Helicobacter pylori - prevalencia, caracterización del gen cagA y determinación de resistencia al antibiótico claritromicina en niños y adolescentes con enfermedad gastroduodenal

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(1)Helicobacter pylori: Prevalencia, caracterización del gen cagA y determinación de resistencia al antibiótico claritromicina en niños y adolescentes con enfermedad gastroduodenal. Yuliet Liliana Rosero Lasso1, María de Pilar Delgado1, José Fernando Vera Chamorro2, Daniella García1, Andrea Ramírez2, Paula Rodríguez 2 Johana Álvarez 2, Carlos Jaramillo1. 1. Laboratorio de Diagnóstico Molecular y Bioinformática. Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia 2 Fundación Santa Fe de Bogotá, Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. RESUMEN. Helicobater pylori es un bacteria tipo bacilo, Gram negativa, microaerófila, espiralada que tiene la capacidad de colonizar la superficie de la mucosa gástrica humana pudiendo desempeñar un papel relevante en la génesis de enfermedades gastroduodenales. Entre sus factores de virulencia más importantes se encuentra la el gen cagA el cual codifica para la citotoxina CagA; ésta proteína posee sitios polimórficos de fosforilación de tirosina en la región carboxi-terminal conocidos como motivos EPIYA cuya presencia, tipo y número de repeticiones parece aumentar el riesgo de desarrollar patologías gástricas. En la actualidad, el tratamiento de la infección incluye el uso del antibiótico claritromicina, sin embargo las tasas de eficiencia de éste han disminuido por la presencia de mutaciones en el gen ribosomal 23S de la bacteria las cuales pueden conferir resistencia a éste antibiótico. Es conocido a nivel mundial que ésta bacteria puede presentarse en etapas tempranas de la vida, por lo cual el objetivo de éste estudio fue determinar la prevalencia de la infección por Helicobacter pylori en pacientes menores de 18 años con enfermedades gastroduodenales; su posible asociación con factores demográficos, antecedentes familiares, sintomatología, hallazgos endoscópicos e histopatológicos como también realizar la caracterización del gen cagA y la detección de mutaciones asociadas a resistencia a claritromicina usando técnicas moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa y secuenciación. Los resultados mostraron una prevalencia de la infección, de cepas cagA positivas y de resistencia a la claritromicina del 44,44%, 16% y 7% respectivamente y una asociación significativa entre la presencia de la infección y antecedentes de la madre, como también en la patología presentada y la severidad de la misma. En cuanto a los motivos EPIYA y mutaciones en el ARNr 23S fueron encontrados motivos tipo ABC, ABCC y ABCCC, y mutaciones A2142G y A2143G respectivamente. En conclusión mediante el presente estudio se logró establecer la. 1.

(2) situación de la infección por Helicobacter pylori por medio de técnicas moleculares en una población pediátrica con lo cual se espera contribuir a la realización de un diagnóstico y esquemas terapéuticos adecuados y eficientes como también a la prevención primaria de ésta infección. Palabras clave: Helicobacter pylori, gen cagA, motivo EPIYA, ARNr 23S, claritromicina. INTRODUCCIÓN Helicobater pylori es un bacteria tipo bacilo, Gram negativa, microaerófila, espiralada que tiene la capacidad de colonizar la superficie de la mucosa gástrica humana1-2. Se ha reportado que se encuentra mundialmente distribuida en más del 50% de la población adquiriéndose en la niñez por vía fecal-oral o gastro-oral 3, su prevalencia puede variar significativamente dentro y entre los países, encontrándose tasas de hasta 30% en países desarrollados y de hasta 90% en países en vía de desarrollo4. Aunque la mayoría de pacientes que presentan la infección de manera crónica permanecen asintomáticos5 en otros la infección por ésta bacteria puede desempeñar un papel importante en la génesis de diversas enfermedades gastroduodenales pues 1 de cada 10 humanos infectados puede llegar a sufrir dispepsia, ulcera o gastritis duodenal, 1 de cada 100 desarrolla adenocarcinoma gástrico y ≤ 1 de cada 1000 podría desarrollar linfoma tipo MALT6-7. Entre los factores de virulencia más importantes de Helicobacter pylori se encuentra la citotoxina codificada por el gen cagA 8, una proteína de 120 a 145 KDa, que posee sitios polimórficos de fosforilación de tirosina correspondientes a una secuencia de 5 amino ácidos (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala) en la región carboxi-terminal, que se conocen como motivos EPIYA; según los aminoácidos que siguen al motivo EPIYA se consideran 4 tipos:A, B, C y D9-10. Se ha encontrado que la presencia, el tipo y el número de repeticiones de los motivos EPIYA en cepas H. pylori cagA positivas, parece aumentar el riesgo de desarrollar patologías gástricas11 ya que se pueden generar variaciones en los niveles de fosforilación de la citotoxina; proceso que se encuentra relacionado con la desregulación de la actividad enzimática del segundo dominio homólogo a Src de proteína tirosina fosfatasa (SHP2) la cual está involucrada en transducción de señales mitogénicas, en la regulación de la migración y adhesión de las células gástricas12.. 2.

