INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
“Inducción de la resistencia a Sclerotium rolfsii en cebolla por la
aplicación de Trichoderma asperellum”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
PATRICIA GUZMÁN VALLE
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL SECRETARÍA DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
CARTA DE CESIÓN DE DERECHOS
En la ciudad de Yautepec, Mor. siendo el día 14 del mes de Noviembre del año 2012, la que suscribe Patricia Guzmán Valle, alumna del Programa de Maestría en Ciencias en Manejo Agroecológico de Plagas y Enfermedades, con número de registro B101191, adscrito al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, manifiesta que es autora intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez y la M. en C. Leticia Bravo Luna y cede los derechos del trabajo intitulado “
“Inducción de la resistencia a Sclerotium rolfsii en cebolla por la
aplicación de Trichoderma asperellum”
, al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines académicos y de investigación. Los usuarios de la información no deberán reproducir el contenido textual, gráficas, o datos del trabajo, sin el permiso expreso del autor y/o director es del trabajo. Este puede obtenerse escribiendo a la siguiente dirección: Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, Carretera Yautepec-Jojutla, Km 6.0, Calle CeProBi No.8, Col. San Isidro, C.P. 62731 11 Yautepec, Morelos, México, Fax: (52) (01) (55) 57296000 ext. 82512 ó 01-7353941896, e-mail: [email protected] (http:\\www.ceprobi.ipn.mx). Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD
Con base en el artículo 57 fracción I del Reglamento de Estudios de Posgrado vigente y en la Sección IV del Código de Ética del IPN, hacemos constar que el trabajo de tesis ““Inducción de la resistencia a Sclerotium rolfsii en cebolla por la aplicación de Trichoderma asperellum” es responsabilidad de la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez y la M. en C. Leticia Bravo Luna Directoras de tesis y Patricia Guzmán Valle, y que ni los datos experimentales ni el texto han sido usados para obtener otro grado académico en el país o en el extranjero. Cualquier colaboración o cita textual fue declarada y reconocida en el documento.
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales del Departamento de Biotecnología y en el Laboratorio de Fitopatología del Departamento de Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Gabriela Sepúlveda Jiménez y la M. en C. Leticia Bravo Luna. Para la realización de los estudios se contó con el apoyo económico de CONACyT (becario No. 367557) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de Investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20111038 y 20121204).
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Gabriela Sepúlveda Jiménez, por toda la paciencia que me tuvo dentro de la Maestría, porque en todo momento me alentó a alcanzar la meta, porque gracias a su apoyo con este título alcanzamos dos el de la Licenciatura y el de la Maestría, porque siempre estuvo al pendiente de lo que me sucedía, por querer ser mi Directora de Tesis…...Le
agradezco todo su apoyo.
A la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna, por querer ser mi Directora de Tesis, por todas las correcciones y paciencia que le dedicó a este trabajo, por escucharme en los momentos de angustia y de frustración, por ser una amiga en todo momento.
Al Doctor Ángel René Arzuffi Barrera, al Doctor Roberto Montes Belmont, al Doctor Mario Rodríguez Monroy y a la Doctora Kalina Bermúdez Torres, por las observaciones enfocadas a generar una investigación más seria, por el esfuerzo e interés que mostraron en la realización de esta Tesis.
A la Maestra Hilda Elizabeth Flores Moctezuma, porque siempre está con una hermosa sonrisa en los momentos que necesitamos de su ayuda.
Al Ing. Manuel Fontanez, a la Lic. Alejandra Vergara, a la Ing. Gina, al Doctor Fede, por todo el apoyo para la realización de esta Tesis.
A las señoritas Licenciadas Elvia Sosa, Vanessa Yañez, Saraita, Eloisa y Kary por toda la disponibilidad que siempre tuvieron y por la infinidad de apoyos que me dieron dentro del Posgrado.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, al Programa Institucional de Formación de Investigadores y a la Secretaria de Investigación y Posgrado por las becas otorgadas para la realización de mis estudios.
DEDICATORIAS
A Dios por darme el Don de la vida y llenarme de los elementos necesarios para sobresalir. A mis padres por formarme con valores, por darme la oportunidad de estudiar una Licenciatura y así ahora terminar una Maestría, por estar a mi lado en todo momento. A mis hermanos, por los momentos de alegría que me regalan.
A la señora Hortensia Guzmán Hdez. (+), por el gran cariño que siempre tuvo para mi, por su apoyo incondicional…porque siempre fue y será como una segunda madre para mí.
A mis sobrinos en especial a Angy, Juan Carlos, Ricardo Samaniel y Ángel Jatziel……..porque por ellos me esforcé a seguir con esta meta.
A mi gran amiga Ruth Zamora Nava, por el apoyo en los momentos difíciles. Y a sus pequeños retoños Maricruz y David, por ser una parte esencial en mi vida.
A la Familia Zamora Camacho………siempre serán mi familia…….
Al Ingeniero Ignacio Franco, por la chispa de alegría que tiene para todos, por regalarme su amistad y por todo el cariño que siempre demuestra a los que estamos junto a él.
A mi ESPOSO Santiago Salazar Sánchez, porque gracias a él me enamore de Dios, por todo lo que ha transformado en mi manera de ser, porque siempre esta sonriente, porque en todo momento tiene una palabra de amor para mi, por ocuparse de mis problemas, por aguantar mis berrinches, por estar conmigo en todo momento de la realización de esta tesis, por alentarme a seguir adelante con todo lo que me propongo, por querer ser mi esposo. A mis compañeros de la Maestría Nancy, Cesar, Rox, Magda, Gris, Daniel, Sandra, Jorge porque con su compañía la estancia en el CeProBi fue más placentera……
A una gran persona que siempre creyó en mí y en que podía hacer muchas cosas……a ti
I CONTENIDO Índice I Índice de cuadros IV Índice de figuras VI Resumen VII Abstrac IX 1. INTRODUCCIÓN 1 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3
2.1 El cultivo de cebolla (Allium cepa L.) 3
2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla 3 2.3 Enfermedades en la cebolla causadas por hongos de suelo 4 2.3.1 Generalidades y control de Sclerotium rolfsii 5 2.4 Los hongos del género Trichoderma en el control de fitopatógenos 7 2.4.1Interacción de Trichoderma con las plantas 10
3. OBJETIVOS 13
4. MATERIALES Y MÉTODOS 14
4.1 Material vegetal 14
4.2 Cepas de hongos 14
4.3 Siembra y manejo agronómico de la cebolla 14
4.4 Propagación e inoculación con Trichoderma asperellum 15 4.5 Propagación e inoculación con Sclerotium rolfsii 16
II
4.7 Cuantificación de proteínas 17
4.8 Cuantificación de azúcares reductores 18
4.9 Evaluación de la actividad enzimática 19
4.9.1 Determinación de la actividad de β-1,3 glucanasa 19 4.9.2 Determinación de la actividad de quitinasa 20 4.9.3 Determinación de la actividad de peroxidasa 20 4.10 Evaluación del crecimiento de las plantas de cebolla sin y con Trichoderma asperellum
21
4.11 Evaluación de la severidad de la enfermedad tizón sureño 21
4.12 Diseño experimental y análisis estadístico 22
5. RESULTADOS 23
5.1 Actividad enzimática en plantas de cebolla de las tres variedades sin tratamiento
23
5.2 Efecto de la aplicación de Trichoderma asperellum en la actividad enzimática de plantas de cebolla
26
5.3 Actividad enzimática en plantas de cebolla inoculadas con Sclerotium rolfsii 31 5.4 Efecto de la aplicación de Trichoderma asperellum y de la inoculación de Sclerotium rolfsii en la actividad enzimática de plantas de cebolla
36
5.5 Peso fresco y seco, y contenido de proteínas y carbohidratos en plantas de cebolla sin tratamiento
41
5.6 Efecto de la aplicación de Trichoderma asperellum en el peso fresco y seco, y contenido de proteínas y carbohidratos en plantas de cebolla
III 5.7 Efecto de Trichoderma asperellum en la severidad de la enfermedad tizón
sureño producida por Sclerotium rolfsii en plantas de cebolla
49 6. DISCUSIÓN 52 7. CONCLUSIONES 59 8. PERSPECTIVAS 61 9. LITERATURA CITADA 62 Anexos A-F
IV ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1. Escala de severidad del tizón sureño en plantas de cebolla 21
2. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de las plantas de cebolla sin tratamiento
24
3. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de las plantas de cebolla sin tratamiento
24
4. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad en plantas de cebolla sin tratamiento
25
5. Actividad enzimática en órganos de plantas de cebolla de diferente variedad sin y con la aplicación de T. asperellum
28
6. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de las plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
29
7. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
29
8. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad en plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
30
9. Actividad enzimática en plantas de cebolla sin inocular e inoculadas con S. rolfsii
33
10. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de plantas de cebolla inoculadas con S. rolfsii
34
11. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de plantas de cebolla inoculadas con S. rolfsii
34
12. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad en plantas de cebolla inoculadas con S. rolfsii
35
13. Actividad enzimática en plantas de cebolla tratadas con T. asperellum sin inocular e inoculadas con S. rolfsii
38
14. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de plantas de cebolla
V 15. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de plantas de cebolla
tratadas con T. asperellum e inoculadas con S. rolfsii
39
16. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum e inoculadas con S. rolfsii
40
17. Comparación entre variedades del peso fresco y seco, y contenido de proteínas y carbohidratos de plantas de cebolla sin tratamiento
42
18. Comparación entre órganos del peso fresco y seco, y contenido de proteínas y carbohidratos de plantas de cebolla sin tratamiento
42
19. Comparación del peso fresco y seco, contenido de proteínas y carbohidratos entre variedades y órganos de una misma variedad de plantas de cebolla sin tratamiento
43
20. Peso fresco y seco de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum 45 21. Contenido de proteínas y carbohidratos de plantas de cebolla tratadas con T.
