IDENTIFICACION DE MICRODELECIONES DE LAS REGIONES AZF (Yq) EN UNA MUESTRA DE PACIENTES DEL INSTITUTO NACIONAL DE PERINATOLOGIA CON AZOOSPERMIA NO OBSTRUCTIVA Y/O CON OLIGOOSPERMIA MODERADA O SEVERA: RELACION FENOTIPO-GENOTIPO

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“Identificación de Microdeleciones de las Regiones AZF (Yq) en una Muestra de Pacientes del Instituto Nacional de Perinatología con Azoospermia no Obstructiva y/o con Oligoospermia Moderada o Severa:

Relación Fenotipo-Genotipo”.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS DE LA SALUD

PRESENTA:

MAURICIO DOMÍNGUEZ CASTRO

Director de Tesis

DR. JAVIER MANCILLA RAMÍREZ M. EN C. MÓNICA AGUINAGA RÍOS

Octubre de 2010

Este trabajo fue realizado en el Instituto Nacional de Perinatología

“Isidro Espinosa de los Reyes” SSA Montes Urales # 800 Col.

Lomas Virreyes Delegación Miguel Hidalgo C. P. 11000 México

D. F. y en la Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de

la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional

bajo la Dirección del Dr. Javier Mancilla Ramírez y la Dirección de

la M. en C. Mónica Aguinaga Ríos.

INDICE:

Glosario………..II Relación de figuras ………..IV Relación de tablas……….VI Resumen………..………...VII Abstract………...…….IX

1. Introducción………….………...….1

2. Antecedentes………..………...…..2

2.1. Fisiología testicular……….2

2.2. Embriogénesis de la gonada……….…...3

2.3. Causas frecuentes de infertilidad masculina………4

2.4. Etiología de la esterilidad atribuible al factor masculino……….. 6

A) Endocrinológicas…….……….7

B) Anormalidades cromosómicas……….………….……8

C)Microdeleción del cromosoma Y……….10

2.5. El cromosoma Y: la esencia genética de la infertilidad masculina……….. 11

2.5.1. La región AZFa……….……….….13

2.5.2. La región AZFb………...…14

2.6. Génes controladores de la espermatogénesis (pasar

antes)………..19

2.7. Métodos utilizados para la evaluación del cromosoma Y abajo………..20

2.7.1. Cariotipo……….…..20

2.7.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)....…..21

2.7.3. Sitios de secuencias marcadoras (STS) en Y...……21

2.8. Implicaciones del dna mitocondrial………..22

en la infertilidad masculina 3. Justificación………...24

4. Hipótesis……….25

5. Objetivos……….…25

5.1. Objetivo General………..25

5.2. Objetivos Particulares………25

6. Material y Métodos………..…...…………..26

6.1. Tipo de estudios………...26

6.2. Ubicación Temporal y Espacial………..……..26

6.3. Criterios de selección de muestra……...…………26

6.4. Variables……….28

6.5. Tamaño de muestra………...29

6.6. Metodología………..29

A) extracción de DNA……….30

B) PCR múltiple………..31

6.7. Análisis estadístico……….……….34

7. Resultados……….………...35

8. Discusión ………39

9. Conclusiones……….…..40

10. Perspectivas……….…….41

11. Bibliografía………42

12. Anexos………47

12.1. Anexo no. 1……….47

12.2. Anexo no. 2………..48

12.3. Anexo no.3………...…….49

RELACIÓN DE FIGURAS.

Figura 2. Gráfica circular en donde muestra los trastornos de infertilidad

masculina más comunes………...7

Figura 3. Cromosoma Y región SRY………...13

Figura 4. Cromosoma X y cromosoma Y con sus regiones homólogas para la recombinanción durante la meiosis……….13

Figura 5. Cromosoma Y con sus 7 regiones y sus divisiones en subintervalos………..14

Figura 6. Intervalos de las regiones de AZF con sus sitios de reconocimiento y sus locus específicos………14

Figura 7. Región AZFa en Yq……….………....15

Figura 8. Región AZFb con los genes más representativosde este intervalo.17 Figura 9. Figura 9. De la región AZFcmostrándo los genes DAZ………19

Figura 10.Cariotipo de un varon formula cromosómica 46,XY normal; con una resolucíon de 550 bandas..22

Figura 11. Espermatozoides analizando los defectos en las mitocondrias y en la cola………...25

Figura 12. Análisis de flagelo espermático………26

Figura 13. Reacción A PCR Múltiple pacientes con deleción………40

Figura 14. Reacción B PCR Múltiple pacientes con deleción………41

Figura 15. Reacción C PCR Múltiple pacientes con deleción………41

Figura 16. Reacción D PCR Múltiple pacientes con deleción………42

Figura 17. Reacción E PCR Múltiple pacientes con deleción………42

Figura 18. Reacción F PCR Múltiple pacientes con deleción……….43

Relación de tablas.

Tabla I. Parámetros seminales normales………...……..5 según la OMS 1992.

Tabla II. Genes involucrados con la infertilidad………...20 masculinas de las diferentes regiones de

AZF en el cromosoma Y.

Tabla III. Regiones STS agrupadas para PCR múltiple………...35 Tabla IV.Secuencias de los primers indicadores………….…..36 Para la amplificación “X” número de STS usadas

Para la detección de microdeleciones del cromosoma Y de el locus Yq11 y del gen SRY. Se indica el

Tamaño del amplicón.

Tabla V. Pacientes con infertilidad utilizados……….38 como control. > 5,000,000 /ml.

Tabla VI. Pacientes con infertilidad utilizados………...39 Como casos < 5,000,000 /ml.

Tabla VII. Tabla de pacientes con infertilidad………...39 primaria <5,000,000/ml vs>5,000,000/ml.

Tabla VIII. Tabla de pacientes con infertilidad………..40 primaria <5,000,000/ml vs 0/ml.

Tabla IX. Tabla de pacientes con infertilidad………...40 primaria <5,000,000/ml vs > 5,000,000/ml.

Tabla X. Tabla de pacientes con infertilidad………. 40

primaria o/ml vs > 5,000,000/ml.

GLOSARIO

ABP. Proteína de unión a andrógenos.

AZF. Factor de azoospermia.

AZOOSPERMIA. Se define como la ausencia de espermatozoides en el líquido eyaculado.

CFTR. Gen regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis quística DAZ. Gen deletado en azoospermia.

DISGENESIA GONADAL MIXTA. Padecimiento que se caracteriza por la presencia de testículo de un lado y estría fibrosa del lado opuesto.

DNA.Acido desoxirribonucleico.

ESPERMATOBIOSCOPIA. Es el estudio en el cual se realiza una evaluación macroscópica y microscópica del semen, el cual está formado por una mezcla de espermatozoides suspendidos en el plasma seminal.

FSH.Hormona folículo estimulante.

ICSI. Inyección intracitoplasmática de espermatozoide.

HIPERPROLACTINEMIA. El aumento en los niveles de prolactina que ocasionan disminución en los niveles de testosterona y de gonadotropinas.

HIPOTIROIDISMO. Es una afección en la cual la glándula tiroides no logra producir suficiente hormona tiroidea.

INFERTILIDAD. Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva.

LH. Hormona luteinizante.

MICRODELECIONES. Las microdeleciones consisten en la pérdida de material cromosómico, que comprende, en la mayoría de los casos entre 1 a 3 Mb de DNA, las cuales no pueden ser detectadas por análisis cromosómico de citogenética convencional.

PCR. Reacción en cadena de la polimerasa.

OLIGOSPERMIA IDIOPATICA. El término de oligospermia idiopática se utiliza para describir el subconjunto de pacientes con infertilidad de causa no determinada que tienen un número de espermatozoides por debajo de 10 millones/ml en el estudio de espermatobioscopía, independientemente de su asociación con la existencia de anormalidades en otros parámetros seminales. De acuerdo al número de espermatozoides se clasifica en: leve: 10-20 millones/ml, moderada de 5-10 millones/ml y severa <5 millones/ml.

RNAm.Acido desoxirribonucléico mensajero.