(3) En la actualidad, existen diversas estrategias de erradicación de la infección por Helicobacter pylori, sin embargo la terapia triple es la más utilizada; en ésta se incluye el uso de un inhibidor de la bomba de protones en combinación con una terapia antibiótica con metronidazol, claritromicina y/o amoxicilina7 sin embargo en las últimas décadas su eficacia ha venido disminuyendo de manera notoria logrando un máximo de curación de sólo el 70% de los pacientes tratados debido a la presencia de cepas resistentes, principalmente a la claritromicina13; en particular, para éste caso la resistencia está relacionada con la disminución de la afinidad de la unión del macrólido a su blanco de acción debido a mutaciones puntuales en el ARNr 23S. 14-15. que se encuentran A2115C, G2141A, A2143C, A2143T, A2143G, A2144G. entre las. 16-19. , siendo. las mutaciones A2143G y A2142G las encontradas más frecuentemente20-21. En Colombia la prevalencia de la infección es una de las más altas del mundo22, encontrándose hasta el año 2003 un promedio de infección del 69% en población adulta23, en los años subsecuentes se han reportado tasas de prevalencia de 98% en pacientes con gastritis crónica folicular24, para el caso de población pediátrica se ha reportado tasas de prevalencia en promedio de 57%25-27. En cuanto a la prevalencia de cepas cagA positivas y de resistencia a claritromicina se han encontrado prevalencias de 43%28 y del 20%29 respectivamente en población adulta. Finalmente es importante mencionar que existen pocos estudios en Colombia que se enfoquen en el estudio de la infección por H. pylori en población pediátrica, y entre los que lo hacen son muy pocos los que utilizan métodos de tipo molecular.. Teniendo en cuenta lo anterior, este estudio se realizó con el fin de i) determinar la prevalencia de la infección por Helicobacter pylori, ii) determinar la prevalencia de cepas cagA positivas y realizar su caracterización iii) y detectar mutaciones asociadas a resistencia al antibiótico claritromicina en pacientes pediátricos con enfermedades gastroduodenales que acudieran al servicio de endoscopia de la Fundación Santa fe de Bogotá mediante el uso de métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación. MATERIALES Y MÉTODOS. Población de estudio: Pacientes menores de 18 años con síntomas digestivos e indicación de esofagogastroduodenoscopia que acudieron al servicio de endoscopia de la Fundación Santa Fe de Bogotá (Bogotá-Colombia) entre los meses de Diciembre de 2011 a Julio de 2012, fueron incluidos en el estudio. Pacientes que hubieran. 3.

(4) ingerido antiácidos 12 horas antes, inhibidores de la bomba de protones y/o antihistamínicos anti-H2 15 días antes y/o usado antibióticos durante el mes anterior de la realización de la endoscopia fueron excluidos del estudio. Datos demográficos y clínicos: Mediante entrevista con el paciente, padre y/o acudiente datos demográficos y socio-económicos, antecedentes familiares de gastritis, de infección por Helicobacter pylori y cáncer gástrico fueron tomados. Adicionalmente se tomaron datos clínicos como sintomatología e ingestión de medicamentos durante las 4 semanas previas a la toma de la endoscopia.. Consideraciones éticas Los padres y/o acudientes de los pacientes incluidos en el estudio firmaron voluntariamente un consentimiento informado, y los pacientes con una edad mayor o igual a 6 años firmaron voluntariamente un asentimiento informado para su participación en el estudio. El protocolo de investigación fue aprobado por los Comités de Ética de las instituciones participantes: Universidad de los Andes y Fundación Santa Fe de Bogotá.. Muestras:. Por. medio. del. procedimiento. endoscópico. realizado. por. un. gastroenterólogo pediatra experto, de cada paciente se obtuvieron 3 biopsias de rutina; dos de éstas fueron utilizadas para la evaluación histopatológica, la muestra restante fue utilizada para realizar el test de ureasa rápida (RUT); ésta en lugar de desecharla como normalmente se realiza en el servicio, se almacenó en etanol al 70% en refrigeración (2-8°C), para su posterior uso en el diagnóstico molecular. Diagnóstico clínico: Los hallazgos endoscópicos en el estómago, en el esófago y el duodeno fueron clasificados como: enfermedad erosiva gastroduodenal (erosiones y/o úlceras); gastritis crónica (nodular y/o eritematosa) y normales. Para la evaluación histopatológica las biopsias fueron fijadas en formol, procesadas en parafina y coloreadas mediante coloración hematoxilina y eosina; se determinó el tipo de patología que presentaba el paciente, y la presencia de H. pylori por visualización de bacterias con morfología típica y su densidad fue clasificada como leve, moderada o severa. Los anteriores procesos fueron realizados por 2 patólogas expertas en el tema. Adicionalmente se realizó la prueba de ureasa rápida Sensibacterpylori-Test®, siguiendo las indicaciones del fabricante. Muestras cuyo test virara a rojo magenta entre los 5 a 15 minutos luego de agregada la biopsia fueron consideradas positivas para H. pylori; muestras que no mostraban un viraje en ese periodo de tiempo fueron consideradas negativas para la presencia de la bacteria.. 4.