asperellum
46
22. Comparación entre variedades del peso fresco y seco, contenido de proteína y carbohidratos de plantas de cebolla con T. asperellum
47
23. Comparación entre órganos del peso fresco y seco, contenido de proteína y carbohidratos de plantas de cebolla con T. asperellum
47
24. Comparación del peso fresco y seco, contenido de proteínas y carbohidratos de plantas entre variedades y órganos de una misma variedad de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
VI ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
Figura 1. Severidad de la enfermedad tizón sureño en plantas de cebolla de tres variedades
50
Figura 2. Severidad de la enfermedad tizón sureño en plantas de tres variedades Crystal White (CW), Red Satan (RS) y Mata Hary (MH) de cebolla tratadas con T. asperellum
VII
RESUMEN
En las interacciones Trichoderma asperellum – cebolla, Sclerotium rolfsii – cebolla y T. asperellum – cebolla – S. rolfsii, se determinó la actividad de glucanasa, quitinasa y peroxidasa en los diferentes órganos de cebolla de las variedades Crystal White (CW), Red Satan (RS) y Mata Hary (MH). Así mismo, se evaluó el efecto de T. asperellum en el desarrollo de las plantas y en la severidad de la enfermedad tizón sureño causada por S. rolfsii. La inoculación con T. asperellum se hizo en la siembra y al trasplante de la cebolla y la de S. rolfsii a los 87 días después del trasplante. Tres días después de inocular con S. rolfsii se colectaron las muestras. En los órganos de las plantas de todas las variedades se encontró una actividad constitutiva de las tres enzimas. Las plantas y el bulbo de la variedad RS mostraron la mayor actividad enzimática. Con la aplicación de T. asperellum, se incrementó la actividad enzimática, tanto en forma local (en bulbos y raíces) como sistémica (hoja). Las plantas de la variedad RS y en especial los bulbos, nuevamente presentaron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa; aunque las plantas de la variedad CW muestran el mayor cambio de la actividad enzimática inducida por la presencia de T. asperellum. La infección de plantas con S. rolfsii causó solo una respuesta local pero no sistémica y esta respuesta también dependió de la variedad y la clase de enzima. Los bulbos de la variedad RS mostraron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa, pero los bulbos de las plantas de la variedad Crystal White mostraron la mayor actividad de peroxidasa. La aplicación de T. asperellum y la infección con S. rolfsii causó un incremento adicional de la actividad enzimática en bulbo y raíz, pero no en las hojas; lo que indica que la respuesta sistémica inducida por T. asperellum no se modifica por la presencia del patógeno. La
VIII inoculación de T. asperellum proporcionó protección contra S. rolfsii, debido quizás a la actividad enzimática que se presentó en los bulbos. En especial, las plantas de la variedad RS mostraron la menor severidad de la enfermedad y esta protección se debe probablemente a que presentan tanto en forma constitutiva como inducida una mayor actividad de glucanasa y quitinasa. Los órganos de las plantas de todas las variedades tratadas con T. asperellum mostraron una ganancia de peso fresco y seco, y del contenido de proteínas y carbohidratos. Por lo cual, la aplicación de T. asperellum en la semilla y durante el trasplante es una alternativa para proteger a las plantas de cebolla del patógeno S. rolfsii, con la ganancia de obtener plantas con un mejor desarrollo.
IX ABSTRACT
In the interactions Trichoderma asperellum - onion, Sclerotium rolfsii - onion and T. asperellum - onion - S. rolfsii was determined the activity of glucanase, chitinase and peroxidase in the different organs of the onion varieties: Crystal White (CW), Red Satan (RS) and Mata Hary (MH). In addition, it was evaluated the effect of T. asperellum on the plant development and the disease severity (southern blight) caused by S. rolfsii. Inoculation with T. asperellum was made in the seed and during the plant transplant; whereas, the infection with S. rolfsii was made 87 days after transplant. The samples were collected three days after inoculation with S. rolfsii. In plants of all varieties, the organs presented constitutive activity of the three enzymes. Plants and bulbs of the RS variety showed highest enzyme activity. The T. asperellum application increased the enzyme activity in local (bulbs and roots) and systemic (leaf) form. Plants of the RS variety and especially bulbs again showed the highest activity of glucanase and chitinase; but plants of the CW variety showed the highest change of the enzymatic activity induced by the T. asperellum presence. Plants infection with S. rolfsii caused only a local but non-systemic response, and this response also depended of the variety and the enzyme kind. The RS variety bulbs showed the greatest activity of glucanase and chitinase, but bulbs of the CW variety plants showed the highest peroxidase activity. The T. asperellum application and S. rolfsii infection caused an additional increase of enzymatic activity in bulb and root, but not in the leaves; indicating that the systemic response induced by T. asperellum is not modified by the pathogen presence. T. asperellum inoculation provided protection against S. rolfsii that could be due to the enzymatic activity presented in bulbs. In particular, the RS variety plants showed the lowest severity of the disease and this protection is probably due
X to the high constitutive and induced activity of glucanase and chitinase. The organs of all varieties treated with T. asperellum showed a gain of fresh and dry weight, and content of proteins and carbohydrates. Therefore, the T. asperellum application in seed and during the plant transplant is an alternative to protect the onion plants of the S. rolfsii pathogen, with the gain of obtain plants with better development.
- 1 - 1. INTRODUCIÓN
El cultivo de la cebolla (Allium cepa L.) tiene importancia nacional por la superficie que se dedica para su siembra; en el año 2010, se cultivaron 45, 347 ha con una producción de 1 millón 148 mil ton.Entre los estados productores se encuentra el estado de Morelos que ocupa el quinto lugar (SAGARPA 2012).
La producción de cebolla está limitada por enfermedades, con un fuerte impacto en su rendimiento (Pérez-Moreno et al. 1995), como es el tizón sureño causada por el hongo Sclerotium rolfsii llegando a causar pérdidas desde un 30% hasta un 50% en la producción (Winstead et al. 1960, Montes-Belmont et al. 2003). S. rolfsii es un hongo con más de 500 especies de plantas hospederas incluyendo malezas, es por esto que es difícil su control (Aycockr 1966 citado por Rakh et al. 2011). Para el control de esta enfermedad se utilizan productos químicos, también prácticas culturales y la combinación de los dos, pero los resultados no son eficaces (Agrios 1996, Montes-Belmont et al. 2003).
