INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada
La diversificación de genoma de Helicobacter pylori 26695
Tesis
Que para obtener el grado de：
Doctor en Ciencias en Tecnología Avanzada
Presenta YAJUAN FU
Directores de Tesis
Dr. Xianwu Guo
Dr. Mario Alberto Rodríguez Pérez
Altamira, Tamaulipas, México, Septiembre de 2013
AGRADECIMIENTOS
Hubiera sido imposible completar mi proyecto doctoral y escritura de tesis sin la ayuda y apoyo de las siguientes personas.
Realmente aprecio a mi asesor el Dr. Xianwu Guo por apoyarme a resolver problemas, su paciencia, sus recomendaciones constructivas, las revisiones del inglés, y las palabras de aliento durante mis estudios. También quiero expresar mi gratitud a mi co-asesor el Dr. Mario Alberto Rodríguez Pérez por el apoyo durante mi trabajo y su asesoría.
Estoy muy agradecido con el CICATA-IPN y el CBG-IPN por proveer una excelente atmosfera de estudio. Agradezco también a los miembros de mi comité tutorial por la lectura y recomendaciones vertidas a mi tesis.
Durante el período de estudios de mi doctorado, he trabajado en el laboratorio de biomedicina molecular del CBG-IPN, Reynosa, con el apoyo de la beca de CONACYT.
No hubiera sido posible terminar mi trabajo de doctorado en México, sin los recursos del laboratorio así como su apoyo financiero. Así que quiero expresar mi agradecimiento sincero a los integrantes del laboratorio de biomedicina molecular y a la institución CONACYT.
Agradezco sinceramente a mis amigos y colegas del laboratorio Prof. Erick de
Cynthia, Wendy, Mary, Erika, Aldo, Carlos, Karen y Patty por el apoyo y darme algo de su tiempo.
Por último, realmente agradezco a mi familia y parientes, la familia de mi esposo.
Un agradecimiento muy especial a mis padres, mi hermano, mi cuñada y mi encantador, dulce y guapo sobrino. Sin su apoyo y aliento todo el tiempo cuando me sentía sóla y nostálgica, probablemente no hubiera podido terminar mi doctorado en el extranjero. Por otra parte, también expresar mi agradecimiento a mi marido Zhang Jian, cuyo amor, dedicación y conocimiento me proporcionó una fuerte motivación espiritual, que me mantuvo mirando hacia el futuro, me ayudó a mantener mi confianza para seguir adelante en mi trabajo en México.
ÍNDICE
Pág
ABREVIATURAS ... iv
LISTA DE TABLAS ... vi
LISTA DE FIGURAS ... vii
RESUMEN ... ix
ABSTRACT ... xi
INTRODUCCIÓN ... 1
1.0 ANTECEDENTES ... 3
1.1 LA INFECCIÓN POR HELICOBACTER PYLORI ... 3
1.2 LA DISTRIBUCIÓN MUNDIAL DE H. PYLORI... 4
1.3 LOS FACTORES DE VIRULENCIA DE H. PYLORI ... 5
1.4 REORDENACIÓN GENÓMICA ... 7
1.4.1 Recombinación hom ... 7
1.4.2 Recombinación sitio específica. ... 12
1.4.3 Recombinación ilegítima ... 16
1.5 TRANSPOSICIÓN ... 20
1.5.1 Las características de SI200/605 familia en H. pylori ... 20
1.5.2 La subfamilia de elementos SI en H. pylori. ... 22
1.5.3 Especificidad la inserción de elementos ... 23
1.5.4 La transposición mecanismo ... 23
1.6 TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES ... 26
1.7 LA FORMACIÓN DE PSEUDOGENES ... 28
2.0 JUSTIFICACIÓN ... 32
3.0 HIPÓTESIS... 34
4.0 OBJETIVOS ... 35
4.1 OBJETIVO GENERAL ... 35
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 35
5.0 MATERIALES Y MÉTODOS ... 36
5.1 CULTIVO BACTERIANO ... 36
5.2 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO ... 36
5.3 ANÁLISIS COMPUTACIONAL ... 37
5.4 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS Y PRUEBA DE PCR ... 37
5.5 PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE PCR ... 40
5.6 SECUENCIACIÓN DEL ADN ... 40
5.7 ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN ... 41
5.8 DETECCIÓN DE EVENTOS DE RECOMBINACIÓN ENTRE REPETICIONES DIRECTAS ... 41
5.9 ESTIMACIÓN DE LA FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN RELATIVA ... 43
5.10 ANÁLISIS DE LAS SI605 EN EL GENOMA DE H. PYLORI MEDIANTE BÚSQUEDAS CON BLAST ... 44
5.11 ANÁLISIS DE SNPs DE LOS GENOMAS SECUENCIADOS H. PYLORI ... 44
6.0 RESULTADOS ... 48
6.1 LOCALIZACIÓN DE SECUENCIAS REPETITIVAS EN EL GENOMA ... 48
6.2 COMPROBACIÓN EXPERIMENTAL DEL FUNCIONAMIENTO DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS ... 53
6.3 DETECCIÓN DE LA DUPLICACIÓN Y DELECIÓN ENTRE REPETICIONES
DIRECTAS ... 55
6.4 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DE LAS ESTRUCTURAS DE DUPLICACIÓN Y ELIMINACIÓN ... 57
6.5 ESTIMACIÓN Y ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA FRECUENCIA RELATIVA DE RECOMBINACIÓN PARA LA DUPLICACIÓN O DELECIÓN ... 57
6.6 DISTRIBUCIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE LAS SI605 EN LAS CEPAS DE H. PYLORI ... 59
6.7 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS DE SNPs EN H. PYLORI 26695 ... 64
7.0 DISCUSIÓN ... 70
8.0 CONCLUSIONES ... 77
9.0 PERSPECTIVA ... 79
REFERENCIAS ... 80
GLOSARIO ... 91
ANEXO ... 97
ABREVIATURAS
A：Adenina
BIR：Romper la replicación inducida
Blast：Herramienta de búsqueda de alineamiento local básico C：Citosina
CagA：Proteína asociada a citotoxina DNA：Ácido desoxirribonucleico dNTP：Trifosfato de desoxinucleótido
DSBR：Reparación de roturas del ADN de doble cadena EBI：Instituto Europeo de Bioinformática
G：Guanina
HFIR：Recombinación ilegítima facilitada por homología HGMD：Base de datos de mutaciónes en genes humano HGT：Transferencia horizontal de genes
HPN：Homopolinucleótidos RH：Recombinación homóloga LE：Extremo izquierdo
NCBI：Centro Nacional de Información sobre Biotecnología NER：Reparación por escisión de nucleótidos
NHEJ：Unión de extremos no homólogos
OMIM：Herencia mendeliana en el hombre en línea ORF：Marco abierto de lectura
PAI：Isla de patogenicidad pb：Pares de bases
PCR：Reacción en cadena de la polimerasa PI：Palíndromo imperfecto
RE：Extremo derecho RNA：Ácido ribonucleico
SDSA：Síntesis de la cadena dependiente de alineamiento
SHDIR：Recombinación ilegítima dependiente de homología corta SHIIR：Recombinación ilegítima independiente de homología corta SI：Secuencia de inserción
SNP：Polimorfismo de un solo nucleótido SSA：Alineamiento de una sola hebra T：Timina
T4SS：Sistema de secreción tipo IV TnpA：Transposasa A
TnpB：Transposasa B U：Unidad de enzima
VacA：Citotoxina vacuolizante
LISTA DE TABLAS
Pág Tabla 1. Clases funcionales de los SNPs...31 Tabla 2. Oligonucleótidos usados en el estudio...39 Tabla 3. Genes de H. pylori 26695 utilizados como referencia para el estudio de los
SNPs en las cepas de H. pylori...46 Tabla 4. Cepas de H. pylori utilizadas para el estudio de los SNPs...47 Tabla 5. Secuencias repetidas directas de H. pylori 26695 obtenidos por el programa REPuter...49
Tabla 6. Sitios exactos de las secuencias de repetición directa (>500 pb) utilizados en este estudio...51 Tabla 7. Análisis comparativo de las frecuencias relativas de recombinación de las secuencias repetidas directas de H. pylori 26695 y de las poblaciones con el mutante recA...58 Tabla 8. Distribución y diversidad de la SI605 en las cepas de H. pylori completamente secuenciadas...59 Tabla 9. Resultado del análisis de SNPs de 20 genes de 31 cepas de H. pylori...69
LISTA DE FIGURAS
Pág
Figura 1. Evolución natural de la infección por H. pylori en el estómago humano...4
Figura 2. Distribución mundial de las poblaciones de H. pylori...5
Figura 3. Mecanismo molecular de las bacterias en vía RecBCD...10
Figura 4. Subclonaje rápido de los productos de PCR en varios vectores y la sustitución de cualquier gen blanco en el cromosoma con ADN construido...12
Figura 5. Modelo de la Cre-loxP sitio de recombinación del mecanismo específico...14
Figura 6. Modelo de sitio web de recombinación específica de serina recombinasas....15