(5) Diagnóstico molecular: Para la extracción de ADN se realizó una digestión de la biopsia gástrica usando una solución tampón de lisis que contenía un detergente aniónico y proteinasa K (Fermentas 18mg/ml) durante 18hs en baño maría a 65°C. Posterior a esto se realizó la extracción de ADN total usando el kit comercial “QuickgDNA Miniprep” (ZymoResearch), siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ADN se resuspendió en una solución estabilizadora y fue almacenado a -20°C para su posterior análisis.. Para la realización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se usó como control positivo ADN extraído a partir de la cepa de referencia Helicobacter pylori NCTC 11637 en las reacciones para la amplificación de un fragmento del ARNr 23S y del gen cagA de H. pylori, para el caso de la amplificación del gen β-globina humana se usó como control positivo ADN humano. En los tres casos se usó agua ultrapura en lugar de ADN como blanco de la reacción. La determinación de la presencia de H.pylori se realizó mediante la amplificación de un fragmento de 267 pb del ARNr 23S utilizando los iniciadores HPYS y HPYA (Tabla 1) siguiendo el protocolo descrito previamente por Ménard et al., 200230 y modificado por Álvarez et al., 200931 (Tabla Suplementaria 1). Para determinar el estatus de cagA en las muestras positivas para H. pylori, se utilizaron los iniciadores CAGTF y CAGTR (Tabla 1) siguiendo el protocolo descrito previamente por Yamaoka et al.et. Al, 199932 y modificado por García et al., 2009 amplificaba un. 33. (Tabla Suplementaria 1) con el cual se. fragmento de la región 3 del gen cagA entre 343 a 811 pb34,. dependiendo de la combinación de motivos EPIYA que presentara la cepa.. Las muestras que resultaron negativas para la detección del microorganismo, fueron sometidas a una amplificación de un fragmento del gen de la β-globina humana de 110pb utilizando los iniciadores PCO3 y PCO4. (Tabla 1) siguiendo el protocolo. descrito previamente por Saiki et al., 198535 y modificado por Molina, et al., 200828, (Tabla Suplementaria 1) con el fin de descartar fallas en la extracción de ADN como también posibles falsos negativos por presencia de inhibidores de la PCR.. Todos los productos de amplificación de las diferentes pruebas fueron visualizados por medio de electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. (p/v) teñido con GelRed. (BIOTUM®) con solución tampón TAE al 0,5X a 100 voltios durante 60 min. Posterior a la electroforesis los geles fueron visualizados en el equipo de documentación de geles. 5.

(6) GelDoc XR System (Bio-Rad) y las imágenes fueron procesadas con el programa QuantityOne® 1-D Analysis Software (Bio-Rad). Secuenciación y análisis bioinformáticos: Tanto los productos positivos para la amplificación del fragmento del ARNr 23S como para la región 3’ del gen cagA evaluada fueron enviados a Macrogen Inc (Seoul, Corea) para su purificación y posterior secuenciación. Los cromatogramas de las secuencias obtenidas para ambos casos fueron analizados, depurados y editados usando el programa CLC DNA Workbench versión 5 (CLC Bio) y se realizó un alineamiento básico local (BLAST) contra la base de datos del GenBank con el fin de confirmar su identidad. Se realizó la búsqueda, cuantificación y clasificación de las unidades de repetición que contienen las secuencias EPIYA tomando como base la traducción de las secuencias obtenidas en los 6 marcos de lectura, mediante el uso del programa Amino Acid Sequence Analyzer (AASA) diseñado por estudiantes de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de los Andes, en el año 200836. Todas las secuencias obtenidas en la amplificación del fragmento del ADNr 23S fueron comparadas con la secuencia de una cepa de Helicobacter pylori susceptible a la claritromicina. (Número de acceso GenBank U27270) con el fin de determinar la presencia de mutaciones en el ADNr 23S asociadas a resistencia a claritromicina. En caso de encontrar una mutación en la secuencia ésta cepa fue considerada como resistente a la claritromicina y su posición en el genoma fue determinada mediante el sistema propuesto por Taylor et al., 199737 (Posición en secuencia -373+1= Posición de Mutación en el genoma) Análisis estadísticos Se calcularon valores de sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo e índice de Kappa utilizando el programa Epidat 4.0 considerándose como prueba de referencia la coexistencia de dos o más resultados positivos entre las tres pruebas realizadas38-39; adicionalmente intervalos de confianza calculados. Para establecer la fuerza de concordancia se. del 95% fueron. utilizaron los criterios. propuestos por Landis y Koch, 1977 40 Se realizaron análisis de tipo univariado y multivariado cuando fuera pertinente utilizando el programa IBM SPSS Statistics versión 19 con el fin de evaluar la posible asociación de la presencia de H. pylori, del gen cagA o mutaciones del ARNr 23S con la otras variables evaluadas. Brevemente, para las asociaciones con variables demográficas se realizó una regresión logística binaria; para las variables de naturaleza cualitativa fueron se calcularon proporciones y valores de X2. Para todos. 6.