El control biológico es un método de gran interés debido a su potencial para el manejo de enfermedades causadas por hongos del suelo y a las aplicaciones exitosas en diferentes cultivos (Fravel 2005, Vinale et al. 2008, Rivas y Domenico 2010). Trichoderma es un hongo habitante del suelo que por su efecto antagonista es usado en el control biológico de patógenos. Además promueve el desarrollo e induce cambios bioquímicos en las plantas que contribuyen a la resistencia a enfermedades (Howell y Puckhaber 2005, Howell 2006, Verma et al. 2007).
La inducción de la resistencia en las plantas se caracteriza por activar una serie de mecanismos cuyo fin es defender, aminorar o contrarrestar la infección. La activación de defensa en las plantas incluye la activación de enzimas hidrolíticas como la glucanasa y la
- 2 - quitinasa y también enzimas oxidoreductasas como la peroxidasa (Yedidia et al. 2003, Harman et al. 2004, Vinale et al. 2008). Las glucanasas y quitinasas son enzimas que degradan la pared celular de hongos (Yedidia et al. 1999 y 2000) y la peroxidasa es una enzima fundamental en los procesos de endurecimiento de la pared celular, como es la lignificación, la cual es una barrera física de entrada de fitopatógenos (Passardi et al. 2005). En cebolla se conoce que la inoculación de T. harzianum (identificado posteriormente por Guigón-López et al. 2010 como T. asperellum) incrementó la actividad de peroxidasa así como también el crecimiento. Las cebollas no pigmentadas mostraron mayores cambios en la actividad de peroxidasa y en el crecimiento que las variedades de cebolla pigmentadas. Así mismo, en las cebollas pigmentadas se encontró una menor severidad de la enfermedad causada por S. rolfsii que en las cebollas no pigmentadas (Aparicio 2010). Por lo cual, en este trabajo se evaluó el efecto de la inoculación con T. asperellum en la actividad de las enzimas glucanasa, quitinasa y peroxidasa en los diferentes órganos de la planta de tres variedades de cebolla y su relación con la resistencia a S. rolfsii.
- 3 - 2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 El cultivo de cebolla (Allium cepa L.)
La cebolla pertenece a la familia de las Liliáceas, nativa de Asia pero cultivada en regiones templadas y subtropicales de todo el mundo. Es una hortaliza distinguida por la particularidad de su aroma y de su sabor, características que la convierten en un condimento de uso mundial. El cultivo de la cebolla ocupa el cuarto lugar en la producción mundial de hortalizas con un volumen de 57.9 millones de toneladas anuales. La producción en América Latina representa el 9% del total mundial y las cifras más destacadas corresponden a México, Argentina, Brasil, Colombia y Chile. México ocupa el cuarto lugar de producción con más de un millón de toneladas anuales (FAO, 2011).
A nivel nacional, Morelos ocupa el 5º lugar entre los estados productores de cebolla. En el año 2009 la superficie cosechada de cebolla fue de 3,070 ha con una producción de 93,410 ton lo que equivale a 9.8% de la superficie sembrada y a 16.5% del valor de la producción (SAGARPA 2012).
2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla
El bulbo de la cebolla está formado por numerosas capas gruesas y carnosas al interior, que realizan la función de reserva de sustancias nutritivas necesarias para la alimentación de los brotes. Estas capas están recubiertas por membranas delgadas y transparentes que son la base de las hojas (Gaviola et al. 2006).
Corzo-Martínez et al. (2007) mencionan que la cebolla contiene lecitina, pectina, vitaminas B1, B2, B6, C, E y aminoácidos, además es rica en compuestos fenólicos y flavonoides, que funcionan como antioxidantes (captación de radicales libres). En
- 4 - particular, la quercetina es el flavonoide antioxidante que representa más del 95% de los flavonoides totales (Rodríguez et al. 2009).
Según Prakash et al. (2007) mencionan que las variedades de cebolla roja y morada muestran más alto contenido de compuestos fenólicos totales y una mayor actividad antioxidante en comparación con las variedades de cebolla blanca y verde. También el contenido de flavonoides es mayor en las cebollas pigmentadas (rojas) que en las variedades de cebolla no pigmentadas (blancas). Las antocianinas son los principales flavonoides que confieren el color a las cebollas pigmentadas (Slimestad et al. 2007, Pérez-Gregorio et al. 2010).
Las variedades de cebolla pigmentadas también difieren a las variedades no pigmentadas, en cuanto a su resistencia al patógeno Colletotrichum circinans (Walker et al. 1929, Link y Walker 1933).
2.3 Enfermedades en la cebolla causadas por hongos de suelo
Como otros cultivos, la producción de cebolla está limitada por enfermedades con un fuerte impacto en su rendimiento. Entre estas se reportan a la raíz rosada de la cebolla que es ocasionada por el hongo Pyrenochaeta terrestris que daña únicamente a las raíces de la planta. La podredumbre basal que es provocada por Fusarium oxysporum f. sp. cepae manifestándose de diferentes maneras según el estado fenológico de la planta. La podredumbre blanca es ocasionada por Sclerotium cepivorum que también es una enfermedad que afecta a los cultivos de ajo (Nico y González 2006). Finalmente, la enfermedad tizón sureño cuyo agente causal es Sclerotium rolfsii Sacc. que llega a causar pérdidas desde un 30% hasta un 50% (Montes-Belmont et al. 2003, Winstead et al. 1960).
- 5 - 2.3.1 Generalidades y control de Sclerotium rolfsii
El tizón sureño es una enfermedad en la cebolla producida por Sclerotium rolfsii (López-Salinas et al. 2002, Montes-Belmont et al. 2003). Este hongo se conoce que tiene la capacidad de sobrevivir en suelos infectados en forma de esclerocios, permaneciendo en latencia por más de 20 años (Punja 1985). Además presenta un amplio rango de hospederos entre los que se encuentran cereales, frutales, forrajes, ornamentales, hortalizas y malezas. Las principales hortalizas que afecta son: papa, cebolla, coliflor, lechuga, melón, chile, sandía, tomate y zanahoria (Saralosa y Rocca 1975).
La enfermedad se puede presentar durante el transporte; sin embargo, lo más frecuente es que infecte tallos bajos, cerca o en la superficie del suelo, pero también puede infectar cualquier parte de una planta susceptible si las condiciones ambientales son favorables (Mullen 2001).
El micelio blanco puede ser producido sobre y cerca de la superficie del suelo, los esclerocios se forman en las masas del micelio. Los esclerocios son la estructura que le permite sobrevivir e iniciar una nueva infección en un hospedero susceptible, con o sin necesidad, de una fuente alimenticia externa. También puede permanecer invernando en plantas o restos vegetales en forma de micelio o esclerocio (Punja y Grogan 1981).
Sclerotium rolfsii ataca directamente a los tejidos, a los que mata y desintegra al secretar ácido oxálico, así como también enzimas pectinoliticas, celuloliticas y otras, antes de que penetre en el hospedante (Agrios 1996). Por otra parte el ácido oxálico actúa aumentando el efecto destructivo de la enzima poligalacturonasa sobre el tejido de dos maneras diferentes. Una de ellas es bajando el pH a uno más favorable para la acción enzimática. La otra es cuando el ácido oxálico combinado con los iones Ca permite a la
- 6 - enzima poligalacturonasa hidrolizar más fácilmente los pectatos en la lámina media (Saralosa y Rocca 1975). Una vez que el hongo se ha establecido en las plantas, éste avanza y forma micelio y esclerocios con gran rapidez, especialmente cuando hay suficiente humedad y la temperatura es alta (entre 30 y 35°C). Al parecer, el patógeno crece, sobrevive y ataca a las plantas con mayor frecuencia cerca de la superficie del suelo, quizá debido a que a ese nivel las temperaturas son más favorables, hay mayor abastecimiento de sustancias orgánicas que el hongo utiliza para alimentarse y existe una menor competencia o antagonismo con otros organismos del suelo (Agrios 1996).