Figura 7. Modelo de recombinación ilegítima SHDIR por formación de una estructura de Holliday...18
Figura 8. Mapa de elementos de SI200/605 familia en H. pylori...22
Figura 9. Transposición vía de SI608...25
Figura 10. Esquema propuesto de un sistema de absorción de ADN en H. pylori...28
Figura 11. Una breve descripción de SNPs en el genoma entre diferentes personas...31
Figura 12. Esquema de identificación de reordenamientos genómicos entre la repetición directa de ADN por PCR...42
Figura 13. Distribución de las secuencias repetidas directas (>500 pb) en el genoma de H. pylori 26695...52
Figura 14.Imágenes de electroforesis en gel de agarosa 1% de la amplificación por PCR usando los oligonucleótidos diseñados...54
Figura 15. Imágenes de electroforesis en gel de agarosa 1% de la amplificación por PCR de las deleciones y duplicaciones causada por RH entre las secuencias de repetición directa......56 Figura 16. Estructura genética de la secuencia SI605 en H. pylori...62 Figura 17. Estructura del bucle en los extremos de SI605 en los genomas secuenciado
por H. pylori...63 Figura 18. Análisis del potencial de transferencia horizontal de un fragmento de ADN entre las diferentes cepas de H. pylori detectadas por el software de ViSNP...67
RESUMEN
Helicobacter pylori infecta a más de la mitad de la población mundial, siendo la
infección más común provocada por bacterias en humanos. Posee una alta diversidad genética y se considera como una de las especies bacterianas más variables. En el presente estudio, se utilizó un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) junto con la secuenciación para detectar la presencia de recombinación homóloga (RH) entre las secuencias de repetición directa (>500 pb) en la cepa de H. pylori 26695.
Los resultados mostraron que la mayoría de los eventos de deleción o duplicación predichos fueron detectados, lo que sugiere que la RH entre repeticiones directas podría ser un mecanismo conservado y tiene un papel importante en la promoción de la diversidad genética de las bacterias. Aunque se ha informado de la recombinación entre repeticiones directas (<100 pb) en H. pylori, es la primera vez que se detecta el RH inherente entre repeticiones directas con la longitud de más de 500 pb en todo el genoma.
Con el fin de probar si los eventos de deleción o duplicación dependen de RecA, para secuencias repetidas directas de más de 500 pb, las frecuencias de recombinación relativas de todas las estructuras de reordenamiento confirmados también se evaluaron a través de la técnica de PCR, usando como molde ADN genómico del tipo salvaje y mutante para recA de H. pylori 26695, respectivamente. Los resultados indicaron que la RH es dependiente de RecA en H. pylori 26695 para las secuencias de repetición directa (>500 pb). Por otra parte, los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) de 20 genes secuenciados de 31 cepas de H. pylori mostraron que los SNPs se producen fácilmente
adenina (A) con guanina (G), mientras que la posibilidad de que en los cuatro nucleótidos ocurra en un SNP sitio es muy raro, aunque H. pylori presenta una alta tasa de mutación puntual. Además, la transferencia genética horizontal entre cepas de H.
pylori no ha sido encontrada usando el software ViSNP desarrollado por nuestro
laboratorio, probablemente debido a que la transferencia de fragmentos más pequeños tiende a ocurrir en H. pylori o que esta bacteria en el nicho natural tiene menos frecuencia que bajo condiciones de laboratorio. Por lo tanto, nuestros resultados podrían ayudar a comprender mejor la evolución del genoma y la adaptación de H. pylori en el estómago humano.
Palabras clave: Helicobacter pylori, dinámica genómica, recombinación homóloga, repeticiones directas, frecuencia de recombinación, PCR
ABSTRACT
Helicobacter pylori infects more than half of the world’s population, making it the
most widespread infection of bacteria in human. It possesses high genetic diversity and is considered as one of the most variable bacterial species. In the present study, a method based on polymerase chain reaction (PCR) along with sequencing was used to detect the presence of homologous recombination (HR) between direct repeat sequences (>500 bp) in H. pylori 26695. The results showed that the majority of deletion or duplication events predicted has been detected, suggesting that HR between direct repeats might be a conserved mechanism and has an important role in promoting genetic diversity of bacteria. Although the recombination between direct repeats (<100 bp) has been reported in H. pylori, it is the first time that the inherent HR between direct repeats with the length more than 500 bp were detected on genome-wide level. In order to test whether deletion or duplication events depend on RecA for direct repeat sequences more than 500 bp, the relative recombination frequencies of all confirmed rearrangement structures were also assessed through PCR technique, using wild-type and recA mutant H. pylori 26695 genomic DNA as templates, respectively. The results indicated that the
HR is RecA-dependent in H. pylori 26695 for direct repeat sequences (>500 bp).
Moreover, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) of 20 genes from 31 sequenced H.
pylori strains showed that SNPs sites involving in replacement of either cytosine (C) with thymine (T) or adenine (A) with guanine (G) easily occur, whereas the four nucleotides possibility occurring in a SNP sites is very rare, although H. pylori shows
strains has not been found by the software ViSNP developed by our laboratory, probably due to that the transfer of smaller fragments tends to occur in H. pylori or that this bacterium in natural niche has less frequency than under laboratory condition. Thus, our results would help in better understanding the genome evolution and adaptation of H.
pylori.
Keywords: Helicobacter pylori, genomic dynamics, homologous recombination, direct repeats, recombination frequency, PCR
INTRODUCCIÓN
Helicobacter pylori es un patógeno humano gram-negativo, microaerofílico,
gástrico que infecta a más de la mitad de la población del mundo, siendo por ello la infección bacteriana más extendida en el mundo (Warren y Marshall, 1983; Graham, 2000). La mayoría de los individuos infectados son asintomáticos, pero la infección puede progresar a enfermedades gástricas, tales como la gastritis crónica, úlcera duodenal, úlcera gástrica o cáncer gástrico (Peek y Blaser, 2002). Aunque se han identificado algunos factores de virulencia, el mecanismo molecular exacto empleado por H. pylori para causar tan variantes patologías en el anfitrion son todavía no claros hasta la fecha, debido a la complejidad de la interacción entre H. pylori y el ser humano y la gran diversidad de cepas de H. pylori.
H. pylori es considerado como una de las especies bacterianas con mayor
diversidad y variabilidad genética. Algunos factores como las mutaciónes puntuales, recombinaciónes, inserciones de secuencias y transferencia horizontal de genes contribuyen a provocar su diversidad genética (Bjorkholm et al., 2001; Kraft y Suerbaum, 2005; Lara-Ramírez et al, 2011). El análisis computacional ha demostrado que una gran cantidad de secuencias repetitivas de ADN se han encontrado en algunos lugares de los genomas de H. pylori (Aras et al, 2003b; Lara-Ramírez et al, 2011), y la recombinación entre las secuencias repetidas directas también sugiere una mecanismo conservado que aumenta la variación genómica (Aras et al., 2003b).