(7) los casos los valores p fueron de dos colas y se consideró un valor p 0,05 como estadísticamente significativo. RESULTADOS. Población de estudio: En total fueron reclutados 134 pacientes de los cuales 8 fueron excluidos por no contar con las biopsias para la realización de las pruebas, por tanto en la población de estudio se incluyeron 126 pacientes, presentando un rango de edad de 3 a 17 años, con media de 11.15 años ± 3.28 SD. Los datos demográficos como género, procedencia y estrato, se muestran en la tabla 2. Diagnóstico clínico: Se encontró que 123 (97,6%), 15 (12%) y 36 (28,5%) pacientes presentaron hallazgos endoscópicos anormales a nivel del estómago, duodeno y esófago respectivamente. En la tabla 3 se muestran de manera detallada los datos para cada caso. Mediante evaluación histopatológica se encontró que 46 (36,5%) muestras de pacientes mostraron presencia de la bacteria (Tabla 5), de los cuales 20 (43,47%) presentaban presencia leve, para presencia moderada como para presencia severa 13 (28,26%) casos fueron encontrados. En la tabla 4 se muestran los resultados de los hallazgos histopatológicos, en cuanto a tipo de patología y severidad de la misma. En la prueba de ureasa rápida 48 (38,1%) muestras de pacientes mostraron cambio de color de amarillo a rojo magenta por lo cual fueron considerados como resultados positivos, las 78 (61,9%) restantes no presentaron viraje considerándose como resultados negativos para la presencia de la bacteria (Tabla 5).. Diagnóstico molecular: 56 (44,44%) muestras de pacientes mostraron bandas de amplificación esperadas considerándose como resultados positivos para la presencia de la bacteria (Tabla 5), los 70 (55,6%) pacientes restantes que resultaron negativos, mostraron amplificación de la β-globina humana descartándose la posibilidad de fallas en la extracción de ADN o que se trataran de falsos negativos. De éstas muestras positivas para la presencia de la bacteria, 9 (16,1%) fueron positivas para la presencia del gen cagA, de las cuales, 4 (4,4%) mostraron un motivo EPIYA de tipo ABC, 1(11,11%) de tipo ABCC y 4(44,4%) de tipo ABCCC. De las 56 muestras de pacientes positivas para la presencia de la bacteria, 49 (87,5%) mostraron genotipo de tipo silvestre (Figura 1), de los 9 restantes, 4. (7,1%) mostraron. mutaciones en la. secuencia del ADNr 23S, de los cuales 2 (3,6%) presentaban la mutación A2142G (Figura 2) y 2 (3,6%) la mutación A2143G (Figura 3), los 3 restantes presentaron. 7.

(8) ambigüedades (Figura 4) en la secuencia por lo tanto la presencia o ausencia de mutaciones no pudo ser determinada. Evaluación de las pruebas realizadas: Los valores de sensibilidad especificidad, y valor predictivo positivo más altos fueron para la PCR, seguida por la prueba rápida de ureasa y la histopatología. Para el caso de los valores predictivos negativos e índice de Kappa los valores más altos fueron para la prueba rápida de ureasa seguida por la histopatología y la PCR. (Tabla 6). En cuanto a la fuerza de concordancia dada por el índice de Kappa para todas las pruebas se encontró una concordancia de tipo considerable.. Asociación de la presencia de H.pylori con otras variables: Se encontró una asociación entre la presencia de la infección por Helicobacter pylori con antecedentes de gastritis (p=0.0036) e infección por H.pylori de la madre encontrándose mayor proporción de resultados positivos para presencia de la bacteria cuando la madre tiene historial de gastritis e infección por H. pylori (Tabla 7). Entre los síntomas evaluados, se encontró una asociación con la presencia de disfagia (p=0.013) encontrándose una mayor proporción de resultados positivos para la presencia de la bacteria cuando hay presencia de disfagia (Tabla 7). Datos demográficos, ingestión de medicamentos, demás antecedentes familiares y síntomas no mostraron ninguna asociación (p>0.05). En cuanto a los hallazgos endoscópicos se encontró una relación entre la presencia de la bacteria y gastritis crónica de tipo nodular en el estómago (p=0.002), como también con la presencia de erosión en el duodeno (p=0.024) encontrándose mayor proporción de resultados positivos para presencia de la bacteria en presencia de los hallazgos mencionados (Tabla 7). Respecto a los hallazgos histopatológicos se encontró relación entre la presencia de la bacteria y el tipo de patología presentada, como también para la severidad de la misma (p=0,000 para ambos casos); para el primer caso, la mayor proporción de positivos se encontró en la gastritis crónica folicular difusa, para el segundo caso la mayor proporción se encontró en la severidad de tipo moderada y severa (Figura 5 y 6). DISCUSIÓN. En la actualidad diversas técnicas para el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori en niños son utilizadas, éstas pueden ser de tipo invasivo cuando requieren la toma de una biopsia por medio de un procedimiento endoscópico o de tipo no invasivo cuando ésta no es requerida41-42. Entre las pruebas de tipo invasivo se incluyen la. 8.