La rápida diseminación de S. rolfsii, principalmente por labores de labranza y las labores de riego por gravedad, obliga a muchos agricultores a cambiar de cultivo en forma definitiva, debido a la alta infestación. Algunos agricultores continúan sembrando en terrenos totalmente infestados, lo que representa mayores costos de producción y grandes pérdidas de cosecha; las que según Pinto et al. (1998) podrían llegar hasta un 100%.
El tizón sureño es difícil de controlar y no hay demasiadas opciones viables. Una opción es arar con profundidad para enterrar los esclerocios y evitar que ataquen a las plantas en la línea del suelo. La rotación de cultivos utilizando plantas que no sean hospederas como el cultivo del maíz ayuda a reducir de manera importante los niveles de esclerocios en el campo, pero no hay ninguna hortaliza que pueda utilizarse como cultivo de rotación. Anteriormente había fungicidas que podían utilizarse al momento de la siembra para manejar la enfermedad; el más común era el PCNB (pentacloronitrobenceno). Sin embargo, el año 2011 sacaron este producto del mercado en México (http://agronomo-uach.blogspot.mx/2012/04/controla-sclerotium-rolfsii-tizon.html).
- 7 - Otras medidas de manejo de S. rolfsii se logra mediante la solarización, es decir, el cubrimiento del suelo humedecido con láminas de polietileno transparentes durante la estación cálida. Con este método, aumenta la temperatura y puede controlarse o disminuir las poblaciones de patógenos que están latentes (Cook y Baker 1983).
Otra alternativa es a través del uso de microorganismos antagonistas como el hongo Trichoderma, que destruye los esclerocios y/o evita su formación (Cook y Baker 1983).
2.4 Los hongos del género Trichoderma en el control de fitopatógenos.
Las cepas de Trichoderma son conocidas por su habilidad para colonizar raíces (Harman 2000). Existen algunas cepas que se establecen sobre la superficie de las raíces y penetran la epidermis y algunas células debajo de este nivel. Pocos casos se han examinado a fondo los mecanismos de cómo Trichoderma coloniza las superficies de las raíces y se ha encontrado que a veces este fenómeno se asemeja a las características observadas durante el proceso de micoparasismo, evidenciando que las hifas invaden la epidermis de la raíz. La penetración de los tejidos radiculares es generalmente limitada a las primeras y segundas capas de las células (Harman et al. 2004). Sin embargo, se ha descrito que la cepa de Trichoderma stromaticum es endofítica o sea que viven sin causar daño en el interior de células y tejidos de plantas durante una parte considerable de su ciclo de vida y pueden localizarse en espacios intracelulares, intercelulares o tejido vascular de cacao (Quispel 1992, Reinhold-Hurek y Hurek 1998, Evans et al. 2003). La invasión de células exteriores de las raíces por cepas de Trichoderma puede resultar en la inducción de resistencia sistémica (Yedidia et al. 2003).
- 8 - El género Trichoderma pertenece al grupo de hongos Deuteromicetes u hongos imperfectos y se caracteriza por presentar conidióforos hialinos, muchas veces blanquecinos, no verticilados, fiálides simples o en grupos. En su estado vegetativo presenta un micelio con septos simples. Las hifas que llevan las esporas o conidióforos son ramificadas (Rodríguez y Verónica 2002).
La mayoría de las especies de Trichoderma presentan clamidosporas, las cuales pueden ser intercalares y en ocasiones terminales. Las clamidosporas toleran condiciones ambientales adversas, son estructuras de sobrevivencia que permiten que el hongo pueda perdurar a través del tiempo (Stefanova et al. 1999).
Las especies pertenecientes al género Trichoderma se caracterizan por ser hongos saprófitos, que sobreviven en suelos con diferentes cantidades de materia orgánica, los cuales son capaces de descomponerla. En determinadas condiciones pueden ser anaerobios facultativos, lo que les permite mostrar una mayor plasticidad ecológica, ya que se encuentran presentes en todas las latitudes, desde las zonas polares hasta la ecuatorial. Esta distribución tan amplia y su plasticidad ecológica están estrechamente relacionadas con la alta capacidad enzimática que poseen para degradar sustratos, un metabolismo versátil y resistencia a inhibidores microbianos (Rodríguez 1990). Además, su fácil aislamiento, propagación y rápido crecimiento hacen que las especies de este género sean los antagonistas más estudiados desde hace mas de 70 años (Hermosa et al. 2000) y utilizados para el control de enfermedades producidas por hongos fitopatógenos (Howell 2003), principalmente de raíz, como son los hongos Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Pythium sp. (Viterbo y Horwitz 2010).
- 9 - Trichoderma ha desarrollado mecanismos para atacar y parasitar a otros hongos y usarlos como una fuente nutricional, entre estos mecanismos de biocontrol utilizados se encuentra el micoparasitismo, la antibiosis y la competencia por espacio (Howell 2003, Vinale et al. 2008).
Los eventos de micoparasitismo son: a) reconocimiento del hospedero, b) ataque al hospedero, c) penetración de la pared celular y d) muerte del hospedero (Vinale et al. 2008). Durante este proceso, Trichoderma secreta enzimas como la glucanasa y quitinasa (Harman et al. 2004) que hidrolizan la pared celular del hospedero. Los oligómeros de la pared celular del patógeno que se liberan funcionan como señales para la planta y desencadenan una respuesta de defensa (Howell 2003, Woo et al. 2006, Vinale et al. 2008, Harman et al. 2004, Woo y Lorito 2007). La glucanasa y quitinasa de Trichoderma liberadas al medio de cultivo inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos como S. rolfsii (El-katatny et al. 2001).
Kredics et al. (2003) reportaron que Trichoderma harzianum por mico-parasitismo sobre el micelio de Rhizoctonia sp., Sclerotinia sp., Pythium sp. y Fusarium sp., reduce la severidad de las enfermedades causadas por la mayoría de estos patógenos.
En la antibiosis muchas cepas de Trichoderma producen metabolitos secundarios volátiles y no volátiles. Algunos, inhiben el desarrollo de otros microorganismos sin un contacto físico. Por lo que tales sustancias inhibidoras son consideradas "antibióticos" (Hjeljord y Tronsmo 1998).
Por otra parte, cuando Trichoderma es adicionado al suelo o aplicado en las semillas, Trichoderma crece simultáneamente con el desarrollo del sistema radicular de la
- 10 - planta tratada; de esta forma en la rizósfera por competencia con el patógeno contribuyen a lograr un control eficaz de un fitopatógeno (Howell 2003).
En el caso de la cebolla, T. harzianum (identificado posteriormente como T. asperellum) redujo significativamente el índice de severidad de la enfermedad tizón sureño ocasionada por Sclerotium rolfsii en plantas de tres variedades de cebolla (Aparicio 2010). T. asperellum Tc74 no permite la formación de esclerocios de S. rolfsii cuando son confrontados in vitro (Ruiz 2010). Así mismo, Ruiz (2011) mostró que T. asperellum presenta compuestos volátiles con actividad antifúngica contra Sclerotium rolfsii.
2.4.1 Interacción de Trichoderma con las plantas
Además de que Trichoderma reduce las enfermedades de las plantas por su efecto directo contra los patógenos, también promueve el crecimiento e induce respuesta de defensa en las plantas. Una de las características de Trichoderma es su capacidad de colonizar la superficie de las raíces induciendo un mejor desarrollo del sistema radicular, incrementando la disponibilidad de nutrientes, aunado con una mejora de la solubilización de nutrientes. Todo esto causa cambios sustanciales en el metabolismo de los tejidos de las plantas que conllevan a mejorar el desarrollo y la productividad (Kullnig et al. 2000, Benítez et al. 2004, Harman et al. 2004, Vinale et al. 2008). Al respecto se propone que hay algunos componentes químicos producidos por Trichoderma que aumentan el crecimiento, la absorción de nutrientes, la eficiencia de la utilización de fertilizantes y aumentan el porcentaje y la tasa de germinación de las semillas (Shoresh et al. 2010).