SINDROME DE CÉLULAS DE SERTOLI. Síndrome diagnosticado por biopsia testicular en el que únicamente se observan células de Sertoli y no se observan espermatozoides.

SINDROME DE KLINEFELTER. Este síndrome es la anormalidad cromosómica más frecuentemente encontrada en varones con azoospermia, el cariotipo es 47,XXY.

SÍNDROME DE KALLMAN. Pacientes que presentan un hipogonadismo hipogonadotrópico y pueden tener otras características clínicas como anosmia, asimetría facial, paladar hendido, daltonismo, sordera, criptoquídia y anormalidades renales.

SRY. (Del inglés Sex-determiningRegionY) gen que determina la diferenciación de la gónada en testículo a las 7 semanas de gestación aproximadamente. Se localiza en el brazo corto del cromosoma Y en la región 11.3.

STS. Sitios marcadores de secuencias.

TRASLOCACIÓN. Reorganización estructural cromosómica entre dos o más cromosomas.

RESUMEN.

Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. El factor masculino como causa de infertilidad se encuentra en aproximadamente el 50% de las parejas, constituyendo el 15% de todas las parejas en edad reproductiva. Los investigadores han demostrado gran interés en la correcta estimación del potencial de fertilidad de un hombre. El término "La infertilidad masculina" no constituye un síndrome clínico definido, pero más bien, un conjunto de diferentes condiciones exhibiendo una variedad de etiologías y diagnósticos. Las causas más frecuentes de infertilidad masculina son: a). Endocrinológicas. b). Anormalidades cromosómicas. c). Causas monogénicas. d).

Microdeleciones de la región eucromática de Yq. Se entiende por deleción cromosómica a la falta de un segmento (3 - 5 Mb) de un determinado cromosoma la cual se identifica por citogenética convencional (resolución de bandas 550), cuando ésta no se identifica por citogenética convencional, se le conoce como microdeleción. La base genética de algunos casos de infertilidad masculina fue demostrada por primera vez en 1976 con los estudios de Tiepolo y Zuffardi a través de deleciones microscópicamente visibles del cromosoma Y de hombres infértiles y con azoospermia; con estos datos se postuló la hipótesis que los factores controladores de la espermatogénesis humana se localizan en la porción distal eucromática de Yq11. Briton- Jones y col (2000) nombraron a esta área la región del factor de azoospermia (AZF). Actualmente, las microdeleciones de Yq se identifican a través de la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica entre 15 y 30 secuencias marcadoras tipo STS de Yq11. Objetivo principal.Determinar la frecuencia de microdeleciones en una muestra de pacientes con azoospermia no obstructiva, con oligospermia moderada y/o severa de etiología no determinada en el Instituto Nacional de Perinatología IER, S.S. Material y Metodos. Se incluyeron en el estudio pacientes masculinos mayores de 18 años (previo consentimiento informado firmado), con diagnóstico

niveles hormonales con parámetros normales. En esta tesis se pretende presentar una breve descripción de la complejidad genética del ser humano y cromosómica en algunos factores como las microdeleciones en el cromosoma Y de la región Yq11 para brindar un mejor consejo genético en el contexto de la infertilidad masculina humana por PCR Múltiple utilizando 21 regiones de AZF ubicadas en el cromosoma Y utilizadas por Hellani y col (2005). En el DNA extraído de sangre periférica. Resultados.Durante el periodo de estudio, se realizó el estudio de microdeleciones del cromosoma Y por PCR múltiple en 64 pacientes: 17 con azoospermia, 15 con oligoospermia severa, 19 con oligoospermia moderada y 13 oligoospermia leve. Se encontraron 4 pacientes con microdeleciones del cromosoma Y en la región AZFc de las siguientes regiones marcadoras STS´s (SY148, SY153, SY154, SY157, SY158, SY254, SY277, SY279), de los cuales 2/17 (11.7 %) fueron diagnosticados con azoospermia y 2/15 (13.3 %) oligospermia severa y los 4 mostraron la deleción de AZFc. Conclusiones.La infertilidad masculina es probable se deba a un resultado de la supresión y/o mutaciones en uno o más de los miles de genes necesarios para la espermatogénesis. En particular, se sigue sin poder establecer la correlación precisa entre genotipo-fenotipo especifico, las deleciones del cromosoma Y; y los diversos patrones histológicos testiculares que se han observado en los hombres infértiles. No se puede elucidar una relación contrastante fenotipo-genotipo debido que a pesar de que diferentes pacientes presenten la misma deleción presentan diferente diagnostico oligoospermia o azoospermia y como consecuencia diferente patrón de reproducción, donde pueden estar involucrados otros factores como los ambientales. Concluyendo de esta manera que para el diagnóstico de microdeleciones en hombres infértiles los que presentan mayor y mejor detección son los que tienen una cuanta espermática menor de 5,000,000 de espermatozoides/ml, con cariotipo normal y patrones hormonales en parámetros normales.

Infertility is defined as the inability to conceive after 12 months of regular sex frequently and without contraceptive protection [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. The cause of male factor infertility is found in approximately 50% of couples, representing 15% of all couples aged reproductive. The researchers have shown great interest the correct estimation of potential fertility of a man. The term "male infertility" is not a defined clinical syndrome, but rather a set of different conditions exhibiting a variety of etiologies and diagnoses. The most common causes of infertility men are: a). Endocrinologist. b). Abnormalities chromosome. c).

Monogenic causes. d). Microdeletions euchromatic region of Yq. Means deletion chromosome to the lack of a segment (3-5 Mb) of a specific chromosome which is identified by cytogenetics conventional (550 bands resolution) when it is not identified by conventional cytogenetics, is known as microdeletion. The genetic basis for some cases of male infertility was first demonstrated in 1976 with the studies of Tiepolo and Zuffardi through deletions microscopically visible Y chromosome of men infertile, with azoospermia, with this data is postulated hypothesis that factors drivers human spermatogenesis are located in the distal euchromatic of Yq11. Briton-Jones et al (2000) named this area the region of the azoospermia factor (AZF).

Currently, Yq microdeletions are identified through the use of chain reaction polymerase (PCR) to amplify sequences between 15 and 30 marker type Yq11 STS. Main objective. To determine the frequency of microdeletions in a sample of patients with azoospermia not obstructive, with moderate oligospermia and / or severe etiology not determined at the National Institute of Perinatology IER, S.S. Material and Methods. Were included in the study male patients over 18 years (previous consent signed informed), diagnosed with azoospermia or oligoospermia severe in at least two studies espermatobioscopía with normal karyotype in 15 cells peripheral blood (46, XY) and hormonal levels normal parameters. This thesis aims to present a brief description of the genetic complexity of humans and factors such as chromosome microdeletions in Y chromosome Yq11 the region to provide better advice gene in the context of human male infertility Multiple PCR using 21

chromosome by multiplex PCR in 64 patients: 17 with azoospermia, 15 with severe oligoospermia, 19 with oligoospermia oligoospermia moderate and 13 mild. There were 4 patients with Y chromosome microdeletions in the AZFc region of the STS marker's following regions (SY148, SY153, SY154, SY157, SY158, SY254, SY277, SY279), of which 2/17 (11.7 %) Were diagnosed with azoospermia and 2/15 (13.3%) severe oligospermia and 4 revealed that the deletion of AZFc. Conclusions. Male infertility is likely due to a result of the removal and / or mutations in one or more of thousands of genes necessary for spermatogenesis. In particular, it does not establish the correlation accurate genotype- specific phenotype, the deletions Y chromosome, and the different testicular histologic patterns have been observed in infertile men. Can not elucidate a relationship because of contrasting phenotype-genotype that despite the fact that different patients will have the same oligoospermia deletion or present different diagnosis azoospermia and following different pattern reproduction, where other factors may be involved as environmental. Thus conclude that for diagnosis of microdeletions in infertile men who have more and better detection are those with a much less than 5,000,000 sperm sperm / ml, with normal karyotype and hormonal patterns in parameters normal.