(9) detección histológica que ha demostrado tener valores de sensibilidad entre 66 a 100% y especificidad entre 94 a 100%, la prueba de ureasa con valores de sensibilidad entre 75 a 100% y especificidad de 84 a 100%, y el cultivo con valores de sensibilidad entre 55 a 96% y de especificidad de 100%, en cuanto a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se han reportado valores de sensibilidad entre 96 a 100% y valores de especificidad entre 94 a 100%43, en concordancia con lo anterior en éste estudio los mejores valores de sensibilidad y especificidad fueron para la PCR. Es importante mencionar que teniendo en cuenta la distribución irregular de Helicobacter pylori en la mucosa gástrica44, pueden existan discrepancias en la presencia de la bacteria en la biopsia usada para la detección histológica y la usada para la detección molecular; y para el caso de la prueba rápida de ureasa no puede descartarse la posibilidad de falsos negativos debido a la posibilidad de una baja densidad de la bacteria45 en la biopsia utilizada, lo cual puede afectar el cálculo de los parámetros mencionados anteriormente.. Teniendo en cuenta lo anterior en conjunto con la concordancia encontrada con la prueba de referencia utilizada en éste estudio se demuestra que el acercamiento molecular es útil para la. detección de H. pylori a partir de biopsias de niños y. adolescentes que presenten enfermedades de tipo gastroduodenal. Además de esto se demostró la viabilidad del uso de la misma muestra utilizada en la realización de prueba rápida de la ureasa que usualmente se descarta para la realización de la PCR, disminuyendo los riesgos asociados a la toma de una biopsia adicional mediante el procedimiento endoscópico. Finalmente cabe mencionar que la mayoría de estudios en los cuales se realiza un diagnóstico de la infección haciendo uso de técnicas moleculares como la PCR se han enfocado principalmente en los genes ARNr 16S, ureasa A, SSA y gIMm. 46. en los últimos años unos pocos estudios -cómo el presente-. han usado como blanco de amplificación del ARNr 23S demostrando que éste gen también puede ser usado para el diagnóstico de la infección, presentado una ventaja adicional como es la posibilidad de determinar la presencia de mutaciones que le confieren a la bacteria resistencia al antibiótico claritromicina, comúnmente usado para el tratamiento de la infección47-49.. La determinación de la presencia de infección por Helicobacter pylori en las primeras etapas de la vida y su relación con el desarrollo de enfermedades gastroduodenales ha sido de gran interés en los últimos años42. Varios estudios alrededor del mundo han revelado que ésta 41. infección puede presentarse en niños desde edades muy. tempranas ,para el caso del continente Americano se. han encontrado tasas de. 9.

(10) prevalencia de 24,3% en Argentina. 50. , 61% en Ecuador51, de 54 a 65% en Brazil52,. 47,7% en Cuba y las tasas más altas se han encontrado en Bolivia y Venezuela con 74,0 y 77,8% respectivamente53. Para el caso colombiano son pocos los estudios enfocados en la detección de ésta infección en pacientes pediátricos y entre los que lo hacen, la mayoría utilizan métodos diagnósticos de tipo no molecular, entre estos se encuentran un estudio realizado en el 2006 en Cali-Valle del Cauca en el que se usó como método diagnóstico prueba del aliento con urea (UBT) encontrándose una prevalencia de 30,3%54 mientras que un estudio realizado en el 2010 usando como método diagnóstico la histopatología se encontró una prevalencia de 58% en biopsias gástricas de niños de 1 a 16 años que acudieron al Hospital Infantil de San José26. Para el caso del uso de métodos diagnósticos de tipo molecular un estudio realizado en el 2012 por Sicinschi et al.,27 en el que se usa una PCR convencional para la amplificación de un fragmento del ARNr 16S de H. pylori se encontró una prevalencia de infección en niños de Nariño entre 4,1 a 8,7 años de edad de 78,1%, porcentaje mucho mayor al 44,44% encontrado en el presente estudio, la gran diferencia entre éstos dos porcentajes puede explicarse teniendo en cuentas las discrepancias socioeconómicas de la población evaluada en ambos estudios; mientras que en el estudio mencionado se estaban evaluado pacientes de regiones rurales (estratos socio-económicos bajos) en el presente estudio casi que el total de la población pertenecía a estratos socio-económicos de medio a alto, pues se sabe que estratos socio-económicos bajos tiene mayor riesgo de padecer la infección por diferencias en las condiciones de higiene, salubridad, acceso a agua potable y dieta55.. En concordancia con otros estudios no se encontró una asociación entre la presencia de la infección con las variables sexo y edad en la población estudiada56;sin embargo a diferencia de otros estudios no se encontró asociación entre el estrato o la procedencia; ésta falta de asociación podría explicarse debido a que la población tenían un sesgo moderado hacia estratos socio-económicos de medio a alto, y un sesgo grande hacia pacientes de la región Andina. En cuanto a los antecedentes familiares, varios estudios han sugerido que la transmisión persona a persona de la infección por Helicobacter pylori sobretodo de manera intrafamiliar es muy probable, esto basándose en la evidencia de una mayor prevalencia de la infección entre pacientes con familiares infectados, en especial los padres. 57-58. . En éste estudio se. encontró una asociación entre los antecedentes de infección y gastritis en la madre con la presencia de infección en el paciente, lo cual concuerda con estudios que sugieren el importante rol que pueden jugar las madres infectadas en la transmisión de la bacteria a sus hijos, por medio de secreciones bucales contaminadas con H. pylori. 10.