Tradicionalmente, la detección de la recombinación homóloga y su frecuencia es necesaria para construir un sistema que necesita la integración de un gen antibiótico. Sin embargo, la diferente distancia entre las repeticiones, la posición en el genoma (por ejemplo, cerca de origen de replicación y terminal), y los genes que participan en los fragmentos de deleción, la amplificación, inversión y translocación podría afectar la ocurrencia y su frecuencia de recombinación real entre pares específicos de repeticiones.
Las técnicas basadas en PCR ofrecen la posibilidad de detectar tales recombinaciones inherentes a las bacterias, que no puede ser detectado por métodos tradicionales.
En el presente estudio, se detectaron los reordenamientos entre secuencias repetidas directas (>500 pb) de H. pylori 26695 asi como su frecuencia relativa de recombinación se estimaron mediante la técnica basada en PCR. Además, se utiliza el software ViSNP para encontrar evidencia de la transferencia horizontal de genes entre cepas de H. pylori, ya que los fragmentos transferidos a un nuevo huésped podrian mantener el patrón de SNPs del hospedero original. Nuestros análisis seran beneficiosos para una mejor comprensión de la diversidad genómica y evolución de H. pylori.
1.0 ANTECEDENTES
1.1 LA INFECCIÓN POR HELICOBACTER PYLORI
H. pylori se descubrió por Robin Warren y Barry Marshall en 1982, lo cual hizo
que los dos descubridores obtuvieran el Premio Nobel en 2005 (Warren y Marshall, 1983). H. pylori es un importante patógeno gástrico humano que infecta a más de la mitad de la población mundial, especialmente en países en desarrollo (Graham, 2000).
La mayoría de los individuos a los que infecta H. pylori son asintomáticos, pero estos pueden progresar a enfermedades gástricas, tales como úlcera gástrica e incluso cáncer gástrico, úlceras duodenales, linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa (del inglés mucosa-associated lymphoid tissue, MALT) (Peek y Blaser, 2002). Como se muestra en la Figura 1, la infección por H. pylori usualmente se establece durante la infancia en una transmisiones de persona a persona, y la mayoría de los individuos infectados son asintomáticos. Por lo que el diagnóstico rara vez se hace durante la niñez. Una característica típica de H. pylori es que puede persistir durante décadas o para toda la vida si no se lleva a cabo tratamiento médico. Con el aumento de la edad, algunos pacientes portadores de H. pylori son capaces de desarrollar gastritis crónica. Por lo general el 10-15% de los pacientes desarrolla úlcera (úlcera gástrica o duodenal), aproximadamente el 1% puede desarrollar adenocarcinoma gástrico, y muy pocos pacientes desarrollan linfoma MALT gástrico (Suerbaum y Michetti, 2002), especialmente en hacinamiento y en condiciones de poca higiene.
Figura 1. Evolución natural de la infección por H. pylori en el estómago humano.
1.2 LA DISTRIBUCIÓN MUNDIAL DE H. PYLORI
Combinando la tipificación de secuencias multilocus con herramientas modernas de genética de poblaciones tales como “Structure” dos grandes poblaciones de H. pylori (370 y 769) que fueron colectadas en diversas etnias y situaciones geográficas fueron analizadas (Falush et al., 2003; Linz y Schuster, 2007b). Los resultados indicaron que las cepas de H. pylori analizadas en los estudios se han agrupado en seis poblaciones principales con las distribuciones geográficas distintas (Figura 2). Estas poblaciones se denominan hpEurope, hpAsia2, hpAfrica2, hpNEAfrica, hpAfrica1 y hpEastAsia. Entre estas poblaciones de H. pylori, hpAfrica1 se subdivide en dos subpoblaciones (hspWAfrica y hspSAfrica), mientras que hspAmerind, hspEAsia y hspMaori juntos forman la población hpEastAsia.
Figura 2. Distribución mundial de las poblaciones de H. pylori.
1.3 LOS FACTORES DE VIRULENCIA DE H. PYLORI
H. pylori es considerado como un carcinógeno de clase I por la Organización
Mundial de la Salud (OMS). Además de su motilidad que contribuye a la penetración de la mucosa lo que permite que las bacterias colonicen y persistan en el lumen gástrico de humanos (Josenhaus y Suerbaum, 2002), otros factores de virulencia conocidos, tales como la ureasa, la citotoxina vacuolante (VacA), y la proteína asociada a la citotoxina (CagA), también se piensa que están involucrados en la patogenicidad de H. pylori mediante la adaptación al entorno hostil del estómago humano o para escapar de la respuesta inmune del huésped.
La ureasa producida por H. pylori se compone de dos subunidades estructurales UreA (30 kDa) y UreB (62 kDa). La activación de la ureasa requiere proteínas accesorias ureasa-específicas y de iones de níquel que se incorporan en el sitio activo de
aproximadamente el 10% de la proteína total, pero sólo una pequeña porción es suficiente para que H. pylori sea resistente al ambiente ácido del estómago (Stingl y De Reciclar, 2005). La ureasa es el factor de virulencia importante y es necesario para eventos de colonización temprana y para sobrevivir en el ambiente hostil del estómago humano debido a su capacidad para hidrolizar la urea en amoníaco y bicarbonato, que mantiene la homeóstasis del pH de la bacteria (Marshall et al., 1990). Un estudio reciente mostró que cepas de H. pylori con mutaciones en MreB presentan una disminución significativa en la actividad de la ureasa, pero la adición de 1 mM de NiCl2 puede restaurar la actividad ureasa hasta el nivel de tipo silvestre (Waidner et al., 2009).
A la fecha no está claro cómo MreB afecta a la actividad ureasa de H. pylori, pero es claro que la pérdida del elemento del citoesqueleto MreB compromete su patogenicidad.
La citotoxina vacuolante (VacA) es otro factor de virulencia que se secreta activamente en el tejido adyacente y podría causar daño al epitelio gástrico (Czajkowsky et al., 1999). Casi todas las cepas de H. pylori poseen una copia de vacA que puede ser dividido en tres regiones: la región señal (s), la región intermedia (i), y la región media (m), basada en la diversidad de alelos en estas tres regiones. La región (s) existe en los tipos s1 y s2, mientras que s1 tipo se subdivide en subtipo a, b, y c. La región (i) está presente como subtipo 1 y 2, y la región (m) contiene tres formas alélicas diferentes (m1, m2a, y m2b) (van Doorn et al., 1998). Por lo tanto, la estructura real del gen vacA es extremadamente diversa y la actividad de citotoxina vacuolizante también es diferente, debido al hecho de que diferentes tipos de recombinación puede ocurrir en esas regiones alélicas de los genes. Por ejemplo, se ha informado de que la proteína VacA codificada por el genotipo s1/m1 tiene una mayor actividad de citotoxina vacuolizante y se
relaciona con enfermedades gastroduodenales graves (Atherton et al., 1995; Rhead et al., 2007). Se ha demostrado que el gen vacA contiene los genotipos s1/m1 y s2/m2 que se asocian con la aparición de gastritis crónica y cáncer gastrico en aislados de H. pylori de pacientes mexicanos (López-Vidal et al., 2008; Paniagua et al., 2009; Martínez-Carrillo et al., 2010).
La proteína asociada a citotoxina (CagA) es también de gran importancia en H.
pylori, y se encuentra en el gen asociado a la isla de patogenicidad (del inglés
pathogenicity island, PAI), que tiene aproximadamente 37 kb de longitud y contiene aproximadamente 28 genes que codifican un sistema de secreción de tipo IV (del inglés type IV secretion system, T4SS) (Censini et al., 1996). CagA, una proteína efectora de 128 kDa, exhibe polimorfismo de secuencia entre las diferentes cepas de H. pylori.
CagA se transloca en las células del epitelio gástrico a través T4SS, y se fosforila por quinasas de las celulas huésped (Lu et al., 2008). La proteína CagA puede provocar respuesta inflamatoria local o el progreso del daño de la mucosa. Por otra parte, la proteína CagA también puede inhibir la proliferación de células B mediante la supresión de la vía de señalización de JAK-STAT, que conduce a la defensa inmune del huésped que es perjudicial para el huésped, pero no para la bacteria.
