de Plata: para esta electroforesis se
sembraron 20μl de muestra con una concentración de 0,017μg/ml (0,34ng/pozo).
Como se puede observar en la Figura 3a, no se presentó una tinción adecuada de las proteínas presentes en las muestras. En algunos estudios se ha comprobado que el SDS interfiere con la tinción de los geles de poliacrilamida con azul Coomassie G250 afectando la interacción entre el colorante y las proteínas (Bradford, 1976; Makino, et al. 1986; Wirth
& Romano, 1995). Sin embargo, el control de pegilación correspondiente a la albúmina sérica bovina si se tiñó, mientras que las proteínas que fueron precipitadas con polietilenglicol no fueron teñidas con azul Coomassie G250; caso similar se presentó en un estudio realizado por Wonganan & Croyle (2010).
Por esta razón se realizó la tinción de los geles con Nitrato de Plata, en donde se evidenció que las proteínas producidas por la bacteria evaluada durante las 7 horas de incubación presentan pesos moleculares entre los 26 y los 37kDa. Algunos estudios en la proteómica de Enterococcus faecium han evidenciado que las proteínas producidas por esta bacteria se encuentran entre los 3kDa y por debajo de los 100kDa y aquellas presentan pesos moleculares similares a los obtenidos en este estudio están asociadas a la resistencia de estas bacterias a diferentes antibióticos, como la vancomicina (Ramos, et al. 2015), así como proteínas pertenecientes a la clase III de las bacteriocinas producidas por las bacterias ácido lácticas, que se caracterizan por ser termolábiles con un peso molecular alrededor de los 30kDa (Ross, et al. 2002; Zacharof & Lovitt, 2012).
Por otro lado, dentro de las proteínas obtenidas no se evidenció la presencia de moléculas de pesos moleculares menores a 15kDa; a partir de lo cual se puede inferir que la producción de enterocinas por parte de esta cepa de E. faecium es muy baja pues, de acuerdo a diferentes estudios, las enterocinas de esta bacteria presentan pesos moleculares menores a 10kDa (Parente, et al. 1992; Parente, et al. 1997; Wachsman, et al.
1999; Wachsman, et al. 2003; Chai, et al . 2013; Ahmadova, et al. 2013; Wang, et al. 2013).
Ya conociendo los pesos moleculares de las proteínas obtenidas, se procedió a evaluar si éstas ejercían un efecto de citotoxicidad sobre las células Ma104, susceptibles a la infección por rotavirus, mediante la técnica de MTT (Sigma) evaluando concentraciones entre 250μg/ml y 0,06μg/ml de las proteínas obtenidas. Los resultados se pueden observar en la Figura 4.
Fig. 4: Gráfico correspondiente al porcentaje de viabilidad de la línea celular Ma104 después de ser puesta en contacto con diferentes concentraciones de las proteínas obtenidas de E. faecium
ATCC 35667. En este ensayo, aquellas concentraciones que presentaran un porcentaje de viabilidad superior al 95% eran consideradas atóxicas para las células.
0,06 0,12 0,24 0,49 0,98 1,95 3,9 7,8 15,6 31,25 62,5 125 250
% Viabilidad 72,38 100,07 117,67 121,76 129,18 128,14 103,25 109,64 121,22 132,88 135,80 97,30 99,02 0,00
20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00
% Viabilidad
Concentración (µg/ml)
Teniendo en cuenta que la técnica de MTT se fundamenta en la reducción de las sales de tetrazolio a formazan por acción de la enzima succinato deshidrogenasa producida por las mitocondrias, está directamente relacionada con la viabilidad de las células y, por lo tanto, ha sido usada para determinar si algunos compuestos tienen un efecto tóxico sobre las células (Escobar, et al. 2010). En este estudio, se estableció que las concentraciones que presentaran un porcentaje de viabilidad mayor al 95% serían consideradas atóxicas; por lo tanto, como se puede evidenciar en la Figura 4, todas las concentraciones evaluadas cumplieron con el parámetro establecido exceptuando la concentración de 0,06μg/ml, que presentó una reducción de la viabilidad hasta un 72,3%.
A su vez, las concentraciones comprendidas entre 62,5μg/ml y 0,24μg/ml presentaron porcentajes de viabilidad mayores al 100%, lo que indica que hubo una sobre estimulación de las células por parte de las proteínas evidenciada por el aumento de la actividad enzimática de la Succinato deshidrogenasa, en la cual se fundamenta la técnica, y a su vez de la producción de formazan. Se ha comprobado que las proteínas de bajo peso molecular producidas por E. faecium pueden ejercer un efecto citotóxico en células de origen tumoral, ya que éstas células presentan algunas diferencias en la superficie celular que permiten la entrada de dichas proteínas al citoplasma y detienen el ciclo celular e inducen la apoptosis;
mientras que las células normales no se ven afectadas (Karpinsky & Szkaradkiewicz, 2013;
Er, et al. 2015).
