Manual de Microbiologia Agricola

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i H O A V I N E A i U N IV E R SID A D N A C IO N A L A G R A R IA LA M O L IN A

MANUAL DE ,

MICROBIOLOGIA AGRICOLA

R H IZO B IU M , PG PR s,

IN D IC A D O R E S D E

F E R T IL ID A D E IN O C U ID A D

(2)

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

MANUAL DE

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA

RHIZOBIUM,

PGPRs,

INDICADORES DE FERTILIDAD E

INOCUIDAD

DORIS ELIZABETH ZÚÑIGA DÁVILA

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Dr. JESÚS ABEL MEJÍA MARCACUZCO Rector

Dr. JORGE LUIS ALIAGA GUTIÉRREZ Vicerrector Académico

Mg.Sc. EFRAÍN DONALD MALPARTIDAINOUYE Vicerrector Administrativo

Mg.Sc. MARÍA BEATRIZ OLAYA MORALES Jefe de EDIAGRARIA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

ISBN: N° 978-612-4147-04-3

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú: Registro: N° 201206340

Primera Edición: mayo del 2012 - Tiraje: 1 000 ejemplares

Impreso en Perú - Printed in Perú

Editor:

M aría Beatriz Olaya Morales

Diseño, diagramación e impresión:

Q & P Impresores S.R.L Av. Ignacio Merino 1546 Lince

Telf. 470-1788 - www.qypimpresores.com

Queda terminantemente prohibida por la Ley del Perú la reproducción total o parcial de esta obra por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, químico, óptico, incluyendo sistema de fotocopiado, sin autorización escrita de la Universidad Nacional Agraria La Molina y la autora.

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PRESENTACIÓN

D

ice el lema de la Universidad, “quiero cultivar al hom bre y al cam po”, como una forma de expresar la interrelación entre la cultura y la naturaleza; sabia combinación que garantiza la existencia de la sociedad. Para que ésta se optimice, el hombre ha creado la ciencia, perenne y constante preocupación por su entorno, que garantiza el desarrollo y progreso de los pueblos del mundo.

La Universidad Nacional Agraria La M olina, es el espacio donde se desarrollan estas preocupaciones y retos en un ambiente de debate y consolidación de la técnica, la ciencia y las humanidades. Sus profesores son los principales agentes de la investigación, cuyos resultados son m ateria de las clases en aulas, y fuera en ella, en foros académicos, donde sale a la luz su excelente preparación e idoneidad experimental.

Bajo estos preceptos y antecedentes, me complace presentar este libro “Manual

de Microbiología Agrícola RMzobium, PGPRs, Indicadores de Fertilidad e Inocuidad” de Doris Elizabeth Zúñiga Dávila, destacada docente de nuestra

universidad, quien en este trabajo demuestra la agudeza de sus investigaciones y com parte sus resultados, como una forma de optim izar el papel de la Universidad para la com unidad universitaria y la sociedad en general.

Dr. Jesú s Abel Mejía Mar ca c u zc o

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A la Memoria de mis queridos padres Celia y Francisco

p o r ilum inar siempre m i sendero.

A mis hijos E th e ly Eduardo por todo su cariño

A m i nietecita Adriana Sol de m i vivir

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COLABORADORES:

Laboratorio de Ecología M icrobiana y Biotecnología M arino Tabusso - U N A LM

Blga. Elena Ram os Vásquez Blgo. M inora M atsubara Bautista Blga. Katty Ogata Gutiérrez

Bach. Blga. Stefany Cépeda Gonzáles Blga. N atalia Kohashikawa Takaezu Blga. Pam ela Calvo Vélez

Centro de Ciencias Genómicas - U N A M (Cuernavaca, México) Dr. Ernesto Orm eño Orrillo

C oordinador de la Red Biofag - CYTED, España Dr. Juan Sanjuán Pinilla (CSIC-EEZ, G ranada)

Fotografías y diagrama de la portada

Fotografías laterales

(D. Zúñiga, E. Ramos y R. Santos)

1. Efecto de la inoculación de cepas de Azotobacter en plantas de papa. 2. Control de Rhizoctonia por cepas de Bacillus sp.

3. Producción de ácido indol acético por cepas aisladas de frijol. 4. Perfiles de amplificación BOX-PCR de Bacillus aislados de papas

amargas.

5. Semillas germinadas de Phaseolus lunatus. Diagrama central (D. Zúñiga)

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INDICE

PRÓLOGO 13

I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE RHIZOBIOS

1. Recolección de nodulos 17 2. Aislamiento de rhizobios 17 2.1. Tratamiento de nodulos 17 2.2. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos 17 2.3. Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados 18 3. Pruebas de pureza 19 3.1. Crecimiento en agar levadura lactosa (LLA) 19 3.2. Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador

púrpura de bromocresol (PGPBC) 19 3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB) 19 4. Autenticación de las cepas de rhizobios 20 4.1. Desinfección de semillas 20 4.2. Evaluación de la germinación 20 4.3. Preparación del inoculo 20 4.4. Trasplante de semillas a tubos con solución nutritiva 20 4.5. Inoculación de las plántulas 21 5. Caracterización fenotípica de cepas de rhizobios 22 5.1. Caracterización morfológica de colonias 22 5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA

con azul de bromotimol (LMA-ABT) al 0.5% 22 5.3. Efecto de los agentes físico-químicos sobre el crecimiento

de las cepas de rhizobios 23 5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, Al3+, Mn2+ 24 5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos 26 5.6. Sensibilidad a antibióticos en disco 26

II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS PGPR

6. Aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) 31 6.1. Procesamiento de las muestras de rizósfera 31 6.2. Aislamiento de Bacillus sp. 31 6.3. Aislamientos de Azotobacter sp. 31 6.4. Aislamiento de actinomicetos 32 7. Pruebas para bacterias promotoras de crecimiento 32 7.1. Detección de acido indol acético (ALA.) 33 7.2. Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato 34 7.3. Pruebas de antagonismo contra hongos fitopatógenos 34 7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación

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III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E INTERPRETACIÓN DE DATOS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN BOX-PCR

Introducción 39

'8. Notas generales para hacer PCR 39 9. Extracción de DNA por lisis alcalina 40 10. Verificación de la calidad del DNA extraído

(Control de calidad) 41 11. Amplificación BOX-PCR 42 12. Agrupamiento de perfiles BOX-PCR semejantes 45 13. Amplificación del gen ribosomal 16s 46 14. Purificación del producto de PCR 47 15. Secuenciamiento 47 16. Elaboración de árboles filogenéticos 50

IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOFERTILIZANTES

17. Producción de biofertilizantes 53 17.1. Producción de biomasa del rhizobio 53 17.2. Preparación del soporte sólido 53 17.3. Presentación del biofertilizante 55 18. Control de calidad del biofertilizante 56 18.1. Recuento de células viables de bacterias fijadoras de nitrógeno 56 18.2. Capacidad infectiva y efectiva de los inoculantes en

plántulas de leguminosas 56 18.3. Recuento de microorganismos contaminantes del biofertilizante 56 18.4. Análisis físico-químico 56 19. Enumeración de bacterias simbióticas fijadoras de

nitrógeno por número más probable 58

V. INDICADORES DE LA FERTILIDAD BIOLOGICA DEL SUELO

Introducción 63

20. Preparación de muestras y diluciones 65 21. Recuento de bacterias 66 21.1. Recuento de bacterias aerobias mesófilas viables 66 21.2. Recuento de heterótrofos 66 22. Recuento de hongos totales 69 23. Recuento de bacterias anaerobias mesófilas 70 24. Recuento de actinomicetos 71 25. Enumeración de bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre 72 26. Actividad microbiana 73 26.1 Determinación de la respiración de los microorganismos del suelo 73 26.2 Determinación de la actividad deshidrogenasa de los

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VI. INDICADORES DE INOCUIDAD DE AGUA Y SUELO

Introducción 79

27. Enumeración de coliformes totales 81 27.1. Enumeración de coliformes totales (ICMSF, 2000) 81 27.2. Enumeración de coliformes totales

(Standard Methods, 1998) 83 28. Enumeración de coliformes fecales 86 28.1. Enumeración de coliformes fecales (ICMSF, 2000) 86 28.2. Enumeración de coliformes fecales

