TESIS DEFENDIDA POR María del Pilar Martínez Barragán Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ
Dra. Idania Valdez Vazquez
Director del Comité
Dr. Marcial Leonardo Lizárraga Partida Dr. Thomas Gunter Kretzschmar
Miembro del Comité Miembro del Comité
Dr. Carlos Hernández Salvador
Miembro del Comité
Dra. Rufina Hernández Martínez Dr. David Hilario Covarrubias Rosales
Coordinador del programa de posgrado en Ciencias de la vida
Director de Estudios de Posgrado
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DE ENSENADA
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS DE LA VIDA
CON ORIENTACIÓN EN BIOTECNOLOGIA MARINA
PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS DE ORIGEN
MICROBIANO, UTILIZANDO COMO SUSTRATO AGUAS RESIDUALES.
TESIS
que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de MAESTRO EN CIENCIAS
Presenta:
MARÍA DEL PILAR MARTÍNEZ BARRAGÁN
RESUMEN de la tesis de María del Pilar Martínez Barragán, presentada como requisito parcial para la obtención del grado de MAESTRO EN CIENCIAS DE LA VIDA con orientación en Biotecnología Marina. Ensenada, Baja California. Noviembre, 2010.
PRODUCCION Y CARACTERIZACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS DE ORIGEN MICROBIANO, UTILIZANDO COMO SUSTRATO AGUAS RESIDUALES.
Resumen aprobado por:
____________________________ Dra. Idania Valdez Vazquez Director de Tesis
Los microorganismos al transcurso de la historia se han caracterizado por su extraordinaria diversidad metabólica, lo que ha permitido su amplio uso en el área alimentaria, farmacéutica e industrial. Entre los múltiples productos sintetizados y acumulados por éstos, los ácidos grasos son actualmente de gran interés en el área industrial, debido a su posible uso para la elaboración de biodiesel. Entre los microorganismos oleaginosos, las bacterias han sido las menos exploradas, registrándose sólo unas pocas especies como oleaginosas bajo determinadas condiciones (fisicoquímicas o nutricionales). No obstante, este grupo puede ser una fuente potencial de ácidos grasos debido a su gran capacidad para crecer en diferentes sustratos, soportar condiciones extremas y por la amplia diversidad de lípidos capaces de sintetizar. Con el fin de brindar información sobre posibles bacterias oleaginosas, sus productos y dar un mayor aprovechamiento a las aguas residuales, en el presente trabajo se analizó el efecto de la temperatura (20 ºC y 35 °C), la relación de C:N (60 y 150) y la fuente de nitrógeno (NH4Cl y glicina), sobre la producción
de ácidos grasos en especies bacterianas aisladas de Ensenada, B.C., utilizando como medio de cultivo aguas residuales. Para este estudio se aplicó un diseño factorial 2^3, los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente con un ANOVA factorial (p < 0.05) y el perfil de ácidos grasos se obtuvo a partir de cromatografía de gases. De un total de 11 cepas posiblemente oleaginosas (9 de fuentes marinas y 2 de aguas residuales), se seleccionaron dos cepas por mostrar una capacidad para acumular lípidos, rápido crecimiento y por aprovechar varios sustratos. Estas cepas se identificaron molecularmente como especies del género Bacillus. Entre los factores estudiados la temperatura y fuente de nitrógeno (p<0.01) influyeron significativa- y positivamente sobre la síntesis de lípidos de estas dos especies. La mayor producción de lípidos se alcanzó con Bacillus sp. SDM5, aislada de sedimento marino, logrando 0.15 mglip/mgps a 20 °C
y glicina, mientras que con Bacillus sp. WWN2, aislada de aguas residuales, se obtuvo un máximo de 0.10 mglip/mgps a 35 °C y con NH4Cl.Respecto al perfil de los ácidos grasos, los más
abundantes fueron los ácidos palmítico (24.68% - 50.87%) y esteárico (17.05% - 33.5%) y con porcentajes menores se presentaron ácidos que parecen corresponder a ácidos grasos ramificados o ácidos polihidroxialcanoatos, siendo estos últimos excelentes candidatos para la producción de biopolímeros.
ABSTRACT of the thesis presented by María del Pilar Martínez Barragán as a partial requirement to obtain the MASTER OF LIFE SCIENCE with orientation on Marine Biotechnology. Ensenada, Baja California, México november, 2010.
PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF FATTY ACID OF MICROBIAL ORIGIN, USING WASTEWATER AS SUBTRATE.
ABSTRACT
Through the course of history, microorganisms have been characterized by its extraordinary metabolic diversity, which has allowed its wide use in the pharmaceutical, industrial and food area. Among the many products synthesized and accumulated by these, fatty acids are currently of great interest in the industrial area, due to its possible use for the biodiesel production. Among the oleaginous microorganisms, bacteria have been the least explored, having only a few species registered as oleaginous under certain conditions (physicochemical or nutritional). However, this group may be a potential source of fatty acids because their great ability to grow on any substrate, survive extreme environmental conditions and because their capacity to produce a wide lipid diversity. To provide further information about possible oleaginous bacteria, its products and to search for a better use of wastewater, in this thesis we analyzed the fatty acid production from bacteria isolated from Ensenada, B.C., using wastewater as substrate and under two temperature conditions (20 º C and 35 ° C), two C:N ratios (60 and 150) and two sources of nitrogen (NH4Cl
and glycine). For this analysis was used a factorial experimental design 2 ^ 3 and the statistical analysis applied was an ANOVA with a 95% confidence interval. The fatty acid profile was obtained by gas chromatography.
From a total of 11 possible oleaginous strains (9 from marine sources and 2 from wastewater), two were selected due to their greater ability to accumulate lipids, rapid growth and ability to take advantage of multiple substrates. These strains were identified at the molecular level as Bacillus sp. SDM5 (marine source) and Bacillus sp.WWN2 (wastewater). Among the factors, temperature and nitrogen source (p <0.01) had a significant and positive effect on the synthesis of lipids in these two strains. For Bacillus sp. SDM5 lipid accumulation was between 0.03 to 0.15 mglip/mgdw,
the highest production was obtained the 20 °C with glycine and Bacillus sp. WWN2 with production range of 0.04 - 0.1 mglip/mgdw, the highest production was obtained the 35 °C with NH4Cl as
nitrogen source. Regarding the profile, the most abundant ones were palmitic acid and stearic acid and other lipids were detected which could be branched fatty acid and polyhydroxyalkanoates acids, there are an excellent candidate for biopolymers production.
DEDICATORIAS
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero dar gracias a CICESE por brindarme la oportunidad de realizar mi posgrado en sus instalaciones y a CONACYT (CVU/Becario: 268905/221739) por otorgarme una beca, que me permitió culminar exitosamente este proceso.
Agradezco a la Dra. Idania Valdez por estar pendiente de este trabajo desde la primera hasta la última línea, por enseñarme a tener más confianza en mis conocimientos, ser más paciente, a escuchar y ver lo fructífero que es el trabajo en equipo.
Al Dr. Leonardo Lizárraga, Dr. Carlos Salvador y Dr. Thomas Kretzschmar por aceptar ser miembros de mi comité y acompañarme en este proceso.
A mi familia conformada por: mi papá alias “el Vejete” que a pesar de su temperamento ha estado apoyándome en este duro proceso. Mis hermanos Camilo y Daniel quienes con sus aventuras de colegio y universidad me hicieron reír sin parar. Mi tío Germán que siempre me mantuvo al día de todos los eventos que transcurrían en la familia y que a pesar de la distancia con sus llamadas me hizo sentir cerca a casa. A Marlene, Fernando, Rafael (tíos), Ronald, Héctor, Javi y Yamile (primos), a mis abuelos adoptivos Ana y Jacinto por sus llamaditas inesperadas y llenas de fortaleza, mi madrina Lulú por su voz de aliento y por último pero no menos importante a la matriarca de los Barragán, mi abuelita Mercedes, que aun en estos momentos sigue demostrando su “endereza y empuje”.
A mi gran y mejor amiga Mayra Fabiola López de la Torre, quién me abrió las puertas de su corazón y su casa desde que toqué tierra Mexicana, estuvo siempre presente en todos los momentos alegres y tristes en estos dos años y que espero lo siga haciendo por muchos años más, me brindó su mano para salir de la tristeza y que espero sepa puede contar con la mía y quien me enriqueció no solo como persona sino como profesional. Por cierto, que aunque diga que es mexicana de nacimiento y española de corazón, yo creo que es más colombiana que nada. A la señorita Rosa María Rico Blanco, quien en dos meses me brindó una risa y un abrazo a diario, escuchó mis largas y monótonas charlas sobre “microorganismos oleaginosos”, se tomó un tiempo para atender mis llamadas de auxilio y quien al final de un día de dramáticos dolores, me dio una corta clase sobre el ARNr 16S, muchas gracias y ¡VIVA MÁLAGA! Ehpaña.