Con respecto al aumento de la actividad enzimática de la succinato deshidrogenasa evidenciado a través de la técnica de MTT, se pudo haber presentado debido a la sobreexpresión de la desacetilasa dependiente de NAD+, SIRT3, la cual media la desacetilación de diferentes proteínas y está fuertemente asociada a la actividad enzimática de la succinato deshidrogenasa (Cimen, et al. 2010). Teniendo en cuenta que las proteínas evaluadas presentan pesos moleculares muy bajos, durante las 24h de exposición algunas pudieron entrar en las células aumentando la concentración de proteínas en el medio y, a su vez, se pudo aumentar la expresión de la SIRT3, lo que conllevó a una mayor actividad enzimática en el complejo II de la cadena transportadora de electrones (succinato deshidrogenasa).
A partir de lo anterior, se estableció que la evaluación del potencial antiviral de las proteínas del secretoma de E. faecium se realizaría desde la primera concentración correspondiente a 250μg/ml, hasta la concentración 0,12μg/ml mediante la determinación de unidades formadoras de foco por mililitro (UFF/ml), a partir de las cuales se calcularon los porcentajes de infectividad y de reducción de ésta (Figura 5). Este ensayo permitió determinar que las proteínas obtenidas del secretoma de Enterococcus faecium, a una concentración de 0,42μg/ml son las que ejercen una mayor actividad antiviral contra rotavirus generando una reducción en la infección del 34.4%.
Fig. 5: Gráfico correspondiente a los resultados de la evaluación del potencial antiviral por bloqueo de las proteínas producidas por Enterococcus faecium ATCC 35667. Se puede evidenciar el porcentaje de infectividad por rotavirus en función de la concentración (μg/ml) de proteínas. La
concentración con mayor actividad potencial fue 0,48μg/ml.
Como se puede observar en la gráfica, se presentó una disminución significativa de la infección después del tratamiento de las células con proteínas a una concentración de 0,48μg/ml (P<0,05). Teniendo en cuenta estudios anteriores con las proteínas de Enterococcus faecium, principalmente las de bajo peso molecular, se puede evidenciar que en concentraciones de aproximadamente 50μg/ml de enterocinas purificadas se obtuvo un efecto de reducción de la infectividad del virus del herpes en células Vero, evitando la producción de proteínas virales en el interior de la célula, (Wachsman, et al. 1999; Todorov et al. 2010). Kwak y colaboradores (2013) describieron unos péptidos producidos por bacterias acidolácticas que presentaron una actividad antiviral contra Influenza A mediante el mismo mecanismo. Por otro lado, se ha evidenciado que la bacteriocina purificada producida por Lactobacillus delbrueckii tiene la capacidad de generar un efecto anti- Influenza tanto en el tratamiento por bloqueo como post-infección (Serkedjieva, et al. 2000).
Conclusiones y Recomendaciones
A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que las proteínas de bajo peso molecular obtenidas a partir del secretoma de Enterococcus faecium ATCC 35667, a concentraciones atóxicas, tienen un potencial efecto antiviral contra la infección in vitro por rotavirus mediante el mecanismo de bloqueo.
Para próximos estudios en el tema se recomienda evaluar la citotoxicidad de las proteínas mediante otra técnica como la de Azul Tripán y evaluar el efecto anti-rotavirus mediante las otras estrategias: virucida y post infección.
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Referencias
● Ahmadova, et al. (2013). Evaluation of antimicrobial activity , probiotic properties and safety of wild strain Enterococcus faecium AQ71 isolated from Azerbaijani motal cheese.
Food Control. 30: 631 – 641.
● Anderson, et al. (2014). Clinical characteristics and genotypes of Rotavirus in adults. The British Infection Association – Elsevier. 10: 683 – 687.
● Beau, et al. (2007). A Protein kinase A – dependent mechanism by which Rotavirus affects the distribution and mRNA level of the functional tight junction – associated Protein, Occludin, in human differentiated intestinal Caco-2 cells. Journal of Virology.
81(16): 8579 – 8586.
● Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry.
72: 248 - 254.
● Butel (2014). Probiotics, gut microbiota and health. Médecine et Maladies Infectieuses.
1 – 8
● Carter, Saunders (2007). Virology: Principles and applications. John Wiley and sons ltd.
England. P 148 – 154.