(11) lo cual puede suceder por hábitos culturales como el uso común de cucharas, probar o masticar la comida de los niños antes de alimentarlos57. En cuanto a la sintomatología se encontró una asociación con la presencia de la infección y la disfagia que junto con la anemia, odinofagia, pérdida de peso y vómito recurrente, entre otros, han sido considerados como características de alarma que los médicos tienen en cuenta para solicitar la realización de exámenes para determinar la presencia o ausencia de la infección, sin embargo en el presente estudio para los dos últimos casos no se encontró asociación. Para el caso de los hallazgos patológicos y endoscópicos se encontró una asociación significativa con la presencia de gastritis nodular lo que concuerda con lo encontrado en el 2007 por Koh et al.,59 quienes encontraron una mayor prevalencia de ésta patología en presencia de la bacteria; también se encontró una asociación significativa con la severidad de la patología presentada lo que concuerda con el hecho de que se ha encontrado que patologías más severas se encuentran relacionadas con la presencia de la infección.. En cuanto a la genotipificación usando como marcador de virulencia el gen cagA son pocos los estudios enfocados en la detección y caracterización de éste gen en cepas encontradas en población infantil, para el primer caso un estudio realizado en México en el 2000 encontró una prevalencia de 47%60 mientras que un estudio realizado en el 2010 en Estados unidos reveló que la prevalencia de éste gen en 176 niños de 2 a 17 años era de 45.9% 61, para el segundo caso otro estudio también realizado en Estados Unidos reveló que entre cepas cagA positivas encontradas 71% tenía motivo EPIYA tipo ABC, 4% tipo BC, 8% tipo BCC, 4% motivo ABCC, y 12% no pudo ser determinado62. En Colombia en el estudio de Sicinschi et al., 2012, anteriormente mencionado se encontró una prevalencia de cepas cagA positivas del. 84%; las. diferencias encontradas con el 16,1% del presente estudio nuevamente pueden explicarse teniendo en cuenta las diferencias de las poblaciones, como también la metodología usada en los estudio, específicamente los primers utilizados para la amplificación el fragmento del gen cagA a, ya que en el presente estudio se amplificó la región 3’ completa lo cual pudo afectar la sensibilidad del métodos, mientras que Sicinschi. et. al. amplificaron una región más pequeña. Debido a lo anterior se. recomendaría realizar una verificación de los resultados mediante una PCR que amplifique una región más pequeña o una PCR de tipo empty site para corroborar la ausencia de la isla de patogenicidad cag en las cepas cagA negativas.. Es importante mencionar que estudios que realicen la caracterización de los motivos EPIYA de éstas cepas encontradas en pacientes pediátricos no se han reportado en el. 11.

(12) país, de manera que el presente estudio se constituye como pionero en la realización de éste tipo de análisis en población pediátrica. Interesantemente entre las cepas cagA positivas encontradas en el presente estudio un alto porcentaje (55,55%) presentaron de 2 a 3 repeticiones del motivo EPIYA C; aunque su asociación con enfermedades más severas aun permanece controversial, en un estudio realizado en Colombia en el 2010 por Quiroga et al., en pacientes adultos se encontró que había mayor frecuencia de aislamientos con EPIYA C en pacientes con gastritis y úlcera duodenal, y que los aislamientos con tres repeticiones del mismo se encontraron con mayor frecuencia en cáncer gástrico asociándose un mayor riesgo de padecer ésta enfermedad en presencia de éstas cepas63, por lo cual, pese a que aún no se sabe con certeza en que etapa de la historia natural de la infección la erradicación de la bacteria puede evitar el desarrollo de cáncer gástrico, se recomendaría un seguimiento adecuado a éstos paciente para evitar llegar a un punto de no retorno en el cual con la erradicación de la infección ya no se pueda impedir el desarrollo de éste tipo de patologías4.. Pocos estudios han revelado las tasas de resistencia a Claritromicina en población infantil, entre éstos se encuentran uno realizado en el año 2009 en Tailandia en el que encontró una tasa de prevalencia de 29,9%64 mientras que otro estudio en España para el año 2010 se encontró una prevalencia de resistencia de 41,8%47.Para el caso de nuestro país se han reportado en adultos prevalencias en un rango de 2% a 20%. 65-. 68. ; pero hasta la fecha no se han reportado estudios en niños lo que hace que el. presente estudio sea el primero en reportar éste tipo de información. En cuanto a las mutaciones se encontró una prevalencia de la mutación de A2143G y A2142G de 50% cada una, lo cual concuerda con lo reportado a nivel mundial pues estas dos mutaciones son las más encontradas en aislamientos resistentes20-21. A pesar de la gran importancia que representa la determinación de la resistencia a antibióticos de una cepa en la formulación del esquema de tratamiento a utilizar, en el caso de Helicobacter pylori ésta determinación no se hace de rutina debido a que para tal propósito se usan métodos fenotípicos como la técnica de dilución en agar, método de microdilución en caldo, difusión en disco, y el E-test los cuales requieren realizar cultivo y aislamiento bacteriano, procedimientos que en particular para Helicobacter pylori son difíciles de llevar a cabo por lo que obtener un resultado puede requerir demasiado tiempo y esfuerzo69, por lo anterior métodos moleculares como los utilizados en el presente estudio son una opción viable para realizar ésta determinación esto evidenciado en el hecho de que se demostró que el uso del ARNr 23S como blanco de amplificación es útil para la detección de la bacteria y que,. 12.