La capacidad de T. harzianum de promover el crecimiento se ha probado tanto en experimentos de invernaderos como en sistemas hidropónicos, donde hay un 30% de
- 11 - incremento en la emergencia de la semilla, las plantas presentan un incremento de 25% del área radicular y en las concentraciones de fósforo y hierro que contienen (Yedidia et al. 1999, Yedidia et al. 2001). En otro trabajo realizado por Yossen et al. (2003), demostraron que al incorporar T. harzianum en el sustrato de germinadores de lechuga, se promueve el crecimiento de las plantas. Aparicio (2010) encontró un aumento del crecimiento de la raíz y de los bulbos de las plantas de cebolla tratadas con T. harzianum.
Por otra parte, las plantas cuando son pre-tratadas con Trichoderma muestran incrementos de su resistencia al ataque por patógenos, ya que se estimulan los mecanismos de defensa de la planta, que incluye la formación de barreras físicas y a través del incremento de reacciones bioquímicas (Rivero 2001, Howell 2003, Harman et al. 2004, Vinale et al. 2008). Las plantas colonizadas por Trichoderma presentan una reducción de la incidencia y la severidad de las enfermedades Trichoderma induce resistencia local que es activada en los sitios de contacto o de inoculación, pero también una resistencia sistémica ya que la respuesta de defensa vegetal se transfiere a otras partes de células y tejidos de las plantas donde no ocurrió el contacto con el patógeno (Rivero 2001, Vinale et al. 2008).
Ezziyyani et al. (2005) observaron que el tratamiento con T. harzianum en las raíces de pimiento produce una reacción sistémica en las hojas que induce la producción de proteínas relacionadas con la patogénesis con actividad de peroxidasa. Yoshioka et al . (2011), encontraron que el tratamiento de T. asperellum en el sustrato de crecimiento causa inducción de resistencia sistémica en plantas de Arabidopsis thaliana contra la mancha bacteriana de la hoja ocasionada por el patógeno Pseudomonas syringae pv. tomato. Esta respuesta bioquímica de resistencia involucra la producción de las enzimas glucanasa y quitinasa que degradan la pared celular del hongo patógeno (Van Loon et al. 1998, Rivero
- 12 - 2001, Harman et al. 2004, Vinale et al. 2008). La incorporación de T. asperellum al sustrato de crecimiento de plántulas de pepino de 7 días de edad incrementa la actividad de las enzimas β-1, 3 glucanasa, quitinasa, y peroxidasa (Brotman et al. 2008).
En plantas de cebolla tratadas con T. harzianum se incrementa la actividad de peroxidasa y estos aumentos son dependientes de la variedad de cebolla y se relacionan con una disminución de la severidad de la enfermedad causada por S. rolfsii (Aparicio 2010).
- 13 - 3. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la inoculación con Trichoderma asperellum en la actividad de las enzimas glucanasa, quitinasa, peroxidasa de plantas de tres variedades de cebolla y su relación con la resistencia a Sclerotium rolfsii.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar el efecto de T. asperellum en la actividad de glucanasa, quitinasa y peroxidasa de bulbo, raíz y hoja de plantas de tres variedades de cebolla.
Determinar el efecto de S. rolfsii en la actividad de glucanasa, quitinasa y peroxidasa de bulbo, raíz y hoja de plantas de tres variedades de cebolla.
Determinar la actividad de glucanasa, quitinasa y peroxidasa de bulbo, raíz y hoja de plantas de tres variedades de cebolla tratadas con T. asperellum e inoculadas con S. rolfsii
Evaluar el efecto de T. asperellum sobre el crecimiento de las plantas de tres variedades de cebolla.
Evaluar el efecto de T. asperellum en la reducción de la severidad de la enfermedad tizón sureño de plantas de cebolla.
- 14 - 4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Material vegetal
Las semillas de cebolla Crystal White (blanca) de producción mexicana, Red Satan (roja) producida por la empresa Americana Nunhems se adquirieron del distribuidor “Rancho los Molinos S. A. de C. V.”. Las semillas de la variedad Mata Hari (morada)
producida en Francia por la empresa Service Plus se adquirió del distribuidor “La Huerta S.P.R. de R.L.”.
4.2 Cepas de hongos
La cepa de Trichoderma asperellum utilizada fue la Tc74, proporcionada por el Laboratorio de Fitopatología del CeProBi. Esta cepa mostró diferencias altamente significativas en su crecimiento y actividad mico-parasítica in vitro contra el patógeno Phytophthora capsici (Guigón-Lopéz y González-González 2003).
La cepa 12 del hongo Sclerotium rolfsii fue proporcionada por el Laboratorio de Fitopatología del CeProBi, proviene de plantas de frijol, colectadas en Yautepec, Morelos. Esta cepa se seleccionó por su mayor capacidad de producción de esclerocios y severidad en cebolla (Ruiz 2010). Previamente a su uso se colocó micelio de S. rolfsii en cajas de Petri con medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar (PDA) y se dejó crecer por 4 días en una incubadora a 27 ± 1 ºC.
4.3 Siembra y manejo agronómico de la cebolla
Las semillas de las tres variedades se pusieron en charolas germinadoras con orificios individuales (una semilla en cada orificio). Se utilizó como sustrato una mezcla de
- 15 - Peet most® y Metromix® en una relación de 1:3 p/p (previamente esterilizados en autoclave a 15 Lbs/cm2 por 15 min), el cual primero se humedeció y después se puso en las charolas.
Las semillas en las charolas se incubaron bajo condiciones de invernadero (29 ± 3 ºC) por 4 días tapadas, después de su germinación se destaparon y se dejaron por 15 días bajo las mismas condiciones. Posteriormente se trasplantaron en macetas de plásticos de 1 kg conteniendo la misma mezcla de sustrato y en las mismas condiciones de invernadero.
En la charola de germinación, los riegos se hicieron cada 4 días manteniendo húmedo el sustrato. Después del trasplante en la maceta, los riegos se dieron cada tercer día durante los primeros 20 días y después se intensificó a un riego por día. Para la fertilización se utilizó la fórmula 140-60-0 (nitrógeno, fósforo y potasio) y se aplicó en dos etapas, la primera al momento del trasplante y la segunda al mes del trasplante (INIFAP 2001).
4.4 Propagación e inoculación con Trichoderma asperellum
Para la propagación de Trichoderma asperellum se utilizó como sustrato la semilla de trigo. Para esto, el trigo se remojó por 24 h, se escurrió y se colocó en papel higiénico para eliminar el exceso de agua. Para medir la humedad en el trigo, se pesaron 250 g de trigo y se midió la humedad con un medidor digital de humedad de grano (Seedburo Equipment Company Chicago Illinois, Modelo 700). La humedad se midió cada 10 minutos, hasta obtener una humedad de 70%. Posteriormente se colocaron 500g de trigo en bolsas de polipapel y se esterilizó a 121 ºC y 15 lb de presión por 40 min. Una vez esterilizado el trigo se almacenó inmediatamente a 4 °C durante 24 h y nuevamente se esterilizó. Una vez que el trigo se enfrío, cada bolsa se inoculó con 10 discos (7 mm de
- 16 - diámetro) de micelio de Trichoderma. Las bolsas se mantuvieron a temperatura del laboratorio (27 ± 2 °C) por 20 días. Durante este periodo, las bolsas se movieron manualmente para distribuir el inóculo en forma homogénea (Ruiz 2010).
El inóculo de T. asperellum se preparó colocando en un vaso de precipitado, 50 mL de agua destilada estéril con 1 g de granos de trigo inoculados con T. asperellum. De esta suspensión se tomó una muestra que se colocó en una cámara de Neubauer para cuantificar el número de esporas y ajustar la suspensión a 1.7 x 107 esporas/mL. La inoculación con T. asperellum se hizo en dos etapas: la primera al momento de la siembra de la semilla y la segunda durante el trasplante. En el caso de la siembra, se aplicó 1 mL de la suspensión de esporas tanto a las semillas como al sustrato que las rodea. Para la inoculación al momento del trasplante, las plántulas con su cepellón se transfirieron a las macetas y se aplicó 1 mL de suspensión de esporas en el sustrato que rodea a la raíz (Ortega 2010).