1. INTRODUCCION.

El factor masculino como causa de infertilidad se encuentra en aproximadamente el 50% de las parejas, constituyendo el 15% de todas las parejas en edad reproductiva. Los investigadores han demostrado gran interés en la correcta estimación del potencial de fertilidad de un hombre. El término "La infertilidad masculina" no constituye un síndrome clínico definido, pero más bien, un conjunto de diferentes condiciones exhibiendo una variedad de etiologías y diagnósticos. Infertilidad se define como la incapacidad para concebir después de 12 meses de relaciones sexuales de regular frecuencia y sin protección anticonceptiva [Seshagiri, 2001; Huynh, 2002]. Globalmente la incidencia de infertilidad se estima en un 13- 18 %. Dentro de las causas de infertilidad en varones, el 10% tendrán defectos severos en la producción de espermatozoides. En consecuencia, casi 1% de los hombres en edad fértil tendrán alteraciones graves en los parámetros de espermatobioscopía.

La función reproductiva masculina depende de múltiples factores, que incluyen una normalidad en la función de la espermatogénesis, del tracto genital, la erección y la eyaculación.

Las principales causas de infertilidad, en los hombres son oligoospermia, astenozoospermia, teratozoospermia y azoospermia queen conjuntorepresentan del 20% al 25% de los casos. Las técnicas modernas de reproducción asistida como la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) pueden ayudar a estas parejas a superar sus problemas de infertilidad, aunque es imprescindible analizar las subyacentes causas genéticas de la infertilidad masculina. En esta tesis sepretende presentar una breve descripción de la complejidad genética del ser humano y cromosómica en algunos factores como lasmicrodeleciones en el cromosoma Y de la región Yq11 para brindar un mejor consejo genético en el contexto de la infertilidad masculina humana por PCR Múltiple utilizando 21 regiones de AZF ubicadas en el cromosoma Y utilizadas por Hellani y col (2005) tabla III. La incidencia y prevalencia de la infertilidad masculina se estima a nivel mundial, entre 60-80

urgente de acción, especialmente cuando la infertilidad es evitable en la mayoría de los casos [Poongothai y col 2009].

2. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS.

2. EMBRIOGÉNESIS DE LA GONADA.

En la tercera semana de desarrollo se originan las células germinativas primordiales, a partir del endodermo del saco vitelino. Después de migrar durante la cuarta y quinta semanas a través del mesenterio dorsal, llegan a las gónadas primitivas, abultamientos localizados en las crestas urogenitales. El desarrollo de las crestas obedece a la acción de un grupo de genes como WT1, SF1, DAX1, Lim1, EMX2, LHX9, situados en cromosomas autosómicos.

Las gónadas indiferenciadas primitivas se originan a partir del reborde epitelial celómico de la cresta urogenital y del mesodermo intermedio, ventral al mesonefros. Los cordones sexuales primarios crecen a partir del epitelio celómico y se dirigen en dirección dorsal, para penetrar en la gónada primitiva. La llegada de las células germinativas a la gónada indiferenciada durante la quinta semana de desarrollo favorece su desarrollo y diferenciación. Por tanto, en su ausencia, desaparece el efecto inductor sobre las gónadas y se produce agenesia gonadal [Rojas et al 2005].

Por otra parte, la determinación del sexo gonadal ocurre en las semanas 6 a 9 de desarrollo. La importancia del cromosoma Y en el desarrollo testicular fue establecida durante la década de 1950, mientras que la del antígeno H-Y, presente en el brazo largo del cromosoma Y, fue dilucidada una década más tarde. Mediante el análisis de las alteraciones estructurales del cromosoma Y fue posible, en la década de 1980, identificar al gen responsable de la diferenciación testicular. Fue así como se postuló que correspondía al gen ZFY (Zinc Finger Chromosome Y), codificante de una proteína reguladora de transcripción y localizado en el brazo corto del cromosoma Y. Sin embargo, el locus del verdadero gen responsable de la diferenciación testicular, sólo se identificó a finales del siglo XX, después de estudios complejos basados en análisis genéticos moleculares de secuencias de traslocación y deleción, en pacientes 46,XX y 46,XY con inversión sexual. El

locus propuesto se encuentra en Yp11.3, inmediatamente proximal a la región pseudoautosómica del brazo corto del cromosoma Y. Al gen se le denominó SRY (Región Determinante del Sexo en el Cromosoma Y) [Rojas et al 2005].

Mediante la transcripción del gen SOX9 tanto en los pliegues gonadales vecinos del conducto de Müller como en los conductos metanéfricos, se ha logrado activar al gen SRY presente en las células del epitelio celómico, precursoras de las células de Sertoli. Por su parte, el desarrollo de las células de Leydig está en apariencia determinado por la expresión de WNT4 [Rojas et al 2005].

En la figura 1 se muestra algunos genes necesarios para la diferenciación sexual en su etapa embrionaria.

Figura 1. Genes involucrados en la diferenciación sexual en la etapa fetal.

La ausencia de SRY y la doble dosis de los genes del cromosoma X aseguran el desarrollo y la permanencia ovárica.

Hacia la semana 12 de la gestación, tanto genitales internos como externos han concluido su proceso de diferenciación y forman en conjunto lo que se denomina “sexo genital”. En la diferenciación de los genitales internos toman parte, tanto los conductos mesonéfricos o de Wolff, como los paramesonéfricos o de Müller. Ambos tipos de conductos requieren de la estimulación de las hormonas gonadales para su diferenciación [Rojas et al 2005].

hacia la semana 9, bajo la influencia de la gonadotropina coriónica. Por su parte, las células de Sertoli comienzan a secretar la hormona antimülleriana. La secreción paracrina de testosterona actúa sobre los conductos de Wolff, de modo que estos dan origen a los conductillos eferentes, al epidídimo, al conducto deferente y a las vesículas seminales. La regresión de los conductos de Müller, provocada a su vez por la hormona antimülleriana, deja como remanentes al utrículo prostático y al apéndice del testículo [Rojas et al 2005].

En la mujer, la ausencia de testosterona determina la regresión de los conductos mesonéfricos o de Wolff. Debido a la ausencia de la hormona antimülleriana se desarrollan los conductos de Müller. Estos crecen en dirección caudal y se fusionan en la línea media para dar origen a las trompas de Falopio, al útero y a la parte superior de la vagina figura 2 diferenciación sexual se lleva a cabo de un origen común. [Rojas et al 2005].

Figura 2.

Figura 3 los genitales externos se originan a partir de un esbozo común, de acuerdo con la disponibilidad de dihidrotestosterona. Cuando hay tejido testicular, la testosterona secretada es transformada en dihidrotestosterona, gracias a la acción de la enzima 5 alfa- reductasa.

Como resultado de su acción hay crecimiento del tubérculo genital y fusión de los pliegues del seno urogenital para dar origen al pene y a la uretra peneana. Los pliegues labioescrotales migran hacia la línea media donde se fusionan para formar el escroto.

Debido a la ausencia de dihidrotestosterona en la mujer, los pliegues del seno urogenital

quedan abiertos, de modo que se forman los labios menores. Los labios mayores a su vez derivan de los pliegues labioescrotales, mientras que el clítoris aparece a consecuencia del pobre crecimiento del tubérculo genital [Rojas et al 2005].

Figura 3. Difernciación sexual entre el feto masculino y femenino.

En humanos, la expresión del RNAm de SRY define la diferenciación testicular. La cresta genital se forma alrededor de los 33 días de gestación, y SRYse detecta a los 41 días en los embriones XY. Los niveles de SRY alcanzan su pico a los 44 días, cuando se hacen visibles por primera vez los cordones testiculares. A los 52 días de gestación, las células germinales se encuentran rodeadas por células de Sertoli, las cuales continúan la expresión de SRY a un nivel más bajo, sugiriendo otros papeles de SRY, posiblemente en la espermatogénesis. El marco de lectura de SRY está contenido dentro de un solo exón y codifica una proteína de 204 aminoácidos. La proteína se divide en tres regiones, la región central de 79 aminoácidos (dominio HMG) que funciona como dominio de unión al DNA y como dominio de inclinación del DNA, la región N-terminal y la región C-terminal. El dominio HMG se une al surco menor del DNA al reconocer el motivo A/TAACAAT/A y provoca una inclinación aguda en éste, figura 4 se observa la estructura de gen SRY [Harley 2002].