1.4 REORDENACIÓN GENÓMICA
1.4.1 Recombinación homóloga. La recombinación homóloga (RH) es un tipo de
diversidad genética y la reparación de daños en el ADN, con el fin de mantener la estabilidad genómica, especialmente para repetir en genomas ricos como el H. pylori y las plantas. RH entre secuencias repetitivas directas podría causar la duplicación o la eliminación de ADN, mientras que la recombinación entre secuencias repetitivas invertida conduce a inversión, además de ciertos eventos de eliminación que fue causados por la estructura secundaria de filamentos de una sola repetición invertida ADN durante la replicación (Lobachev et al., 1998).
1.4.1.1 Recombinación homóloga y la reparación de daños en el ADN. Las roturas de doble cadena de ADN (del inglés double strand breaks, DSBs) son el tipo de más citotóxico de daño en el ADN. Se puede causar por diversos factores, tales como desdoblamiento endonucleasa, así como estrés físico y radiación ionizante (Bresler et al., 1984; Takahashi et al., 2004; Ohnishi et al., 2009). La reparación precisa y oportuna de DSBs es fundamental para evitar los reordenamientos genómicos que podrían ser dañinas o letales para los organismos.
La reparación de DSB puede ocurrir a través de dos formas diferentes de reordenamiento genómico. Ellos son la unión de extremos no homólogos (del inglés non-homologous end joining, NHEJ), o la recombinación homóloga (RH) que ha sido considerada como una conserva y recombinación mecanismo generalizado en procariotas. RH se subdividen en cuatro clases: clásica rotura en la doble cadena de reparación (del inglés DNA double-strand break repair, DSBR), la síntesis de línea de recocido dependientes (del inglés synthesis dependent strand annealing, SDSA), la síntesis de línea de recocido (del inglés single-strand annealing, SSA), y la replicación
inducida por rotura (del inglés break-induced replication, BIR) (Krogh y Symington, 2004). Un punto en común es que RH comienza con la invasión de filamento o recocido de fragmentos homólogos, estas secuencias homólogas se utilizan luego como plantilla para nueva síntesis de ADN, independientemente de que el mecanismo RH fue usado para la reparación de DSB. Otra cuestión importante durante el progreso de RH es una proteína clave―RecA que se une a un simple trenzado de ADN y provoca la reacción de intercambio de filamento (Nishinaka et al., 1998).
La vía RecBCD es la vía principal de recombinación usada en bacterias para reparar roturas de doble cadena de ADN (Dillingham y Kowalczykowski, 2008). En primer lugar, RecBCD, una enzima de tres subunidades compleja que consiste en RecB, RecC y RecD, se enlaza con el final de la doble cadena de ruptura de ADN. Después, las subunidades RecB y RecD inician el desenrollo dúplex de ADN usando su actividad helicasa y continúan a desenrollar ADN hasta que RecBCD llegue al sitio Chi, donde el RecBCD reducirá la cadena de ADN para producir un ADN de cadena larga única. El sitio Chi, también conocido como punto caliente de recombinación (recombination hotspot, en inglés), es una secuencia corta de nucleótidos específica (5'-GCTGGTGG-3').
Después de la recarga de la proteína RecA sobre la cola del Chi de ADN simple trenzado, la proteína compleja RecBCD se desmonta. El trenzado sencillo de ADN cubierto por la proteína RecA después invade a el ADN homologo dúplex, dando lugar a la formación del D-loop. Posteriormente, D-loop se corta y recuece con la brecha en el primero de ADN para producir una estructura de Holliday. Finalmente, la estructura de
Figura 3. Mecanismo molecular de las bacterias en vía RecBCD.
1.4.1.2 Los factores que afectan la frecuencia de RH. La frecuencia de RH entre ADN repetitivo puede ser afectada por el tamaño y la distancia entre las secuencias repetitivas, así como por la divergencia de secuencias repetitivas. La tasa de recombinación aumenta a medida que aumenta la longitud de la secuencia de la repetición en varios organismos (Shen y Huang, 1986; Bell y McCulloch, 2003), pero no linealmente con en el tamaño de la secuencia de repetición, mientras que la frecuencia de RH ha demostrado que disminuye exponencialmente con el incremento de la distancia entre las secuencias repetitivas (Peeters et al., 1988; Chedin et al., 1994). Por otra parte, también se encontró que la frecuencia de RH es mayor entre las secuencias idénticas o similares a las secuencias divergentes, y que la tasa de recombinación y divergencia presenta relación
lineal en varios estudios realizados con levaduras y bacterias (Datta et al., 1997; Vulic et al., 1997).
1.4.1.3 La relación entre RH y RecA. En Escherichia coli y Bacillus subtilis, se ha mostrado previamente que RH de repetición corta directa no es dependiente en RecA, independientemente de la distancia entre las repeticiones (Chedin et al., 1994; Lovett et al., 2002), diferente de repeticiones ya reportado por Bi et al (1994). Pero es coherente con la observación de que la reciente reorganización de H. pylori CagY, que incluye una gran cantidad de secuencias repetitivas cortas y directas, no requirieron la función de RecA (Aras et al., 2003a). Por otra parte, la deleción por recombinación homóloga entre directos se repite menos de 100 pb, se ha demostrado ser también independiente de RecA en H. pylori (Aras et al., 2003b). Pero la recombinación intergenomica entre las diferentes especies requiere RecA funcional (Schmitt et al., 1995; Thompson y Blaser, 1995). Por lo tanto, la recombinación homóloga intragenómica entre repeticiones largas directas es dependiente de RecA pero es independiente de RecA entre repeticiones directas cortas, independientemente de que las bacterias sean Gram negativas (tales como E. coli y H. pylori) o Gram positivas (como B. subtilis).
Varias técnicas de biología molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, en inglés polymerase chain reaction) y RH se han establecido como herramienta útil en el campo de la investigación científica. En la Figura 4, se representa un protocolo PCR de alto rendimiento para el subclonaje en bacterias (Figura 4-A) y un
Figura 4. Subclonaje rápido de los productos de PCR en varios vectores y la sustitución de cualquier gen blanco en el cromosoma con ADN construido.
1.4.2 Recombinación sitio específica. El sitio de recombinación específica tiene lugar entre las secuencias de ADN con un grado limitado de secuencia homóloga, depende del lugar de recombinasas específicas, que catalizan el corte y su reincorporación de dos diferentes fragmentos de ADN en secuencias específicas. El ejemplo más conocido es λ- bacteriófagos que utilizan el mecanismo de recombinación específica para integrar sus propios genomas en el genoma del anfitrión bacterial. Dos familias de sitio específico de recombinasas, que son la familia λ-integrasa y la familia resolvasa/invertasa, se han identificado en las bacterias (Stark et al., 1992). Basado en similitud de secuencias, más de 100 miembros de λ-integrasa familia se han sido identificados (Nunes-Duby et al., 1998) que usan el mismo mecanismo de la formación de una estructura de Holliday para realizar recombinación específica (Craig, 1988). El mecanismo y el mando de la tirosina recombinasa como representante de λ-integrasa familia Cre-loxP sitio de recombinación
específica se muestra en la Figura 5. Recombinasa Cre es una recombinasa tirosina derivado del bacteriófago P1, cuyo mecanismo para realizar recombinación específica de sitio es igual a la topoisomerasa (Ennifar et al., 2003). Los sitios de recombinación se componen típicamente de dos idénticas o diferentes motivos con secuencias cortas de repetición invertida, en cual la recombinasa puede enlazar estos sitios y catalizar la ruptur de objetivos cadenas (Landy, 1989). Como se muestra en la Figura 5, en primer lugar dos monómeros Cre reconocen y se unen a cada sitio de recombinación de sustrato de ADN. El ADN se separó por las cadenas laterales de tirosina conservadas de un par de subunidades Cre, con el fin de formar enlaces covalentes 3' fosfotirosina vínculos.