Como testigos, se usaron semillas no inoculadas con T. asperellum, pero cultivadas bajo las mismas condiciones. A los 87 días después de la segunda inoculación con T. asperellum, se tomaron muestras de raíz, bulbo y hoja de seis plantas inoculadas y seis plantas no inoculadas de las tres variedades y se almacenaron en congelación a -20 °C.
4.5 Propagación e inoculación con Sclerotium rolfsii
De un cultivo de S. rolfsii de 4 días se tomaron círculos (0.5 cm de diámetro) de medio PDA con micelio con los que se inocularon bulbos de cebollas blancas que se adquirieron en el mercado local. Para esto, previamente los bulbos se lavaron con jabón y agua y en la primera capa del bulbo se hizo con una navaja estéril una perforación de 0.125 cm3 (0.5 cm de largo x 0.5 cm de ancho y 0.5 cm de profundidad). En la perforación se
- 17 - colocó el inóculo de S. rolfsii y sobre éste se colocó un algodón humedecido por 24 h. Al término de este tiempo, se retiró el algodón y los bulbos se volvieron a incubar en una cámara húmeda durante 3 días y a temperatura del laboratorio (27 ± 2 ºC).
Posteriormente, del tejido infectado se tomaron círculos de 0.5 cm de diámetro y se colocaron nuevamente en los bulbos de cebollas que se adquirieron en el mercado, pero esta vez sin perforarlas. Después de 4 días, del tejido infectado se tomaron muestras de 0.5 cm de diámetro que se utilizaron para inocular los bulbos de las plantas de 87 días de edad. Después de 3 días de la inoculación, se tomaron 6 muestras de raíz, bulbo y hoja de las plantas de las tres variedades y se almacenaron en congelación hasta su uso.
4.6 Obtención de extractos enzimáticos
Los extractos enzimáticos se prepararon de acuerdo al método reportado por El Ghaouth et al. (2003). Del material vegetal congelado, se pesaron 200 mg de tejido y se maceró con nitrógeno líquido. El polvo se mezcló y se homogeneizó con una solución amortiguadora que contenía acetato de sodio 50 mM a pH 5.0. La mezcla se centrifugó a 13000 rpm, a 4 °C, durante 30 min. El sobrenadante se recuperó y se usó como extracto enzimático.
4.7 Cuantificación de proteínas
La actividad de la glucanasa, quitinasa y peroxidasa se expresan en función de la cantidad de proteína en el extracto enzimático, por lo que el contenido de proteínas se determinó por el método de Bradford (1976), que consiste en la formación de un compuesto de absorción que vira de color azul a azul verdoso y que absorbe a 595 nm. La curva
- 18 - patrón que se utilizó se realizó con suero de albúmina de bovino en un rango de 0 a 15.0 µg de proteína/mL. La ecuación de la regresión que se obtuvo fue y = 0.065x + 0.047 con un coeficiente de regresión (R2) de 0.988. De donde:
x= y - 0.047 0.065 siendo: x= contenido de proteína en µg/mL. y= la absorbancia a 595 nm.
4.8 Cuantificación de azúcares reductores
La actividad de glucanasa y quitinasa se expresó en nmol de glucosa y de N-acetil glucosamina, respectivamente. Para lo cual, fue necesario determinar los azúcares reductores liberados por la actividad enzimática. Los azúcares reductores se determinaron por el método colorimétrico basado en la reacción con el ácido dinitrosalicílico (DNS), donde el DNS de color amarillo se reduce en presencia del azúcar formando un compuesto de color rojo ladrillo (Adney y Baker, 1996). El compuesto resultante se detecta por su absorbancia a 575 nm en un espectrofotómetro (Marca Genesys 2, modelo Thermo spetronic).
La cantidad de azúcares reductores liberados se calcularon a través de curvas patrón construidas con glucosa en un rango de 0.00 a 800 µg y con N-acetil glucosamina en un rango de 0.00 a 800 µg. La ecuación de regresión de la curva patrón de glucosa fue y = 0.1301x – 0.2154 con un coeficiente de regresión (R2) de 0.9846. De donde:
x= y - 0.2154 0.1301
- 19 - siendo:
x= Contenido de glucosa en µg/mL y= la absorbancia a 575 nm
Para la curva patrón de N- acetil glucosamina, la ecuación de regresión fue y = 0.0985x – 0.1542 con un coeficiente de regresión (R2) de 0.983. De donde:
x= y - 0.1542 0.0985
siendo:
x= Contenido de N-acetil glucosamina en µg/mL y= la absorbancia a 575 nm
4.9 Evaluación de la actividad enzimática
4.9.1 Determinación de la actividad de glucanasa
Para medir la actividad de glucanasa se siguió el método propuesto por El-Katatny et al. (2001). El volumen final de la mezcla de reacción de la enzima fue de 700 µL y contenía como sustrato 500 µL de laminarina (Sigma Chemical Company) al 5.0 % p/p y 200 µL de extracto enzimático que contenía 5 µg de proteína. Esta mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación a 300 rpm en un Termomixer (Eppendorf, modelo 22331 Hamburg). Después de la incubación, a la mezcla se le agregó 300 µL de acetato de sodio (50 mM, pH 5.0) y 3 mL del reactivo DNS. La mezcla se calentó a 90 ºC por 5 min y se añadió 1 mL de tartrato de sodio y potasio para detener la reacción. La mezcla se dejó enfriar a temperatura del laboratorio (27 ± 2 ºC) y se leyó la absorbancia a 575 nm en un
- 20 - espectrofotómetro (Marca Genesys 2, modelo Thermo spetronic). La actividad de glucanasa se expresó en nmol de glucosa/min/mg de proteína.
4.9.2 Determinación de la actividad de quitinasa
La actividad de quitinasa se evaluó mediante el método descrito por El Katatny et al. (2001). Como sustrato se usó quitina (Sigma Chemical Company) al 1.0 %, disuelta en solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0). La mezcla del ensayo se realizó en un volumen final de 1 mL y contenía 0.5 mL de quitina y 0.5 mL de extracto enzimático (12.5 µg de proteína). Esta mezcla se incubó a 37 °C durante 7 h a 300 rpm en un Termomixer y se le agregó 3 mL de DNS. Los azúcares reductores liberados por la actividad de la quitina se leyeron en un espectrofotómetro a una absorbancia de 575 nm. La actividad se expresó en nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína.
4.9.3 Determinación de la actividad de peroxidasa
La actividad de peroxidasa se evaluó siguiendo el método descrito por Stasolla y Yeung (2007). Como sustratos se usaron guayacol (1 M) y peróxido de hidrógeno al 0.3 % ambos adquiridos de Sigma Chemical Company. El volumen final de mezcla de reacción fue de 1 mL y la mezcla contenía 670 µL de acetato de sodio 50 mM (pH 5.2), 200 µL de extracto enzimático (5 µg de proteína), 100 µL de H2O2 y 30 µL de guayacol. La oxidación
del guayacol por la enzima en presencia de peróxido de hidrógeno, se registró en un espectrofotómetro a una absorbancia de 470 nm. La actividad de la enzima se expresó como μmoles de tetraguayacol/min/mg de proteína. Los μmoles de tetraguayacol se
- 21 - 4.10 Evaluación del crecimiento de las plantas de cebolla sin y con Trichoderma
asperellum
Después de 87 días de crecimiento, seis plantas se extrajeron de sus macetas, se les retiró el sustrato de raíces y bulbos, y se midió el peso fresco y seco de la planta, de las hojas, del bulbo y de las raíces.