Así mismo, SRY inicia múltiples señalizaciones que incluyen a aquellas que dirigen la proliferación, migración y organización celular, así como patrón vascular. Se han diferenciado tres tipos de células que migran desde el mesonefros hasta la gónada: células endoteliales, células mioepiteliales o pericitos y células adyacentes a las células de Sertoli. Las células que emigran pueden introducir a la gónada algún componente esencial de la lámina basal que rodea al cordón testicular y/o una señal que dispara la diferenciación de la población celular ya existente en la gónada hacia células de Leydig o de Sertoli [Brennan 1998].

Se han propuesto varios modelos para describir las peculiaridades del cromosoma Y, y se pueden clasificar en tres tipos. El primero: el concepto de una entidad dominante, actuando para determinar el sexo masculino, independientemente de que otros cromosomas estén presentes. Un segundo modelo alternativo es que el cromosoma Y es una entidad egoísta, el cual de alguna manera acumula genes que son útiles en el hombre y/o dañinos en una mujer. El tercer tipo sostiene que el cromosoma Y es un cromosoma “débil”, proveniente de un cromosoma antecesor. Los genes que contiene son sólo reliquias de genes que estuvieron originalmente en un autosoma. La razón de esta entidad poderosa es el papel dominante que juega en la determinación sexual masculinael cromosoma Y [Kirsch 2000].

Figura 4.  Gen  SRY. 

2.1.FISIOLOGÍA TESTICULAR.

A partir de la 8ª. semana, las células de Leydig producen andrógenos, responsables de la estabilización de los conductos de Wolff y de su diferenciación en epidídimo, conducto deferente y vesículas seminales, así como de la masculinización del seno urogenital y de los genitales externos los cuales se muestran en la figura 5. Los andrógenos son hormonas esteroideas sintetizadas a partir del colesterol a través de una larga cadena de reacciones enzimáticas. La diferenciación de las células de Leydig, su proliferación y su actividad esteroidogénica dependen del estímulo gonadotrófico proporcionado por la gonadotrofina coriónica humana (hCG) en los primeros seis meses de vida intrauterina y de la hormona luteinizante (LH) hipofisaria en el último trimestre. Tanto la hCG como la LH se unen a un mismo receptor de membrana presente en las células de Leydig, responsable de transducir la señal [Rey 2001].

Los conductos de Wolff expresan el receptor de los andrógenos, receptor nuclear con actividad de factor transcripcional. Al unirse la testosterona a su receptor, se induce la diferenciación del gonaducto en sentido masculino. En el seno urogenital y los esbozos de los genitales externos, la testosterona es transformada en dihidrotestosterona (DHT) por la enzima 5--reductasa (Fig. 5). La DHT tiene una afinidad 20 veces mayor que la testosterona por el receptor de andrógenos, por lo cual su efecto masculinizante es mucho más potente. En el sexo femenino, la falta de andrógenos resulta en una regresión de los conductos de Wolff y en una feminización de los genitales externos figura 6. Sin embargo, un exceso anormal de andrógenos durante la vida fetal puede provocar una virilización de fetos XX, tal como ocurre en la hiperplasia suprarrenal congénita, la causa más frecuente de anomalías del desarrollo sexual fetal. La acción estrogénica no juega ningún rol en la morfogénesis temprana de los genitales en el sexo femenino, tal como lo demuestran mutaciones en los receptores de estrógenos. En cambio, los estrógenos son indispensables hormonas tróficas en el desarrollo del útero durante la pubertad [Rey 2001].

Los testículos tienen dos componentes distintos, los túbulos seminíferos (sitio de la espermatogénesis) y las células de Leydig (fuente de testosterona). La función de estos dos componentes requiere de ambas gonadotropinas pituitarias, la hormona folículo estimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH). El efecto primario de la LH es estimular la síntesis y secreción de testosterona por las células de Leydig, efecto potenciado por la FSH, la cual también se une a las células de Leydig y aumenta el número de receptores de LH en las células. La FSH en conjunto con la testosterona actúa sobre los túbulos seminíferos para estimular la espermatogénesis. Este efecto puede estar mediado por activación de las células de Sertoli, la cual es controlada por la FSH y la testosterona. La FSH se une a las células de Sertoli y estimula la producción de varias proteínas, principalmente la proteína de unión a los andrógenos (ABP). La ABP se secreta hacia el lumen del túbulo y se une a la testosterona y a la dihidrotestosterona, concentrando estos andrógenos en el epitelio seminífero para la espermatogénesis y en el epidídimo para la maduración espermática.

La inhibina B se sintetiza en las células de Sertoli en respuesta a la FSH y específicamente inhibe la secreción de la FSH en la hipófisis. Los espermatozoides en desarrollo son envueltos por las células de Sertoli que influencian el proceso secuencial de la espermatogénesis. Las espermatogonias sufren una división mitótica para formar los espermatocitos primarios, que a su vez forman los espermatocitos secundarios haploides mediante la división meiótica. Los espermatocitos secundarios proceden a una fase de maduración hacia el estadío de espermátides para finalmente convertirse en espermatozoides. Se necesitan aproximadamente 74 días para producir espermatozoides, de los cuales 50 días transcurren dentro del túbulo. Después de abandonar los testículos, tardan 12 a 21 días para transportarse hacia el epidídimo y aparecer en el eyaculado [Huynh 2002].

Figura 5. Regulación hormonal de la diferenciación sexual fetal. El testículo fetal posee dos poblaciones celulares con función endocrina: las células de Leydig y las células de Sertoli. Las células de Leydig producen testosterona, que viriliza los conductos de Wolff al unirse a su receptor nuclear ; también masculiniza el seno urogenital y los genitales externos, luego de ser transformada por la 5--reductasa en dihidrotestosterona (DHT), que se une al mismo receptor, pero con más afinidad. Por su parte, las células de Sertoli secretan hormona anti-Mülleriana (AMH) que provoca la regresión de los conductos de Müller, esbozos del útero, tubas uterinas y porción superior de la vagina, al unirse a su receptor de membrana.

2.3. CAUSAS MÁS FRECUENTES DE INFERTILIDAD MASCULINA.

El examen más importante para la valoración del varón infértil es el estudio de espermatobioscopia, que sirve para hacer el diagnóstico de azoospermia, oligoospermia y/o teratoospermia. Se recomienda realizarse a todos los hombres que no han podido tener hijos, para conocer si el problema para concebir es atribuible al factor masculino.

Los valores normales en la espermatobioscopíase presentan en la tabla 1.

Figura 6.Hipótesis sobre los mecanismos moleculares involucrados en la determinación testicular .1. En el feto XX normal y en el feto XY con una mutación o deleción de SRY, los factores anti-testiculares (quizás DAX1) inhiben el desarrollo testicular. 2. En el feto XY normal, SRY contrarresta la acción de los factores anti-testiculares, permitiendo que las gónadas se desarrollen en sentido testicular y expresen genes como SOX9 y AMH, específicos de la gónada masculina. 3. En fetos XY con una doble dosis de DAX1, una sola dosis de SRY no puede contrarrestar el efecto antitesticular de dos dosis de DAX1. 4. En el feto XX con una alteración en los genes antitesticulares, las gónadas se desarrollan en sentido testicular aún en ausencia de SRY: sería el caso de los varones XX sin SRY, aunque esta hipótesis necesita ser confirmada.

PARAMETRO VALOR

Volumen >2mL

pH 7.2-8.0 Concentración >20 x 10⁶ espermatozoides/mL

Cuenta total >40 x 10⁶ espermatozoides/eyaculado

Motilidad >50% con progresión anterógrada o >25% con progresión rápida 60 min después del eyaculado

Morfología >30% con forma normal

Tabla 1. Parámetros seminales normales según la OMS 1992.