A don Ramón, por la valiosa amistad que me brindó desde que llegue a CICESE y que día a día se enriqueció con sonrisas y sabios consejos al calor de un café. Conocerle deja una huella imborrable en mi vida y en mi corazón.
A mis compañeros de laboratorio Oscar Martínez “Puebla”, Carmen y Karla Alejo por su compañía dentro y fuera de CICESE, aunque estos últimos hayan sido pocos.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ... I
ABSTRACT ... II
DEDICATORIAS ... III
AGRADECIMIENTOS ... IV
LISTA DE FIGURAS ... VIII
LISTADO DE TABLAS ... X
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES ... 5
II.1 Ácidos grasos ...5
II.1.1 Definición y funciones ... 5
II.1.2 Tipos de ácidos grasos ... 6
II.1.2.1 Ácidos grasos saturados e insaturados ... 6
II.1.2.2 Triglicéridos y Ácidos polihidroxialcanoatos(PHA) ... 7
II.1.3 Síntesis de ácidos grasos ... 8
II.1.3.1 Triglicéridos y PHA ... 10
II.2 Biodiesel ...12
II.3 Aguas Residuales ...15
II.4 Antecedentes ...19
III. HIPÓTESIS... 24
IV. OBJETIVOS ... 24
IV.1 Objetivo General ...24
IV.2 Objetivos Específicos ...24
V. METODOLOGÍA ... 25
V.1 Aislamiento y selección de microorganismos oleaginosos ...25
V.1.1 Aislamiento de microorganismos oleaginosos ... 25
V.1.2. Selección de microorganismos oleaginosos ... 28
V.1.2.1 Selección cualitativa ... 28
V.1.2.2 Verificación cuantitativa ... 29
V.1.2.2.1 Extracción de lípidos por el método de Bligh y Dyer (1969) ... 30
V.1.2.2.2 Extracción de lípidos intracelulares (método de Cunniff, 1995) ... 31
V.1.2.2.3 Determinación de biomasa seca ... 31
V.2 Caracterización bioquímica e identificación molecular de los microorganismos oleaginosos ...32
V.2.1 Caracterización bioquímica ... 32
V.2.1.1 Coloración de Gram... 32
V.2.1.2 Movilidad ... 32
V.2.1.3 Hidrólisis de almidón... 33
V.2.1.4 Hidrólisis de caseína... 33
V.2.1.5 Producción de catalasa ... 33
TABLA DE CONTENIDO (continuación)
V.2.1.7 Crecimiento en diferentes fuentes de carbono ... 34
V.2.2 Identificación molecular ... 35
V.2.2.1 Extracción de ácidos nucleicos por el método fenol-cloroformo ... 35
V.2.2.2 Amplificación por PCR ... 36
V.2.2.3 Purificación y secuenciación del producto de PCR ... 37
V.3 Producción de lípidos bacterianos a partir de agua residual ...37
V.3.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual acondicionada... 37
V.3.2 Ensayos de crecimiento en agua residual ... 38
V.3.2.1 Cinéticas de crecimiento ... 39
V.3.3 Efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de N sobre la producción de lípidos ... 40
V.3.3.1 Diseño factorial 2k ... 40
V.3.3.2 Procedimiento experimental... 40
V.3.3.3 Métodos analíticos ... 41
V.3.3.3.1 Demanda química de oxígeno ... 41
V.3.3.3.2 Perfil de ácidos grasos... 42
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 44
VI.1 Aislamiento y selección de microorganismos oleaginosos ...44
VI.1.1 Aislamiento de microorganismos oleaginosos ... 44
VI.1.2 Selección de microorganismos oleaginosos ... 45
VI.2 Caracterización bioquímica e identificación molecular de los microorganismos oleaginosos ...53
VI.2.1 Caracterización bioquímica ... 53
VI.2.2 Identificación molecular ... 56
VI.3 Producción de lípidos bacterianos a partir de agua residual ...61
VI.3.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual acondicionada... 61
VI.3.2 Ensayos de crecimiento en agua residual acondicionada ... 62
VI.3.3 Efecto de la temperatura, fuente de nitrógeno y relación C:N sobre la producción de lípidos ... 64
VI.3.3.1 Velocidad de crecimiento ... 64
VI.3.3.2 Producción de lípidos ... 68
VI.3.3.3 Perfil de ácidos grasos ... 76
VI.3.3.4 Posibles aplicaciones industriales ... 81
VII. CONCLUSIONES ... 83
VIII. RECOMENDACIONES ... 85
IX. BIBLIOGRAFÍA ... 87
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química de una molécula de triglicérido (TAG). ...7
Figura 2. Estructura química de un ácido polihidroxialcoanatos (PHA)...8
Figura 3. Biosíntesis de lípidos en microorganismos oleaginosos (Modificado Ratledge y Wynn 2002). Enzimas: 1: piruvato carboxilasa, 2:deshidrogenasa málica, 3: enzima málica, 4: piruvato deshidrogenasa, 5: citrato sintasa, 6: Aconitasa, 7: isocitrato deshidrogenasa, 8:citrato/malato translocasa, 9: ATP citrato liasa. ...9
Figura 4. Rutas para la síntesis de los ácidos grasos insaturados y poliinsaturados en microorganismos: elongasa 4,5,6,9,12y 15 y desaturasa 17 (tomado de Ratledge,
2004). ...10
Figura 5. Reacciones metabólicas en la biosíntesis de los triacilgliceroles (TAG) en bacterias (Álvarez y Steinbüchel, 2002). ...11
Figura 6. Ecuación general del proceso de transesterificación (Fukuda et al. 2001). ...12
Figura 7. Fotografías de tinciones con Negro Sudán B correspondientes a las cepas SDM5 y WWN2. (↓) Indica el material liposoluble intracelular teñido. ...45
Figura 8. Incrustaciones lipídicas teñidas con Negro Sudán B para el género Bacillus en fase estacionaria (tomada de Burdon, 1946). ...45
Figura 9. Curvas de crecimiento y producción de lípidos de las cepas SDM5, SDM9 y SWEM8 en medio de inducción con una relación C/N: 150. ...51
Figura 10. Curvas de crecimiento y producción de lípidos de las cepas WWN2 y WWN3 en medio de inducción con una relación C/N: 150. ...53
Figura 11. Comparación entre las secuencias de la cepa SDM5 y Bacillus aquimaris cepa HM480347 (100% similitud). Editado de la página de NCBI. ...56
Figura 12. Comparación entre las secuencias de la cepa SDM5 y Bacillus vietnamensis cepa N20-1 (100% similitud). Editado de la página de NCBI. ...57
LISTADO DE FIGURAS (continuación)
Figura 14. Comparación entre las secuencias de la cepa WWN2 y Bacillus
amyloliquefaciens cepa HM992829 (99% similitud). Editado de la página de NCBI.