4.11 Evaluación de la severidad de la enfermedad tizón sureño
A los 87 días después del tratamiento con y sin T. harzianum, se inocularon los bulbos con micelio de S. rolfsii proveniente de bulbos infectados de cebolla comercial. En cada bulbo se colocaron cuatro discos de micelio, cada uno de 0.5 cm2 de diámetro. La medición de la enfermedad se hizo hasta los 26 días después de la inoculación. La escala que se utilizó para cuantificar la severidad fue la reportada por Aparicio (2010) y que se muestra en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Escala de severidad del tizón sureño en plantas de cebolla
Descripción de síntoma
Valor de severidad
Plantas sanas 1
Plantas sin síntomas, con esclerocios en el suelo 2
Plantas amarillentas con presencia de micelio a su alrededor y esclerocios 3 Plantas con síntomas de marchitez y pudrición además de micelio y esclerocios 4
- 22 - 4.12 Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental que se utilizó fue un diseño bifactorial completamente al azar con 6 tratamientos y 6 repeticiones, la unidad experimental consistió de una planta. Los datos se procesaron mediante ANOVA de dos vías, la comparación de medias se hizo a través de la prueba de Tukey o prueba de t-test (p< 0.001) según fuera el caso. Para la severidad del tizón sureño el diseño fue completamente al azar con 6 tratamientos y 36 repeticiones, los datos se analizaron con la prueba de Mann Whitney y de Kruskal Wallis (p<0.001). En todos los casos se utilizó el programa SIGMA PLOT 11.0
- 23 - 5. RESULTADOS
5.1 Actividad enzimática en plantas de cebolla de las tres variedades sin tratamientos. Las plantas de cebolla de la variedad Red Satan sin tratamiento son las que presentaron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa seguidas de las plantas de las variedades Mata Hary y Crystal White. Mientras que en las plantas de las variedades Crystal White y Red Satan la actividad de peroxidasa fue similar, pero mayor a la actividad que se encontró en las plantas de la variedad Mata Hary (Cuadro 2). El bulbo es el órgano que presentó la mayor actividad enzimática y en la raíz y la hoja la actividad enzimática fue similar (Cuadro 3).
En el cuadro 4 se observa que solamente en los bulbos hay diferencias entre variedades. Los bulbos de las plantas de la variedad Red Satan mostraron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa, mientras que los bulbos de las variedades Red Satan y Crystal White presentaron una actividad similar de peroxidasa a la encontrada en los bulbos de la variedad Crystal White. En las raíces y en las hojas de las tres variedades la actividad de las tres enzimas fue similar.
En el mismo cuadro se muestra que en las plantas de la variedad Crystal White, para esta misma variedad todos los órganos presentaron una actividad de glucanasa similar. La actividad de quitinasa es mayor en la raíz y en la hoja que la encontrada en el bulbo; pero la mayor actividad de peroxidasa se presentó en el bulbo. Para las plantas de la variedad Red Satan, se encontró que el bulbo presentó la mayor actividad de las tres enzimas; mientras que en las plantas de la variedad Mata Hary el bulbo presentó mayor actividad de glucanasa y quitinasa, pero en la peroxidasa fue similar en los tres órganos.
- 24 - Cuadro 2. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de las plantas de cebolla sin tratamientos
Variedad Glucanasa1 Quitinasa2 Peroxidasa3
Crystal White 13.527 ± 0.607c 14.093 ± 1.294c 18.558 ± 1.407ab Red Satan 24.419 ± 0.607a 20.401 ± 1.294a 19.296 ± 1.407a Mata Hary 18.086 ± 0.607b 15.349 ± 1.294b 13.900 ± 1.407b Los datos representan la media ± el error estándar (n=54). Letras diferentes en una columna indican diferencias estadísticas según la prueba de dos vías (p<0.001) (Anexo 1). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína
Cuadro 3. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de las plantas de cebolla sin tratamiento
Órgano Glucanasa1 Quitinasa2 Peroxidasa3
Bulbo 28.597 ± 0.607a 22.228 ± 1.294a 29.162 ± 1.407a Raíz 13.791 ± 0.607b 15.438 ± 1.294b 11.553 ± 1.407b Hoja 13.644 ± 0.607b 12.176 ± 1.294b 11.040 ± 1.407b Los datos representan la media ± el error estándar (n=54). Letras diferentes en una columna indican diferencias estadísticas según la prueba de dos vías (p<0.001) (Anexo 1). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína.
- 25 - Cuadro 4. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad de plantas de cebolla sin tratamiento
Órgano
Variedad BULBO RAÍZ HOJA
Actividad de glucanasa1
Crystal White 12.3 ± 1.1c A 14.1 ± 0.2a A 14.1 ± 0.2a A Red Satan 46.1 ± 1.4a A 13.7 ± 0.2a B 13.5 ± 0.1a B Mata Hary 27.3 ± 2.5b A 13.5 ± 0.1a B 13.5 ± 0.1a B
Actividad de quitinasa2
Crystal White 8.8 ± 1.0c B 16.7 ± 0.4a A 16.7 ± 0.4a A Red Satan 36.4 ± 3.3a A 14.0 ± 0.4a B 9.9 ± 0.1a B Mata Hary 21.5 ± 2.0b A 14.7 ± 0.6a AB 9.9 ± 0.1a B
Actividad de peroxidasa3
Crystal White 32.9 ± 2.3a A 11.4 ± 0.2a B 11.4 ±0.2a B Red Satan 36.2 ±3.0a A 10.8 ± 0.4a B 10.9 ± 0.3a B Mata Hary 18.4 ± 1.9b A 12.4 ± 0.3a A 10.9 ± 0.3a A Los datos representan la media ± el error estándar (n=6). Letras minúsculas en columna por actividad indican comparación entre variedades según la prueba de dos vías. Letras mayúsculas en fila indican comparación entre órganos en una misma variedad (p<0.001) (Anexo 1). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína.
- 26 - 5.2 Efecto de la aplicación de Trichoderma asperellum en la actividad enzimática de plantas de cebolla
La aplicación de T. asperellum en las plantas de todas las variedades generó un incremento en los tres órganos de la actividad enzimática. En el bulbo se encontraron los mayores cambios de la actividad enzimática. Para la actividad de glucanasa el aumento fue de 0.4 a 2.2 veces, para la quitinasa de 0.5 a 1.7 veces y para la peroxidasa de 0.8 a 1.0 veces. Las plantas de la variedad Crystal White fueron las que mejor respondieron a la aplicación de T. asperellum (Cuadro 5).
La comparación entre variedades de la actividad enzimática de las plantas tratadas con T. asperellum indicó que las plantas de cebolla de la variedad Red Satan mostraron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa. Sin embargo no fue la que mejor respondió a la aplicación de T. asperellum. Las plantas de todas las variedades presentaron una actividad similar de peroxidasa (Cuadro 6). Nuevamente, el bulbo es el órgano que mostró la mayor actividad de las tres enzimas. En la raíz y en la hoja la actividad de glucanasa es similar; pero la actividad de quitinasa y peroxidasa es mayor en la raíz que en la hoja (Cuadro 7).
En el cuadro 8 se muestra que el bulbo de la variedad Red Satan mostró la mayor actividad de glucanasa y quitinasa; seguido de los bulbos de las variedades Mata Hary y/o Crystal White. La actividad de peroxidasa es similar los bulbos de las variedades Crystal White y Red Satan. En la raíz de las plantas de las tres variedades se encontró una actividad similar de glucanasa o de quitinasa; mientras que las raíces de las plantas de la variedad Mata Hary presentaron la mayor actividad de peroxidasa. En las hojas de las plantas de la variedad Crystal White se encontró la mayor actividad de glucanasa y quitinasa. La actividad de peroxidasa fue similar en las hojas de las plantas de todas las variedades.
- 27 - La comparación de la actividad enzimática de órganos de plantas de una misma variedad (Cuadro 8) mostró que los bulbos de las tres variedades presentaron la mayor actividad de glucanasa, seguido de las raíces y las hojas. Todos los órganos de las plantas de la variedad Crystal White presentaron una actividad similar de quitinasa, pero los bulbos de las variedades Red Satan y Mata Hary presentaron una mayor actividad de esta enzima que los otros órganos. Los bulbos de las variedades Crystal White y Red Satan presentaron una actividad de peroxidasa mayor que las raíces y las hojas. Sin embargo, los bulbos y las raíces de las plantas de la variedad Mata Hary mostraron una actividad similar de peroxidasa y mayor a la encontrada en las hojas.
