JUAN EDUARDO RUIZ GÓMEZ

R

EVISIÓN

T

AXONÓMICA

Y DE

A

LGUNOS

C

ARACTERES

M

OLECULARES

DE LAS

D

IFERENTES

E

SPECIES

DE

I

NSECTOS

V

ECTORES

DE LA

E

NFERMEDAD

DE

C

HAGAS

J

UAN

E

DUARDO

R

UIZ

G

ÓMEZ

D

C

B

Facultad de Ciencias

Universidad de los Andes

B

D. C.

R

EVISIÓN

T

AXONÓMICA

Y DE

A

LGUNOS

C

ARACTERES

M

OLECULARES

DE LAS

D

IFERENTES

E

SPECIES

DE

I

NSECTOS

V

ECTORES

DE LA

E

NFERMEDAD

DE

C

HAGAS

Juan Eduardo Ruiz Gómez

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el titulo de Biólogo

DIRECTOR:

Carlos A. Jaramillo M. Sc. Profesor Titular

Departamento de Ciencias Biológicas Universidad de los Andes

Bogotá D.C.

CODIRECTOR:

Emilio Realpe M. Sc. Profesor Asociado

Departamento de Ciencias Biológicas Universidad de los Andes

Bogotá D.C.

D

C

B

Facultad de Ciencias

Universidad de los Andes

B

D. C.

A Nohra Gema Gómez

Y Luis Eduardo Ruiz mis padres

AGRADECIMIENTOS

Deseo agradecerle a una gran cantidad de personas que de una u otra manera han colaborado con el desarrollo de este proyecto y que además me han alentado en la parte personal para poder llegar a concluirlo con éxito. Agradezco muy especialmente a mis padres Nohra Gema y Luis Eduardo por su continuo apoyo y compañía, al profesor Carlos Jaramillo quien dirigió la realización de este trabajo y cuya asesoria se convirtió en una invaluable ayuda en la resolución de los diferentes problemas y cuestionamientos que se presentaron a lo largo del trabajo, igualmente al profesor Emilio Realpe codirector del proyecto quien igualmente fue una fuente de colaboración y aportes valiosos para este trabajo con sus sugerencias para mejorarlo. Por otra parte agradezco a mis compañeros y amigos de la universidad quienes estuvieron presentes en todo momento a lo largo del desarrollo del trabajo brindándome su apoyo y compañía incondicional.

Juan E. Ruiz Gómez Bogotá D.C. Enero, 2003

Í

NDICE

G

ENERAL

1. I

2. O

3. J

4. M

T

4.1. GENERALIDADES DE LA FAMILIA REDUVIIDAE

4.1.1. Desarrollo y Caracteres Morfológicos de Clasificación 4.1.2. Posición Taxonómica

4.1.3. Distribución Geográfica 4.1.4. Especies mas Estudiadas 4.1.5. Hábitat Silvestre de Reduviidae 4.1.6. Proceso de Infestación de Viviendas

PARTE II

4.2. INVESTIGACIONES

4.2.1. Generalidades de las Investigaciones

4.2.2. Técnicas Utilizadas en las Diferentes Investigaciones. 4.2.3. Morfometria Utilizada Para la Diferenciación de Especies

de Triatominos

4.2.4. Investigación Ecológica Basada en Ciclo de Vida de

Triatoma rubrovaria

4.2.5. Relación del Proceso de Desarrollo con la Fuente Alimenticia de Varias Especies de Triatominos.

4.2.6. Investigación Ecológica Basada en la Presencia de Triatominos en Cultivos de Palmas

4.2.7. ADN Mitocondrial Utilizado Para Determinar Variaciones Entre Poblaciones

2

5

6

10

4.2.8. Relojes Moleculares

4.2.9. Análisis Genético Mediante Amplificación con RAPD de rADN

4.2.10. Proceso Evolutivo de Domesticación de Triatominos

5.