● Cimen H, Han MJ, Yang Y, Tong Q, Koc H, Koc EC. (2010) Regulation of Succinate Dehydrogenase Activity by SIRT3 in Mammalian Mitochondria. Biochemistry. 49(2): 304 - 311 doi 10.1021/bi901627u
● Collado, et al. (2013). The role of microbiota and probiotics on the gastrointestinal health:
Prevention of pathogen infections. Bioactive food as dietary interventions for liver and gastrointestinal disease. Chapter 12: 201 – 213.
● Chai, et al. (2013). Antiviral effects of a probiotic Enterococcus faecium strain against transmissible gastroenteritis coronavirus. Archives of Virology. 158: 799 – 807.
● Dennehy P. (2015). Rotavirus infection: A disease of the past?. Infectious Disease Clinics of North America. doi - http://dx.doi.org/10.1016/j.idc.2015.07.002
● Desselberger & Gray. (2013). Viral Gastroenteritis. Medicine. 41(12): 700 – 704.
● Díaz, et al. (2010). Aspectos fundamentales sobre el género Enterococcus como patógeno de elevada importancia en la actualidad. Revista Cubana de Higiene y Epidemiología. 48 (2): 147 – 161.
● Er S, Koparal AT, Kivanc M. (2015) Citotoxic effects of cytotoxic bacteria on Caco - 2 cells. Turkish Journal of Biology. 39: 23 - 30 doi:10.3906/biy-1402-62
● Escobar L, Rivera A, Aristizabal FA. (2010) Comparison of resarzurin and MTT methods on studies of citotoxicity in human tumor cell lines. Vitae: Revista de la facultad de Química Farmacéutica. 17(1): 67 - 74.
● Fisher, Phillips. (2009). The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus.
Microbiology. 155: 1749 – 1757.
● Georgiev (2009). Enteric diseases. National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
2: 49 – 65 doi 10.1007/978-1-60327-297-1_9
● Giraffa (2002). Enterococci from foods. FEMS Microbiology Reviews. 26: 163 – 171.
● Glass R, Parashar U, Patel M, Gentsch J, Jiang B. (2014) Rotavirus vaccines: Successes and challenges. Journal of Infection. 68: S9 - S18 doi - http://dx.doi.org/10.1016/j.jinf.2013.09.010
● Gupta, et al. (2010). Purification and characterization of enterocin FH99 produced by a faecal isolate Enterococcus faecium FH99. Indian Journal of Microbiology. 50: 145 – 155.
● Jahan, et al. (2015). Horizontal transfer of antibiotic resistance from Enterococcus faecium of fermented meat origin to clinical isolates of E. faecium and Enterococcus faecalis. International Journal of Food Microbiology. 199: 78 – 85.
● Karafillakis, et al. (2015). Effectiveness and impact of Rotavirus vaccines in Europe, 2006 – 2014. Vaccine Journal. 33: 2097 – 2107.
● Karpinsky & Szkaradkiewicz (2013). Anticancer peptides from bacteria. A Journal of the Bangladesh Pharmacological Society. 8: 343 - 348.
● Knipping, et al. (2012). An evaluation of the inhibitory effects against Rotavirus infection of edible plant extracts. Virology Journal. 9:137.
● Makino A, Mae T, Ohira K. (1986) Colorimetric measure of protein stain with Coomassie blue R on Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide gel electrophoresis by eluting with formamide. Agricultural and Biological Chemistry. 50(7): 1911 - 1912. doi http://dx.doi.org/10.1080/00021369.1986.10867672
● Maragkoudakis P, Chingwaru W, Gradisnik L, Tsakalidou E, Cencic A. (2010) Lactic acid bacteria efficiently protect human and intestinal epithelial and immune cells from enteric virus infection. International Journal of Food Microbiology. 141: S91 – S97 doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.12.024
● Martínez S, López M, Bernardo A. (2003) Thermal inactivation of Enterococcus faecium:
Effect of growth temperature and physiological state of microbial cells. Letters in Applied Microbiology. 37: 475 - 481. doi doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01431.x
● Moreno Muñoz JA, Chenol E, Casinos B, Bataller E, Ramón D, et al. (2011) Novel probiotic Bifidobacterium longum subsp. infantis CECT 7210 strain active against
rotavirus infection. Applied and Environmental Microbiology. 77(24): 8775 – 8783 doi 10.1128/AEM.05548-11
● Oliveira, et al. (2015). Rotavirus vaccine effectiveness in Latin American and Caribbean countries: A systematic review and meta – analysis. Vaccine Journal. 33: 248 – 254.
● Parashar U, Cortese M, Payne D, Lopman B, Yen C, Tate J. (2015). Value of post – licensure data of benefits and risks of vaccination to inform vaccine policy: The example of rotavirus vaccines. Vaccine Journal. Article in press. doi http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.05.094
● Parente, et al. (1992). Characterization of enterocin 1146, a bacteriocin from Enterococcus faecium inhibitory to Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection.
55(7): 497 – 502.