...58
Figura 15. Relaciones filogenéticas para las cepas SDM5 y WWN2, basadas en secuencias del ARN ribosómico 16S. Filograma obtenido con el programa Phylogeny. Fr (Dereeper et al. 2008). ...60
Figura 16. Crecimiento de Bacillus sp. SDM5 en diferentes porcentajes de agua residual acondicionada. ...62
Figura 17. Crecimiento de Bacillus sp. SDM5 en agua residual acondicionada suplementada...63
Figura 18. Crecimiento de Bacillus sp. WWN2 en agua residual acondicionada suplementada...63
Figura 19. Efectos principales de la temperatura, fuente de nitrógeno y relación C:N sobre la velocidad de crecimiento de Bacillus sp. WWN2 y Bacillus sp. SDM5 en ARAS. ...66
Figura 20. Producción de lípidos en función de la fuente de nitrógeno, relación C:N y temperatura con Bacillus sp.SDM5 y Bacillus sp.WWN2 en ARAS. ...69
Figura 21. Efecto principal de la fuente de nitrógeno sobre la producción de lípidos (ácidos grasos) en Bacillus sp.WWN2 y Bacillus sp. SDM5. ...70
Figura 22. Efecto principal de la temperatura sobre la producción de lípidos (ácidos grasos) en Bacillus sp. WWN2 y Bacillus sp. SDM5. ...73
LISTADO DE TABLAS
Tabla I. Listado de algunos ácidos grasos saturados e insaturados. ...6
Tabla II. Propiedades fisicoquímicas del biodiesel. ...13
Tabla III. Listado de microalgas, levaduras y hongos oleaginosos con potencial para la síntesis de ácidos grasos con fines oleoquímicos. ...15
Tabla IV. Clasificación del agua residual de acuerdo a su composición (Tomada de Mefcalt y Eddy, 1991). ...16
Tabla V. Listado de estudios realizados con bacterias catalogadas como oleaginosas, indicando sustrato utilizado y porcentaje de lípidos producidos. ...20
Tabla VI. Sitios de muestreo para el aislamiento de microorganismos ...27
Tabla VII. Caracterización fisicoquímica del agua residual acondicionada. ...38
Tabla VIII. Diseño factorial 2k para estudiar el efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de nitrógeno sobre la producción de lípidos microbianos. ...40
Tabla IX. Número de cepas aisladas de origen marino, del campo geotérmico Cerro Prieto y de agua residuale. ...44
Tabla X. Porcentaje de células teñidas con Negro Sudán B bajo diferentes relaciones C/N. ...47
Tabla XI. Características bioquímicas de las bacterias acumuladoras de lípidos. ...54
Tabla XII. Crecimiento de las bacterias oleaginosas bajo distintas fuentes de carbono. ..55
Tabla XIII. Listado de las especies del género Bacillus que presentaron una similitud del 100% con el segmento de ARNr 16S amplificado para las cepas SDM5 y WWN2. ...59
Tabla XIV. Análisis fisicoquímico del agua residual acondicionada. ...61
Tabla XV. Velocidades de crecimiento en los diferentes tratamientos en agua residual. .65
Tabla XVI. Producciones lipídicas en microorganismos oleaginosos. ...75
Tabla XVII. Perfil de los ácidos grasos sintetizados por Bacillus sp.SDM5 en ARAS. ...78
I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos al transcurso de la historia se han caracterizado por su extraordinaria diversidad metabólica, lo que ha permitido su amplio uso en el área alimentaria, farmacéutica e industrial (Magidan et al. 2000; Hold et al. 1992). Entre los múltiples productos sintetizados y acumulados por éstos, se encuentra actualmente uno de gran interés en el área industrial por su posible uso en la elaboración de biodiesel, los ácidos grasos.
Para la elaboración de este biocombustible (que es considerado una de las alternativas de energía más viable para sustituir a largo plazo al combustible de origen fósil), se han utilizado principalmente los ácidos grasos de origen vegetal. Sin embargo, desde los años 80’s esta fuente de lípidos no se considera rentable económica- y ambientalmente por: 1) deterioro ocasionado en suelo y agua por el uso de pesticidas en las siembras, 2) lentitud en obtener los lípidos, debido a los largos periodos de crecimiento de los cultivos, 3) elevados costos por el mantenimiento de los cultivos y la inversión tecnológica para lograr un producto con calidad aceptable y 4) competencia en determinados países sobre el uso de los cultivos como fuente de alimento o de biocombustibles, situación observada Asia, China e India (Canakci y Sanli, 2008; De Fraiture et al. 2008; Meng et al. 2008; Patnayak y Sree, 2005; Ratledge, 2004).
(Álvarez et al. 1997a; Álvarez y Steinbüchel, 2002; Certik y Shimizu, 1999; Lemann, 1997; Meng et al. 2008; Quiang et al. 2008; Ratledge, 2002; Ratledge, 2004; Ritmann, 2008).
Los microorganismos que tienen la capacidad de acumular lípidos en una cantidad superior al 20% de su masa celular y que son considerados una fuente alternativa de lípidos para biocombustibles u otros productos industriales, se denominan oleaginosos. Fisiológicamente, su proceso de acumulación de ácidos grasos (considerados la mayor reserva energética en todos los seres vivos) está relacionado con cuatro aspectos: 1) exceso de carbono y limitación de nitrógeno en el medio, lo cual obliga al microorganismo a detener su crecimiento y producir material de reserva para su supervivencia a partir del carbono disponible; 2) cambios en los factores fisicoquímicos del medio como la temperatura, pH, oxígeno y la concentración de diferentes iones, los cuales pueden generar diferentes estímulos en el complejo enzimático que participa en la síntesis de ácidos grasos, 3) fase de crecimiento en la cual se encuentre el microorganismo y 4) por aspectos genéticos (Angerbauer et al. 2008, Certik y Shimizu, 1999; Cronan, 1978; Ratledge, 2002; Ratledge y Wynn, 2002; Suutari et al. 1990,). Generalmente, la acumulación de lípidos ocurre como inclusiones intracelulares (Shively, 1974); en procariotas es común hallarlos en forma de ácidos grasos saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGM), ácidos grasos ramificados (iso-anteiso) y ác. polihidroxialcanoatos (PHA) y rara vez en forma de triglicéridos (TAG), aunque éstos últimos son los más comunes en organismos eucariotas (Álvarez y Steinbüchel, 2002; Álvarez et al.1997a y b; Certik y Shimizu, 1999; Meng et al. 2008).
Entre los microorganismos oleaginosos (bacterias, levaduras, hongos filamentosos y microalgas), las microalgas autótrofas han sido las más usadas para obtener ácidos grasos, con producciones entre un 16% y 75% (Meng et al. 2008). Estas se caracterizan por aprovechar el CO2 como fuente de carbono y por
requerimiento de luz ha sido el mayor limitante para su explotación comercial debido a los elevados costos para su mantenimiento (Chisti, 2008; Quiang et al. 2008). Con microorganismos heterótrofos, como hongos, levaduras y bacterias la limitación generada por la necesidad de luz se elimina y se pueden obtener acumulaciones lipídicas entre un 60 y 85% de su peso seco.
De los microorganismos heterótrofos, las bacterias han sido las menos exploradas como fuente de lípidos para la producción de biocombustibles. No obstante, estas se caracterizan por su capacidad de producir una gran diversidad de ácidos grasos, con varias propiedades útiles en la industria (e.g. polihidroxialcoanatos que presentan propiedades termoplásticas). A nivel metabólico la proporción de estos ácidos en el microorganismo pueden variar, de acuerdo al estímulo originado por factores físicos y nutricionales (Álvarez y Steinbüchel, 2002; Fulco, 1983), como se ha observado con algunas especies de los géneros Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas, Mycobacterium, Acinetobacter y Streptomyces, que hasta ahora han sido los únicos entre el grupo de las bacterias consideradas como oleaginosas (Álvarez et al. 1997b; Olukoshi y Packter, 1994; Meng et al. 2008; Ratlegde, 2004; Steinbüchel y Valentin, 1995).
Existen dos características que dan a las bacterias un potencial para la síntesis de ácidos grasos viables para biodiesel: 1) la abundancia de ácidos monoinsaturados en sus productos lipídicos que son más apropiados para fines oleoquímicos, por ser menos susceptibles a la oxidación en comparación con los poliinsaturados abundantes en eucariotas y 2) su capacidad de degradar un amplio espectro de sustancias orgánicas en compuestos más simples o en productos de interés como lípidos (Álvarez y Steinbüchel, 2002; Fulco, 1983; Knothe et al. 2006; Madigan et al. 2000 ).
diversidad de materia orgánica presentes en las aguas residuales, hacen que sean un buen sustrato para ensayar la síntesis de lípidos utilizando bacterias. Esta asociación entre las bacterias y el agua residual para la producción de ácidos grasos destinados a biodiesel daría inicio al aprovechamiento del agua residual y consecuentemente la disminución de su negativo impacto ambiental (Glynn y Gary, 1999).
II. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES
II.1 Ácidos grasos
II.1.1 Definición y funciones
Los ácidos grasos (R – COOH) son biomoléculas lipídicas anfipáticas, que están formados por una cadena hidrocarbonada lineal (R) no menor a 4 carbonos y un grupo carboxilo (-COOH) ubicado en el n terminal de la cadena (Certik y Shimizu, 1999; Madigan et al. 2000). Los enlaces de la cadena son covalentes y dependiendo si son sencillos o dobles la clasificación en ácidos grasos saturados (AGS: enlace sencillo), insaturados (AGI: un doble enlace) y poliinsaturados (AGP: más de dos enlaces dobles) (Fulco, 1983; Madigan et al. 2000; Ratledge, 1993).