(13) acoplado a la secuenciación permite también. la determinación de mutaciones. asociadas a resistencia a claritromicina, presentando la ventaja frente a los métodos fenotípicos de que para su aplicación no es necesario tener el microorganismo viable, y se pueden obtener resultados de manera rápida y confiable70, adicionalmente la secuenciación directa de los productos amplificados del ARNr 23S brinda resultados fáciles de obtener, rápidos y certeros.. Finalmente es importante mencionar que la posible asociación entre la presencia del gen cagA o mutaciones en el ARNr 23S que le confieren resistencia a claritromicina a Helicobacter pylori con factores como tipo y severidad de patología como también el haber recibido un tratamiento contra la infección durante un periodo anterior a las 4 semanas previas a inclusión en el estudio no pueden descartarse del todo debido a los pocos resultados positivos encontrados para ambos casos, limitando la realización de análisis estadísticos más robustos.. En conclusión el presente estudio permitió determinar la prevalencia de la infección por Helicobacter pylori, su asociación con antecedentes familiares especialmente de la madre, con la patología presentada y la severidad de la misma, como también la determinación de presencia de cepas cagA positivas, su caracterización y la detección de mutaciones asociadas a resistencia a claritromicina por medio de técnicas moleculares en pacientes pediátricos con enfermedades gastroduodenales aportando conocimiento sobre ésta infección en éste grupo poblacional en el país, con lo cual se espera contribuir a la realización de un diagnóstico y esquemas terapéuticos adecuados y eficientes como también a la prevención primaria de ésta infección. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a los pacientes, a sus padres y/o acudientes por la participación en el estudio. A la Universidad de los Andes y al Centro de Estudios e Investigación en Salud, CEIS de la Fundación Santa fe de Bogotá por la financiación del estudio. V Convocatoria de Investigación Conjunta año 2011.. 13.

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(21) TABLAS Tabla 1. Primers utilizados para la amplificación del un fragmento del ADNr 23S, del gen cagA de Helicobacter pylori y el gen β-globina humana. Gen. Primer. ARNr 23S. cagA β-Globina humana. bp. Referencia. HPYS. Secuencia (5’-- 3’) AGGTTAAGAGGATGCGTCAGTC. 267. 30. HPYA CAGTF. CGCATGATATTCCCATTAGCAGT ACCCTAGTCGGTAAT GGG. 400- 800. 32. 110. 35. CAGTR GCTTTAGCTTCTGAYACYGC PCO3 AGGTTAAGAGGATGCGTCAGTC PCO4. ACACAA ACTGTGTTCACT AGC. Tabla 2. Datos demográficos de género, procedencia, estrato de la población y porcentaje de resultados positivos para Helicobacter pylori según PCR en la población de estudio. Característica n(%) n (%) de H. pylori+ Total 126 (100%) 56 (44,44) Género Masculino 52 (41,3) 25 (48,07) Femenino 74 (58,8) 31 (41,89) Procedencia Región Andina 115 (91,3) 52 (45,21) Región Atlántica 3 (2,4) 0 (0) Región Pacífica 1 (0,8) 0 (0) Región Orinoquía 2 (1,6) 1(50) Región Amazónica 1 (1,6) 0 (0) Exterior 4 (3,2) 3 (75) Edad (Años) 3-7 22 (17,5) 8 (36,36) 8-12 48 (38,0) 27 (56,25) 13-17 55 (43,7) 21(38,18) Media 11.15 ± 3.28 SD Estrato Dos 3 (2,3) 2 (66,66) Tres 18 (14,2) 6 (33,33) Cuatro 41 (32,53) 21(51,21) Cinco 27 (21,42) 16(59,25) Seis 37 (29,36) 11(29,72). 21.

(22) Tabla 3. Hallazgos endoscópicos anormales en el estómago, duodeno y esófago y porcentaje de resultados positivos para Helicobacter pylori según PCR en la población de estudio. Región*. n (%). n (%) de H. pylori+. Estómago EE GC Duodeno EE GC. 123 (97,61) 49 (40) 89 (72,35) 15 (11,90) 7 (47) 8 (53) Esófago 36 (28,57) EE 27 (75) Otros 15 (41,6). 54 (43,90) 19 (38,77) 47 (52,80) 11 (73,33) 6 (85,71) 5 (47,2) 17 (30,35) 14 (51,85) 4 (26,6). *Los hallazgos endoscópicos en cada región no son mutuamente excluyentes.EE: Enfermedad erosiva (erosiones y/o úlceras); GC: Gastritis crónica (Nodular y/eritematosa).. Tabla 4. Hallazgos histopatológicos. de patología, severidad y porcentaje de. resultados positivos para Helicobacter pylori según PCR en la población de estudio. Patología GC superficial Leve Moderada Severa. n (%). 55(43,65) 52 (92,8) 3 (5,3) 1 (1,7) GC difusa folicular 51 (40,47) Leve 15 (29,41) Moderada 23 (45,5) Severa 13 (25,4) Gastropatía reactiva 12 (9,52) Leve 12 (100) Moderada 0 (0) Severa 0 (0). n (%) de H. pylori+ 16(29,09) 14 (26,92) 1 (33,33) 1 (100) 36 (70,58) 7 (46,46) 19 (82,60) 10 (76,92) 2(1,6) 2 (1,6) 0 (0) 0 (0). GC: Gastritis crónica Tabla 5. Resultados de prueba rápida de la ureasa, histopatología y PCR para la detección de Helicobacter pylori en la población de estudio. Resultado Positivo (%) Negativo (%) Ureasa 48 (38,1) 78(61,9) Histopatología 46(36,5) 80(63,5) PCR 56(44.4) 70(55,6) Prueba. 22.