M

6. R

6.1. RESULTADOS DE INVESTIGACIONES ECOLÓGICAS 6.2. RESULTADOS DE INVESTIGACIONES MOLECULARES

6.2.1. ADN Mitocondrial 6.2.2. Relojes Moleculares

6.2.3.Morfometría, Isoenzimas y RAPDs en Triatoma Brasiliensis 6.2.4. rADN

6.2.5. Marcador Molecular Gen mtCytB. 6.2.6. RAPD

7.

D

8. C

9. B

54

58

70

78

81

Í

NDICE DE

F

IGURAS

• Mapa de la distribución geográfica de las principales especies de insectos vectores de la enfermedad de chagas pertenecientes a la tribu Rhodniini. (Tomado de http://lanic.utexas.edu/la/region/map/ y adaptado por Juan Eduardo Ruiz)

• Mapa de la distribución geográfica de las principales especies de insectos vectores de la enfermedad de chagas pertenecientes a la tribu Triatomini. (Tomado de http://lanic.utexas.edu/la/region/map/ y adaptado por Juan Eduardo Ruiz)

• Algunas de las medidas anatómicas utilizadas para la identificación de poblaciones de Brasil. (Tomado del artículo Genetic Variability of Triatoma brasiliensis Populations Borges et al. 2000)

• Fenograma generado mediante programas de computador para poblaciones silvestres y domiciliarias de Rhodnius en Colombia (Tomado del artículo Differentiation and Genetic Analysis of Rhodnius prolixus and Rhodnius colombiensis by rDNA and RAPD Amplification. Jaramillo et al. 2001)

• Resultados obtenidos en la pagina www.ncbi.nlm.nih.gov mediante el uso de las palabras evolución de triatominos. (Tomado de la página www.ncbi.nlm.nih.gov y modificada por Juan Eduardo Ruiz Gómez)

• Árbol filogenético encontrado para la comparación de secuencias de 9 poblaciones de T. infestans, T. melanosoma y

T. brasiliensis. (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Variation of

Triatoma infestans Populations and its Implications on the Specific

Status of T. melanosoma. Monteiro et al. 1999)

• Dendrograma de poblaciones de T. brasiliensis brasiliensis.

14 15 32 36 55 61 64

FIGURA 8.

FIGURA 9.

FIGURA 10.

(Tomado del artículo Genetic Variability of Triatoma brasiliensis (Hemiptera: Reduviidae) Populations Borges et al. 2000)

• Arbol filogenético realizado mediante las secuencias de la región mtlsurRNA de 17 especies de triatomidos. (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Sequence Variation Among Triatomine Vectors of Chagas Disease. Lyman et al. 1999)

• Arbol filogenético realizado mediante las secuencias de la región mtCytB de 17 especies de triatominos. (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Sequence Variation Among Triatomine Vectors of Chagas Disease. Lyman et al. 1999)

• Fenograma generado para poblaciones silvestres y

domiciliarias de Rhodnius en Colombia. (Tomado del artículo Differentiation and Genetic Analysis of Rhodnius prolixus and

Rhodnius colombiensis by rDNA and RAPD Amplification. Jaramillo

et al. 2001)

67

68

Í

NDICE DE

F

OTOGRAFÍAS

FOTOGRAFIA 1. • (A) Espécimen de Triatoma infestans. (B) Espécimen de

Rhodnius prolixus. (C) Espécimen de Triatoma sordida.

(D) Espécimen de Rhodnius neglectus (Fotos A, C y D tomadas de www.sucen.sp.gov.br, Foto B tomada de

www.techne.com.ar). 17

Í

NDICE DE

T

ABLAS

• Especies de la tribu Triatomini que son vectores de la enfermedad de acuerdo a su distribución geográfica

• Especies de la tribu Rhodniini que son vectores de la enfermedad de acuerdo a su distribución geográfica

• Resultados de los experimentos de cruces entre hembras de

Triatoma infestans y machos de Triatoma melanosoma.