II.1.2 Tipos de ácidos grasos
Los ácidos grasos se clasifican como saturados e insaturados (mono- y poliinsaturados) de acuerdo al tipo y número de los enlaces (sencillos, dobles o triples) presentes en su cadena hidrocarbonada. En los microorganismos se pueden presentar libres y/o unidos a otras moléculas formando triglicéridos o triacilgliceroles (TAG) (predominantes en eucariotas), ácidos especializados como polihidroxialcoanatos (PHA) (abundantes en procariotas), entre otros (Álvarez et al. 1996; Barksdale y Kim, 1997; Olukoshi y Packter, 1994; Steinbüchel et al. 1995).
II.1.2.1 Ácidos grasos saturados e insaturados
Los ácidos grasos saturados sólo presentan enlaces simples y son generalmente sólidos a temperatura ambiente. Por otro lado, los ácidos grasos insaturados presentan enlaces dobles y dependiendo si es uno o más, se clasifican en mono- o poliinsaturados, respectivamente. Los enlaces dobles son de tipo cis, y físicamente estos ácidos insaturados son líquidos a temperatura ambiente. A continuación se mencionan ejemplos de ácidos grasos (Tabla I).
Tabla I. Listado de algunos ácidos grasos saturados e insaturados.
ÁCIDOS GRASOS SATURADOS CH3-(CH2)N –COOH Ácido butírico CH3(CH2)2COOH
Ácido láurico CH3(CH2)10COOH
Ácido mirístico CH3(CH2)12COOH
Ácido palmítico CH3(CH2)14COOH
Ácido esteárico CH3(CH2)16COOH
Ácido araquídico CH3(CH2)18COOH
ACIDOS GRASOS INSATURADOS
Ácido linolénico CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
Ácido linoléico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH
Ácido oleico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
II.1.2.2 Triglicéridos y Ácidos polihidroxialcanoatos (PHA)
Los triglicéridos son compuestos formados por una molécula de glicerol, que tiene esterificado sus grupos hidroxilos (OH-) con ácidos grasos (Figura 1). Las características de estos compuestos están determinadas por el tamaño de la cadena y enlaces que contengan los ácidos grasos que hacen parte de su estructura (Álvarez et al. 1997a y b; Álvarez y Steinbüchel, 2002).
Figura 1. Estructura química de una molécula de triglicérido (TAG).
Figura 2. Estructura química de un ácido polihidroxialcoanatos (PHA).
II.1.3 Síntesis de ácidos grasos
La acumulación de ácidos grasos en bacterias al igual que en otros microorganismos, ha sido una estrategia desarrollada para sobrevivir en ambientes con fuertes cambios nutricionales y fisicoquímicos, que pueden alterar la integridad celular (Álvarez et al. 1997b; Álvarez y Steinbüchel, 2002; Angerbauer et al. 2008; Cronan, 1978; Ratledge, 1993; Suutari et al. 1990).
translocasa (el malato para este intercambio se obtiene de la transformación del oxaloacetato, por la vía malato deshidrogenasa). El citrato en el citoplasma se une al acetil Co-A por medio de la ATP: Citrato-liasa (enzima ausente en microorganismos no oleaginosos) y comienza la biosíntesis de lípidos con la sintasa de ácidos grasos (SAG) y la enzima málica (EM) donadora de los NADPH, la cual se activará de acuerdo a la cantidad de ácidos grasos en la célula, es decir, si la cantidad es baja la EM se inactiva y viceversa (Figura 3) (Álvarez y Steinbüchel, 2002; Ratledge, 2002; Ratledge, 2004). Al estar ensamblados los lípidos en forma de triglicéridos o ácidos grasos libres, estos son incorporados posteriormente al retículo endoplasmático.
Figura 3. Biosíntesis de lípidos en microorganismos oleaginosos (Modificado Ratledge y Wynn 2002). Enzimas: 1: piruvato carboxilasa, 2:deshidrogenasa málica, 3: enzima málica, 4: piruvato deshidrogenasa, 5:
La biosíntesis de los ácidos grasos termina generalmente en la formación de ácidos grasos saturados de 16 carbonos (C16) o 18 carbonos (C18), a partir de los cuales se obtienen ácidos grasos insaturados y poliinsaturados como resultado de una serie de desaturaciones y elongaciones (Figura 4).
Figura 4. Rutas para la síntesis de los ácidos grasos insaturados y poliinsaturados en microorganismos: elongasa 4,5,6,9,12y 15 y desaturasa 17 (tomado de Ratledge, 2004).
II.1.3.1 Triglicéridos y PHA
proceso es la diaglicerol acetiltransferasa (DGAT), la cual cataliza la última acilación de la molécula de glicerol con los ácidos grasos. Su actividad está relacionada con la fase de crecimiento, aumentando en la fase estacionaria y disminuyendo en la fase exponencial o en cultivos viejos, concomitante con un aumento de la enzima TAG hidrolasa (Olukoshi y Packter, 1994) (Figura 5).
Figura 5. Reacciones metabólicas en la biosíntesis de los triacilgliceroles (TAG) en bacterias (Álvarez y Steinbüchel, 2002).
En cuanto a los ácidos polihidroxialcanoatos (PHA), su mayor producción se manifiesta en la fase exponencial de crecimiento aún en presencia de nitrógeno, por medio de la enzima PHA sintasa y tomando como sustrato el acetil Co-A y/o propionil-CoA. Posteriormente, cuando se agota el nitrógeno y los microorganismos entran a la fase estacionaria, la cantidad sintetizada de PHA disminuye y da inicio la producción de triglicéridos por la enzima ATP-citrato liasa, la cual presenta su mayor actividad en esta fase. En muchas situaciones, dependiendo de la especie y de la fuente de carbono, en este fase se puede
Sn-glicerol 3P
Glicerol 3P fosfato aciltransferasa
Acilglicerol 3P Acido Fosfatídico
Acilglicerol 3P fosfato aciltransferasa
Diacilglicerol 3P Acido Fosfatídico
Fosfatidato fosfatasa
Diacilglicerol
TRIACILGLICEROL Acil-CoA
presentar una competencia por el acetil Co-A como sustrato entre las enzimas PHA sintasa y la ATP-citrato liasa (Ratledge, 2004).
II.2 Biodiesel
El biodiesel se define como una mezcla de monoacil ésteres con cadenas largas de ácidos grasos y cadenas cortas de alcoholes (e.g. ácidos grasos etil ester - AGEEs o ácidos grasos metil ester - AGMEs), obtenidos de la transesterificación de triglicéridos de origen vegetal o animal (materia biodegradable) (Demirbas, 2008; Meng et al. 2008; Sandun et al. 2006).
Este proceso de transesterificación permite la separación de los ácidos grasos y el glicerol por medio de un catalizador alcalino (hidróxido de sodio o hidróxido de potasio) en presencia de un alcohol (Figura 6) y consecuentemente reduce la viscosidad de los ácidos grasos (Canakci y Sanli, 2008; Fukuda et al. 2001).
Figura 6. Ecuación general del proceso de transesterificación (Fukuda et al. 2001).
Este biocombustible es considerado el mejor candidato para reemplazar a largo plazo al combustible de origen fósil, que actualmente enfrenta dos problemas: 1) el agotamiento de sus reservas debido a la sobreexplotación y 2) la alta contaminación generada por la emisión de gases de efecto invernadero (Canakci y Sanli, 2008; De Fraiture et al. 2008; Demirbas, 2008). Entre sus ventajas están: i) una emisión de energía similar al petróleo, ii) menor liberación de gases tóxicos
CH2-OOC-R1 R1-COO-R’ CH2-OH
CH-OOC-R2 + 3R’OH R2-COO-R’ + CH-OH
CH2-OOC-R3 R3-COO-R’ CH2-OH
(sulfuros, compuestos aromáticos, monóxido de carbono, dióxido de carbono, óxido nitroso y materia particulada) (Dunn, 2001), iii) rápida degradación y iv) la posibilidad de utilizar materias primas de bajo costo (Tabla II) (Bala, 2005; Sheehan et al.1998; Reijnders, 2006). No obstante, la elaboración de este biocombustible presenta algunos inconvenientes, como su elevado costo comercial debido a las fuentes de lípidos utilizadas (plantas), la emisión de óxidos de nitrógeno que implican un pre-tratamiento para cumplir con las normas y otros aspectos de ingeniería automotriz (Demirbas, 2008; Knothe et al. 2006).
Tabla II. Propiedades fisicoquímicas del biodiesel.