(Standard Methods, 1998) 88 29. Enumeración de Escherichia coli 90 29.1. Técnica para el aislamiento y purificación de cultivos 90 29.2. Técnica para la prueba del indol 90 29.3. Técnica para la prueba del rojo de metilo 90 29.4. Técnica para la prueba de Voges-Proskauer 90 29.5. Técnica para la prueba del citrato sódico 91 30. Determinación de Salmonella 92 30.1. Enriquecimiento no selectivo de salmonelas 92 30.2. Enriquecimiento selectivo de salmonelas 92 30.3. Siembra en medios de agar selectivo para salmonelas 92 30.4. Bioquímica de Salmonella 92 30.5. Serología somática 93

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 95

ANEXOS 99

N° 1: Medios de cultivo y reactivos 100 N° 2: Ensayos de sensibilidad a diferentes antibióticos 106 N° 3: Tablas de número más probable 107 N° 4: Material de biología molecular 111

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A B R E V IA T U R A S AP A gua peptonada

APT A gua peptonada tam ponada EC Caldo EC

LM C Caldo extracto de levadura - m anitol CG Caldo glucosa

Brilla Caldo lactosa bilis (2 %) verde brillante CL Caldo lactosado

LST Caldo lauril sulfato triptosa SC Caldo selenito cistina

T-VB Caldo tetrationato verde brillante TSC Caldo tripticasa de soya

CT Caldo triptona

TY Caldo triptona - extracto de levadura M M - ABT M edio mineral sin nitrógeno con

indicador azul de bromotimol SS Solución salina 0.85 %

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PRÓLOGO

L

a fertilidad del suelo generalmente está relacionada con la cantidad de nutrientes disponibles para las plantas y los microorganismos juegan un rol importante en el reciclaje de todos estos elementos nutricionales que muchas veces no se comprende. A nivel mundial existen muchas investigaciones relacionadas con la dinámica de la microflora de diferentes suelos y su relación con la producción de diferentes cultivos, pero estos análisis resultan aún muy costosos.

En el primer manual Fertilidad Biológica del Suelo con énfasis en el estudio del Rhizobium editado en Junio del 2006 fue utilizado dentro del I Curso Internacional de Fertilidad Biológica del Suelo, auspiciado por la Red Biofag (Cyted España). Después de una revisión e incorporación de nuevas técnicas como el aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) y pruebas de actividad microbiana investigados en nuestro laboratorio, se propuso darle el título de Microbiología Agrícola: Rhizobium, PGPR, indicadores de fertilidad e inocuidad, puesto que los ensayos se enfocan principalmente en el estudio de los suelos para la producción de diversos cultivos de manera sostenible.

Por otro lado, en los últimos años se ha incrementado la demanda de análisis microbiológicos en suelos, agua de riego y residuos orgánicos, que nos indican la riqueza natural de estos sustratos; y mas aún por empresas que trabajan a nivel de exportación de cultivos, cuyas exigencias se basan en las normas de Eurepgap, son mayores cuando se trata de productos orgánicos. Estas involucran las buenas prácticas agrícolas, seguridad alimentaria, protección del ambiente y salud. Pero además, los pequeños agricultores cuya proyección es ofrecer productos nativos manejados de manera tradicional, también requieren de estas técnicas y conocimientos.

El presente manual se organiza en 6 capítulos con un total de 30 temas. En primer lugar se describe todo lo relacionado con el Rhizobium aislados de nodulos de diferentes leguminosas, es decir, desde su aislamiento, purificación, y autenticación en plántulas hasta su caracterización fenotípica: morfológica y bioquímica.

En segundo lugar, se presentan las técnicas de aislamiento de bacterias promotoras de crecimiento con énfasis en Bacillus y Azotobacter no presentadas en el manual anterior de Fertilidad Biológica. Así también se describen algunas técnicas para evaluar la capacidad promotora de crecimiento (PGPR), como solubilización de fosfato y producción de ácido indol acético (AIA). En la presente obra, también se incluyen dos pruebas importantes como es la capacidad antagónica de fitopatógenos y efecto de las bacterias en la germinación de semillas.

Todas estas pruebas, nos permite conocer no solo el potencial de la fijación simbiótica de nitrógeno en diferentes ecosistemas, sino también diferentes bondades de las bacterias PGPR que favorecen significativamente la producción de leguminosas y otros cultivos.

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La caracterización molecular que aparece como tercer capítulo permite determinar la diversidad intra e interespecíficas de cepas bacterianas con énfasis en rhizobios, pero que pueden ser aplicadas o adaptadas a bacterias PGPRs. Estas herramientas moleculares son muy importantes para conocer con qué cepas bacterianas estamos trabajando y poderlas aplicar sin riesgo para el agricultor, el ambiente y el consumidor.

Como cuarto capítulo, se muestra la metodología de producción de inoculantes en soportes sólidos a nivel de laboratorio y algunas de las técnicas para evaluar su control de calidad: número de células viables en el soporte, capacidad infectiva y efectiva en el cultivo entre otras.

En el quinto, se presentan algunos métodos para la determinación de la actividad microbiana y poblaciones microbianas, como indicadores de la fertilidad del suelo. En el último capítulo se describen las técnicas de análisis de coliformes y Salmonella, las cuales son útiles para determinar el estado sanitario del suelo, residuos orgánicos, compost, bioles, lodos y agua de riego. Es necesario resaltar que el LEMYB Marino Tabusso está realizando investigaciones para validar estos métodos ya que no existen todavía normas estandarizadas en nuestro país y en otros, aún están en proceso de discusión.

Esperamos que el contenido de este segundo manual, resultado también de mucha dedicación y de investigación sea útil para diferentes investigadores, profesores, alumnos y todas aquellas personas relacionadas con la agricultura, interesadas en incursionar en el fascinante mundo de las bacterias fijadoras de nitrógeno y otros microorganismos promotores de crecimiento que son clave en el manejo sustentable de los suelos.

Finalmente, quiero agradecer a todas las personas del laboratorio que hicieron posible la publicación del presente manual, en especial a Elena Ramos y Minoru Matsubara. Así también al Dr. Juan Sanjuan, coordinador de la Red Biofag (Cyted España) y Dr. Ernesto Ormeño, del Centro de Ciencias Genéricas UNAM (México).

Doris Zúñiga

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I. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

DE RHIZOBIOS

1. R eco le cció n de n o d u lo s 2. A isla m ie n to d e rh izo b io s 3. P ru e b a s de p u re z a

4. A u te n tic a c ió n de las cepas de rh izo b io s

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MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

1. RECOLECCION DE NODULOS

Esta metodología se realiza de acuerdo al m anual del CIAT (1988).

1. C on ayuda de una lampa, extraer la planta que presente mejor aspecto. Luego colectar entre 10 y 20 nodulos de la raíz (Figura 1.1).

2. Colocar los nodulos en frascos con silica gel y algodón para su posterior conservación, asignándoles a cada m uestra u n código de acuerdo al lugar de m uestreo y núm ero de planta. Se recom ienda u n tiempo m áxim o de 3 meses de alm acenam iento bajo esta condición.

3. Posteriorm ente se trasladan al laboratorio para su tratam iento y procesamiento respectivo.

2. AISLAMIENTO DE RHIZOBIOS 2.1. Tratamiento de los nodulos

* Seleccionar 3 nodulos de cada frasco con silica gel.

■ Colocarlos en sobres de papel de filtro estéril e hidratarlos en agua destilada tam bién estéril durante 30 m in (en caso que los nodulos estén secos).

■ Desinfectar con alcohol al 70 % por espacio de 1 m in en u n recipiente estéril.

* Trasladar a otro recipiente que contenga lejía (hipoclorito de sodio) al 3 % y dejar reposar durante 3 m in (Figura 2.1)

■ Enjuagar con agua destilada estéril durante 6 veces hasta que no se perciba el olor a lejía.

2.2. Aislam iento de rhizobios a partir de nodulos

* Con ayuda de pinzas estériles, abrir los sobres que contienen los nodulos. ■ Colocar los nodulos en placas Petri estériles y con ayuda de u n a pipeta

agregar una gota de agua destilada estéril a cada uno.

■ C on una bagueta proceder a la m aceración del nodulo (es necesario que por cada nodulo se utilice una bagueta).

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D O R IS E L IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

■ El m acerado se siembra en placas Petri con medio agar levadura m anitol con rojo congo (LMA-RC) por estrías paralelas.

■ Incubar las placas a 28 °C por 24 - 72 horas (Rhizobium sp.) o 5 - 7 días

(Bradyrhizobium sp.).