● Parente, et al. (1997). Growth and bacteriocin production by Enterococcus faecium DPC1146 in batch and continuous culture. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 18: 62 – 67.
● Paternina-Caicedo, et al. (2015). Effect of Rotavirus vaccine on childhood diarrhea mortality in five Latin American countries. Vaccine Journal. Article in press.
● Patton JT. (2012) Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13(68): 85 – 97.
● Pedone, et al. (2000). Multicentric study of the effect of milk fermented by Lactobacillus casei on the incidence of diarrhoea. International Journal of Clinical Practice. 54 (9): 578 – 71.
● Prevost, et al. (2015). Large scale survey of enteric viruses in river and wastewater underlines he health status of the local population. Environment International. 79: 42 – 50.
● Qin, et al. (2012). Complete genome sequence of Enterococcus faecium strain TX16and comparative genomic analysis of Enterococcus faecium genomes. BMC Microbiology.
12:135.
● Ramos S, Chafsey I, Silva N, Hébraud M, Santos H, et al. (2015). Effect of vancomycin on the proteome of the multiresistant Enterococcus faecium SU18 strain. Journal of proteomics. 113: 378 – 387 doihttp://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.10.012
● Rathnayake, et al. (2012). Antibiotic resistance and virulence traitsn clinical and environmental Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium isolates. Systematic and Applied Microbiology. 35: 326 – 333.
● Rheingans R, Anderson J, Anderson B, Chakraborty P, Atherly D, Pindolia D. (2014) Estimated impact and cost-effectiveness of rotavirus vaccination in India: Effects of geographic and economic disparities. Vaccine. 32S: A140 – A150.
● Ross RP, Morgan S, Hill C. (2002) Preservation and fermentation: Past, present and future. International Journal of Food Microbiology. 79: 3 - 16.
● Serkedjieva, et al. (2000) Anti Influenza virus activity of a bacteriocin produced by Lactobacillus delbrueckii. Applied Biochemistry and Biotechnology. 88: 285 – 298.
● Todorov SD, Wachsman M, Tomé E, Dousset X, Destro MT, et al. (2010) Characterisation of an antiviral pediocin-like bacteriocin produced by Enterococcus faecium. Food Microbiology. 27: 869 - 879 doi:10.1016/j.fm.2010.05.001
● Turroni, et al. (2014) Molecular dialogue between the human microbiota and the host.
Cellular and Molecular Life Sciences. 71: 183 – 203.
● Vallejo M, Marguet M, Etchechoury V. (2008) Characteristics of α-acetolactate synthase and diacetyl production by Enterococcus faecium ETw7 and Enterococcus faecalis ETw23. Revista Peruana de Biología. 15(1): 97 - 100.
● Velasquez ED, Parashar UD, Jiang B. (2014). Strain diversity plays no major role in the varying efficacy of rotavirus vaccines: An overview. Infection, Genetics and Evolution. 28:
561 - 571. doi http://dx.doi.org/10.1016/j.meegid.2014.10.008
● Vera Pingitore, et al. (2012). Application of bacteriocinogenic Enterococcus mundtii CRL35 and Enterococcus faecium ST88Ch in the control of Listeria monocytogenes in fresh minas cheese. Food Microbiology. 32: 38 – 47.
● Wachsman MB, Castilla V, Ruíz Holgado AP, de Torres RA, Sesma F, Coto CE. (2003) Enterocin CRL35 inhibits late stages of HSV-1 and HSV-2 replication in vitro. Antiviral research. 58: 17 - 24. doi 10.1016/S0166-3542(02)00099-2
● Wang, et al (2013). Inhibitory influence of Enterococcus faecium on the propagation of swine Influenza A virus in vitro. PloS ONE. 8(1): e53043.
● WHO (2012). Estimated Rotavirus deaths for children under 5 years of age: 2008, 453.000. Recurso electrónico. Recuperado el 12 de julio de 2015 en http://www.who.int/immunization/monitoring_surveillance/burden/estimates/rotavirus/en/
● Wirth PJ & Romano A. (1995) Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection methods. Journal of Chromatography A. 698(1-2): 123 – 143 doi doi:10.1016/0021-9673(94)00879-E
● Wonganan P & Croyle MA. (2010). Pegylated Adenoviruses: from Mice to Monkeys.
Viruses. 2: 468 – 502. doi:10.3390/v2020468
● Yang, et al. (2010). Clinical characteristics of Rotavirus gastroenteritis in children in a medical center. Pediatrical Neonatology. 51(2): 112 – 115.
● Zacharof MP & Lovitt RW. (2012) Bacteriocins produced by lactic acid bacteria: A review article. APCBEE Procedia. 2: 50 - 56. doi 10.1016/j.apcbee.2012.06.010