Se define como azoospermia a la ausencia de espermatozoides en el líquido eyaculado. El diagnóstico de azoospermia se basa en al menos dos espermatobioscopías realizadas en las condiciones adecuadas. La muestra debe ser centrifugada antes de definir la completa ausencia de espermatozoides. Es fundamental diferenciar entre azoospermia obstructiva y secretora. Las numerosas etiologías de la azoospermia pueden dividirse en tres categorías: a) La pretesticular es la que presenta alteraciones endocrinas que afectan a la espermatogénesis; b) La testicular incluye alteraciones en la esteroidogénesis o en la espermatogénesis y c) Las causas postesticulares comprenden alteraciones en la eyaculación o procesos obstructivos en el tramo final.

La oligospermia es la disminución en el número de espermatozoides y puede ser de tres tipos: a) Severa: menos de 5 millones de espermatozoides/ml, b) Moderada: de 5 a 10 millones de espermatozoides/ml y c) Leve: de 10 a 20 millones de espermatozoides/ml, y refleja una producción inadecuada de espermatozoides por el epitelio germinal. Puede ser secundaria a un inadecuado estímulo hormonal, a daño directo del testículo o rara vez a obstrucción parcial de los ductos eyaculadores. El diagnóstico se realiza a través de un examen clínico en la consulta, que incluye estudios endocrinológicos y parámetros seminales figura 7.

2.4 ETIOLOGIA DE LA ESTERILIDAD ATRIBUIBLE AL FACTOR MASCULINO.

La fertilidad también depende de tránsito de los espermatozoides hacia la porción ampular del oviducto, capacitación, penetración al óvulo, fertilización y desarrollo embrionario temprano. Cualquier alteración genética puede afectar cualquiera de estos componentes y llevar a varios grados de infertilidad/subfertilidad masculina. La infertilidad puede ser primaria cuando nunca ha ocurrido un embarazo, o secundaria, cuando ya ha ocurrido un embarazo sin importar el resultado final, siendo de aproximadamente 67 al 71% para el primer grupo y 29 al 33% para el segundo [Seshagiri, 2001].

Aproximadamente una de cada diez parejas son infértiles por varias razones posibles, el factor masculino se da en un 50% de los casos. Este grupo es normalmente dividido en 30% con factores estrictamente masculinos, y el 20% de los factores femeninos. Sin embargo, en aproximadamente el 30% de estos casos, los orígenes de la infertilidad masculina son desconocidos. La infertilidad masculina es un síndrome multifactorial que abarca una amplia variedad de trastornos. En más de la mitad de hombres infériles, la causa de su infertilidad es desconocida (idiopática) y podría ser congénita o adquirida.

Hasta el 10% de la infertilidad no se puede explicar médicamente; algunos de los trastornos de infertilidad masculina se resumen en la figura 8.

Figura 7. Clasificación y morfología de los espermatozoides.

Las causas conocidas de infertilidad en el hombre son muy numerosas, pero se pueden agrupar en varias categorías importantes. La infertilidad masculina ha sido asociada con varios trastornos genéticos y no genéticos. Los factores genéticos involucrados en el hombre con infertilidad se manifiestan como trastornos cromosómicos, mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt), alteraciones monogénicas, enfermedades multifactoriales y trastornos endocrinos de origen genético [Poongothai y col 2009].

Causas No Genéticas.

a) Endocrinológicas.

- Falla Testicular Primaria. Se encuentra aproximadamente en el 10% de los hombres con infertilidad. La testosterona e inhibina se encuentran disminuidas y la FSH elevada (hipogonadismo hipergonadotrópico). La elevación de LH es variable, debido a que las células de Leydig son más resistentes al daño que las células germinales. Usualmente los testículos son pequeños y suaves. El 90% de los hombres con aplasia de células germinales tendrán elevación de la FSH. Todos los hombres con incremento de tres veces más la FSH tendrán algún anormalidad significativa en la biopsia testicular.

- Hipotiroidismo. Tanto los niveles elevados como bajos de la hormona tiroidea alteran

Figura 8. Gráfica circular en donde muestra los trastornos de infertilidad masculina

más comunes.

evidentes. Por lo tanto, la evaluación hormonal tiroidea de rutina no está recomendada inicialmente en pacientes con infertilidad.

- Hiperplasia Adrenal Congénita. Lo más común es la deficiencia de la enzima 21 hidroxilasa, lo que lleva a un defecto en la producción de cortisol. Los testículos fallan en su maduración debido a los bajos niveles de gonadotropinas por el exceso de andrógenos suprarenales. El diagnóstico es raro y clásicamente los pacientes presentan pubertad precoz;

se requiere una cuidadosa evaluación y estudios de laboratorio. La condición y la infertilidad asociada son tratadas con corticosteroides.

Causas Genéticas.

b) Anormalidades cromosómicas.

Las anormalidades cromosómicas son más comunes en hombres infértiles afectando a un 3 a 13% (ref Gardner) comparadas con la población general normal presentes en un 0.5% [Brugh 2003]. Las anormalidades en cromosomas sexuales son más comunes que las autosómicas, presentes en un 4.2% y 1.5% respectivamente [Hargreave 2002; Foresca 2001].

Los rearreglos cromosómicos se observan en algunos pacientes con azoospermia y oligospermia severa e involucran a los autosomas, cromosomas sexuales, o ambos.

Aproximadamente 10-15% de hombres infértiles presentan cambios estructurales del cromosoma Y. Una serie de datos obtenidos de 11 publicaciones que reportaron un total de 9766 hombres infértiles encontró una incidencia de anormalidades cromosómicas del 5.8%, de las cuales las anormalidades de los cromosomas sexuales representaban un 4.2% y las anormalidades autosómicas 1.5%. Es mucho más frecuente ver pacientes con alteraciones numéricas de cromosomas sexuales en la práctica clínica de la infertilidad masculina [Brugh 2003], las más frecuentes son:

- Síndrome de Klinefelter (47,XXY) lo padecen aproximadamente el 10–30 % de los hombres con azoospermia. Un 90% de estos pacientes presentan el cariotipo 47,XXY y un 10% son mosaico 47,XXY/46,XY [Turek y col 2002]. Este síndrome es la anormalidad cromosómica más frecuente, ya que se ve 30 veces más frecuente en hombres infértiles que

acuden a una clínica de infertilidad que en la población general. Se ha encontrado que la prevalencia de este síndrome en pacientes azoospérmicos es de 10-14% en países occidentales [Brugh y col 2003,Harvreage y col 2006].

Los pacientes adultos presentan testículos pequeños y firmes usualmente libres de células germinales. Las biopsias testiculares muestran esclerosis y hialinización [Turek y col 2002;Harvreage y col 2006].

- Síndrome 47,XYY: es una aneuploidía de los cromosomas sexuales en el que un varón humano recibe un cromosoma Y extra. Esta anomalía cromosómica se presenta en 1/1,000 varones nacidos vivos en la población en general, pero más frecuente en la población infértil. En la mayoría de los casos las características fenotípicas son normales, lo que dificulta su manejo ulterior basado en los requisitos específicos asociados a un determinado etiología. Las anormalidades citogenéticas han sido conocidos por ser importantes causas de la infertilidad masculina durante décadas y las alteraciones cromosómicas son más frecuentes en la población de azoospérmicos y/o oligospérmicos en los hombres de la población general. Los hombres con un cariotipo 47,XYY generalmente son fértiles y no hay evidencia de transmisión del cromosoma Y a sus descendientes porque el cromosoma supernumerario se elimina durante la meiosis, y algunas células germinales XYY puede completar la meiosis y producir espermatozoides aneuploides maduros. Sin embargo, se les ve con más frecuencia en las poblaciones infértiles. En este estudio todos los pacientes con cariotipo 47,XYY son infértiles. Sin embargo, las generalizaciones no se puede hacer con respecto a la correlación entre el cariotipo y fenotipo por infertilidad. Este hallazgo puede ser casual. No hay estudios sistemáticos para estos pacientes. Se han publicado que el síndrome 47,XYY está asociado con una mayor frecuencia con infertilidad.