Nombre común Biodiesel
Nombre químico Ácidos grasos (m)etil ester
Formula química C14 – C24 metil esteres o C
15-25 H28-48 O2
Rango viscosidad cinemática (mm2/s, a 313 K) 3.3-5.2
Densidad (Kg/m3, a 288 K) 860-894
Punto ebullición (K) >475
Puntos inflamación (K) 430 – 455
Destilación (K) 470 – 600
Valor presión (mm Hg a 295 K) <5
Solubilidad en agua Insoluble
Apariencia física Amarillo
Olor
Biodegradabilidad Más biodegradable que el
petróleo
Reactividad
Estable, pero evita la oxidación de reactivos fuertes
una alta viscosidad y baja volatilidad, características no apropiadas para su uso comercial y 4) competencia en países asiáticos por el uso de cultivos oleaginosos como fuente alimento o como materia prima para producir biodiesel (Canacki y Sanli, 2008; De Fraiture et al. 2008; Meng et al. 2008).
Por estos inconvenientes, actualmente se explora la obtención de biodiesel a partir de lípidos de origen microbiano (Demirbas, 2008; Quiang et al. 2008; Meng et al. 2008; Ritmann, 2008). Estos pueden considerarse una fuente alternativa eficiente, debido i) a la posibilidad de reducir el costo de producción mediante la utilización de sustratos económicos, ii) rápida producción por los cortos tiempos del crecimiento microbiano, iii) facilidad en su producción a gran escala, iv) capacidad para sintetizar un amplio abanico de ácidos grasos, v) posible manipulación sobre el tipo y cantidad de ácidos grasos producidos, vi) así como la disponibilidad de técnicas genéticas para mejorar los rendimientos de producción (Álvarez y Steinbüchel, 2002; Certik y Shimizu, 1999; Lemann, 1997; Meng et al. 2008; Quiang et al. 2008; Ratledge, 2002; Ritmann, 2008).
Tabla III. Listado de microalgas, levaduras y hongos oleaginosos con potencial para la síntesis de ácidos grasos con fines oleoquímicos.
Microalgas Lípidos (%)
Levaduras Lípidos (%)
Hongos Lípidos (%) Botryococcus braunii 25-75 Rhodotorula minuta 11-48 Aspergillus oryzae 57 Cylindrateca sp. 16-37 Candida curvata 58 Mortierella isabellina 86 Nitzschia sp. 45-47 Cryptococcus albidus 64 Humicula lanuginosa 75 Schizochytrium sp. 50-77 Rhodotorula glutinis 72 Mortierella vinacea 66 Aspergillus nidulans 50 Aspergillus sydowii 42.1 Fusarium oxysporum 51 Fusarium equisetti 36.2
Respecto a la producción mundial de biodiesel, Europa, Estados Unidos, Suráfrica, China y Brasil son los principales proveedores (Bala, 2005; Canakci y Sanli, 2008). Para comercializar biodiesel, estos países cuentan con una serie de estándares que indican i) los parámetros fisicoquímicos que son requeridos para su uso comercial, ii) los métodos utilizados para su análisis, iii) valores límites y iv) unidades de medición. Estos estándares se basan principalmente en dos normas, la ASMT D-6751 (American Section of the International Association for Testing Materials) (Anexo A), implementada en Estados Unidos y la norma europea EN 14214 (Anexo B). La diferencia entre estas normativas, está en la cantidad de parámetros considerados para determinar la calidad del biodiesel, los cuales son más en la norma europea, que incluye los rangos de monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos que deben estar presentes, así como aspectos fisicoquímicos sobre estos (Canakci y Sanli, 2008; Knothe et al. 2006).
II.3 Aguas Residuales
origen, y para su estimación se analizan algunos parámetros fisicoquímicos como el porcentaje de sólidos suspendidos (SS), demanda química de oxígeno (DQO), demanda biológica de oxígeno (DBO), carbono orgánico total (COT), nitrógeno total, nitrógeno amoniacal y metales pesados (Tabla IV). De acuerdo a estos parámetros (u otros dependiendo de la planta de tratamiento) se puede determinar la conveniencia de su descarga en bienes nacionales o cuerpos de agua según la normativa aplicable (Madigan et al. 2000; Rigola-Lapeña, 1989).
Tabla IV. Clasificación del agua residual de acuerdo a su composición (Tomada de Mefcalt y Eddy, 1991).
Componente Fuerte Media Débil
Sólidos Totales 1200 720 35
Disueltos 950 500 250
Fijos 525 300 145
Volátiles 325 200 105
Suspendidos 350 220 100
Fijos 75 55 20
Volátiles 275 165 80
Sedimentables 20 10 5
DBO 400 220 110
COT 290 160 80
DQO 1000 500 250
Nitrógeno Total 85 40 20
Orgánico 35 15 8
Amoniacal 50 25 12
Nitritos 0 0 0
Nitratos 0 0 0
Fósforo Total 15 8 4
Orgánico 5 3 1
Inorgánico 10 5 3
Cloruros 100 50 30
Alcalinidad 200 100 50
En México, la Secretaria del Medio Ambiente y de Recursos Naturales (SERMANAT) es la entidad encargada de emitir las normas que regulan los límites máximos permisibles para la descarga de aguas residuales en arroyos, ríos, lagos y océanos, con el fin de proteger estos recursos hidráulicos. Algunas de las normas vigentes son la AA-005 SCFI 2000 (grasas y aceites), 026 SCFI 2001 (nitrógeno total), 029 SCFI 2001 (fosfatos), NMX-AA-030 SCFI 2001(DQO), MX-AA-034 SCFI 2001 (sólidos), NMX-AA-073 SCFI 2001 (cloruros). Para lograr los estándares impuestos por estas normas, el agua residual se somete a una serie de tratamientos, que varían dependiendo de su grado de contaminación y su uso final. Estos tratamientos se dividen en tres etapas principales, tratamiento primario, secundario y terciario (Glynn y Gary, 1999; Madigan et al. 2000).
En el tratamiento primario, se realiza la reducción de los sólidos en suspensión contenidos en el agua residual, a partir de diferentes mecanismos físicos o químicos, como: a) la decantación que se basa en la densidad de las partículas y el efecto de la gravedad, b) por coagulación y floculación que emplea la eliminación de cargas eléctricas presentes en los sólidos con un coagulante y la agrupación de partículas descargadas a partir de floculantes y c) la filtración que permite retener objetos de gran tamaño como trapos, plásticos, hojas, entre otros por medio de rejillas.
cantidad de lodos activados, como resultado del crecimiento microbiano por el consumo de los nutrientes presentes en el agua residual (Rigola-Lapeña, 1989). En el tratamiento secundario se puede utilizar diferentes configuraciones de reactores biológicos lo cual depende la composición del agua residual. Estos reactores se pueden clasificar de acuerdo al i) requerimiento de oxígeno, en aerobios o anaerobios y ii) conforme al tipo de crecimiento en reactores, como película fija o de biomasa suspendida. En el proceso aerobio, participan algas verdes y bacterias aerobias que llevan a cabo la fotosíntesis y la respiración, por lo que requieren estanques de poca profundidad y amplia superficie para la disponibilidad de oxígeno. Por otro lado, en el proceso anaerobio el primer paso es la fermentación de la materia orgánica por medio de bacterias anaerobias, seguido de la producción gases como el metano, el dióxido de carbono y el ácido sulfhídrico por arqueas metanogénicas. En este caso, se requieren estanques con gran profundidad, de poca superficie y la ausencia absoluta de oxígeno (Glynn y Gary, 1999).
desinfección por cloración (uso hipoclorito de sodio) por ser el más económico y eficiente en comparación con la radiación ultravioleta, iozonización y bromación que son otros posibles métodos (Metcalf y Eddy et al. 1991). Para eliminar la concentración de fósforo el método más común es la precipitación con sales metálicas. El agua que resulta de este proceso no es apta para el consumo humano, pero sí para aplicaciones recreativas como lagos artificiales y riego de áreas verdes y de zonas agrícolas (Glynn y Gary, 1999; Rigola-Lapeña, 1989).
II.4 Antecedentes
A pesar de la gran diversidad metabólica, ecológica y funcional de las bacterias, es poco el conocimiento que se tiene sobre especies que tienen la capacidad de acumular lípidos y su aplicación en la elaboración de biodiesel (Álvarez y Steinbüchel, 2002). Entre los componentes sintetizados por bacterias, se ha observado que algunas especies presentan una gran especialización en cuanto al tipo de lípido producido. Por ejemplo, los géneros Acinectobacter y Streptomyces, además de producir TAG, sintetizan ácidos polihidroxialcanoatos (PHA: poliéster de cadenas cortas 3-hidroxilo ácidos grasos) a partir de hidrocarburos y los almacena en forma de incrustaciones intracelulares (Álvarez et al. 1997a, b; Anderson y Dawes, 1990; Singer et al.1985; Steinbüchel y Valentin, 1995).