(Tomado del artículo Mitochondrial DNA Variation of Triatoma infestans Populations and its Implication on the Specific Status of Triatoma

melanosoma Monteiro et al. 1999)

• Resultados de los experimentos de cruces entre machos de

Triatoma infestans y hembras de Triatoma melanosoma.

(Tomado del artículo Mitochondrial DNA Variation of Triatoma infestans Populations and its Implication on the Specific Status of Triatoma

melanosoma Monteiro et al. 1999).

• Primers directos y reversos utilizados para el gen mtlsurRNA. (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Sequence Variation Among Triatomine Vectors of Chagas Disease. Lyman et al. 1999 adaptada por Juan Eduardo Ruiz Gómez).

• Primers directos y reversos utilizados como regiones consenso para el segmento mtCytB. (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Sequence Variation Among Triatomine Vectors of Chagas Disease.

19 21 45 45 48 48

TABLA 7.

TABLA 8.

Lyman et al. 1999 adaptada por Juan Eduardo Ruiz Gómez).

• Especies de las tribus Triatomini y Rhodniini examinadas, lugar de captura, números de acceso en GenBank de (mtlsurRNA) y de (mtCytB). (Tomado del artículo Mitochondrial DNA Sequence Variation Among Triatomine Vectors of Chagas Disease. Lyman et al. 1999).

• Tiempos de divergencia de especies de triatominos calculados mediante reloj molecular (Tomado del artículo Nuclear rDNA-based Molécula Clock of the Evolution of Triatominae (Hemiptera: Reduviidae), Vectors of Chagas Disease. Bargues et al. 2000 adaptada por Juan Eduardo Ruiz Gómez).

50

1. INTRODUCCIÓN

El creciente interés científico en los campos de la sistemática y evolución de insectos y su relación con la parasitología, al igual que el preocupante crecimiento de la población de personas infectadas con el parásito Trypanosoma cruzi en la región de sur y centro América, han llevado a que se realicen investigaciones en estos campos con el fin de poder identificar las especies de insectos vectores de este parásito y así poder implementar mecanismos de control para evitar una mayor propagación de la enfermedad.

Esta enfermedad presenta una distribución exclusiva de América Latina, especialmente en países como Brasil, Bolivia, Argentina y Colombia entre otros. Los primeros casos de esta enfermedad fueron tratados por el médico brasileño Carlos Chagas (1879-1934) en la población de Lassance estado de Minas Gerais (Brasil). El descubrimiento de la enfermedad dio dos aportes básicos que fueron: la detección del parásito que la causa, el Trypanosoma cruzi, y el otro fue la detección de la forma principal de contagio que se da mediante las heces de un insecto vector que, al picar en ocasiones deja sus deyecciones cerca de la herida que causa y por este lugar entra el parásito al organismo (Segura 1991).

Esta enfermedad se caracteriza por presentar básicamente tres estadios: uno agudo, que aproximadamente dura de 20 a 30 días; posteriormente uno de latencia que tiene un período que puede alcanzar años incluso y una última etapa donde es crónica la enfermedad (Asociación Lucha Contra el Mal de Chagas). Este período crónico es el más grave de todos y es una etapa prácticamente incurable de la enfermedad. Por lo general es una manifestación tardía de la infección. Se la encuentra en casi un 15% de las personas que han sido contagiadas y sus manifestaciones se relacionan directamente con alteraciones del corazón y otros órganos. Sus síntomas más comunes son: palpitaciones, dificultad para respirar, dolores localizados hacia el área cardiaca, dolor en la

región del hígado y una serie de manifestaciones típicas que se observan en el electrocardiograma. La mayor parte de los síntomas son indicaciones del daño cardiaco, que cuando es grave lleva a diferentes grados de insuficiencia cardiaca. La gravedad del proceso es variable, pero lo que le da la característica alarmante es la frecuencia con que el daño cardiaco se produce (Asociación Lucha Contra el Mal de Chagas).