- 28 - Cuadro 5. Actividad enzimática en órganos de plantas de cebolla de diferente variedad sin y con la aplicación de T.
asperellum
ÓRGANO VARIEDAD
Actividad de glucanasa1 Actividad de quitinasa2 Actividad de peroxidasa3 Sin T. asperellum Con T. asperellum Incremento (No. de veces) Sin T. asperellum Con T. asperellum Incremento (No. de veces) Sin T. asperellum Con T. asperellum Incremento (No. de veces) BULBO Crystal
White 12.3 ± 1.1a 39.3 ± 3.8b 2.2 8.8 ± 1.0a 23.4 ± 3.1b 1.7 32.9 ± 2.3a 65.7 ± 2.7b 1.0 Red Satan 46.1 ± 1.4a 64.0 ± 2.0b 0.4 36.4 ± 3.3a 54.5 ± 4.5b 0.5 36.2 ±3.0a 65.3 ± 1.8b 0.8
Mata Hary 27.3 ± 2.5a 43.7 ± 3.8b 0.6 21.5 ± 2.0a 32.1 ± 2.9b 0.5 18.4 ± 1.9a 32.3 ± 0.4b 0.8
RAÍZ
Crystal
White 14.1 ± 0.2a 26.5 ± 0.5b 0.9 16.7 ± 0.4a 23.8 ± 0.7b 0.4 11.4 ± 0.2a 15.3 ± 0.4b 0.3 Red Satan 13.7 ± 0.2a 19.5 ± 1.2b 0.4 14.0 ± 0.4a 21.2 ± 0.6b 0.5 10.8 ± 0.4a 17.8 ± 0.7b 0.6
Mata Hary 13.5 ± 0.1a 21.7 ± 1.3b 0.6 14.7 ± 0.6a 22.9 ± 1.6b 0.6 12.4 ± 0.3a 38.9 ± 0.2b 2.1
HOJA
Crystal
White 14.1 ± 0.2a 26.5 ± 0.6b 0.9 16.7 ± 0.4a 23.8 ± 0.7b 0.4 11.4 ±0.2a 15.3 ± 0.4b 0.3 Red Satan 13.5 ± 0.1a 15.6 ± 0.9b 0.2 9.9 ± 0.1a 11.5 ± 0.7b 0.2 10.9 ± 0.3a 14.9 ± 0.8b 0.4
Mata Hary 13.5 ± 0.1a 15.6 ± 0.9b 0.2 9.9 ± 0.1a 11.5 ± 0.7b 0.2 10.9 ± 0.3a 14.9 ± 0.8b 0.4 Los datos representan la media ± el error estándar (n=6). Letras diferentes en una misma fila para una actividad enzimática indican diferencias estadísticas según la prueba de t-test (p<0.001). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína.
- 29 - Cuadro 6. Comparación entre variedades de la actividad enzimática de las plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
Variedad Glucanasa1 Quitinasa2 Peroxidasa3
Crystal White 30.780 ± 1.255b 23.670 ± 1.259b 32.113 ± 2.192a Red Satan 33.046 ± 1.255a 29.080 ± 1.259a 32.442 ± 2.192a Mata Hary 27.023 ± 1.255b 22.149 ± 1.259c 28.701 ± 2.192a Los datos representan la media ± el error estándar (n=54). Letras diferentes en una columna indican diferencias estadísticas según la prueba de dos vías (p<0.001) (Anexo 2). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína
Cuadro 7. Comparación entre órganos de la actividad enzimática de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
Órgano Glucanasa1 Quitinasa2 Peroxidasa3
Bulbo 49.009 ± 1.255a 36.666 ± 1.259a 54.439 ± 2.192a Raíz 22.607 ± 1.255b 22.639 ± 1.259b 23.774 ± 2.192b Hoja 19.233 ± 1.255b 15.593 ± 1.259c 15.044 ± 2.192c Los datos representan la media ± el error estándar (n=54). Letras diferentes en una columna indican diferencias estadísticas según la prueba de dos vías (p<0.001) (Anexo 2). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína
- 30 - Cuadro 8. Comparación de la actividad enzimática entre variedades y órganos de una misma variedad de plantas de cebolla tratadas con T. asperellum
Órgano
Variedad BULBO RAÍZ HOJA
Actividad de glucanasa1
Crystal White 39.275 ± 1.1b A 26.533 ± 0.2a B 26.533 ± 0.2a B Red Satan 64.010 ± 1.4a A 19.545 ± 0.2a B 15.584 ± 0.1b B Mata Hary 43.700 ± 2.5b A 21.700 ± 0.1a B 15.500 ± 0.1b B
Actividad de quitinasa2
Crystal White 23.440 ± 1.0c A 23.786 ± 0.4a A 23.786 ± 0.4a A Red Satan 54.508 ± 3.3a A 21.234 ± 0.4a B 11.497 ± 0.1b C Mata Hary 32.051 ± 2.0b A 22.899 ± 0.6a B 11.497 ± 0.1b C
Actividad de peroxidasa3
Crystal White 65.707 ± 2.3a A 15.316 ± 0.2b B 15.316 ±0.2a B Red Satan 65.289 ±3.0a A 17.129 ± 0.4b B 14.908 ± 0.3a B Mata Hary 32.320 ± 1.9b A 38.877 ± 0.3a A 14.908 ± 0.3a B Los datos representan la media ± el error estándar (n=6). Letras minúsculas en columna por actividad indican comparación entre variedades según la prueba de dos vías. Letras mayúsculas en fila indican comparación entre órganos en una misma variedad (p<0.001) (Anexo 2). 1nmol de glucosa/min/mg de proteína. 2nmol de N-acetil glucosamina/min/mg de proteína. 3µmol de tetraguayacol/min/mg de proteína
- 31 - 5.3 Actividad enzimática en plantas de cebolla inoculadas con Sclerotium rolfsii
En las plantas de todas las variedades sin tratamiento, la presencia de S. rolfsii indujo en el bulbo y la raíz un incremento en la actividad enzimática, pero no en las hojas. En el bulbo, la actividad de glucanasa y quitinasa aumentó de 0.4 a 1.4 veces y para la peroxidasa el incremento fue de 0.8 a 1.6 veces. Mientras que en la raíz, el mayor aumento (de 0.8 a 2.0 veces) se presentó en la actividad de peroxidasa. La variedad Crystal White fue la que mejor respondió a la inoculación de S. rolfsii (Cuadro 9).
Con la presencia de S. rolfsii, las plantas de la variedad Red Satan mostraron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa; pero las plantas de la variedad Crystal White mostraron la mayor actividad de peroxidasa, seguida de las plantas de la variedad Red Satan y de la variedad Mata Hary (Cuadro 10). En bulbos se encontraron los mayores cambios en la actividad enzimática, seguidos de las raíces y las hojas. En las raíces y las hojas de la variedad Crystal White mostraron la mayor actividad en glucanasa y quitinasa mientras que en peroxidasa las raíces de la variedad Mata Hary mostraron la mayor actividad, en las hojas las tres variedades mostraron una actividad de peroxidasa similar (Cuadro11).
En especial, los bulbos de la variedad Red Satan presentaron la mayor actividad de glucanasa y quitinasa, seguida de los bulbos de las variedades Mata Hary y Crystal White Sin embargo, los bulbos de la variedad Crystal White presentaron la mayor actividad de peroxidasa (Cuadro 12).
Comparando la actividad enzimática que se encontró en los órganos de plantas de una misma variedad (Cuadro 12), los resultados mostraron que en las plantas de la variedad Crystal White, la actividad de glucanasa fue similar en bulbo y raíz; pero en las plantas de las variedades Red Satan y Mata Hary, la actividad de glucanasa fue mayor en bulbo que en