[El-Dahtory,2009].

b) Los portadores de alguna anormalidad cromosómica estructural presentan fertilidad disminuida, así como un mayor riesgo de abortos y de hijos con retraso mental y defectos al

ocurrir en hombres infértiles que en los fértiles. Las translocaciones Robertsonianas y recíprocas son 8.5 veces más frecuentes en varones infértiles que en varones recién nacidos seleccionados al azar. La mayoría de los pacientes con translocaciones Robertsonianas muestran parámetros seminales anormales que pueden ir desde una oligospermia hasta una azoospermia, dependiendo del grado de arresto meiótico inducido por la reorganización cromosómica [Brugh 2003].

En las translocaciones Robertsonianas y recíprocas, que involucran al menos un cromosoma acrocéntrico, las regiones autosómicas no apareadas de los cromosomas con el rearreglo y las regiones no apareadas de los cromosomas X y Y han demostrado establecer contacto durante la profase meiótica. Este mecanismo fue propuesto inicialmente por Forejten 1995, y posteriormente ampliado por Chandley en 1986 para explicar el daño espermatogénico causado por la interferencia autosómica sobre los cromosomas sexuales o por la influencia de éstos sobre la actividad de los autosomas. La ausencia de sinapsis extensa puede ser también la responsable de la falla en la espermatogénesis, aún en ausencia de la asociación con el bivalente XY. La asinapsis y sinapsis no homóloga se observan principalmente en la proximidad de los puntos de ruptura [Kirsch 2000; Jaafar 1989].

Así mismo, es frecuente observar un efecto intercromosómico cuando el cromosoma translocado tiene un efecto sobre la segregación de otros cromosomas que no están involucrados en la translocación, por ejemplo, una frecuencia aumentada de trisomía 21 asociada a una t(13q:14q) [Shi 2001].

2.5 MICRODELECIÓN DEL CROMOSOMA Y.

Uno de los defectos más importantes asociados con infertilidad masculina es la presencia de microdeleciones en el brazo largo del cromosoma Y (Yq), las cuales se presentan en 13% de los pacientes con azoospermia y entre el 1-7% con oligospermia severa. Las deleciones de novo en Yq son una de las causas más frecuentes de anormalidades

cromosómicas en los hombres y se cree que proceden de los eventos de recombinación desigual entre secuencias de ADN altamente repetitivas durante la meiosis o durante el desarrollo temprano (pre-implantación). En consecuencia, las microdeleciones del cromosoma Y contribuyen en una pequeña proporción a la totalidad de infertilidad masculina humana, pero cuando está presente, la introducción de alguna técnica de reproducción asistida puede permitir la transmisión de dichas deleciones a la siguiente generación si el producto es varón [Poongothai y col 2009].

2.6. EL CROMOSOMA Y: LA ESENCIA GENÉTICA DE LA INFERTILIDAD MASCULINA.

El cromosoma Y es el cromosoma más pequeño, con aproximadamente 60 millones de pares de bases y cerca de 50 genes funcionales, de los cuales aproximadamente la mitad se especializan en la diferenciación sexual y espermatogénesis. La información genética dentro del cromosoma Y se requiere para los eventos iniciales de diferenciación sexual y para la espermatogénesis normal.

El evento que marca la determinación sexual masculina en los humanos es la diferenciación testicular, que inicia aproximadamente en la quinta semana de gestación. El acontecimiento genético fundamental es el cambio de la gónada indiferenciada (cresta genital) hacia la diferenciación testicular mediante la acción del gen llamado factor determinante de testículo (TDF), codificado por SRYcomo se mencionó anteriormente figura 9 [Marshal y col 2001]. Además se requieren genes localizados en los autosomas y en el cromosoma X, como aquellos que codifican para proteínas necesarias para la biosíntesis, metabolismo y acción de los andrógenos. Así mismo, existen loci en el cromosoma Y que contienen una amplia gama de genes que codifican para la estatura, tamaño de dientes y otros [Pagani y col 2002].

Las regiones homólogas de X-Y se localizan en ambos extremos de estos cromosomas, éstas se aparean y recombinan durante la meiosis masculina. Estas regiones no tienen relación con el sexo, y se denominan “regiones pseudoautosómicas” (PAR). Las PAR contienen varios genes que son activos en el cromosoma Y, y no están sujetos a la inactivación del X en mujeres. Los loci compartidos entre el X y el Y son probablemente genes cuyas copias en el Y no han degenerado figura 10.

En los humanos cerca del 95% del cromosoma Y forma la región no recombinante (NRY). Se pensó durante mucho tiempo que esta región era un área de desperdicio funcional, pero reportes en 1959 acerca de mujeres 45,X y hombres 47,XXY establecieron la existencia de un gen determinante del sexo en el cromosoma Y, y en 1976 se localizó un factor requerido para la espermatogénesis dentro del cromosoma Y humano [Bachtrog y col 2003].

Para seguir definiendo las regiones funcionales y la posición de los genes en el cromosoma Y se han creado diferentes tipos de mapas. Uno se basa en el patrón de bandeo observado en

Figura 9. Ubicación de la región SRYen el cromosoma Y.

Figura 10. Cromosoma X y cromosoma Y con sus regiónes homólogas para la recombinanción

durante la meiosis.

el cromosoma con tinciones citogenéticas específicas. Otro, el mapa de Vernaugnd, identifica deleciones que ocurren naturalmente y divide al cromosoma en 7 intervalos (Yp se subdivide en 4 intervalos y la región eucromática de Yq se dividen en intervalos 5 y 6). Este mapa posteriormente subdivide estos 7 intervalos en 43 subintervalos figura 11 [Pagani y col 2002].

Un segmento variable del cromosoma Y está compuesto de DNA satélite repetitivo, localizado en el bloque de heterocromatina dentro del brazo largo y consiste principalmente de las familias repetitivas DYZ1 de 3.4 kilobases y DYZ2 de 2.5 kilobases, que juntas representan alrededor de 50-70% del contenido de DNA en el cromosoma Y [Bachtrog y col 2001].

Tiopolo y Zuffardien 1976 postularon que los factores controladores de la espermatogénesis humana se localizan en la porción distal eucromática de Yq11. Nombraron a esta área la región del factor de azoospermia (AZF). Casi veinte años después, el primer gen candidato para la espermatogénesis se identificó en esta región del Y.

Utilizando sitios de secuencias marcadoras (STS) ligados al Y, y clonación de los puntos de ruptura, exones y mapeo óptico, se han podido definir deleciones específicas del brazo largo del cromosoma Y en esta región.

Cuatro distintos intervalos dentro de la región AZF se correlacionan con distintos grados de daño en la espermatogénesis (de Yq proximal a distal: AZFa, AZFb, y AZFc; se ha propuesto una cuarta región entre AZFb y AZFc, denominada AZFd) En la figura 12se

Figura 11. Cromosoma Y con sus 7 regiones y sus divisiones en subintervalos.

Foresta y cols. reportaron (Vazquez y col 2007) que la prevalencia relativa de deleciones en la región AZF es para AZFa =4,9%, AZFb = 15,8%, AZFc = 59,6%, AZF a+b =1,5%, AZF b+c = 8,3% y AZF a+b+c = 3,8%.

2.6.1 LA REGIÓN AZFa.

Se localiza en el intervalo 5 de Yq figura 13 [Pagani y col 2002]. Esta región difiere de AZFb y AZFc en su estructura no repetitiva y su baja frecuencia de deleciones, ya que se han descrito pocos pacientes con ellas. Se extiende hasta 800 kilobases [Silber y col 2002]. La mitad proximal de AZFa contiene secuencias de pseudogenes y genes homólogosdel brazo corto del cromosoma X (Xp22). La mitad distal contiene los siguientes genes:

 AZFaT1.

 DBY.

 UTY (gen de repetición del tetracopéptido regularmente transcrito), y una isoforma TBY4.

Figura 12. Intervalos de las regiones de AZF con sus sitios de reconocimiento y sus locus específicos.