Secuencialmente, un cruce Holliday intermedio se forma por una reacción, en la que es liberado 5' grupos hidroxilo atacan los sustratos asociados para intercambiar un par de hebras. Después de la isomerización, otro par de subunidades Cre se activaron y se dejó que la escisión de la Holliday intermedio ADN, así como el intercambio del la segundo par de hebras de ADN, de forma similar al caso del la primera par de hebras de ADN.
Finalmente, los productos recombinantes fueron dados y terminaron el proceso de recombinación específica de sitio. En todo el proceso, la escisión de ADN y la reincorporación no necesita fuente de energía externa, como ATP.
Figura 5. Modelo de la Cre-loxP sitio de recombinación del mecanismo específico.
Óvalo negro o gris representa el monómero de la Cre. Y representa la tirosina conservada en cadenas laterales.
Basado en las secuencias de aminoácidos, las recombinasas serina pertenecen a la familia resolvasa/invertasa, diferente de recombinasa tirosina de familia λ-integrasa. El mecanismo de recombinación específica de sitio involucrado en recombinasa serina fue mostrado en la Figura 6. Los dímeros de recombinasa serina en primer lugar reconocen y se unen a sitios de destino de los sitios del sustrato (como attP y attB), formando el complejo sináptico que contiene dímeros pre-formados de recombinasa y los respectivos sitios de destino del ADN. Entonces de la recombinasa divide dos pares decadenas de ADN simultáneamente en los puntos que se escalonan por 2 pb. La subunidad gira 180°
con el intercambio de cadenas de ADN. Finalmente, productos de recombinación que forman dos nuevos sitios-híbridos (attL y attR) están presentes en cadenas de ADN reincorporadas.
Figura 6. Modelo de sitio web de recombinación específica de serina recombinasas.
CTD/DTN representa los dímeros formados por dos subunidades recombinasa.
El proceso de recombinación sitio específica mediada por serina recombinasas es diferente de la tirosina recombinasa en algunos aspectos, a pesar de que estos dos procesos comparten recombinación de reacción química básicamente idéntica. Por un lado, el sistema de recombinación mediado por la tirosina recombinasa puede ser reversible si el los grupos 5' hidroxilo liberados atacan a los sustratos de vinculación, mientras que el camino de la recombinación de serina es irreversible. Por otro lado, la tirosina recombinasa corta en primer lugar un par de cadena de ADN en sitios específicos que se escalonan por 6-8 pb y alcanza el intercambio de otro par de cadena de ADN por un empalme de Holliday intermedio, mientras que la recombinasa serina cortó las cuatro hebras de ADN que participan en los sitios que se escalonan en sólo 2 pb.
En la actualidad, el sitio sistema de recombinación específica se ha demostrado ser una
herramienta útil para la manipulación de genes y los cromosomas en un gran número de organismos como gen de bloqueo (knock in–knock out).
1.4.3 Recombinación ilegítima. Todas las demás recombinaciones que llevan a reordenamientos genómicos se denomina recombinación ilegítima, además de recombinación homóloga y la recombinación específica de sitio. La recombinación ilegítima se produce entre las secuencias de ADN con poca o ninguna homología tanto en procariotas y eucariotas, y probablemente, cubre múltiples mecanismos (Connelly y Leach, 1996). En genomas eucariotas, la recombinación ilegítima también puede tener lugar entre secuencias homólogas dispersas (generalmente 1-10 pb), lo que lleva a la duplicación o eliminación (Devos et al., 2002; Daley et al., 2005; Wicker et al., 2007).
Por lo tanto, la recombinación ilegítima es de importancia en la contribución a la diversidad genética de los organismos. Puede causar varios tipos de reordenamientos genómicos, como la supresión, duplicación, inversión, mutación de inserción, produciendo genes quiméricos y genoma por revolver fragmentos de ADN, formación especializada fago transductor como λbio-transducción de fagos, y la escisión precisa de transposones tales como Tn5 (Egner y Berg, 1981; Onda et al., 2001). En algunos casos, la recombinación ilegítima puede ocurrir con alta frecuencia tanto en procariotas como eucariotas (Roth y Wilson, 1986).
Se han encontrado que dos tipos de recombinación ilegítima, la recombinación ilegítima-dependiente de la homología corta (del inglés short-homology-dependent illegitimate recombination SHDIR, por lo general 1-10 pb) y la recombinación ilegítima corto-homología-independiente (del inglés short-homology-independent illegitimate
recombination, SHIIR), que puede conducir a la formación de λbio-fagos transductores (Shimizu et al., 1997). El mecanismo de SHIIR implica secuencias prácticamente con ninguna homología, probablemente mediada por la ADN girasa o ADN topoisomerasas (Ikeda et al., 2004). La ADN girasa es una topoisomerasa de tipo II que es extremadamente importante para la replicación y transcripción de ADN para generar muescas en una cadena de ADN o de roturas de doble cadena (Kim y Wang, 1992).
Además de ADN topoisomerasas, algunas otras enzimas tales como ADN ligasa, DnaB helicasa, RecJ, RecQ, y exonucleasa, también se ha demostrado que afectan a la frecuencia de recombinación ilegítima (Ukita y Ikeda, 1996; Hanada et al., 1997;
Yamashita et al., 1999; Yamaguchi et al., 2000;Onda et al., 2001).
Anteriormente, los dos mecanismos se dan para explicar SHDIR llamados, modelo de desemparejamiento por deslizamiento de cadenas y doble filamento de rotura y final (Michel, 1999). Sin embargo, el ADN de ruptura y unión se considera el más probable mecanismo para llevar a SHDIR (Kusano et al., 2003). Como se muestra en la Figura 7, dos moléculas de ADN corto que comparten secuencias homólogas reconocen una la otra, lo que lleva a la formación de una estructura de Holliday que es un intermediador importante durante la recombinación homóloga. En el proceso de migración de la marca, las estructuras aberrantes causadas por recombinación ilegítima fueron dadas, si la doble línea de ruptura se llevó a cabo en el punto de ramificación.
Figura 7. Modelo de recombinación ilegítima SHDIR por formación de una estructura de Holliday.
Para las bacterias de transformación naturales como Acinetobacter sp y Streptococcus pneumoniae, el ADN extraño puede ser integrado en el cromosoma por
homología facilitado por recombinación ilegítima (del inglés homology-facilitated illegitimate recombination, HFIR), y depende de RecA (de Vries y Wackernagel, 2002;
Prudhomme et al., 2002). Una observación similar se registró también en Pseudomonas stutzeri, una de las muy diversas y competentes especies naturales que la longitud de las
secuencias homólogas a regiones no homólogas influye fuertemente en los eventos de recombinación ilegítimos y este fenómeno es dependiente de RecA (Meier y Wackernagel, 2003). HFIR se produce durante la transformación natural, pero la tasa de recombinación ilegítima es mucho menor que la recombinación homóloga. Por ejemplo, la frecuencia de adquisición de ADN fue de aproximadamente 1% en S. pneumoniae, aproximadamente 0.01% en Acinetobacter sp, y sólo alrededor de 0.0003% en P.
stutzeri, en comparación con la frecuencia de recombinación homóloga. Los resultados
de estos estudios también demostraron que las micro homologías identificadas en P.
stutzeri, Acinetobacter sp y S. pneumoniae fueron respectivamente de 3-6 pb, 3-8 pb y 3-
10 pb (de Vries y Wackernagel, 2002; Prudhomme et al., 2002; Meier y Wackernagel, 2003). Además, también se encontró que HFIR observado en los tres organismos se produjo en las GC ricas en micro sitios de homologías, probablemente debido a que un alto contenido de GC puede aumentar la estabilidad para unirse a los sitios de recombinación ilegítima.