* U na vez observado el crecimiento, se procede a elegir las colonias de los posibles rhizobios teniendo en consideración las características típicas de estos (Tema 5.1). Posteriormente se reaíslan de 2 - 3 veces en placas Petri con LM A-RC hasta obtener colonias aisladas con crecimiento homogéneo.

2.3. Mantenimiento y conservación de rhizobios aislados

* Sembrar a partir de una sola colonia en medio LM A, incubar a 28 °C por 3 - 1 0 días, y luego conservar a 4 °C. Realizar el mismo procedim iento cada 6 meses.

■ Para tener cultivos stocks, hacer crecer las cepas en Caldo Extracto de Levadura - M anitol sin rojo congo (LMC) hasta una población de aproxim adam ente 108 cel/m L .

■ M ezclar 1 mL de este cultivo con 0,5 m L de glicerol al 87 % y guardar a -80 °C.

Desinfección: alcohol al 70 % x 1 min.

Desinfección: hipoclorito de sodio 3 % x 3 min.

I

Enjuague: 5 - 6 veces con H20

EfEEEzEE3

Triturado del nodulo y siembra por estría en medio LMA-RC. Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días

Reaislamiento del rhizobio en medio LMA-RC. Incubar a 28 °C por 24 - 72 h ó 5 - 7 días

T

Conservación de cepas a 4 °C

FIGURA 2.1. Aislamiento de rhizobios a partir de nodulos

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3. PRUEBAS D E PUREZA

Las pruebas de pureza siguen la m etodología em pleada por el CIAT (1988).

3.1. Crecimiento en agar - levadura - lactosa (LLA)

■ Sembrar los cultivos aislados en placas con LLA por estrías paralelas. ■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Khizobium sp. o Bradyrhizobium sp). ■ Observar el crecimiento de la bacteria.

■ Adicionar 5 m L del reactivo de Benedict, e incubar a tem peratura ambiente por 10 m in .

■ Observar el cambio de coloración, de blanquecino a amarillento (Figura 3.1). El cambio de color en el reactivo de Benedict a amarillo se debe a la producción de a-cetolactosa, característico del género Agrobacterium y no de rhizobios.

3.2. Crecimiento en agar peptona - glucosa con indicador púrpura de bromocresol (PG-PBC)

■ Sembrar los cultivos en medio PG-PBC m ediante estrías paralelas. ■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días (según sea Rdiizobium sp. o Bradyrhizobium sp.). ■ Observar el crecimiento y cambio de coloración (Figura 3.1).

G eneralm ente los rhizobios no crecen o crecen poco virando ligeramente a amarillo el medio de cultivo. Resultados diferentes a los antes descritos indicarían el crecimiento de un microorganismo contaminante.

3.3. Crecimiento en agar Luria Bertani (LB)

■ Sembrar los cultivos en medio LB m ediante estrías paralelas. ■ Incubar a 28 °C por 2-10 días.

Cepas de rhizobios

é

EEEEE

j

Í5EEEE3

Siembra por estría Medio PG-PBC

Siembra por estría Medio LLA

Siembra por estría Medio LB

Incubar a 28 °C por 2 -1 0 días

Agregar 5 mL de reactivo de. Benedict e incubar Evaluar crecimiento y viraje de color Evaluar crecimiento Rvo. Benedict. Evaluar crecimiento

FIGURA 3.1. Pruebas de pureza 19

(17)

■ Observar crecimiento (Figura 3.1).

AI igual que en el medio PG-PBC, en este medio no se observa un buen crecimiento de los rhizobios. Se ha observado excepcionalmente el crecimiento de las cepas de Rhizobium tropici de frijol.

4. AUTENTICACIÓN DE LAS CEPAS DE RHIZOBIOS 4.1. Desinfección de semillas

■ Escoger las semillas de interés para realizar la autenticación.

■ Desinfectar utilizando hipoclorito de sodio al 2 % durante 5 min (de acuerdo a la sensibilidad de la semilla).

■ Enjuagar con agua destilada estéril varias veces cada 5 min.

■ La hidratación de las semillas se realiza colocándolas en vasos de precipitación con 400 mL de agua destilada estéril. Las semillas grandes (mayor a 1 cm) se dejan hidratar por 3 - 4 h y las semillas pequeñas durante 1 - 2 h.

■ Con ayuda de pinzas estériles se tom an 10 semillas de cada variedad. ■ Colocar en placas Petri con la base recubierta de papel de filtro estéril

hum edecido (Figura 4.1).

■ Cubrir las placas con papel para proteger de la luz.

■ Llevar a una estufa a 24 °C por 24 - 72 h. (según el tipo de semilla).

4.2. Evaluación de la germinación

La germinación de las semillas se evalúa cada doce horas, teniendo en consideración los siguientes parámetros: porcentaje de germinación, número de radículas con punta roma, número de radículas con punta fina.

4.3. Preparación del inoculo

* De las cepas de rhizobios conservadas en refrigeración, tom ar una asada. ■ Sembrar en caldo levadura manitol.

■ Incubar a 28 °C por 2 - 7 días (según la bacteria) con la finalidad de obtener una población de bacterias de 108 U F C /m L .

4.4. Transplante de semillas a tubos con solución nutritiva

■ Para la autenticación se escogen las semillas que presentaron radículas con punta fina.

■ Las semillas pequeñas germinadas (trébol, alfalfa) se transfieren a tubos de ensayo que contienen m aterial de polipropileno, papel de filtro y aproxim adam ente 10 mL de solución nutritiva (Figura 4.2).

■ Las semillas grandes (pallar, frijol) colocarlas en placas Petri. Con ayuda de un bisturí y pinzas quitar el pericarpio.

■ Luego, transferirlas a tubos grandes con 25 m L de solución nutritiva o a jarras Leonard.

■ Los tubos que contienen las semillas se cubren con un papel en la parte externa inferior para proporcionarle la oscuridad necesaria a la raíz.

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■ Colocarlos en gradillas y trasladarlos a u n a cám ara de crecimiento, proporcionándoles 12 h de luz blanca y directa (utilizándose dos fluorescentes de 40 w atts cada uno) y 12 h de oscuridad, a u n a tem peratura de 1 8 - 2 2 °C.

4 .5 .Inoculación de las plántulas

■ R ealizar la inoculación de las plántulas a los 7 dias.

■ C olocar 1 m L del inoculo bacteriano cerca de la radícula de cada plántula.

■ R egar las plántulas con la solución nutritiva cada 3 o 5 días (si fuera necesario).

■ O bservar la aparición de nodulos, cada 7 días, p o r cinco sem anas aproxim adam ente.

L a p ru e b a de au ten tica ció n confirm a que la colonia aislada de Rhizobium es capaz de n o d u la r (nod +).

MANUAL P E MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RHIZOBIUM, PGPRS, INDICADORES P E FERTILIDAD E INOCUIDAD

Desinfección de semillas con hipoclorito de sodio 2 % durante 5 min

1

Enjuagar las semillas con agua destilada estéril cada 5 min ( 5 - 7 veces)

Hidratar las semillas de leguminosa en agua estéril Semilla grande: 3 - 4 h Semilla pequeña: 1.5 - 2 h

i

Colocar las semillas en placas con papel filtro humedecido con agua destilada estéril

Semilla grande: 6 mL Semilla pequeña: 2 mL

i

Cubrir las semillas en placas y llevarlas a incubar a 24 °C

l

Evaluación de la germinación

FIGURA 4.1. Desinfección y germinación de semillas de leguminosas

(19)

D O RIS E L IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

Semillas de leguminosa pre germinadas

Transplante de las sem illas a tubos de ensayo con solución nutritiva

Llevar a cámara de crecimiento de 18 a 22 °C

Inoculo de plántulas a los 7 días con cepas de rhizobios (108 UFC/mL)

Observar la aparición de nodulos cada 7 días por cinco semanas.

FIGURA 4.2. Autenticación

5. CARACTERIZACION FENOTIPICA DE CEPAS DE RHIZOBIOS

La caracterización fenotípica se realiza en base a los protocolos recom endados por Somasegaran y H oben (1985), CIAT (1988), M atos et al. (1998) y H ungría et al. (2001).

5.1. Caracterización morfológica de colonias

" Sembrar las cepas en el medio LM A - RC. ■ Incubar a 28 °C por 2 - 1 0 días.

■ M edir diámetro, forma, apariencia y color de la colonia, así como la cantidad, textura y consistencia de la gom a producida.