 USP9Y (proteasa de ubiquitinización específica 9), que se expresa ampliamente en el humano con transcritos identificados en muchos tejidos adultos y embrionarios, incluyendo el testículo.

DBY y UTY son expresados ubicuamente y no se duplican, ambos genes tienen homólogos en el cromosoma X. DBY puede ser un gen importante de la espermatogénesis y sufre más frecuentemente deleciones que el USP9Y. La pérdida de DBY se asocia con agenesia de células de Sertoli y se presenta en el 4.9 % de las deleciones en esta regíon (Kent-First, 1999). Los pacientes con deleción de USP9Y y DBY son azoospérmicos con patología testicular de Síndrome de Células de Sertoli. La pérdida de USP9Y o AZFaT1 juntos o por separado resulta en infertilidad masculina. La pérdida adicional de DBY puede empeorar el fenotipo espermatogénico [Pagani y col 2002].

Figura 13 región AZFa en Yq.

2.6.2. LA REGIÓN AZFb.

Contiene los siguientes genes:

 RBMY (motivo de unión al RNA) es un gen candidato de la espermatogénesis localizado en la región AZFb, inmediatamente proximal a la región AZFc. Presenta múltiples copias (por lo menos 30) localizadas tanto en los brazos largos como en los brazos cortos del cromosoma Y. Existen posiblemente seis subclases de RBM (RBMY1-RBMY6).

 RBM se expresa en células espermatogénicas, pero desaparece en el momento de elongación de espermátides. Los hombres infértiles con deleción en la región AZFb, particularmente en el intervalo 6B, no tienen expresión testicular de la proteína RBM.

Basados en la homología de su secuencia con proteínas autosómicas, es probable que RBMY1 y RBMY2 funcionen como proteínas de unión al RNA. Los RBM son proteínas nucleares, implicando que juegan un papel clave en el metabolismo y procesamiento del RNA. También existe una amplia expresión homóloga de RBMY1 en el cromosoma X.

 Factor de elongación 1A (Eif-1A) codificado por EIF1AY, una isoforma de un factor de iniciación esencial. Su papel en la espermatogénesis se desconoce. La deleción intersticial de este gen no se ha reportado en pacientes masculinos con infertilidad.

 CDY, es un gen con múltiples copias en el cromosoma Y derivado de un homólogo autosómico durante la evolución primate. Se piensa que un transcrito se expresa durante la espermatogénesis de la copia del gen localizado en el intervalo 5 de AZFb (CDY2) figura 14, y otro transcrito se expresa de la copia del gen localizado en el intervalo 6 de AZFc (CDY1).

 XKRY, es otro gen con múltiples copias en Yq. Este gen codifica una proteína homóloga a XK y se piensa que funciona como proteína transportadora.

 SMCY, su función precisa todavía no se determina. Deleciones en esta región pueden estar asociadas al desarrollo de tumores de células renales [Pagani y col 2002].

2.6.3. LA REGIÓN AZFc.

Esta región está constituida por áreas masivas de secuencias de identidad absoluta llamadas amplicones, arregladas en repeticiones directas, invertidas o palíndromes. Se extiende 3.5 megabases y contiene siete familias de genes separadas con un total de 19 unidades de transcripción que son expresadas exclusivamente en el testículo. Entre los genes de interés de esta región se encuentran [Silber y col 2002]:

- El gen DAZ (delecionado en azoospermia) fue el primer gen candidato para la espermatogénesis identificado en la región AZFc [Pagani y col 2002]. Es miembro de una familia de 6 a 10 genes y tiene una variación considerable en el número y secuencia de repeticiones. La proteína se encuentra principalmente en el citoplasma de células germinales postmeióticas (espermátides tardías y espermatozoides) sugiriendo un papel en el control posttranscripcional durante las fases tardías de la diferenciación de células germinales [Pagani y col 2002, Seshagiri y col 2001]. Su cDNA revela una secuencia de aminoácidos que contiene un dominio único de unión al RNA y una serie de motivos repetidos de 24 aminoácidos llamados repeticiones DAZ. Existen 7 copias en tandem de DAZ en el cromosoma Y, todas con deleciones

Figura 14. Región AZFb con los genes más representativos de este intervalo.

Existe un homólogo de DAZ en el cromosoma 3p24 (llamado DAZLA) cuyas proteínas están presentes en el núcleo y citoplasma de gonocitos fetales. En el testículo del adulto, se encuentra en abundancia en el núcleo de las espermatogonias pero migra hacia el citoplasma del espermatocitos primarios durante la mitosis [Seshagiri y col 2001].

Stuppia et al (año) reportaron infertilidad masculina causada por deleciones en la región AZFc que no involucraba a DAZ sugiriendo que existen loci adicionales relacionados con la fertilidad en el intervalo AZFc figura 9. Los siguientes genes se han identificado en esta región:

 CDY1 (cromodominio Y1).

 BPY2 (proteína básica Y2)

 PRY

 TTY2 (transcrito testicular Y2)

Aunque las funciones de estos genes son desconocidas, comparten características similares con DAZfigura 15 muestra las regiones de los genes DAZ[Pagani y col 2002].

Esta región es la que con mayor frecuencia sufre deleciones. Las podemos encontrar en aproximadamente 12% de hombres azoospérmicos y 6% de hombres con oligospermia severa.

De manera interesante, la nulisomía de esta amplia región parece no tener algún otro efecto fenotípico excepto sobre la espermatogénesis. Aunque todas sus deleciones aparentan ser idénticas en una escala genómica, los hombres con estas deleciones muestran una gran diversidad de falla espermatogénica en contraste con aquellas deleciones que involucran a AZFa y AZFb, que siempre serán azoospérmicos. La mayoría de las deleciones son de novo, pero pueden encontrarse ocasionalmente en el padre “fértil” del hijo infértil [Silber y col 2002].

En la Tabla II se muestran las diferentes regiones AZF con los genes específicos, función y fenotipo testicular de cada uno de ellos.

REGIÓN GEN FUNCIÓN FENOTIPO TESTICULAR

TDF SRY Proteína de unión al DNA. Determinación testicular

XY/Agenesia de células de Sertoli

AZFa AZFaT1 USP9Y

DBY UTY TBY4

Desconocida Degradación de proteínas Mediador de interacción Proteína-proteína Secuestro de actina

Desconocido

Azoospermia,Oligoospermia severa

Azoospermia, Oligoospermia severa, Agenesia de células de Sertoli

AZFb RBMY1-6 E1F1AY CDY2 XKRY SMCY

Procesamiento de RNA

Factor de traducción esencial

Desconocida Proteína

transportadora de membrana

Antígeno H-Y

Desconocido

Azoospermia, Oligoospermia severa, Agenesia de células de Sertoli Desconocido

Desconocido

Tumor renal

AZFc CDY1 BPY2 PRY TTY2

Desconocida Desconocida Desconocida Desconocida

Desconocido Desconocido Desconocido Desconocido

Figura 15. Región AZFc que muestra los genes

DAZ.

diferenciación de células germinales

Tabla II. Genes involucrados con la infertilidad masculinas de las diferentes regiones de AZF en el cromosoma Y.

2.8. SITIOS DE SECUENCIAS MARCADORAS(STS) EN Y.

El desarrollo de la metodología de la PCR y la secuenciación de fragmentos del genoma ha permitido desarrollar un nuevo concepto de unidad física de mapeo, definida por los sitios identificados por una secuencia (STS), que son secuencias marcadoras de referencia en la construcción de los mapas físicos de solapamiento de clones.

Para su detección, se realiza una electroforesis de los fragmentos de DNA amplificados por PCR(la migración en el gen es de acuerdo en el tamaño de los fragmentos), y se tiñen con bromuro de etidio. Así mismo, se puede utilizar una prueba de PCR múltiple.

Cada ensayo requiere la prueba de controles tanto positivos (masculino normal-todas las bandas de DNA presentes) como negativos (DNA femenino sin bandas de cromosoma Y) y debe contener un marcador positivo para el cromosoma Y (usualmente el gen SRY). El reporte clínico probablemente presentará un mapa del cromosoma Y delineando las regiones que fueron ensayadas para deleciones.