Tabla V. Listado de estudios realizados con bacterias catalogadas como oleaginosas, indicando sustrato utilizado y porcentaje de lípidos producidos.
Microorganismos Sustrato % de lípidos Referencia Acinetobacter Hexadecano, hexadecanol. 1.9 Makula et al. 1975 Acinetobacter lwoffii Hexadecano y etanol 16 µg/mg Vachon et al. 1982 Streptomyces coelicolor,
S lividians, S. albus, S. griseus
Glucosa
Hidrocarburos (hexadecano)
60 TAG Olukoshi y Packter, 1994
Nocardia globerula Gluconato, hexadecano, pristino
18.6 TAG Álvarez et al. 2001
Rhodococcus Gluconato, fructosa, acetato, citrato, succinato, propionato, valerato, fenilacetato, aceite de oliva, fenildecano, n-alcanos
26 - 87 TAG Álvarez et al.1997a
Acinetobacter sp. Acetato, etanol, aceite de oliva, hexadecano y heptadecano
10 – 15 PHA 25 TAG
Álvarez et al. 1997b
Pseudomonas sp. Gluconato, acetato, fructosa, glicerol , octanato.
5 – 70 PHA
Pseudomonas aeruginosa cepa 44T1
Glucosa, n –alcanos y aceite de oliva
38 De Andrés et al.1991
Los géneros de bacterias reportadas como oleaginosas (Tabla V), tienen en común que han sido encontradas en suelos y en áreas contaminadas con hidrocarburos. Las características fisicoquímicas de estos ambientes (sequedad, cambios drásticos de temperatura, concentración de sales, etc), han inducido a que los microorganismos desarrollen capacidades metabólicas especiales, útiles en procesos de biorremediación o en la síntesis de productos de interés comercial (Sánchez et al. 2004). A continuación se describe con más detalle los estudios mencionados en la Tabla V.
heptadecano) y otra no hidrocarbonada como control (medio nutritivo con extracto de levadura). A nivel intra- y extracelular, la mayor cantidad de ácidos grasos se obtuvieron con hexadecano en forma de triglicéridos (2.5%), mono- y diagliceroles (6.8%) y ácidos grasos libres (8.2%). Las ceras esterificadas (18%) fueron detectadas sólo en los medios con hexadecano y en mayor proporción a nivel extracelular. Respecto al perfil de ácidos grasos, con pentadecano obtuvieron a los ácidos margárico (17.45%) y oléico (18.45%) como los más abundantes; con hexadecano el mayor porcentaje lo alcanzó el ácido palmítico (79.00%), y finalmente el ácido margárico (49.97%) fue el más abundante en los ensayos con heptadecano.
La relación entre el sustrato y el perfil de ácidos grasos sintetizados por especies del género Acinetobacter observadas por Makula et al. (1975), también fueron detectadas por Vachon et al. (1982) y Álvarez et al. (1997b). Vachon et al. (1982) estudió Acinetobacter lwoffii cultivada en medios con etanol y hexadecano. Con etanol predominó el ácido palmítico y con hexadecano el ác. palmítico y ác. palmitoléico.
Álvarez et al. (1997b) trabajaron con Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp., especies psicrófilas aisladas de las costas del golfo de San Jorge (Patagonia, Argentina). Para los análisis de la síntesis de lípidos realizaron dos ensayos: en el primero expusieron a las especies de Pseudomonas y Acinetobacter a seis fuentes de carbono (gluconato, fructosa, acetato, octanoato, octanol y glicerol) y tres temperaturas (4 °C, 20 °C y 30 °C) en medios con limitación de nitrógeno. Posteriormente, el segundo ensayo se efectuó solo con Acinetobacter 211 por obtener en el primer ensayo la mayor cantidad de ceras esterificadas. Para este último análisis emplearon como fuentes de carbono el aceite de oliva, ácidos orgánicos (ácido acético, ácido propionico), alcanos (C14 a C18) y alcoholes
°C. En las especies del género Acinetobacter, el principal producto fue el ácido 3-hidroxibutírico (3HB), obtenido con acetato. Con Pseudomonas, el ácido 3-hidroxidecanoico (3HD) fue el más abundante (36.6 – 44.9% mol), excepto cuando se utilizó octanoato y acetato como fuentes de carbono, donde predominó el ácido 3-hidroxioctanoico (3HO) (69.4 – 83.6% mol). En el segundo ensayo observaron el predominio del ácido palmítico (32.7% - 89.3%) con acetato, etanol y hexadecanol, con el aceite de oliva fue el ácido palmitoléico (81.5%) y con heptadecano fue el ácido margárico. Estos resultados, permitieron confirmar la fuerte relación entre la fuente de carbono con el tipo y cantidad de ácido graso sintetizado y también demostraron la importancia que tiene la temperatura en la activación de las diferentes enzimas que participar en la síntesis de lípidos.
En el estudio de Olukoshi y Packter (1994), se analizó la acumulación de lípidos con cuatro especies de Streptomyces en medios nutritivos con una alta concentración de carbono y con tres niveles de nitrógeno (alta, baja y nula). La mayor cantidad de ácidos grasos en forma de TAG, se obtuvieron en el ensayos con un nivel nulo de nitrógeno (565 mg/gproteína) y los más bajos valores se
registraron en la pruebas con altos niveles de nitrógeno. De acuerdo a las fases de crecimiento, la mayor síntesis de TAG se observó en la fase estacionaria en la cual se detectó grandes cantidades de DAG aciltransferasa, enzima responsable de la síntesis de triglicéridos. Aunque este comportamiento fue común en todas las especies estudiadas, los autores observaron que la eficiencia en la toma de la fuente de carbono no fue igual, lo cual podría estar asociado con el origen de aislamiento de cada cepa.
oliva, alcanzando un 38% de su peso seco. De acuerdo al perfil de ácidos grasos, el ácido palmítico y los ácidos trans-oleicos fueron los más frecuentes y abundantes, mientras que el ácido araquidónico sólo se presentó en los ensayos con glucosa y la mezcla de n-alcanos.
III. HIPÓTESIS
La producción de ácidos grasos en bacterias acumuladoras de lípidos será afectada positivamente por bajas de temperaturas, una alta relación C:N y una fuente de nitrógeno orgánica.
IV. OBJETIVOS
IV.1 Objetivo General
Obtener y caracterizar ácidos grasos producidos por bacterias acumuladoras de lípidos aisladas en Baja California, utilizando aguas residuales como sustrato y bajo diferentes condiciones de estrés.
IV.2 Objetivos Específicos
1. Obtener bacterias que tengan la capacidad de acumulación de lípidos.
2. Caracterizar bioquímica- y molecularmente las bacterias oleaginosas seleccionadas.
3. Caracterizar fisicoquímicamente aguas residuales municipales del municipio de Ensenada.
4. Determinar el efecto que ejercen las condiciones fisicoquímicas (temperatura) y nutricionales (relación C:N y fuente de nitrógeno) del medio de cultivo sobre la producción de ácidos grasos a partir de aguas residuales.
V. METODOLOGÍA
V.1 Aislamiento y selección de microorganismos oleaginosos
La primera fase del trabajo experimental consistió en el aislamiento de bacterias y levaduras de fuentes terrestres, marinas y de aguas residuales en Baja California. Las colonias aisladas fueron sometidas a un ensayo con baja concentración de nitrógeno en el medio, seleccionando aquellas que mostraron la capacidad de acumular lípidos de forma intracelular, visualizados con la tinción con Negro Sudán B. Las colonias positivas fueron posteriormente sometidas a ensayos confirmativos bajo diferentes relaciones de C:N, resultados que también sirvieron para seleccionar aquellas cepas con mayor producción de lípidos. Finalmente, las cepas seleccionadas como tentativamente oleaginosas, fueron caracterizadas bioquímica- y molecularmente.
V.1.1 Aislamiento de microorganismos oleaginosos
El aislamiento de microorganismos a partir de fuentes terrestres y marinas se realizó en un trabajo previo y fue complementado con microorganismos aislados de aguas residuales. En la Tabla VI se mencionan los sitios de muestreo y los códigos asignados para las cepas aisladas.
biológicos que tienen una concentración de lodos activados entre 3500 a 5000 mg/L y finalmente el tratamiento terciario donde se lleva a cabo la desinfección mediante cloración. De estas tres fases, se tomó muestra de la etapa del tratamiento biológico en recipientes de plástico de capacidad de 4 L y se almacenaron a -10 °C hasta su procesamiento (un tiempo máximo de 5 días, para evitar cambios en la DQO y N total).