Candida glabrata es un importante patógeno oportunista, que causa 10-15% de
síntomas vaginales y candidiásis sistémica (Redondo-Lopez et al., 1990). En C. glabrata, ADN extraño puede ser integrado en el genoma por recombinación homóloga en la que el plásmido lleva un fragmento de ADN (<100 pb) homóloga con el genoma del anfitrión, y la recombinación ilegítima en el que se realizó sin ningún ADN genómico de C. glabrata en el plásmido. La diferencia entre ambos mecanismos es que la frecuencia
de integración de la recombinación ilegítima sólo representa el 10% de homólogos de integración (Cormack y Falkow, 1999). Por otra parte, las variantes de H. pylori CagA, que es un factor de virulencia importante asociado con el cáncer gástrico, también pueden ser causada por recombinación ilegítima entre secuencias cortas similares (Furuta et al., 2011b). Por lo tanto, la recombinación ilegítima ha sido considerada como un mecanismo generalizado para la adquisición de ADN extraño en los procariotas, especialmente para las bacterias con propiedad de transformación natural (Cormack y
1.5 TRANSPOSICIÓN
La secuencia de inserción (SI) (IS en inglés) es un grupo de segmentos de ADN que se distingue por su capacidad de traslado a los nuevos sitios de genomas sin necesidad de homología de ADN amplia (Mahillon y Chandler, 1998). SI está ampliamente presente en procariotas y eucariotas. La transposición de SI es de gran importancia en la generación de la diversidad genómica, debido a que su incorporación no sólo puede conducir a la mutación de inserción, reordenamientos del genoma, sino que también puede causar la dispersión de la resistencia a los antibióticos y genes de virulencia. La mayoría de los elementos SI lleva secuencias de repetición terminales invertidas cortas entre 10 y 40 pb, con varias excepciones tales como la familia SI91 y SI200/605. SI91 lleva muy corto (7-8 pb) terminal imperfecto de repetición invertidas en sus extremos, y se inserta en una secuencia de tetra nucleótidos específica (GAAC y CAAG) sin generar ningún objetivo repetido directo en el sitio de inserción (Mendiola y de la Cruz, 1989).
Los elementos de la familia SI200/605 han sido ampliamente identificados en bacterias y arqueas. Una característica típica de SI de la familia SI200/605 es que no tienen secuencias invertidas en sus extremos, en lugar de palindrómica imperfecta (PI) (IP en inglés) secuencias que se encuentran cerca de los extremos del transposón (Kersulyte et al., 2002). Cada SI puede presentar sus propias secuencias PI distintas, dando lugar a diferentes estructuras secundarias de PIL y PIR (SI buscador: http://www-is.biotoul.fr).
1.5.1 Las características de SI200/605 familia en H. pylori. En el presente, cinco secuencias de inserciones (SI) elementos (SI605, SI606, SI607, SI608, y SI609), que pertenecen a la misma familia SI200/605, han sido encontradas en H. pylori (Kersulyte
et al., 2004). Además de SI609 que contiene cuatro ORFs (orfA, orfB, orf1, y orf2) en la misma orientación, otros cuatro elementos de SI llevan dos ORFs (orfA y orfB) en la misma o en distinta orientación (Figura 8). Se ha encontrado que la transposasa codificada por SI605 orfA es un homólogo de la única transposasa de SI200, mientras que otro ORF de SI605 es un homólogo de la ORF de SI1341, que está muy extendida en las especies Gram positivas. Los SI606 transposasas que codifican por orfA y orfB exhiben 25% y 28% de la identidad de aminoácidos a las de SI05, respectivamente (Kersulyte et al., 1998). Las dos secuencias de ORFs de SI608 son homólogas a la de SI605 en el nivel de aminoácidos, pero que están en la misma orientación y solapado por 10 codones. Es similar al caso de SI607 que contiene dos ORFs superpuestas 9 codones en la misma orientación. El orfB de SI607 es homóloga a la de orfB de otros SI elementos de la familia H. pylori. El orfA de SI607 es diferente de la orfA de los otros, debido al hecho de que el orfA de SI607 se considera para codificar una recombinasa serina. Está reportado que la mayoría de recombinasa serina y sus homólogos típicamente catalizan la recombinación específica de sitio (Smith y Thorpe, 2002), excepto un informe en el que tanto la recombinación específica de sitio y la transposición pueden ser catalizados por recombinasa serina (Kiss et al., 2003).
Figura 8. Mapa de elementos de SI200/605 familia en H. pylori.
1.5.2 La subfamilia de elementos SI en H. pylori. En las poblaciones H.pylori, los elementos SI de la familia SI200/605 no están distribuidos al azar y la frecuencia de cada elemento SI varía geográficamente. SI608 no es común (sólo un 1%) en las cepas de Asia oriental mientras que se observó en las cepas de H. pylori en Perú, Alaska, Europa, África, India y Bangladesh, con mayor frecuencia varió de 15% a 41%
(Kersulyte et al., 2002). La distribución de SI609 poblaciones de H. pylori fue básicamente similar a la de SI608, pero sólo con distintas frecuencias de distribución.
SI607 se encontró en el 5% de aislamientos de H. pylori en Japón (Honshu) y el 27% de cepas peruanas (Kalia et al., 2004). SI605 se encuentra principalmente en el oeste de H.
pylori colecciones que van 28 a 50%, pero este elemento fue menos frecuente en los
aislamientos de Asia Oriental (Hook-Nikanne et al., 1998; Kersulyte et al., 1998). Se identificaron dos subfamilias, con base en las filogenias de OrfA o OrfB de cinco conocidos SI en H. pylori. Uno representados por los genes orfA de SI607, SI609 y que se prevé para codificar recombinasas serina, y el otro representados por los genes orfA
de SI605, SI606, SI608, y que codifican otro tipo de transposasa distintos de recombinasa serina en el nivel de aminoácidos. Además, OrfBs de H. pylori SI605, SI606, SI607, SI608 y forman una subfamilia OrfB diferente de la de SI609 en el nivel de proteína (Kersulyte et al., 2004).
1.5.3 Especificidad la inserción de elementos. La inserción de elementos SI en sitios genómicos no es al azar, sino con especificidad de diana. SI605, SI606, y SI608 tienden a insertar el extremo 3' de las secuencias conservadas AT-ricos (SI605, 5'-TTTAA o 5'- TTTAAC, SI606, 5'-TTTAT, SI608, 5'-TTAC) (Kersulyte et al., 2004). SI607 preferentemente inserta una región rica en GC en el ADN objetivo específico (Kersulyte et al., 2000). La inserción favorece SI609 seguido de TAT en su extremo izquierdo (en inglés LE), sin especificidad de inserción para su extremo derecho (en inglés RE) (Kersulyte et al, 2004; Barabas et al., 2008).
1.5.4 La transposición mecanismo. La transposición de ADN es un fenómeno muy presente tanto en eucariotas y procariotas. El proceso de incorporación de elementos también desempeña un papel importante en la evolución del organismo. En H. pylori, la incorporación de dos elementos probados (SI607 y SI608) depende de TnpA transposasa codificada por orfA, pero no en transposasa codificada por orfB. Durante la transposición, no se observó ninguna supresión o la duplicación de secuencias objetivas en sitios de inserción (Ton-Hoang et al., 2005). Por otra parte, la transposición de elementos SI en el fondo de E. coli también fue probado en un ensayo de apareamiento
duplican o se eliminan en el proceso de inserción, además de que no se detectó la transposición de SI609 en el experimento de E. coli (Kersulyte et al., 1998; Kersulyte et al., 2004; Ton-Hoang et al., 2005). Hasta ahora, el mecanismo de transposición de SI608, que utiliza ADN de una sola hebra como sustrato y siempre insertados a un tetra nucleótido específico (TTAC), se ha estudiado en detalle y se muestra en la Figura 9.
SI608 lleva dos ORFs codificación de transposasa TnpA y TnpB, respectivamente.