En vista de la gravedad de la enfermedad, se han llevado a cabo estudios sobre este mal, en las regiones que están dentro del área de riesgo con el fin de lograr detener la propagación de la misma. Para que esto se logre ha sido necesaria la investigación de las especies de insectos vectores de ella. Se ha encontrado que existen varias especies de insectos pertenecientes al Orden Hemiptera, conocidos también comúnmente como pitos, los cuales se encuentran agrupados en los géneros Rhodnius y Triatoma. Dentro de éstos géneros existen a su vez algunas especies vectoras que son de más alto riesgo que otras. A estas poblaciones que son un riesgo directo para el ser humano se les llama poblaciones domiciliarias, ya que son las que conviven directamente en los lugares donde habita el hombre. Esto hace que sea necesario determinar si una población encontrada en determinado lugar es silvestre ó por el contrario domiciliaria.

Así mismo es de gran importancia determinar qué especies presentan la capacidad de domiciliarse a partir de un estadio silvestre ya que se ha encontrado que en varios hogares humanos en los cuales se ha llevado a cabo el tratamiento de fumigación eliminando así al vector presente, después de algún tiempo se ha podido observar una re-infestación por una nueva población de individuos, los cuales, presentan infección por Trypanosoma cruzi aumentando el riesgo de propagación de la enfermedad. (Schoefield et al., 1999)

A diferencia de las especies silvestres, las domiciliarias presentan una menor variabilidad, lo que hace necesario el empleo de técnicas moleculares para esta diferenciación. En algunos estudios se han utilizado métodos como: la

implementación de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic), PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) (Jaramillo et al., 2000), las secuencias de aminoácidos, las secuencias de ADN, los sitios de restricción entre otros (Futuyma 1998), todas estas técnicas pueden ser aplicadas al estudio de la taxonomía y filogenia de los insectos vectores de la enfermedad de Chagas especialmente en Colombia.

Estos estudios se han llevado a cabo en América Latina con el fin de posteriormente buscar mecanismos de tratamiento y erradicación de los vectores. Para lograr esto es necesario el conocimiento de la ecología, taxonomía y filogenia general de las especies que se podrían considerar como un riesgo latente para las poblaciones rurales humanas de los países Latinoamericanos donde se encuentran distribuidos los vectores de la enfermedad de Chagas. El interés por conocer este grupo mas a fondo se debe a que este taxón (Subfamilia Triatominae) es bastante extenso, ya que se conocen aproximadamente 128 especies, las cuales se agrupan en 17 géneros y 5 tribus. Pero a pesar de esto, no todas son vectores de la enfermedad ya que de hecho la mayoría son especies silvestres y de las cuales no se conocen antecedentes de domiciliación ni de ser culpables de transmisión del parásito al ser humano.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo General

Realizar una revisión bibliográfica de las diferentes características tanto morfológicas, como de caracteres moleculares y determinar qué técnicas de biología molecular han sido utilizadas en los diversos estudios de la clasificación taxonómica de las distintas especies de insectos que han sido considerados como vectores de la enfermedad de Chagas con especial énfasis en Colombia.

2.2. Objetivos Específicos

• Revisar en la literatura los factores evolutivos que han influido en los proceso de adaptación de algunas especies de triatominos al hábitat domiciliario haciéndolas un riesgo para el ser humano.

• Determinar qué técnicas moleculares de laboratorio han sido las más utilizadas en los distintos estudios de clasificación taxonómica de estas especies, especialmente en Colombia.

• Basándose en los resultados de las investigaciones revisadas, encontrar en qué nivel taxonómico han sido ubicadas las distintas especies de insectos que son considerados como vectores de la enfermedad de Chagas.

• De acuerdo a las investigaciones revisadas, presentar algunas referencias bibliográficas, las cuales puedan ser utilizadas como soporte en futuras investigaciones con respecto a este tema.