■ D e acuerdo a las- características evaluadas, las cepas en estudio pueden agruparse en distintos géneros de rhizobios (Tabla 5.1).

5.2. Producción de acidez o alcalinidad en medio LMA con azul de bromotimol (LMA - ABT) al 0.5%

■ Sembrar las cepas de rhizobios en el medio LM A con azul de brom otimol (ABT) al 0.5 %.

(20)

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RKZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

* Incubar a 28 °C por 2 - 12 días (Figura 5.1).

■ El cambio de color de verde a amarillo o a azul depende del género del rhizobio en estudio (Tabla 5.1).

TABLA 5.1. Características morfológicas de rhizobios en medio LM A

(modificado de W ang y M artinez-Romero, 2005).

TIEMPO DIÁMETRO TEXTURA APARIENCIA COLOR GOMA LMA-ABT

A z o rh iz o b iu m 2 d ía s > 2 m m C re m o s o Translúcidas B la n co R e g u la r A zu l (Á lc a li) B ra d y rh iz o b iu m 5-7 d ía s < 2 m m L ig o s o / c re m o s o Opacas B la n co P oc o a re g u la r A zu l (Á lc a li)

M e s o rh iz o b iu m 3 -7 d ía s 2 -4 m m C re m o s o Sem itranslúcidas B la n co R e g u la r a a b u n d a n te A m a rillo (Á c id o ) R h iz o b iu m 2 -5 d ía s 2 -4 m m L ig o s o / c re m o s o Semitranslúcidas u opacas B la n co ó b e ig e A b u n d a n te A m a rillo (Á c id o )

Cultivo de rhizobios de 3 - 1 0 dias

i

Sembrar por estría en medio LMA con azul de bromotimol

1

Incubar a 28 °C x 3 -1 2 días

I

Evaluar viraje del medio: amarillo: acidez / azul: alcalinidad F IG U R A 5.1. Producción de acidez o alcalinidad

5.3. Efecto de los agentes físico - químicos sobre el crecimiento de las cepas de rhizobios

■ Para realizar los siguientes ensayos es necesario tener las cepas previamente crecidas en caldo LM C a una población de aproxim adam ente 106- 108 U F C /m L (cultivos de rhizobios de 3 días ó de bradyrhizobios de 5 días)

(21)

■ Luego, tom ar 5 pL con u n pipetor autom ático y colocarlo en la placa con m edio L M A a las diferentes condiciones a ensayar (pH, concentraciones de NaCl). E n caso de no contar con u n pipetor, usar una asada del cultivo líquido y realizar una pequeña estría (Figura 5.2).

■ C ada placa Petri de 1 0 x 9 m m se divide en cuadrantes y sirve para 9 cepas de rhizobios ó 16 de bradyrhizobios.

5.3.1. Crecimiento a varios niveles de pH

• Sembrar las cepas en medio LM A a diferentes pH (4, 5, 8 y 9). ■ Incubar a 28 °C y evaluar el crecimiento de las cepas cada 24 o 48 h

por 10 días para los rhizobios y 15 días para los bradyrhizobios.

5.3.2. Crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl

■ Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de N aC l (0.25, 0.5, 1, 2 % a más).

■ Incubar a 28 °C y evaluar el crecimiento de las cepas en estudio cada 24 o 48 horas por 10 días para Rhizobium y 10 - 15 días para

Bradyrhizobium.

5.3.3. Crecimiento en diferentes temperaturas

* Sembrar las cepas en medio LMA.

■ Incubar a diferentes temperaturas: 8, 28, 37 y 40 °C, y evaluar el crecimiento de las cepas en estudio cada 24 o 48 horas por 10 días para Rhizobium y 15 días para Bradyrhizobium. Luego, a los 15 y 20 días como evaluación final.

5.4. Tolerancia a iones metálicos Cu2+, Zn2+, AP+, Mn2+

■ Sembrar las cepas en medio LM A con diferentes concentraciones de Cu2+ y Z n2+ (10, 20 y 40 pg/m L); Al3+ (0.625, 1.25 y 2.5 pg/m L ) y M n2+ (0.3125, 0.625 y 1.25 pg/m L). Los iones metálicos se obtienen a partir de CuS0 4.5H20 y ZnSO4.7H20, A1C13.6H20 y M n S 0 4.H20.

■ Incubar a 28 °C.

* Evaluar el crecimiento de las respectivas cepas cada 24 horas por 12 días (Figura 5.3).

(22)

/

Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h

1

Inoculo (5 j jL d e lO 6 UFC/mL)

LMA con diferentes concentraciones de NaCI (0.5, 1 y 2 %)

LMA con diferentes niveles de pH (4, 5, 8, 9) LMA Incubar a 28 °C x 3 a 15 días Incubar a 8, 28, 37 y 40 °C por 3 a 20 días

Reportar el crecimiento: Abundante (++++), bueno (+++), regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).

FIGURA 5.2. Crecimiento en diferentes niveles de NaCI, pH y temperatura

Cultivo de rhizobios de 24 a 48 h

LMA con diferentes concentraciones de Zn (40, 20,10 pg/mL)

LMA con diferentes LMA con diferentes concentraciones de concentraciones de Al Cu (40, 20, 10 pg/mL) (2.5, 1.25, 0.625

pg/mL)

LMA con diferentes concentraciones de Mn (1.5, 0.625, 0.3125 pg/mL)

Incubar a 28° C x 3 -1 2 días

Reportar el crecimiento: abundante (++++), bueno (+++), regular (++), escaso (+) y no crecimiento (-).

FIGURA 5.3. Tolerancia a metales 25

(23)

D O RIS FJ.TZAHETH ZÚ Ñ IG A D Á V tLA

5.5. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos

■ Inocular una asada del cultivo fresco en el medio base de Bergersen descrito por Somasegaran (1985) con el carbohidrato (1%) o am inoácido (0.1%) en estudio.

■ Incubar a 28 °C por 2 a 10 días (Figura 5.4).

■ Evaluar cambio de color del medio:*Si vira a color amarillo la reacción es positiva (metabolismo del carbohidrato o aminoácido). La turbidez del medio tam bién indica reacción positiva).

Cultivo fresco de rhizobios de 24 a 48 h

i

Transferir una asada del cultivo fresco ai medio base con el carbohidrato o

aminoácido de interés

i

Incubar a 28 °C x 2 a 10 días

i

Evaluar viraje del medio:

Amarillo: ferm entación del carbohidrato o aminoácido Evaluar crecimiento:

Turbidez: crecimiento positivo

FIGURA 5.4. Crecimiento en diferentes fuentes de carbohidratos y aminoácidos

5.6. Sensibilidad a antibióticos en disco

* Sembrar las cepas de interés, por duplicado, en medio LM A, esto se puede realizar con la ayuda de una espátula de vidrio o por el m étodo de incorporación. El inoculo de rhizobios es de 106 U F C /m L .

■ Colocar los discos sobre el medio sembrado (de 2 a 4 discos por placa). * Los antibióticos pueden ser: rifampicina, penicilina, carbenicilina,

sulfatrimetropin, doxiciclina, lincomicina, cloramfenicol, eritromicina, ceñxima, kanamicina, norñoxacina, tetraciclina, estreptom icina (León, 1998).

(24)

■ Incubar las placas a 28 °C durante 3 a 10 días y evaluar el halo formado alrededor del disco, m edir el diám etro del halo en milímetros (Figura 5.5).

Siembra de Rhizobium y Bradyrhizobium en caldo Levadura Manitol

I

Incubar a 28 °C por 2 -1 0 días

X /

Siembra del inoculo (10° cel/ml) en medio LMA

Colocación de discos de antibióticos 4 discos por placa (2 repeticiones)

1

Incubar a 28 °C por 2 - 1 2 días

i

Evaluación de la sensibilidad o resistencia de las cepas

(25)

II. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

DE BACTERIAS PGPR

6. A islam ien to de bacterias prom otoras de crecim iento (PG PR ) 7. Pruebas para bacterias prom otoras de crecim iento.

(26)

6. AISLAMIENTO DE BACTERIAS PROMOTORAS D E CRECIMIEN TO (PGPR)

6.1. Procesamiento de las muestras de rizósfera

El procesamiento se realiza de acuerdo al Tema 20, con la diferencia de que la m uestra es tom ada de la porción de suelo que se encuentra alrededor de las raíces (rizósfera).

6.2. Aislamiento de Bacillus sp.

Para este ensayo se aplica la m etodología A P H A (1992) y M erck (1994), pue de realizarse u n pre-tratam iento térmico para eliminar la microflora no deseada, quedándonos únicam ente con las esporas bacterianas.