Después de obtener las muestras, se realizaron siembras en superficie en los siguientes medios: medio marino 2216 DIFCO (medio M) para el aislamiento de bacterias marinas heterotróficas de las muestras de agua y sedimentos de mar; medio nutritivo (medio N) para el aislamiento de bacterias de las muestras del campo geotérmico y de las aguas residuales y agar papa-dextrosa (PDA) para el aislamiento de levaduras en todas las muestras.
Inicialmente para las siembras de las muestras de agua de mar, sedimentos marinos y del campo geotérmico, se realizaron diluciones en relaciones de 1:50, 1:25 y 1:10 en solución salina al 0.85% y para las muestras de aguas residuales se hizo una dilución 1:10. Posteriormente, se tomaron 200 µL de las diluciones de las muestras de agua de mar y sedimentos y 100 µL de las diluciones del campo geotérmico y de las aguas residuales y se sembraron por extensión en los medios de cultivos indicados en la Tabla VI, por duplicado. La temperatura de incubación fue de 30 °C para los cultivos en PDA y 37 °C para las siembras en los medios M y N durante 48 h.
Tabla VI. Sitios de muestreo para el aislamiento de microorganismos
SITIO DE
MUESTREO DESCRIPCIÓN
MEDIO DE
AISLAMIENTO CÓDIGO
Campo geotérmico de Cerro Prieto, Mexicali, B.C.
Lodos obtenidos de una manifestación geotérmica superficial - Nutritivo - PDA GLN GL Campo geotérmico de Cerro Prieto, Mexicali B.C. Lodos con revestimiento salino - Nutritivo - PDA GLSN GLS Campo geotérmico de Cerro Prieto, Mexicali B.C.
Agua estancada en el campo geotérmico
- Nutritivo - PDA
WGN WG
Ensenada, B.C. (1) Agua de mar superficial de la costa
de Ensenada
- Marino 2216 - PDA
SWEM SWE
Ensenada, B.C. (2)
Agua de mar superficial del estero de Punta Banda
- Marino 2216 - PDA
SWPBM SWPB
Michoacán Sedimentos marinos presumiblemente contaminados con hidrocarburos
- Marino 2216 - PDA SDM SD Planta de tratamiento de aguas residuales “El Sauzal” Ensenada, B.C.
Agua residual tomada del reactor biológico
V.1.2. Selección de microorganismos oleaginosos
V.1.2.1 Selección cualitativa
Con los microorganismos aislados de las diferentes fuentes, se efectuaron ensayos en un medio sintético con diferentes relaciones de C:N, a partir de los cuales se seleccionaron las cepas que fueran capaces de acumular lípidos. Éstos se presentaron como inclusiones intracelulares y se observaron al microscopio después de realizar tinciones diferenciales con Negro Sudán B.
El medio de inducción contenía por litro: NH4Cl (como fuente de nitrógeno),
glucosa (como fuente de carbono), 0.75 g de NaH2PO4, 0.49 g de CaCl2, 0.4 g de
MgSO4 y NaCl, de éste último componente se realizaron modificaciones de
acuerdo al medio utilizado para el aislamiento de la cepa, en medio marino (19.45 g/L NaCl) o nutritivo y PDA (5 g/L NaCl). Se emplearon tres relaciones de C:N (150, 190 y 250) para tener una mayor visión del proceso de acumulación de lípidos por parte de las cepas, ya que se ha reportado que bajo condiciones limitantes de nitrógeno algunos microorganismos pueden iniciar la acumulación de lípidos como una estrategia de supervivencia (Álvarez et al. 1997a y b; Shively, 1974).
Durante el ensayo, se realizó un seguimiento diario de la presencia de lípidos intracelulares mediante la tinción con Negro Sudán B (Burdon, 1946; Norris y Swain, 1990) y su posterior análisis al microscopio. La técnica de coloración con Negro Sudán B es utilizada en estudios microbiológicos o histológicos para la observación de material liposoluble. Un resultado positivo es indicado por la visualización de acumulaciones oscuras (azul-grisáceas), donde el núcleo y el citoplasma son contrastados con otro colorante como la safranina. El colorante se preparó con 0.7 g de Negro Sudán B (SIGMA 199664, Certificado por Biological Stain Commision, Inc) en 100 mL de etanol al 70%. La mezcla fue calentada por 10 min y filtrada para eliminar grumos. El colorante fue conservado a temperatura ambiente en un recipiente protegido de la luz solar.
El procedimiento de tinción fue el siguiente: primero, se realizó un frotis de células en un portaobjetos y se fijó con calor, se cubrió por completo con el colorante Negro Sudán B dejando reposar por 1 h. Transcurrido este tiempo, el frotis fue lavado con xilol en un sitio bien ventilado, después se aplicó el colorante de contraste (safranina) por 2 min y finalmente se lavó con agua destilada y se dejó secar. Las tinciones fueron observadas con un microscopio compuesto (MARCA Leica DMLS) usando el objetivo de inmersión (100x). De la observación al microscopio se determinó: a) porcentaje de células teñidas en el campo luminoso, b) porcentaje ocupado por las manchas dentro de la célula, y c) posición de la mancha dentro de la célula (terminal o subterminal).
V.1.2.2 Verificación cuantitativa
V.1.2.2.1 Extracción de lípidos por el método de Bligh y Dyer (1969)
La extracción de lípidos descrita por Bligh y Dyer (1969) es una de las técnicas más utilizadas para la recuperación de lípidos en microorganismos. El método consistió en el uso inicial de un sistema ternario monofásico conformado por cloroformo/metanol/agua, que después fue transformado a un estado bifásico por la adición de cloroformo y agua. Durante el proceso de mezcla se forman dos fases, la inferior que contiene cloroformo con los lípidos y la superior o metalónica en la cual se encuentra el material no lipídico (Burja et al. 2007; Lewis et al. 2000). Para la extracción, se prepararon medios de inducción con una relación C:N predeterminada a partir de los ensayos anteriores. Se inocularon con las cepas seleccionadas por su capacidad de acumular lípidos y se dejaron en incubación a 37 ºC /7 días en un agitador a 200 rpm. Después de este tiempo, se recuperó la biomasa en tubos estériles por centrifugación del cultivo a 10,000 g/15 min/10 °C. La pastilla obtenida se lavó con solución salina al 1%, y se recuperó nuevamente por centrifugado (10,000 g/15 min/ 10 °C) para después dejarla a -20 °C/20 h. Transcurrido este tiempo, se adicionó en el siguiente orden: cloroformo/metanol/agua en una relación 1:2:0.8 (Lewis et al. 2000), agitando la muestra 15 s después de aplicar cada solvente y se dejó reposar por 18 h. Luego, se agregó cloroformo y agua para obtener una nueva relación de cloroformo/metanol/agua de 1:1:0.9, y se dejó reposar hasta la formación de dos fases. La fase orgánica (cloroformo) que contiene los lípidos extraídos fue recuperada en un tubo de vidrio limpio a peso constante. El cloroformo fue eliminado por evaporación en un baño María a 90 °C.
Finalmente, después de la evaporación del cloroformo, los tubos fueron secados en un horno a 50 °C/10 min y se registró su peso final. El porcentaje de lípidos recuperados se determinó con la siguiente ecuación:
100 (mg)
muestra
(mg) orgánico extracto
(%) extraídos
V.1.2.2.2 Extracción de lípidos intracelulares (método de Cunniff, 1995)
En éste ensayo se utilizó sólo una de las bacterias seleccionadas, utilizando pre-cultivos con 150 mL del medio de aislamiento (M o N) y 700 mL del medio de inducción con una relación de C:N de 150. Como control se empleó medio de cultivo nutritivo o marino (dependiendo del origen de la cepa) inoculado y no inoculado.