(23) Tabla 6. Valores de sensibilidad, especificidad, valores predictivos y concordancia de la prueba de Ureasa, Histopatología y PCR para la detección de Helicobacter pylori. Ureasa Histopatología PCR Sensibilidad (%) [ IC] 86,9[76,14-97,78] 82,61 [70,57-94,65] 91,3 [82,07-100] Especificidad (%) [ IC] 90[82,8-97,2] 90 [82,8-97,2] 82,5[73,55-91,45] VPP (%) [ IC] 83,3[71,75-94,92] 82,61 [70,57-94,65] 75 [62,77-87,23] VPN (%) [ IC] 92,31[85,75-98,86] 90 [82,8-97,2] 94,29[88,13-100] Indice Kappa (%) [ IC] 0,762 [0,645-0,879] 0,726 [0,601-0,851] 0,705 [0,581-0,829] IC: Intervalo de Confianza del 95%; VPP: Valor Predictivo Positivo; VPN: Valor Predictivo Negativo. Tabla 7. Asociaciones entre los resultados de la PCR y antecedentes familiares y características clínicas de la población en estudio.. Característica Antecedentes de gastritis de la madre Positivo Negativo Antecedentes de H. pylori de la madre Positivo Negativo Presencia de disfagia Positivo Negativo Hallazgos Endoscópicos Gastritis crónica nodular del estómago Positivo Negativo Erosión en el Duodeno Positivo Negativo. Resultado PCR Positivo Negativo. p* 0,036. 21 27. 29 49. 23 14. 33 56. 10 46. 3 67. 0,010. 0,013. 0,002 22 34. 10 59 0,024. 6 1 50 69 *Valores de p<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. 23.

(24) FIGURAS.. A B C. D. Figura 1. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la región del 23S ADNr amplificada de A. la cepa referencia de Helicobacter pylori susceptible a la Claritromicina HPU27270 vs B. Muestra de genotipo de tipo silvestre C. Secuencia Forward. D. Secuencia Reverse. A B. C. D. Figura 2. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la región del 23S ADNr amplificada de A. la cepa referencia de Helicobacter pylori susceptible a la Claritromicina HPU27270 vs B. Muestra de con mutación A2142G C. Secuencia Forward. D. Secuencia Reverse. La posición del cambio del nucleótido fue hallado siguiendo el sistema propuesto por Taylor et. al, 1997 (posición 2460-373+1= posición 2089). Las líneas rojas verticales indican el punto de la mutación.. 24.

(25) A B. C. D. Figura 3. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la región del 23S ADNr amplificada de A. la cepa referencia de Helicobacter pylori susceptible a la Claritromicina. HPU27270 vs B. Muestra con mutación A2143G. C. Secuencia. Forward. D. Secuencia Reverse. La posición del cambio del nucleótido fue hallado siguiendo el sistema propuesto por Taylor et. al, 1997 (posición 2460-373+1= posición 2089). Las líneas rojas verticales indican el punto de la mutación.. A B. C. D. Figura 4. Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de la región del 23S ADNr amplificada de A. la cepa referencia de Helicobacter pylori susceptible a la Claritromicina HPU27270 vs B. Muestra con secuencias ambiguas C. Secuencia Forward. D. Secuencia Reverse.. 25.

(26) Figura 5. Distribución de resultados de la PCR entre las patologías presentadas por los pacientes de la población en estudio. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p=0.000), encontrándose mayor proporción de resultados positivos en la gastritis crónica difusa folicular*.. Figura 6. Distribución de resultados de la PCR entre las severidad de las patologías presentadas por los pacientes de la población en estudio. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p=0.000),encontrándose mayor proporción de resultados positivos en la severidad de tipo moderada y severa*.. 26.

(27) MATERIAL SUPLEMENTARIO Tabla Sumplementaria 1. Mezcla de Reacción y Perfil térmico para la amplificación del un fragmento del ADNr 23S, del gen cagA de Helicobacter pylori y el gen βglobina humana . Gen ARNr 23S. cagA. Mezcla de Reacción*. Perfil Térmico Ciclos Temperatura Tiempo 1X 94°C 5min.. 50 mM de KCl. 20 mM de Tris HCl pH 8.4. 1,5 mM de MgCl2. 35X 200 μM de dNTPs. 10 pmoles/µL de cada primer. 1.25 U de Taq polimerasa. 1x 2 µL de ADN.. 95°C 60°C 72°C 72°C. 45s 30s 1min 10min. 50 mM de KCl. 20 mM de Tris HCl pH 8.4. 2,5 mM de MgCl2. 200 μM de dNTPs. 1 pmol/µL de cada primer. 1,25 U de Taq polimerasa. 5 µLde ADN.. 1X. 94°C. 5min.. 35X. 94°C. 1min. 62°C. 1min. 72°C. 1min. 1x. 72°C. 10min. β-globina humana 50 mM de KCl. 20 mM de Tris HCl pH 8.4. 2,5 mM de MgCl2. 200 μM de dNTPs. 1 pmol/µL de cada primer. 1,25 U de Taq polimerasa. 3µLde ADN. .. 1X. 94°C. 5min.. 35X. 94°C. 1min. 57,5°C. 1min. 72°C. 1min. 72°C. 10min. 1x. *Para todos los casos la reacción se ajustó a un volumen inicial de 25μL.. 27.

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