El tratam iento térm ico consiste en calentar el frasco con la m uestra a la dilución (-1) por 30 m in en baño m aría a 80 °C. Después del tiempo indicado, se procede a realizar las diluciones de m anera rutinaria.

■ Sembrar en placas Petri 1 m L de las diluciones (-2) hasta (-5) e incorporar agar glucosa triptona extracto de carne (TGE) fundido tem perado a 45 °C, hom ogenizar bien e incubar a 28 °C por 48 h.

■ Seleccionar colonias características de Bacillus y sembrar por estría en una placa con medio TGE. Repetir este procedim iento por aproxim adam ente 2 veces hasta obtener un cultivo puro.

■ Para confirmar la pureza se debe realizar una tinción Gram. Se debe observar la morfología al microscopio para verificar la presencia de bacilos G ram posi tivos.

■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar TGE inclinado a 4 °C para su m antenim iento hasta un m áximo de 6 meses.

Las colonias del género Bacillus sp. se caracterizan por ser blanquecinas mucosas o secas con bordes irregulares. Algunas colonias van a presentarse m ás com pac tas y otras m ás dispersas dado que el microorganismo es mótil y pueden hallarse colonias muy invasivas.

6.3. Aislamientos de Azotobacter sp.

El procesamiento de la m uestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se realizan diluciones para el aislamiento del microorganismo según Z apater (1975). ■ Colocar 1 mL de las diluciones (-2) hasta (-5) en tubos que contienen medio

m ineral sin nitrógeno con el indicador azul de brom otim ol (ABT) al 0.5% y por triplicado.

■ Incubar a 28 °C por 7 - 1 0 días.

■ Los tubos se reportan como positivos cuando hay viraje de color a amarillo, presencia de turbidez y formación de u n velo en la superficie del caldo. ■ Tomar una alícuota de los tubos positivos y estriar en una placa que contiene

medio mineral sin nitrógeno. ■ Incubar a 28 °C por 3 - 5 días.

■ Repetir este procedimiento por 2 veces hasta obtener un cultivo puro. ■ Para confirmar la pureza, se debe realizar una tinción G ram y observar la

(27)

D O R IS E L IZ A B E TH Z U N IG A D A V ILA

morfología al microscopio para verificar la presencia de Azotobacter spp. que son gram negativos.

■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en cuñas con medio mineral sin nitrógeno a 4 °C para su mantenimiento hasta un m áximo de 6 meses.

En los tubos que contienen el medio sin nitrógeno es muy im portante verificar la formación de velos que son estructuras en form a de película o aspecto filam ento so entrelazados (observar al microscopio para no confundir con micelio de hon gos). Además de la formación de turbidez en el medio, los tubos positivos serán aquellos que presenten velo y / o turbidez.

Dado que el medio de cultivo no contiene nitrógeno, es bastante selectivo y solo per mite que las bacterias que son fijadoras Ubres de nitrógeno puedan crecer. Las colo nias de Azotobacter spp. en placa presentan en general una morfología característica, son traslúcidas, de consistencia mucosa, superficie húmeda y poco convexas.

6.4. Aislamiento de actinomicetos

Los actinomicetos son u n grupo de bacterias filamentosas G ram positivas. Como resultado de u n adecuado crecimiento y ramificación, se form a una estructura ramificada de filamentos, denom inada micelio, el mismo que aún siendo de di mensiones bacterianas es análogo al micelio que form an los hongos filamentosos. M uchos actinomicetos form an esporas por esta razón. Las colonias son fáciles de reconocer por presentar una forma redondeada a m anera de costra; el color suele ser muy variable: blancas, verdes, rojas, moradas, grises, marrones, entre otros y su aspecto es espolvoreado en la superficie. Adicionalm ente las placas que con tienen actinomicetos suelen presentar u n olor característico a m ohoso o a tierra de campos recién arados.

Se sigue la m etodología del APHA-AW W A-W PCF (1998).

* El procesamiento de la m uestra se realiza de igual m anera que en el Tema 20 y se realizan diluciones sucesivas para el crecimiento del m icroorganismo y su posterior aislamiento.

■ Sembrar por incorporación, lm L de las diluciones (-2) hasta (-5) en placas con medio de almidón-caseína suplementado con fluconazol (al 0.25 % para inhi bir el crecimiento de hongos), homogenizar e incubar a 28 °C por 6 - 7días. ■ Seleccionar una colonia característica de Actinom iceto y sembrar por estría

en una placa con medio alm idón - caseína. Repetir este procedimiento por 2 veces hasta obtener u n cultivo puro.

■ Para confirmar la pureza se debe observar el microscopio las colonias selec cionadas y visualizar las estructuras características.

■ U na vez obtenidos los aislamientos se deben guardar en agar triptona glucosa (TGA) inclinado a 4 °C para su mantenimiento hasta un m áxim o de 6 meses.

7. PRUEBAS PARA BACTERIAS PROMOTORAS D E CRECIMIENTO

Las siguientes pruebas: producción de ácido indol-acético, solubilización de fos fato, antagonism o contra hongos fitopatógenos y ensayos de prom oción de la germinación, son utilizadas para determ inar las capacidades prom otoras de cre cimiento (PGPR), que en nuestro caso, se han utilizado de m anera eficiente en

(28)

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RH1ZOBIUM, PGPRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

7.1. Detección de Ácido Indol A cético (AIA)

Se utiliza la metodología para bacterias del grupo de Pseudomonas seguida por N aik y Sakthivel (2005) y m odificada para cepas de Rhizobium y otros m icroorga nismos PG PR.

■ Reactivar las cepas en estudio.

■ Sembrar una colonia de cada cepa en tubos con medio líquido específico para cada microorganismo y suplementado con 5 m M de L-triptofano. ■ Incubar aproxim adam ente por 5 - 7 días a 28 °C.

■ Em plear controles positivos con cepas productoras de A IA y controles nega tivos.

Evaluación

* Tomar una alícuota de 100 pL del caldo bacteriano respectivo y adicionar 400 pL del reactivo de Salkowski

* Hom ogenizar con cuidado. ■ Incubar en oscuridad por 30 min.

■ Se reporta como positivo si el medio vira de amarillo claro a tonos rojizos (Figura 7.1).

Reactivar las ceDas

Sembrar en un tubo con medio apropiado + 5 mM L- triptófano Incubar a 28 °C por 5 días y tom ar 100 jjL del cultivo

Agregar 400 pL del reactivo Salkowski,

Incubar en oscuridad y observar cambio de coloración

(29)

7.2. Detección de bacterias solubilizadoras de fosfato

La m etodología de solubilizadores de fosfatos se tom ó en base al protocolo utili zado por N autiyal (1999).

■ Reactivar las cepas en estudio.

■ Sembrar por estría en el medio de cultivo National Botanical Research Institute’s phosphate growth médium (NBRIP) con fosfato bicalcico o tricalcico.

■ Incubar las placas por 5 - 1 5 días a 28 °C

Evaluación

■ Se tom arán como positivas las cepas que crezcan en el medio de cultivo y muestren presencia de u n halo transparente alrededor de la estría (Figura 7.2).

Cultivo en estudio

i

Sembrar la cepa con una estría en el medio para solubilizadores de fosfatos

1

Observar crecimiento de la cepa y formación de halo alrededor.

FIGURA 7.2. Método de detección de bacteria solubilizadoras de fosfato

7.3. Prueba de antagonismo contra hongos fítopatógenos

Esta m etodología puede ser adaptada a las bacterias que se deseen probar, los ensayos se realizan de acuerdo a A hm ed et al. (2005).

* Reactivar las cepas de bacterias que se van a utilizar.

■ Dividir una placa con agar papa dextrosa (PDA) en un m áxim o de 4 cuadran tes m arcando el punto central de la placa y una línea equidistante del centro en cada cuadrante.

(30)

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA RJHIZOBIUM, PGFRS, INDICADORES DE FERTILIDAD E INOCUIDAD

■ En cada una de las líneas se sembrarán las diferentes cepas a probar y se incubarán a 28 °C hasta obtener su crecimiento (puede variar según él genero de bacteria a utilizar).

■ Simultáneamente se hará crecer en una placa con medio PDA el hongo fito- patógeno hasta obtener un crecimiento del micelio que llegue a cubrir toda la placa.