• Comparar las distintas metodologías de estudio llevadas a cabo por los diferentes autores para la clasificación taxonómica de estos insectos con énfasis en Colombia.

3. JUSTIFICACION

El mal de Chagas, es una de las enfermedades que ha aquejado al ser humano y se hace más importante aún por el hecho de ser una enfermedad que cada día se propaga mas elevándose así la cantidad de personas infectadas con ella. Además de esto, es importante su estudio ya que una buena parte de la población rural se encuentra en riesgo de contraerla. Esta enfermedad se distribuye exclusivamente en América Latina y por esta misma razón, es común en muchas regiones de Colombia. Por todo lo anterior, se hace importante su estudio. Así mismo es importante recalcar que una parte de la población humana a lo largo de toda América Latina se encuentra afectada por la enfermedad, un aproximado de 16 a 18 millones de personas, y cerca de 100 millones se encuentran en riesgo de ser contagiados por la enfermedad (Panamerican Healt Organization). A causa de esto, se han realizado investigaciones sobre la misma y con ellas se ha logrado determinar que es producida por el parásito Trypanosoma cruzi, el cual infecta al ser humano, gracias a insectos vectores que lo portan y le facilitan la entrada al organismo donde encuentra un medio óptimo para desarrollarse y proliferar. Esta enfermedad se caracteriza por causar serias lesiones en los órganos internos, especialmente en el bazo y músculo cardiaco, los cuales se inflaman y a causa de esto terminan por manifestarse con graves cardiopatías que incluso pueden llevar a la muerte de la persona afectada.

Por lo anterior, se ha hecho imperativo el poder identificar y clasificar a estos insectos que son vectores del parásito con el fin de implementar algunos mecanismos de control para limitar su propagación, impidiendo así, el contagio masivo de personas a lo largo del territorio por donde se encuentran distribuidos estos insectos evitando un aumento en la cantidad de personas con la enfermedad de Chagas. En la mayoría de países se han implementado programas de fumigación con insecticidas residuales para viviendas rurales con alto riesgo de infestación por parte del insecto (Panamerican Healt Organization). La necesidad

de controlar la propagación de los triatominos ha llevado a que se realicen estudios para determinar qué especies de estos insectos son los principales vectores del parásito y para lograrlo se han utilizado diversas técnicas tanto morfológicas como moleculares.

Los insectos implicados en la transmisión de la enfermedad son pertenecientes al Orden Hemiptera, conocidos comúnmente como pitos o chinches, los cuales son insectos hematófagos, poseedores de piezas bucales perforadoras y chupadoras que forman un complejo aparato diseñado para extraer sangre, el cual es introducido en la piel y por el cual procede a chupar la sangre de su presa. El problema principal que causa este insecto para la salud humana es que, por medio de sus heces que entran en la herida de la picadura, el parásito encuentra la puerta de acceso al organismo (Ruppert & Barnes 1996). Sin embargo, no todos los hemípteros hematófagos son vectores de ésta enfermedad, ya que se conoce que existen aproximadamente 128 especies de este taxón distribuidas en 17 géneros. Como resultado de las investigaciones se ha encontrado que básicamente, el género Rhodnius es el principal vector de la enfermedad en Colombia, como segundo genero se encuentra Triatoma y dentro de este género algunas otras especies como: T. infestans o T. legista, que han sido los principales agentes culpables de la transmisión, el primero en Colombia y el segundo principalmente en países como Brasil, Argentina, Uruguay, Méjico, entre otros.