Secuencias palindrómicas imperfectas (PI) situadas tanto en el extremo izquierdo (en inglés LE) y el extremo derecho (en inglés RE) de SI608. Las secuencias de PI en la LE y RE son casi idénticas, pero estas dos secuencias de propiedad intelectual se encuentran asimétricas: las secuencias de PI en RE están más cerca del sitio de corte RE (5'-TCAA) al final de la SI608 de las secuencias de PI en LE da el sitio de escisión LE (5'-TTAC) (Ronning et al., 2005). Durante la transposición SI608, las etapas de escisión y la reincorporación se llevan a cabo por SI608 TnpA, que es un solo transposasa de 155 aminoácidos (Barabas et al., 2008). Sin embargo, las secuencias objetivas para la inserción de SI608 no se reconocen directamente por la transposasa TnpA pero si por emparejamiento de bases con BL tetra nucleótidos correspondientes (5'-AAAG). De la misma manera, la escisión precisa de SI608 en los extremos izquierdo y derecho también es reconocida por el apareamiento de bases con los BL tetra nucleótidos correspondientes (5'-AAAG) y CL tetra nucleótidos (5'-TTAC), y CR tetra nucleótidos (5'-TCAA) y BR tetra nucleótidos (5'-GAAT).
Figura 9. Transposición vía de SI608. LE y RE representan el extremo izquierdo y el extremo
derecho del SI608, respectivamente. IPL y IPR representan secuencias palindrómicas imperfectas en el extremo izquierdo y derecho del SI608. BL y BR representan regiones de apareamiento de bases en el extremo izquierdo y derecho del SI608. CL y CR representan sitio de escisión en el extremo izquierdo y derecho de SI608. CT representa sitios objetivos (tetra nucleótidos, TTAC).
1.6 TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES
La transferencia horizontal de genes se define como la transferencia de material genético entre bacterias distintas de transferencia vertical de genes de generación de los padres a la descendencia mientras que la célula se divide. En procariotas, debido al hecho de que no son capaces de propagarse sexualmente, el intercambio de materiales genético se logra principalmente por transformación, conjugación, y transducción. La transformación implicada en la alteración genética por encima de tomar material genético extraño (ADN o ARN) en especies bacterianas que alcanzan la etapa fisiológica específica (Dubnau, 1999). La transducción es un proceso en el que el ADN bacteriano se transfiere desde una bacteria a otra por bacteriófago (Jiang y Paul, 1998). La conjugación bacteriana es un mecanismo en el que material genético se puede intercambiar entre las especies bacterianas por el plásmido o transposón, pero el contacto físico entre las células del donante y las células receptores es esencial (Grillot- Courvalin et al., 1998). Aunque las bacterias son capaces de obtener material genético extraño a partir de las mismas o diferentes especies bacterianas por estos mecanismos, varios eventos, tales como sistemas de modificación de restricción de ADN o hasta sistema de toma, probablemente limiten la integración del fragmento extraño en genomas bacterianos.
Estudios anteriores han mostrado que la importación de las secuencias exteriores es considerablemente más frecuente que la mutación en E. coli (Guttman y Dykhuizen, 1994), H. pylori (Suerbaum et al., 1998), y Neisseria meningitidis (Feil et al., 1999). La transferencia horizontal de genes ocurre en poblaciones de H. pylori, pero su mecanismo no se conoce bien. Hasta ahora, una opinión predominante es que la competencia de
transformación natural es esencial para la consecución de la plasticidad genética en muchas especies de bacterias, y el sistema de secreción de tipo IV especializada, que se muestra en la Figura 10, desempeña un papel importante en el proceso de la transferencia horizontal de genes y el intercambio genético (Hofreuter et al., 2001).
Recientemente, con el fin de desentrañar las influencias de la transferencia horizontal de genes en la conformación de la evolución de los sistemas biológicos, Treangen y Rocha (2011) analizaron cepas procariotas estrechamente relacionadas o especies con genomas de diferente tamaño: genomas de pequeño tamaño (Helicobacter, Neisseria, Streptococcus, Sulfolobus), genomas de tamaño medio (Bacillus, Enterobacterias), y genomas grandes (Pseudomonas, Bradyrhizobiaceae). Los resultados mostraron que una alta tasa de transferencia horizontal de genes en los procariotas analizados en su estudio, por lo menos 88% de todas las ampliaciones de las familias de proteínas se originó por transferencia horizontal de genes (Treangen y Rocha, 2011), lo que sugiere que la transferencia horizontal de genes juega un papel principal en la diversificación de las familias de proteínas. Sorprendentemente, las células de H. pylori que van a través de recombinación para importar fragmentos de ADN cortos (en promedio 417 pb) en sus cromosomas, en contraste con otras bacterias, por ejemplo E. coli, donde las longitudes conocidas pueden llegar a 10 kb (Falush et al., 2001). Este hallazgo es consistente con el estudio de Kersulyte en que la sustitución de piezas cortas de ADN (36 a 124 pb) también se detectó durante dos H. pylori co-infección por de un paciente en Lituania (Kersulyte et al., 1999). La alta frecuencia de la transferencia de genes indica la importancia de esta transferencia en la evolución y la adaptación de los organismos al
dispersión de genes de resistencia a antibióticos, casetes de virulencia o islas de patogenicidad (Hackeret et al., 1997; Dutta y Pan, 2002).
Figura 10. Esquema propuesto de un sistema de absorción de ADN en H. pylori.
1.7 LA FORMACIÓN DE PSEUDOGENES
Los pseudogenes son comúnmente definidos como secuencias de ADN que se asemejan a los genes conocidos, aunque no pueden producir proteínas funcionales, si bien la mayoría de ellos tiene algún gen de características similares. Un análisis bioinformático indicó que el genoma de H. pylori contiene una gran cantidad de pseudogenes, que ocupan aproximadamente 5.6 hasta 8.7% (Lara-Ramírez et al., 2011).
El mismo estudio también mostró que la proporción predominante de pseudogenes en H.
pylori aún conserva toda la secuencias de genes ortólogos, lo que sugiere que eran
probables mutaciones recientes. Además, la alineación de 59 pseudogenes de H. pylori muestra que la mutación por desplazamiento es una de las principales fuentes generadoras de los pseudogenes, además de algunos causados por mutaciones puntuales
o de inserción de transposones (Lara-Ramirez et al., 2011), mientras que alrededor del 60% del total fue causada por ralentí de nucleótidos homopolinucleótidos (HPN). En realidad, HPN se ha sido encontrado en algunos genes con una alta frecuencia. Estos genes fueron principalmente divididos en tres grupos: biosíntesis de lipopolisacárido (LPS), superficie celular de ADN y genes asociados a los sistemas restricción/modificación (Saunders et al., 1998). Por otra parte, una sola hebra de deslizamiento/reparación de H. pylori puede proporcionar la oportunidad de generar HPN y la falta de algunos genes de reparación de ADN podría promover este proceso (Tomb et al., 1997; Kang y Blaser, 2006), de modo que sería razonable dilucidar por qué los HPN son particularmente comunes en el genoma de H. pylori. En otras palabras, HPN podría actuar un factor importante para el interruptor de encendido-apagado de pseudogenes, y la ocurrencia de pseudogenes podría ser una preparación de adaptación en diferentes nichos, así como un factor no despreciable que implica en la diversidad genómica, que es de particular importancia para los microorganismos, especialmente patógenos, tales como H. pylori.
1.8 POLIMORFISMOS DE UN SOLO NUCLEÓTIDO (SNPs)
Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) también son una forma común de las variaciones genéticas entre los individuos. También es de importancia en la contribución a la diversidad genética en genoma procariotas o eucariotas, como los casos mencionados de mutaciones puntuales, transformación horizontal de genes y recombinación intragenómica. Los SNPs son variaciones de la secuencia de ADN que
SNPs que ocurren en el genoma humano se estima en 1 SNP por cada 300 bases de nucleótidos, y la frecuencia de ocurrencia de los distintos alelos varía en diferentes poblaciones (Schafer y Hawkins, 1998; Wang et al., 1998; Cargill et al., 1999). SNPs puede ocurrir tanto en las secuencias codificadoras de proteínas y las regiones no codificadoras, pero la mayoría de los SNPs que ocurren no-codificante del genoma (Hagmann, 1999). Las consecuencias de los SNPs pueden solamente hacer el cambio de la secuencia del ADN pero no presentan ningún efecto en función de las proteínas, o tengan un impacto en la función biológica. Por lo tanto, los SNPs pueden cambiar la función de ADN, ARN y proteínas, y generalmente se dividen en cinco clases sobre la basado en sus localizacion genomica (Tabla 1). Especialmente en el caso de patógenos, la identificación de los SNPs en su genoma puede ayudar a entender susceptibilidad a enfermedades, y la localización de los locus involucrados en el desarrollo de enfermedades (Monot et al., 2005). En la actualidad, los SNPs asociado a enfermedades pueden ser obtenidos a partir de diferentes bases de datos tales como Swiss-Prot (Boeckmann et al., 2003), OMIM (Hamosh et al., 2000), HGMD (Stenson et al., 2003) y HGVbase (Fredman et al., 2004). Estas bases tienen conjuntamente más de 40,000 polimorfismos de los SNPs que son sinónimos, no- sinónimos, y no-codificantes.