■ Con un sacabocado de 1 cm. de diámetro retirar una porción del micelio del hongo ya crecido y colocarla boca abajo en el centro de la placa que contiene las bacterias.

■ Se debe utilizar una placa control donde solo se sembrará el hongo sin bac teria y placas donde se prueben cepas como controles positivos y negativos. Todo el ensayo se realiza por duplicado.

■ Incubar a la tem peratura óptima del hongo.

■ Evaluar si hay inhibición del crecimiento del hongo por las bacterias después de que la placa control haya completado su crecimiento (Figura 7.3).

■ M edir las áreas de inhibición alrededor de cada cepa bacteriana.

Micelio del hongo en placa de PDA

Reportar como cepas positivas

aquellas que presenten un halo Placa control con micelio

evidente alrededor de la bacteria del hongo.

(31)

1

D O RIS E L IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

7.4. Efecto de la inoculación con PGPRs en la germinación de diferentes cul tivos.

Desinfección de semillas e inoculación

• Se utilizan semillas de diferentes cultivos a las que se les hace una prueba de germinación previa.

■ Las semillas se desinfectan en alcohol de 96 ° por 2 - 5 m inutos dependiendo del tam año (Figura 4.1).

■ Se enjuagan con agua destilada estéril hasta elim inar los residuos de alcohol. ■ Se procede a embeber las semillas con los inóculos que contenga una pobla

ción bacteriana de 106 cel/m L.

■ El tiempo de inhibición va a depender de cada tipo de semilla por ejemplo para tom ate se inbebe por dos horas y para frijol por tres.

■ C on ayuda de pinzas estériles se tom an 20 semillas y se colocan en placas Pe- tri de 18 x 140 m m con papel filtro y papel toalla, esterilizados. La cantidad de semillas por placa depende del tam año de la semilla.

■ U na vez colocadas las semillas en la placa asegurarse que el papel este h ú medo, para eso se puede adicionar con pipeta agua destilada estéril sobre el papel.

■ El núm ero de repeticiones recomendadas es de 4 placas por tratamiento. ■ Es im portante tener un control solo con agua destilada estéril y otro con el

medio de cultivo sin bacteria.

■ Las placas se envuelven en papel y se colocan en una cám ara tem perada, la tem peratura adecuada va a depender de los requerimientos fisiológicos de cada semilla.

Evaluación de la germinación

La germinación de semillas se evalúa cada 24 horas por un periodo determ inado de germinación para cada tipo de semilla, teniendo en cuenta el porcentaje de germinación y la forma y tam año de la radícula. Se siguió la m etodología de M ishra (1998).

(32)

III. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR E

INTERPRETACIÓN DE DATOS MEDIANTE

AMPLIFICACIÓN BOX - PCR

8. N o ta s g enerales p a r a h a c e r P C R 9. E x tra c c ió n de A D N p o r lisis a lc a lin a

10. V erificación de la c a lid a d del A D N ex tra íd o (c o n tro l d e ca lid ad )

11. A m p lific a c ió n B O X - P C R

12. A g ru p a m ie n to de perfiles B O X - P C R sem eja n te s 13. A m p lific a c ió n del gen rib o so m a l 16s

14. P u rific a c ió n del p ro d u c to de P C R 15. S ec u e n c ia m ie n to

(33)

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos del suelo presentan un rol relevante para el m antenim ien to de la vida, la fertilidad, la calidad y el equilibrio en el ecosistema. Estudiar su diversidad resulta importante, porque estos microorganismos form an parte de comunidades muy complejas y dinámicas conformadas por numerosas especies. Para entender la función e interacción de cada uno de los miembros que confor m an estas com unidades en los nichos específicos es esencial la identificación de los mismos.

L a técnica de reacción de la cadena polimerasa dirigida a rD N A 16s ha sido uti lizada am pliam ente en el estudio de la diversidad en procariotas. El m étodo de rep-PCR es utilizado en bacterias y proporciona un fingerprint de la estructura cromosómica, la cual es considerada variable entre cepas y por comparación, se pueden detectar diferencias a nivel intra e interespecíficas.

8. NOTAS GENERALES PARA HACER PCR

1. Trabajar siempre en un lugar limpio y de preferencia con guantes. Cualquier contam inante puede ser una fuente de ADN.

2. U sar puntas (tips) nuevas y estériles.

3. Cam biar de punta siempre que se vaya a agregar el siguiente reactivo.

4. Los volúmenes de los reactivos para las reacciones de P C R dependen de las concentraciones de las soluciones stocks disponibles. D e m anera que siempre se m antengan las concentraciones especificadas en las condiciones de amplifi cación.

5. Incluir siempre un control positivo con un A D N en buen estado y u n control negativo sin ADN.

6. Usar agua de grado molecular autoclavada tres veces y dispensadas en alícuo tas de 1.5 mL en tubos eppendorf.

7. C uando se preparan las mezclas para PCR, m antener todos los reactivos, in cluyendo las muestras, en hielo picado. G uardar los reactivos a -20 °C lo más rápido posible después de utilizarlos.

8. Si se tienen dos tam pones de PC R [KC1 y S 0 4(N H 4)2]. U sar por defecto en reacciones rutinarias el que trae KC1. El otro se usa para amplificaciones que empleen mayores concentraciones de M gClr

9. Seguir el siguiente orden al m om ento de agregar los reactivos a los tubos para hacer PCR:

a. Agua milli-Q. Agua desionizada ultra pura.

b. Buffer KC1. Otorga las condiciones óptimas para la actividad de la Taq A D N polimerasa.

(34)

c. MgCl,. Influye en la fuerza de la interacción entre los primers y el A D N molde. d. Dim etil sulfóxido (DM SO) -si es que es necesario-. Inhibe la form ación de

estructuras secundarias en el A D N molde o primers.

e. Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs). Son las bases de nucleótidos que la Taq A D N polimerasa utiliza para la extensión de las cadenas de ADN. f. M uestra

g. Primer(s). Fragmentos cortos de una cadena simple de A D N (15-30 nucleó tidos) que son complementarios a las secuencias que flanquean la región de A D N de interés. El propósito de los primers PC R es proveer un grupo libre 3’-OH para que la A D N polimerasa pueda añadir dNTPs.

h. Taq A D N polimerasa. Aislada de la bacteria Thermus aquaticus. Puede sinteti zar A D N de m anera eficiente bajo condiciones de calor intenso.

10. C uando se trabajen más de 3 muestras, es posible realizar u na sola mezcla de reacción. Se multiplican todos los volúmenes de los reactivos listados en el punto anterior, por el núm ero de m uestras que se vayan a ensayar, m ás una adicional. Luego de repartir la mezcla en los tubos para PCR, se agrega la m uestra respectiva.

11. Después de adicionar todos los reactivos necesarios y la m uestra en el tubo, se dan unos ligeros golpes al tubo para hom ogeneizar la mezcla de reacción, evitar form ar burbujas y centrifugar por 15 segundos a 13000 rpm . Finalm ente colocar los tubos en el termociclador.

9. EXTRACCIÓN D E A D N POR LISIS ALCALINA

El aislamiento del A D N genómico se basa en su liberación a través de lisis celular y el aislamiento de proteínas, polisacáridos y lípidos. El m étodo se desarrolla se gún lo establecido por Herrera-Cervera et al. (1999) y m odificado por M atsubara (2010). (M étodo para lisis de bradyrhizobios).

A . Materiales y equipos

Cultivo m icrobiano de la noche anterior, crecido en caldo Triptona - Extracto de levadura (TY) ■ M icrocentrífuga a 12000 rpm ■ Refrigeradora a 4 °C ■ Baño de agua a 80 °C ■ Baño de agua a 37 °C ■ Vortex ■ N aO H 0.05 M

■ Dodecil sulfato de sodio (SDS) 0.25 %

■ 2 (iL, 1 - 10 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL

■ Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso) ■ M icrotubos de 2 mL

(35)

B. Procedimiento

1. Tomar con u n palillo estéril m asa bacteriana “fresca” crecida en placa. 2. Resuspender los microorganismos en un microtubo conteniendo 20 pL de

una solución N aO H 0.05 M y SDS 0.25 %. H om ogeneizar haciendo uso de u n vortex.

3. Colocar en baño de agua a 80 °C por 15 min.

4. Colocar en baño de hielo por 10 min y hom ogeneizar con vortex. 5. Agregar 200 pL de agua milli-Q estéril. Homogeneizar.