Igualmente, se han llevado a cabo investigaciones con diferentes técnicas de biología molecular, con el fin de realizar una clasificación taxonómica de estas especies y así poder diferenciarlas unas de otras y conocer básicamente cuáles son las que están causando un mayor efecto en el proceso de propagación de la enfermedad. Además, ha sido necesario determinar incluso qué poblaciones dentro de los mismos hemípteros vectores son domiciliarias, ya que estas poblaciones de insectos son las que presentan el mas alto riesgo para el ser humano pues comparten con ellos su lugar de residencia, siendo así el hombre su principal fuente de alimento. Es por esto que se hace necesaria la implementación

de técnicas de laboratorio como la búsqueda de diferencias moleculares entre las poblaciones, para de esta forma, poder determinar qué grado de relación se presenta entre las poblaciones de insectos distribuidos en diferentes lugares ó determinar qué relaciones filogenéticas se presentan entre las distintas especies de insectos vectores existentes; lo cual permitiría ver procesos importantes dentro de la genética de poblaciones como lo puede ser la especiación, ó dentro de la ecología, en caso de que sean poblaciones ó especies que migran de un lugar a otro. Además, no solo se realizan investigaciones en el campo molecular; sino también, por medio de la morfología de las especies, de tal forma que mediante el uso de claves taxonómicas y principalmente por medio de la morfometria (Borges et al., 2000) se logran diferenciar unas especies de otras, ya que tanto estructuras anatómicas como distancias entre ellas permiten la diferenciación entre poblaciones, un claro ejemplo de esto es la longitud de la antena, la distancia existente entre los ojos, la venación alar, etc. (Dujardin et al., 1999), logrando de esta manera obtener información relacionada tanto con clasificaciones taxonómicas como relaciones filogenéticas.

También es importante tener en cuenta que se hace necesario conocer el proceso que llevo a que solo algunas de las poblaciones de estos insectos se llegaran a especializar en la hematofagia y especialmente en la relación con los seres humanos ya que esto permitiría determinar que factores ambientales afectan a las distintas poblaciones silvestres y las obliga a cambiar sus hábitos convirtiéndose en poblaciones domiciliarias, un ejemplo de esto es la destrucción de los habitats naturales de las especies de mamíferos y aves que son las presas originales de estos hemípteros obligándolos a buscar nuevas fuentes de alimento, las cuales en ocasiones llegan a ser las viviendas humanas que presentan las condiciones ideales para la proliferación de estos insectos. Esto termina representando un alto riesgo para los seres humanos, ya que en varias de estas investigaciones se han encontrado procesos de re-infestación de viviendas que fueron tratadas mediante insecticidas residuales y que se creía que ya estaban libres de insectos vectores, pero que después de un tiempo son colonizadas nuevamente por poblaciones de

insectos, convirtiéndose de nuevo en un factor de riesgo para la salud de los habitantes de la zona.

Es también de gran importancia notar que la revisión de estas distintas investigaciones permite aclarar aún mas, el panorama de esta enfermedad en Colombia y proporciona un marco de referencia para futuras investigaciones, especialmente en lo concerniente a la implementación de mecanismos de control de los insectos vectores, tratando de no dañar a las poblaciones silvestres que no representan ningún riesgo de transmisión de la enfermedad al ser humano, igualmente, estas técnicas moleculares, pueden ser aplicables a otras áreas diferentes de la biología, las cuales son también de importancia, como por ejemplo la genética de poblaciones, ecología, inmunología, parasitología, identificación de poblaciones ó especies, filogenia, entre otras. De ahí la importancia de esta revisión, la cual pretende generar una base de datos bibliográficos, que permitan a futuros investigadores referenciarse en cuanto a técnicas de identificación taxonómica, tanto a niveles moleculares como morfológicos, así como de la filogenia de las especies de insectos vectores de esta enfermedad.

Por otra parte también se pretende por medio de este trabajo tratar de dar algunas conclusiones generalizadas con respecto a los diferentes resultados obtenidos por las investigaciones revisadas y que fueron llevadas a cabo a lo largo de toda la zona geográfica de impacto de esta enfermedad para poder estandarizar algunos conceptos sobre aspectos taxonómicos, filogenéticos, evolutivos e incluso ecológicos y comportamentales, como lo es por ejemplo el proceso de domesticación de las especies de insectos que son vectores de la enfermedad y que por tanto se convierten en un riesgo latente para las poblaciones humanas, que además son en su gran mayoría poblaciones rurales y que se encuentran expuestas a estos insectos vectores y por lo tanto se encuentran en un alto riesgo de contagio con el parásito.