Figura 11. Una breve descripción de SNPs en el genoma entre diferentes personas.
Tabla 1. Clases funcionales de los SNPs
Los nombres de los SNPs La posición de SNPs en el genoma
Codificación SNPs cSNP Las posiciones que corresponden a las regiones codificantes de los genes
Reguladora SNPs rSNP Las posiciones que se encuentran en las regiones reguladoras de los genes
Sinónimo SNPs sSNP Las posiciones en los exones que no cambian el codón de la sustitución un aminoácido
No-sinónimo SNPs nsSNP Posición en la que incurren en una sustitución de un aminoácido
Intronic SNPs iSNP Las posiciones que se encuentran dentro de los intrones
2.0 JUSTIFICACIÓN
La diversidad genómica de la bacteria H. pylori es importante para adaptarse al medio ambiente particular del estómago humano. Análisis in-silico han mostrado que los genomas de H. pylori contienen un gran número de secuencias repetidas directas. La RH entre secuencias repetidas directas, parece ser un mecanismo conservado que refuerza la variación genómica, causando deleciones o duplicaciones en la bacteria. La transposición de los elementos SI es también un mecanismo importante que genera diversidad genética, especialmente en los patógenos, ya que las SI pueden llevar indirectamente a la ocurrencia de cepas resistentes a antibióticos o a cambios en la virulencia. Otros mecanismos, tales como las mutaciones puntuales, la transferencia horizontal de genes y otras formas de recombinación pueden también generar flexibilidad genómica. Sin embargo, es difícil confirmar los re-arreglos genómicos y es difícil la detección de su frecuencia de recombinación. Las detecciones actuales sólo se pueden realizar en secuencias de plásmidos o regiones no esenciales en el cromosoma.
Los resultados de dicha detección se deducen de los eventos de recombinación en regiones esenciales en las células. Sin embargo, la ubicación en el cromosoma o las regiones relacionadas con la recombinación podría afectar a la frecuencia de recombinación. En el presente estudio, se aplicó un método basado en la PCR para detectar tanto las estructuras inherentes de recombinación entre repeticiones directas predichas y su frecuencia relativa de recombinación, utilizando una combinación apropiada de oligonucleótidos, la cual proporciona un método sencillo y rápido para la detección de eventos reordenados predecibles en la población bacteriana. Por lo tanto,
los resultados experimentales podrían ser útiles para dilucidar el papel de las secuencias repetidas en la evolución genómica H. pylori y además para entender mejor cómo las cepas de H. pylori se adaptan al continuo cambio de su entorno.
3.0 HIPÓTESIS
La RH inherente entre las secuencias repetidas directas de ADN en H. pylori puede ser detectada por un método basado en la PCR. La evolución genómica y la diversidad genómica en H. pylori se pueden demostrar mediante la aplicación del software ViSNP.
4.0 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Analizar las características dinámicas del genoma de H. pylori 26695 mediante análisis bioinformático y comprobación experimental.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Detectar la RH inherente entre secuencias repetidas directas (>500 pb) del genoma H.
pylori 26695.
2) Detectar las frecuencias de recombinación relativas en poblaciones de tipo salvaje y mutantes recA de la cepa H. pylori 26695 bajo condiciones de laboratorio.
3) Analizar los SNPs del genoma de H. pylori 26695.
5.0 MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 CULTIVO BACTERIANO
Las cepas de H. pylori 26695 de tipo salvaje y las mutantes recA utilizadas en este trabajo, se obtuvieron de Centro de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas (Instituto Nacional de Salud Pública, México) y se cultivaron en las placas de agar sangre de caballo (5% de sangre de caballo en base de agar Casman, BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) y medio selectivo (Oxoid), los cuales se incubaron en una combinación de 5% de oxígeno y 10% de dióxido de carbono durante 72 horas a 37°C.
Cada una de las cepas de H. pylori se propagó por triplicado en placas de agar sangre por inoculación consecutiva para obtener biomasa suficiente para la extracción de ADN.
Todos los medios empleados para el cultivo H. pylori se trataron en autoclave a 121°C durante 15 minutos y se enfriaron a aproximadamente 50℃. Posteriormente dentro de una cabina de bioseguridad (para asegurar un medio estéril) se procedió a añadir sangre de caballo o los antibióticos adecuados al medio estéril y finalmente se vertieron en las placas de cultivo. Las placas de agar sangre de caballo se utilizaron de inmediato o se almacenaron a 4°C para su uso posterior.
5.2 EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO
El aislamiento y purificación de ADN genómico de H. pylori se realizó de acuerdo con el manual del kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega).
5.3 ANÁLISIS COMPUTACIONAL
La secuencia del genoma de H. pylori 26695 se obtuvo de la base de datos del GenBank del sitio web del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología (NCBI, por sus siglas en inglés) (Número de Acceso: NC_000915.1). Posteriormente el programa REPuter (Kurtz et al., 2001) se aplicó para identificar todas las secuencias repetidas de H. pylori 26695 genoma. Los fragmentos de repeticiones directas de más de 500 pb se usaron para la prueba en el estudio.
5.4 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS Y PRUEBA DE PCR
Cada grupo de secuencias repetidas directas se alineó con el programa ClustalW2 (Linz et al., 2007a) del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, por sus siglas en inglés) con el fin de definir los límites exteriores máximos de los grupo de repetición directa, para el diseño de oligonucleótidos y de esta manera detectar los eventos de recombinación. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar los fragmentos repetidos directos (>500 pb) fueron diseñados con la ayuda del software DNAstar 7.1. Los oligonucleótidos se localizaron en las regiones que flanqueaban cada repetición de (<500 pb), generalmente con una Tm entre 52-60℃. Cuando un par de oligonucleótidos no produjo un buen producto, se diseñaron nuevos conjuntos de oligonucleótidos hasta que se obtuvo un producto específico en buena cantidad. Todos los pares de oligonucleótidos diseñados, así como su especificidad de amplificación y la formación de dímeros fueron verificados con el software AmplifX1.5.4. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por la compañía Eurofins MWG Operón (EE.UU.). Los oligonucleótidos utilizados en este
Ensayos de PCR: La PCR se realizó en un sistema de reacción de 25-μl que contiene 100 ng de ADN genómico de H. pylori 26695 en una concentración 1x de Buffer de reacción de PCR, 2 mM de cloruro de magnesio, 200 mM de desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs), 1 μM de cada oligonucleótido y 1.25U de Taq ADN polimerasa (Perkin-Elmer). Las amplificaciones de PCR se realizaron en un Termociclador Dyad (Peltier thermal cycler, Applied Biosystems, USA). Las
condiciones para la PCR, en general, son: una desnaturalización inicial a 95°C durante 2 min, 30 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95°C, alineamiento durante 30 segundos (55°C-60°C, de acuerdo con los diferentes valores de Tm de cada par de cebadores) y la extensión a 72°C (30s-150s dependiendo de la longitud de los productos de destino), y una extensión final a 72°C durante 10 min, a continuación, una pausa indefinida a 4°C. Los productos de PCR se examinaron por electroforesis en agarosa al 1% con colorante SYBR Green (Invitrogen). Una cantidad de 50-μl de sistema de reacción y 36 ciclos para la PCR se utilizaron para la estimación de la frecuencia relativa de recombinación.