6. Centrifugar 5 m in a 12000 revoluciones por minuto (rpm).

7. Trasvasar el sobrenadante a un microtubo limpio y conservar a 4 °C.

10. VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD D E A D N EXTRAÍDO (CONTROL DE CALIDAD)

■ Balanza digital de 200 g de capacidad ■ H orno m icroondas

■ Probetas de 100 y 1000 mL

■ M icropipetas de 0.1 - 2 pL y 1 - 10 pL ■ Tips de 10 pL

■ Cámaras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm ■ Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable

■ Translum inador de luz UV ■ C ám ara digital

■ Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas Inc. USA) ■ M arcador molecular Lam bda A D N 500 pg, Fermentas Inc. USA - Buffer tris-borato-EDTA (TBE) IX

* Agarosa

■ Solución acuosa de bromuro de etidio (0.5 pg/m L ) ■ Agua destilada

B .l Preparación del gel de agarosa 1%

1. Pesar 0.75 g de agarosa y mezclar con agua destilada (c.s.p. 75 mL).

2. Licuar el horno m icroondas hasta la completa disolución de los cristales de agarosa.

3. Temperar a 50 °C y vertir en una bandeja electroforética de 15 x 10 cm, pre viam ente nivelada.

4. Colocar el peine que m arca los pocilios de la bandeja. 5. D ejar solidificar, evitando la formación de burbujas.

6. Retirar las paredes de goma de la bandeja del gel y el peine, teniendo cuidado de no dañar los pocilios de vertido de la muestra.

(36)

3 Q R IS E L IZ A B E TH ZÚ K 1G A D Á V ILA

B.2 Corrida electroforética de las muestras

7. Transferir la bandeja con el gel a la cám ara de electroforesis.

8. L a cám ara de electroforesis es cargada con buffer TBE IX, hasta cubrir los pocilios de muestra.

9. M ezclar 1 pL de buffer de carga con 5 pL de la muestra.

10. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q.

11. Cargar las mezclas realizadas con una m icropipeta de 1 - 10 pL, dispensando cada m uestra en un pocilio del gel.

12. Cerrar la cám ara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co rrespondientes.

13. Se program a la fuente de poder a 80 V por 60 min. 14. Iniciar la corrida.

B.3 Tinción del gel

15. Concluido el tiempo de corrida, trasladar cuidadosam ente el gel a una ban deja de solución acuosa de brom uro de etidio (0.5 pg/m L), dejando reposar durante 15 min.

16. Trasladar el gel de agarosa a la bandeja con agua destilada y dejar reposar durante 10 m in para su lavado.

17. Colocar el gel sobre el translum inador y encender la luz UV. 18. El gel revelado es observado a través el fotodocumentador.

11. AM PLIFICACIÓN BOX - PCR A . Materiales y equipos

* Termociclador

■ M icropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 - 10 pL, 10 - 100 pL y de 100 - 1000 pL ■ Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)

■ M icrotubos de 1.5 mL

■ Tubos para PC R de 0.2 mL (estériles y de prim er uso) ■ Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas)

■ Prim er BOX A IR (5’ - C TA C G G C A A G G C G A C G C TG A C G - 3’) 10 p m o l/ mL

■ Buffer Taq KC1 10X

• Dimetil sulfóxido (DMSO) 100% ■ MgC12 25 m M

■ dN TPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno) ■ Taq A D N polimerasa 5U /pL

(37)

B. Procedimiento B. 1 Mezcla de Reacción

1. Se realiza u n m aster mix, multiplicando todos los volúmenes requeridos (Ta bla 11.1) por el núm ero de muestras a ensayar más una adicional.

2. Dispensar la mezcla obtenida en cada uno de los tubos de PCR.

3. Se procede a colocar el volumen respectivo de A D N y agua milli-Q (c.s.p. 25 pL de reacción).

NOTA: La cantidad de A D N depende de la concentración del mismo en el eluente de extracción, el cual se evalúa previam ente en la verificación del ADN.

TABLA 11.1. M ezcla para reacciones de amplificación BOX-PCR

Reactivos Concentración Inicial Concentración Final Volumen (25 pL) Buffer KC1 (X) 10 1,00 2,50 MgCl2 (mM) 25 7,50 7,50 DMSO (%) 100 10,00 2,50 dNTPs (mM) 25 1,25 1,25 Primer BOX A IR (pmol/mL) 10 0,80 2,00 Taq ADN Polimerasa (U/pL) 5 0,08 0,40

ADN (pL) 5 -8

Agua milli-Q (pL) c.s.p. 25,00

B.2 Reacción de amplificación BOX-PCR

4. Introducir los tubos para PCR en el termociclador, previam ente program ado para la reacción de amplificación BOX (Versalovic et al., 1991).

5. El perfil de tem peraturas para el term ociclador se m uestra en la Tabla 11.2.

TABLA 11.2. Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación BOX-PCR

Desnaturalización inicial 95 °C por 3 min 25 ciclos desnaturalización 93 °C por 45 segundos

annealing 53 °C por 1 min extensión 65 °C por 8 min Extensión final 65 °C por 16 min

(38)

DO RJS E L IZ A B E T H Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales y equipos

■ Balanza digital de 200 g de capacidad ■ Probetas de 100 y 1000 mL

■ M icropipetas d e 0 . 1 - 2 p L y l - 1 0 p L ■ Tips de 10 pL

* Cám aras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 15 cm ■ Fuente de poder de voltaje y tiempo regulable

■ Translum inador de luz UV ■ C ám ara digital

■ Buffer de carga (6X D N A Loading dye, Fermentas)

■ M arcador m olecular Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus (Fermentas Inc., USA)

■ Buffer TBE IX ■ Agarosa

■ Solución acuosa de brom uro de etidio (0.5 pg/m L) ■ A gua destilada

■ A gua milli-Q

Procedimiento

1. Preparar agarosa al 1.5 % en buffer TBE IX y vertir en una bandeja electrofo- rética para gel de 15 x 15 cm.

2. Introducir el gel dentro de la cám ara de electroforesis conteniendo la m isma solución buffer.

3. M ezclar 1 pL del buffer de carga con 5 pL del amplificado.

4. M ezclar 1 pL del m arcador Gene Ruler 1 kb A D N Ladder Plus con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q.

5. Se carga cada uno de los pocilios con los amplificados, colocando los m arca dores moleculares a los extremos del gel.

6. Se cierra la cámara de electroforesis y se conectan los cables en sus electrodos correspondientes.

7. Las muestras son corridas a 80 V por 180 min.

(39)

12. AGRUPAMIENTO DE PERFILES BOX-PCR SEMEJANTES A . Materiales

- Fotografías de los geles electroforéticos revelados con los productos de am pli ficación BOX-PCR

- Software de edición fotográfica.

1. Alinear las imágenes de los geles en función a los marcadores de peso molecular. 2. C om parar los perfiles BOX de cada una de las cepas ensayadas, buscando

bandas en com ún que muestren un mismo peso molecular.

3. Form ar agrupam ientos de alta similitud, de m anera que los patrones de los diferentes grupos obtenidos se diferencien unos de otros.

4. Para hacer comparaciones entre geles, se alinean las bandas de los marcadores con u n mismo peso molecular

Extracción del ADN bacteriano 1

Verificación de la calidad de ADN extraído

1

A m plificación BOX - PCR Prim er BOX A1R

(5’-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3')

Gel de Agarosa al 1.5 %

Com probación de la am plificación por electroforesis

Revelado con Bromuro^de etidio, 0.5 pg/m L 1

Exposición al translum inador y tom as fotográficas Agrupam iento de perfiles sim ilares

FIGURA 9. Caracterización molecular de cepas bacterianas

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D O RIS EL IZ A B E T H Z Ú Ñ IG A D ÁVILA

13. AM PLIFICACIÓN DEL G EN RIBOSOMAL 16s

La reacción de amplificación del gen ribosomal 16s se realiza con el fm de secuen- ciarlo y determ inar la identidad de las cepas ensayadas.

■ Termociclador Eppendorf

■ M icropipetas de 0.1 - 2 pL, 1 -1 0 pL, 10 -100 pL y de 100 - 1000 pL ■ Tips de 10 pL, 100 pL y 1000 pL (estériles y de prim er uso)

■ M icrotubos de 1.5 mL

■ Tubos para PC R de 0.2 mL (estériles y de prim er uso) ■ Buffer de carga (6X A D N Loading dye, Fermentas) ■ Primers:

■ fD 1: 5’ - CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’ ■ rD l: 5’ - C C C G G G A TC C A A G C TTA A G G A G G TG A TC C A G C C - 3’ - Buffer Taq KC110X

- M gCl2 25 m M

■ dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10 m M cada uno) ■ Taq A D N polimerasa 5U /pL

■ Agua milli-Q

B. Procedimiento B .l M ezcla de Reacción

1. Rotular debidam ente los tubos de PCR.

2. Preparar una mezcla de reacción de 25 pL para cada u n a de las muestras a ensayar. E n la Tabla 13.1 se detalla la formulación de la misma.

