Producción de lípidos bacterianos a partir de agua residual

Las cepas seleccionadas tentativamente como oleaginosas, se sometieron a ensayos de crecimiento con el agua residual acondicionada y suplementada con glucosa, para la producción de lípidos. Las actividades que se realizaron fueron: a) caracterización del agua residual, b) determinación del crecimiento bacteriano en el AR, c) cinéticas de crecimiento y d) diseño factorial para estudiar el efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de nitrógeno sobre la producción de lípidos.

V.3.1 Caracterización fisicoquímica del agua residual acondicionada

Las aguas residuales presentan una alta concentración de sólidos suspendidos y carga de microorganismos (bacterias y levaduras) que pueden interferir de forma negativa sobre las pruebas de la acumulación de lípidos. Para reducir la interferencia por estos factores, se acondicionó el agua residual eliminando partículas y/o células mediante centrifugación y centrifugación/ filtración/ esterilización. Esta agua residual acondicionada fue analizada bajo diferentes parámetros fisicoquímicos y fue utilizada como medio de cultivo para el crecimiento de las cepas seleccionadas. En la Tabla VII se muestran los análisis realizados al agua residual acondicionada.

Tabla VII. Caracterización fisicoquímica del agua residual acondicionada. Variable Método Analítico

Nitrógeno Total HACH-10072 Nitrógeno Amoniacal US EPA-350.2 Nitratos US EPA-353.3 Nitritos US EPA 354.1

DQO NMX-AA-030

Grasas y aceites US EPA-1664

pH Cinta indicadora

V.3.2 Ensayos de crecimiento en agua residual

Después de efectuar los análisis fisicoquímicos del agua residual, se realizaron pruebas preliminares de crecimiento que implicaron la utilización de diferentes porcentajes del agua residual (50, 67, 83 y 100%), la adición de glucosa (2 g/L) como fuente de carbono y NH4Cl (0.6 g/L) como fuente de nitrógeno. Los

diferentes porcentajes de AR permitieron observar si había interferencia en el crecimiento de las cepas por la presencia de posibles compuestos inhibitorios y con la adición de carbono y nitrógeno se determinó la necesidad de realizar un acondicionamiento nutricional. El pH del agua en todos los ensayos fue de 7.0 ± 0.2.

Inicialmente, se prepararon pre-cultivos (50 mL) en el medio habitual de crecimiento de las bacterias (M o N) y se incubaron por 24 h/37 °C. Se recuperó la biomasa por centrifugación 10,000 g/ 10 min/10 °C y se re-suspendió en 150 mL de agua residual acondicionada con diferentes porcentajes y fuentes de carbono y nitrógeno. Durante los 5 días de incubación a 200 rpm, se hicieron tinciones con Negro Sudán B para confirmar la presencia de material liposoluble y se efectuaron mediciones diarias de crecimiento por densidad óptica a 540 nm, utilizando como blanco para esta lectura el agua residual acondicionada estéril. Los controles

fueron a) el agua residual acondicionada y suplementada sin inóculo, b) el medio marino y/o nutritivo inoculado y c) el medio marino y/o nutritivo sin inocular.

V.3.2.1 Cinéticas de crecimiento

Una vez fijado el porcentaje de AR que permitió el crecimiento bacteriano, se realizaron cinéticas de crecimiento en AR acondicionada y suplementada (ARAS), teniendo como control las cinéticas de crecimiento en los medios habituales de crecimiento (medio M para cepas de origen marino y N para cepas aisladas de aguas residuales). Para todas las cinéticas se prepararon pre-cultivos (M, N y ARAS) (50 mL), cuyos inóculos de obtuvieron de siembras previas en los medios habituales de crecimiento (M o N). La biomasa de estas siembras se recuperaron por centrifugación (10,000 g/10 min/10 ºC), se lavaron con solución salina al 0.85% y se adicionaron a los pre-cultivos que se mantuvieron por 24 h/37 °C con agitación constante de 200 rpm.

La biomasa alcanzada con los pre-cultivos, se recuperó por centrifugación (10,000

g/ 10 min/10 ºC), se lavó con solución salina al 0.85% y se re-suspendió en los 250 mL del medio respectivo (ARAS o medio M/N), para iniciar la cinética. La temperatura de incubación fue de 37 ºC.

Durante las primeras 12 h, se midió la densidad óptica a 540 nm cada 60 min y luego cada 3 h, hasta observar la fase estacionaria. Al tener definida esta fase, se calculó la biomasa seca a partir de filtraciones en membranas (Whatman de 0.45

µm), las cuales fueron secadas a 100 ºC/24 h. Con el volumen restante, se realizó

la extracción de ácidos grasos por el método de Bligh y Dyer (1969), adicionando el paso de transesterificación.

V.3.3 Efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de N sobre la producción de lípidos

V.3.3.1 Diseño factorial 2k

La producción y acumulación de ácidos grasos está influenciada por la interacción de factores nutricionales y algunos parámetros fisicoquímicos. De acuerdo a esta información, se evaluó a partir de un diseño experimental factorial (Montgomery, 1991), el efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de nitrógeno sobre la producción y perfil de ácidos grasos acumulados por las cepas seleccionadas. Cada factor se estudió a dos niveles como se muestra en la Tabla VIII. En total se obtuvieron 8 tratamientos, con su respectiva réplica. Los resultados fueron sujetos a un análisis de varianza (ANOVA) según la práctica común de un diseño factorial 2k, con un intervalo de confianza del 95% y comprobando la independencia, normalidad y homogeneidad de varianzas de los datos (Montgomery, 1991).

Tabla VIII. Diseño factorial 2k para estudiar el efecto de la relación C:N, temperatura y fuente de nitrógeno sobre la producción de lípidos microbianos.

Factor Nivel (-) Nivel (+)

Temperatura (°C) 20 35

Fuente de nitrógeno NH4Cl Glicina

Relación C:N 60 150

V.3.3.2 Procedimiento experimental

Se prepararon pre-cultivos (120 mL) en el ARAS, los cuales se incubaron a 37 °C/18 h. Se recuperó la biomasa por centrifugación (10,000 g/ 10 min/10 ºC) y se realizó un lavado con solución salina al 0.85% para retirar residuos del medio del pre-cultivo. Esta biomasa se distribuyó homogéneamente en matraces que contenían 600 mL del agua residual acondicionada con la fuente de nitrógeno y la

relación C:N establecida por el diseño factorial. La duración del experimento fue de 30 h y se tomaron muestras a las 0, 6, 18, 24 y 30 h, para realizar diferentes análisis. Los cultivos se mantuvieron a 200 rpm.

V.3.3.3 Métodos analíticos

Durante el transcurso del ensayo se evaluó crecimiento a partir de densidad óptica a 540nm y la presencia de material liposoluble intracelular con la tinción de Negro Sudán B mediante el procedimiento previamente descrito. Al final, la biomasa total fue recuperada para realizar la extracción de lípidos con el método de Bligh y Dyer (1969). Otros métodos utilizados fueron la determinación de consumo de sustrato mediante la demanda química de oxígeno (DQO) y la determinación del perfil de ácidos grasos mediante cromatografía de gases.