Este tipo de análisis genético no puede distinguir pequeñas alteraciones en la secuencia de DNA dentro del cromosoma Y (mutaciones o polimorfismos) que pueden llevar a un fenotipo de infertilidad [Pagani y col 2002].

La adición de tintas fluorescentes a los primers (PCR fluorescente) aumenta la confiabilidad de la detección de señales, y puede mejorar la sensibilidad de la técnica hasta por 1000 veces.

En la PCR cuantitativa, la cantidad del producto es medida y comparada con controles y permite el cálculo del número de moléculas presentes. Finalmente, en la preamplificación de primers, el genoma entero se amplifica con PCR para crear una mayor cantidad de plantillas iniciales (50 a 100 copias genómicas) [Turek y col 2002].

2.9 IMPLICACIONES DEL DNA MITOCONDRIAL EN LA INFERTILIDAD MASCULINA.

Las mitocondrias son organelos que producen la mayoría del ATP en las células de los eucariotes mediante la fosforilación oxidativa y actúan como sitio para la síntesis de varios metabolitos esenciales. [Thangaraj y col 2003].Los espermatozoides maduros en el mamífero contienen aproximadamente 22-75 mitocondrias, las cuales forman una hélice alrededor de la base flagelar en la pieza media, proveyendo el ATP necesario para la propulsión flagelar Figura 16 [Holyoake y col 2001]. Así mismo, cada espermatozoide contiene alrededor de 50- 75 copias de DNAmt, la biogénesis cesa hacia la mitad de la espermiogénesis con una reducción a una octava a décima parte de su valor inicial. Los cuerpos residuales, que contienen la mayoría del citoplasma de la espermátide, son fagocitados por las Células de Sertoli. A nivel molecular, la reducción en el contenido de DNAmt se debe a una regulación del Factor A de transcripción mitocondrial, codificado en el núcleo, el cual es el principal factor que controla el número de copias de DNAmt. La función de la cadena respiratoria en el espermatozoide debe mantenerse hasta la fertilización. [Thangaraj y col 2003; Holyoake y col 2001].

Figura 16 . Espermatozoides analizando los defectos en las mitocondrias y en la cola.

Durante los últimos años, se ha encontrado evidencia del papel mitocondrial en la infertilidad masculina. En primer lugar, la infertilidad masculina asociada a astenospermia u oligoastenospermia ha sido reportada en pacientes que sufren de enfermedades del DNAmt típicas. En segundo lugar, los espermatozoides han demostrado ser particularmente sensibles a deleciones del DNAmt, probablemente debidas a los efectos deletéreos del estrés

oxidativo. En tercer lugar, se ha encontrado una correlación entre la calidad del semen y la funcionalidad de la cadena respiratoria en las mitocondrias espermáticas Figura17.

Un estudio conducido por Panloup et al. analizó el contenido de DNAmt en espermatozoides anormales utilizando PCR. Se encontró un aumento en el contenido de DNAmt en estos espermatozoides (hasta 28 veces más que en espermatozoides normales).

Estos resultados pueden tener dos causas principales. Una es que existe un mecanismo de retroalimentación que compensa una baja actividad en la cadena respiratoria. Otra puede ser la diferenciación en la maduración anormal de espermatozoides en pacientes infértiles.

3. JUSTIFICACION.

En el Instituto Nacional de Perinatología IER acuden anualmente alrededor de 200 parejas con infertilidad para su atención. En aproximadamente el 50% de los casos, la etiología de la infertilidad no es determinada. El estudio molecular para la detección de microdeleciones del cromosoma Y en el varón infértil con azoospermia u oligospermia severa permitirá estudiar de una manera más completa a este tipo de pacientes. Actualmente en el INPer IER, se realiza el estudio citogenético con una resolución de 550 bandas el cual no detecta este tipo de deleciones. En nuestro país, se desconoce la frecuencia de las microdeleciones que comprometen las regiones AZF, consideradas como la causa monogénica más frecuente de infertilidad masculina. La identificación de estas mutaciones, permitiría brindar un pronóstico

Figura 17. Análisis de flagelo espermático por microscopia

electrónica.

reproductivo, así como un asesoramiento genético a las parejas y los riesgos potenciales en la descendencia masculina en parejas que opten por estrategias de reproducción asistida.

5. OBJETIVOS.

5.1. OBJETIVO GENERAL.

- Determinar la frecuencia de microdeleciones en una muestra de pacientes con azoospermia no obstructiva, con oligospermiamoderada y/o severa de etiología no determinada en el Instituto Nacional de Perinatología IER, S.S.

5.2. OBJETIVOS PARTICULARES:

1.- Implementar estrategias de Biología Molecular para la detección de microdeleciones en el cromosoma Y, las cuales han sido descritas como causantes de infertilidad masculina por condiciones de azoospermia y/u oligospermia moderada o severa.

2.-Establecer la relación de microdeleciones del Cromosoma Y en varones con infertilidad con parámetros >5,000,000 de espermatozoides/ml vs<5,000,000 espermatozoides/ml.

3.- Correlacionar la extensión y la localización de las microdeleciones con respecto a los parámetros anormales de la espermatobioscopia.

6. MATERIAL Y METODOS.

6.1. TIPO DE ESTUDIO.

 Observacional

 Descriptivo

 Transversal

 Prospectivo

6.2. UBICACIÓN TEMPORAL Y ESPACIAL.

El estudio se realizó en el Instituto Nacional de Perinatología “Isidro Espinosa de los Reyes”

SSA, México D.F. en el Departamento de Genética en el periodo de Mayo 2008 a Abril de 2010.

6.3. CRITERIOS DE SELECCIÓN DE LA MUESTRA.

- Se incluyeron en el estudio pacientes masculinos mayores de 18 años (previo consentimiento informado firmado), con diagnóstico de azoospermia u oligospermia severa en por lo menos dos estudios de espermatobioscopía, con cariotipo normal en 15 células de sangre periférica (46,XY) y con niveles hormonales con parámetros normales.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN.

-Sexo masculino.

- Edad 18-55 años.

INFERTILIDAD IDIOPATICA POR FACTOR MASCULINO CON:

- Azoospermia no obstructiva.

- Oligospermia severa, moderada o leve cuenta espermática menor a 20,000,000/ml.

- Antecedente de infertilidad primaria.

- Cariotipo normal 46,XY en 15 células de sangre periférica con una resolución de 550 bandas.

- Consentimiento informado por escrito.

CRITERIOS DE NO INCLUSIÓN.

- Hipogonadismo hipogonadrotópico.

- Hiperprolactinemia.

- Hipotiroidismo.

- Pacientes con síndrome monogénico condicionante de esterilidad masculina.

- Pacientes con infertilidad secundaria.

- Pacientes con criptorquídia.

CRITERIOS DE ELIMINACIÓN.

- Retiro voluntario del consentimiento informado.

6.4. VARIABLES.

A) PRESENCIA O AUSENCIA DE MICRODELECIÓN EN ALGUNA DE LAS REGIONES AZF.

B ) NUMERO DE ESPERMATOZOIDES.

6.5. TAMAÑO DE LA MUESTRA.

- Muestreo no probabilístico de casos consecutivos.

6.6. METODOLOGÍA.

6.6.1. MÉTODOS DE LABORATORIO.

a) EXTRACCIÓN DE DNA.

Se tomaron de 3-5 ml. de sangre venosa periférica y colocaron en un tubo Vacutainer con EDTA como anticoagulante, se mezcló por inversión. Se utilizó para la extracción del DNA un GFX Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Health Care).Se tomaron 300 μl de sangre periférica y se agregan 900 μl de solución de lisis RBC a temperatura ambiente, se encubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó por 20 segundos a 14000 rpm. Se desechó el sobrenadante por decantación, se resuspendió vigorosamente con el vortex el paquete celular y se agregaron 500 μl de solución de extracción, se incubó por 5 minutos a