TABLA 13.1 Mezcla para reacciones de amplificación 16S

Reactivos Concentración Concentración Volumen

Inicial Final (25 pL) Buffer KC1(X) 10 1,00 2,50 MgCl2 (mM) 25 1,50 1,50 dNTPs (mM) 10 0,50 0,20 Primer fDl (pmol/mL) 10 0,50 0,20 Primer rDl (pmol/mL) 10 0.50 0,20 Taq ADN Polimerasa (U/pL) 5 0.50 0,10

ADN (pL) 5

Agua milli-Q (pL) c.s.p. 25,00

B. 2 Reacción de amplificación

3. Introducir los tubos para P C R en el term ociclador previam ente program ado para la reacción de amplificación del gen ribosom al 16s.

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4. El perfil de tem peraturas para el term ociclador se m uestra en la Tabla 13.2.

TABLA 13.2 Perfil de temperaturas para las reacciones de amplificación del gen ribosomal 16s

Desnaturalización inicial 93 °C por 2 min 30 ciclos desnaturalización 93 °C por 45 segundos

annealing 62 °C por 45 segundos extensión 72 °C por 2 min. Extensión final 72 °C por 5 min.

B.3 Comprobación de la amplificación por electroforesis Materiales y equipos

* Lo requerido en la sección 11 - B.3, con la siguiente variante en la bandeja de electroforesis y m arcador molecular:

■ Cám aras electroforéticas con bandejas para gel de agarosa de 15 x 10 cm ■ M arcador m olecular Ladder A D N m arker (300 - 10000 pb), Fermentas Inc.

USA

Procedimiento

1. Preparar un gel de agarosa al 1 % en buffer TBE IX, en una bandeja electrofo- rética para gel de 15 x 10 cm. Colocar el peine y dejar solidificar.

2. Proceder como lo señalado en el Tema 11, B.3

3. M ezclar 1 pL del m arcador molecular con 1 pL de buffer de carga y 4 pL de agua milli-Q.

4. Cargar las muestras en los pocilios del gel y los m arcadores moleculares a los extremos del gel.

5. Cerrar la cám ara de electroforesis y conectar los cables en sus electrodos co rrespondientes.

6. Correr las muestras a 60 V por 150 m in aproxim adam ente o hasta que la ban da más oscura del buffer alcance la m itad del largo del gel.

7. Revelar el gel con brom uro de etidio, enjuagarlo y observarlo a través del tras- luminador.

14. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR

Puede hacerse uso de kits comerciales de purificación de productos de PCR, los cuales se basan en el empleo de columnas que contienen resinas con alta selectivi dad y recuperación de fragmentos de ADN. Remueve los primers no constituidos (< 50 nucleótidos), enzimas y mononucleótidos o sin marcar.

15. SECUENCIAMIENTO

Para la identificación por secuenciamiento del gen ribosomal 16s, las muestras son enviadas a u n laboratorio especializado en dichos servicios. E n la Figura 15.1 se muestra un cromatograma proporcionado como resultado del secuenciamiento.

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D O RIS E L IZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA 170 180 G C T T G 7 T T G .... CC GC. T G G T i ■ ' 190 C . . . C . . T . ' . . . - A . . ; H ñ ! ' : u J ; . „ ; L J J G & u i i . \ i \ -290 300 G G ..G G G T G T C G G C C »CACT L J s l M ¿ u ^ h 10 32 3G G C TG . G ..C f ; ' | Í L . ) 420 430 440 : i < ’ i rl*L -4vJ•Í^J 'LjlrJ 330 340 350 360 j^ áM i É ilk ...m m o I ^ M

FIGURA 15.1. Sección de nucleótidos proporcionados por un cromatograma

Tras el envío de las secuencias, se procede de la m anera siguiente:

Se adquiere u n banco de secuencias de las posibles especies a la que pertenece el microorganismo en cuestión: “N ational Center for Biotechnology Inform ation” (http://w w w .ncbi.nlm .nih.gov/).

Lim piar y unir las secuencias dadas por cada Prim er (fD l y rD l), em pleando los program as BioEdit versión 7.0.5.3 y Chrom as Lite versión 2.01, así como el banco de secuencias.

Los program as BioEdit y Chrom as Lite son utilizados para alinear las secuen cias de las muestras con secuencias de especies ya conocidas y detectar posibles errores en el cromatogram a (Figuras 15.2 a 15.4), ya que m uchas veces este tiene bases solapadas o extras y la corrección ayuda a la definición de las posibles espe cies con m ayor afinidad.

FIGURA 15.2 Secuencias del banco de genes (genebank, NCBI) y cepa en estudio. Tras la obten ción de secuencias similares a las secuencias en estudio por medio de la NCBI, se procede a limpiar las secuencias por medio de los programas BioEdit (arriba) y CHROMAS Lite (abajo), el primero se emplea para comparar la semejanza entre las bases de la secuencia de la muestra con las secuen cia extraídas de la NCBI y el segundo para corroborar esta información con el cromatograma, ya que en este se pueden observar los posibles errores de secuenciamiento.

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FIGURA 15.3 Aplicación de ClustalW para la alineación de secuencias. La aplicación ClustalW permite alinear todas las secuencias en el archivo, permitiendo así la comparación entre estas.

FIGURA 15.4 Secuencias alineadas para la corrección de posibles errores. El programa CHRO- MAS, es determinante al momento de realizar las correcciones necesarias, ya que el cromatograma permite determinar si la diferencia en una base es real o si existe un error en la lectura de este.

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D O R IS ELIZ A B E TH Z Ú Ñ IG A D Á V ILA

16. ELABORACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS

1. Se obtienen los datos de las secuencias del gen ribosom al 16s de distintas ce pas patrón del género en estudio.

2. Las secuencias obtenidas son alineadas con las secuencias limpias de las muestras. La aplicación ClustalW Múltiple Alignm ent del program a BioEdit (Figura 16.1) es un sistema empleado para alinear secuencias hom ologas de nucleótidos. Para la alineación de múltiples secuencias, ClustalW utiliza m é todos de alineación progresiva, donde las secuencias m ás parecidas se alinean primero y luego los grupos de secuencias cada vez m ás distantes hasta obtener una alineación global.

3. Alineadas las secuencias, se cortan los extremos para que todas las secuencias tengan la m isma longitud.

4. Posteriorm ente se emplea el program a M E G A versión 4, en la opción “Phylo- geny” se selecciona el m étodo estadístico “N E IG H B O R JO IN IN G ”, el cual es empleado en estudios de evolución basados en técnicas moleculares. Este tiene la capacidad de m anejar u n amplio conjunto de datos, por lo que es uno de los pocos métodos que permite la rápida inclusión de todas las secuencias homologas en un solo árbol. E n resumen este m étodo utiliza una m atriz de distancias, la cual va agrupando en parejas según la divergencia promedio hasta llegar a una base.

5. Para evaluar la fidelidad del árbol filogenético construido, se emplea el test de filogenias inferidas “bootstrap” , el cual crea u n núm ero arbitrario de posi bles dendogramas por m edio de cambios puntuales en diferentes bases de las secuencias y elige uno de consenso, así, en cada divergencia se m uestra un porcentaje el cual representa el núm ero de ramas que se h an repetido del total de árboles creados.

FIGURA 16.1 Alineación de cepas de referencia y cepas en estudio para la creación del dendogra- ma. Se empleó nuevamente el programa BioEdit para la alineación de todas las secuencias en estu dio corregidas y las secuencias de cepas tipo o de referencia para la construcción del dendograma.

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IV. PRODUCCIÓN Y CONTROL DE CALIDAD

DE BIOFERTILIZANTES

17. P ro d u c c ió n de b io fertilizan te s 18. C o n tro l de c a lid a d del b io fe rtiliz a n te

19. E n u m e ra c ió n de b a c te ria s sim b ió ticas fijad o ra s de n itró g e n o p o r n ú m e ro m á s p ro b a b le