Para el pre-cultivo, se tomaron colonias obtenidas de una siembra por agotamiento en placa que se sembró 24 h previas al ensayo. El pre-cultivo en medio marino o nutritivo, se incubo por 24 h/37 °C. Transcurrido este periodo de tiempo, se centrifugó el pre-cultivo 10,000 g/15 min/ 10 ºC y la pastilla formada se lavó con solución salina 1%, la cual fue recuperada de nuevo por centrifugación (10,000 g/15 min/10 ºC ). Después, la pastilla obtenida se mezcló con HCl concentrado y se colocó a baño María a 100 °C por 90 min. Se dejó enfriar y luego se agregaron 10 mL de éter de petróleo. Pasado unos minutos se observaron dos fases. La fase superior que contiene los lípidos extraídos fue recuperada en un tubo de vidrio a peso constante y se evaporó a baño María a 70 °C. Luego los tubos fueron secados en un horno a 50 °C/10 min, finalmente fueron enfriados en un desecador y se registró su peso final. El porcentaje de lípidos recuperados se determinó con la siguiente ecuación:
100 (mg)
muestra
(mg) etéreo extracto (%)
extraídos
Lípidos [2]
V.1.2.2.3 Determinación de biomasa seca
Se estimó la biomasa seca tomando 25 mL del cultivo y filtrándolos en membranas de 0.45 µm (Whatman), las cuales fueron posteriormente secadas a
V.2 Caracterización bioquímica e identificación molecular de los microorganismos oleaginosos
V.2.1 Caracterización bioquímica
La caracterización bioquímica de los microorganismos, se usa actualmente como una herramienta complementaria de la identificación molecular, debido a que puede ofrecer información sobre algunas características fisicoquímicas distinguibles entre los géneros (Madigan et al. 2000). La caracterización bioquímica se realizó a las cepas aisladas de fuentes marinas y de agua residual que dieron positivo para la acumulación de lípidos intracelulares. Las cepas bacterianas usadas para los controles de estas, hacen parte de la colección del Departamento de Biotecnología Marina de CICESE.
V.2.1.1 Coloración de Gram
Las bacterias de acuerdo a la estructura de su pared celular y la respuesta que presentan frente a la tinción de Gram se dividen en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas (Hold et al. 1992; Madigan et al. 2000). Para esta diferenciación se utilizó cristal violeta, una solución de lugol como mordiente y una solución de safranina como colorante de contraste.
V.2.1.2 Movilidad
V.2.1.3 Hidrólisis de almidón
El almidón (polisacárido) para ser transportados al interior de la célula y tomarse como fuente de carbono, requiere muchas veces hidrolizarse en amilopectina y amilosa (componentes del almidón). La enzima amilasa es la que permite esta hidrólisis y generalmente es excretada al medio, lo cual se puede observar con el método de McFaddin (1980). Para esta prueba se utilizaron placas con medio marino y nutritivo suplementado con almidón soluble al 0.2% (p/v) (Merck). La cepas fueron sembradas en placas por agotamiento y se incubaron a 37 °C/24 h. Después de este tiempo, se agregó lugol sobre las colonias para observar si estaba o no presente la enzima. El lugol al unirse con el almidón sin hidrolizar forma un complejo de color púrpura, por lo tanto se considera positiva la prueba de amilasa para aquellas colonias que presentan un halo claro a su alrededor. Se utilizó como controles positivo y negativo a Bacillus sp. y Escherichia coli, respectivamente crecidas en placas con medio nutritivo suplementado con 0.2% (p/v) de almidón.
V.2.1.4 Hidrólisis de caseína
La actividad de caseinasa se determinó en placas con medio Skim Milk DIFCO que contiene caseína entre sus componentes. Las placas fueron inoculadas por agotamiento con la cepa de prueba e incubadas a 37 °C/24 h. La aparición de una zona de aclaramiento alrededor de la colonia indicó la actividad de caseinasa. Los controles fueron Escherichia coli (negativo) y Bacillus sp. (positivo).
V.2.1.5 Producción de catalasa
marino, y nutritivo para las cepas aisladas de agua residual incubadas por 37 °C / 24 h. El control positivo fue Bacillus sp.
V.2.1.6 Sensibilidad a antibióticos
Se observó la sensibilidad de las bacterias seleccionadas frente a dos antibióticos con un amplio uso en infecciones de origen bacteriano: Cloramfenicol y Ampicilina. Para obtener una densidad celular homogénea en las pruebas y reducir el error que se puede generar por este factor, se realizaron suspensiones bacterianas en solución salina al 0.85% obteniendo densidades ópticas próximas a 0.1. De estas suspensiones, se tomaron 100 µL y se sembraron por extensión
en placas con agar marino DIFCO 2216 y nutritivo, sobre las cuales se colocaron filtros de5mm de diámetro impregnados con ampicilina o cloramfenicol a una concentración de 30 µg/mL. Las placas se incubaron a 37 °C/48 h. La formación de un halo transparente alrededor de los filtros indica la sensibilidad del microorganismo a los antibióticos probados.
V.2.1.7 Crecimiento en diferentes fuentes de carbono
Se analizó la capacidad de las bacterias seleccionadas para crecer en diferentes fuentes de carbono: glucosa, glicerol, xilosa, hexadecano, hexanos y octanos. Las pruebas se llevaron a cabo en el medio de inducción sólido agregando 1% (p/v) de la fuente de carbono. Los componentes se describen a continuación: NH4Cl
0.3 g/L, glucosa 1 g/L, NaH2PO4 0.75 g/L, CaCl2.7H2O 0.49 g/L, MgSO4 0.4 g/L,
controles se utilizaron medios nutritivo, marino e inducción sin fuente de carbono, inoculados con las bacterias en estudio.
V.2.2 Identificación molecular
La identificación a nivel molecular en procariotas, se basa principalmente en la comparación de secuencias altamente conservadas del ARNr 16S (Woese, 1987; Madigan et al. 2000), lo que ha facilitado el establecimiento de nuevas relaciones filogenéticas y clasificaciones taxonómicas más precisas. Entre estas secuencias, existen dos que permiten la amplificación de una zona denominada “región ribosómica universal amplificada” o UARR (por sus siglas en inglés) que contiene 495 pb en procariotas y 508 pb en eucariotas. Para la amplificación de esta zona en ambos grupos de microorganismos pueden utilizarse cebadores universales previamente reportados. A continuación se describe el proceso de extracción de ácidos nucleicos y la amplificación de la UARR por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
V.2.2.1 Extracción de ácidos nucleicos por el método fenol-cloroformo
La extracción de ADN genómico se realizó con el método de fenol-cloroformo reportado por Ashktorab y Cohen (1992) y Challen et al. (1995). Inicialmente, para obtener biomasa se preparó un cultivo con las cepas seleccionadas en 150 mL de caldo triptona (32 g/L triptona, 20 g/L extracto de levadura, 5 g/L NaCl para las bacterias aisladas de agua residual o 19,45 g/L NaCl para aquellas de origen marino), incubándose a 37 ºC /24 h.
fases y se tomaron 2 mL del sobrenadante, el cual se pasó a un tubo estéril donde se mezcló con 1 volumen de fenol equilibrado Sigma (pH: 7.9 ± 0.2). Se realizó la agitación por 3 minutos y se centrifugó nuevamente a 10,000 g durante 12 min/10 ºC. Posteriormente, se tomó el sobrenadante y se agregó 1 volumen de cloroformo agitando por 30 s. Esta mezcla se centrifugó a 10,000 g durante 6 min/10 ºC. Se recuperó el sobrenadante y se adicionó acetato de sodio 2.7 M (pH: 5.2 ± 0.2) y 2 volúmenes de etanol frío al 99%, se agitó suavemente con la mano y después se centrifugó a 10,000 g durante 30 min/10 ºC, recuperando el precipitado. Éste se lavó con etanol frío al 70%, se centrifugó a 10.000 g/30 min/10 ºC y la pastilla obtenida se resuspendió en agua estéril y se almacenó a -20 °C. Los ácidos nucleicos recuperados fueron documentados en un gel de agarosa al 0.8% en TBE 1x con bromuro de etidio (0.5 µg/mL) con un flujo de 90
V por 75 minutos.
V.2.2.2 Amplificación por PCR
Después de confirmar la presencia de ácido desoxirribonucleico, se preparó la siguiente mezcla para llevar a cabo la reacción de PCR (volumen total de 50 µL):
1x PCR buffer, 0.2 µM de los cebadores U1F (5’
-CTYAAAKRAATTGRCGRRRSSC-3, posiciones 909 - 932 en Escherichia coli ATCC11775) y U1R (5’-CGGGCGGTGTGTRCAARRSSC-3’, posiciones 1383 – 1404 E. coli) (Rivas, et al. 2004),1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP’S, 0.5 µM DNA Taq
polimerasa y 2 µL de los ácidos nucleicos. El programa de PCR consistió en
precalentamiento por 5 min/ 95 ºC, 35 ciclos 1 min/95 ºC para desnaturalizar, 2 min/55 ºC para la alineación, 1 min/72 ºC para la extensión y una extensión final por 7 min/72 ºC.