4. MARCO TEORICO

P

I

4.1. G

D

L

F

R

4.1.1. Desarrollo y Caracteres Morfológicos de Clasificación

La enfermedad de chagas es transmitida al ser humano por medio de las deyecciones de un insecto perteneciente al Orden Hemiptera, familia Reduviidae y subfamilia Triatominae el cual una vez pica defeca sobre la herida que ha causado permitiendo así la entrada al organismo del parásito Trypanosoma cruzi, el cual es el responsable y causante directo de la enfermedad, que se caracteriza por inflamar órganos internos como el hígado y especialmente el corazón, lo que lleva normalmente a graves insuficiencias cardiacas que pueden terminar con la muerte del individuo infectado con el parásito (Asociación Lucha Contra el Mal de Chagas).

Esta familia de insectos presenta un amplio rango de distribución abarcando la totalidad de sur y centro América, por lo cual es considerado uno de los mas graves problemas para la salud humana de las zonas rurales especialmente, donde se estima que aproximadamente entre 16 y 18 millones de personas se encuentran infectadas con el parásito y cerca de 100 millones se encuentran en un alto riesgo de llegar a ser infectadas por su posible contacto con el insecto vector de la enfermedad (World Health Organization 1995).

La familia Reduviidaese caracteriza morfológicamente por presentar un cuerpo de forma ovalada aunque en ocasiones puede presentarse de manera alargada, los bordes del abdomen normalmente se extienden lateralmente mas atrás que las alas, igualmente poseen un aparato picador chupador corto llamado probóscide, el

cual esta dividido en 3 segmentos, usualmente se encuentra ubicado en una hendidura en la región del protórax. La cabeza es normalmente elongada y con una hendidura transversal entre los ojos, también poseen ocelos en su mayoría. En cuanto al par de antenas cada una de ellas presenta normalmente 4 segmentos, donde algunas veces uno de estos, se encuentra dividido en subsegmentos. Usualmente estos insectos son de color café o negro y miden entre 10 y 25 mm. Se encuentran básicamente en plantas que presentan nidos de aves y en viviendas lo que los hace un riesgo para el ser humano, presentan una dieta básicamente hematófaga por lo cual prácticamente cualquier mamífero o ave está en su lista de organismos hospederos o fuentes de alimento (Borror y White. 1997).

Por otra parte es importante también conocer algo del proceso de desarrollo de estos insectos ya que al realizar muestreos en residencias que se consideran infestadas es posible encontrar algunos de los demás estadios de desarrollo y no necesariamente adultos. Estos insectos presentan un desarrollo metamórfico gradual o incompleto, también conocido como desarrollo paurometabolo, en el cual se da la maduración y formación de las alas, al igual que la maduración de los órganos sexuales, este desarrollo se caracteriza por presentar pocos cambios físicos y por no producirse cambio de medio de vida entre los estados juveniles y el adulto. Una vez eclosionan los individuos del huevo nacen muy similares a los adultos pero con una marcada diferencia en su tamaño, a esta etapa se le conoce como ninfa de primer estadío y posteriormente sufren cambios morfológicos tales como un notorio crecimiento atravesando así por otros cuatro estados ninfales antes de ser adultos; es decir, antes de llegar a la madurez totalmente (Ruppert y Barnes. 1990).

De la subfamilia Triatominae se reconocen formalmente 128 especies, que se encuentran agrupadas en 17 géneros y 5 tribus. La mayoría de estas especies presentan un hábito de vida silvestre y se encuentran normalmente asociados a una gran variedad de huéspedes vertebrados silvestres como aves y mamíferos. A

pesar de esto, también los domésticos como cerdos, gatos, perros y ratas los cuales conviven con el hombre, pueden ser fuentes de alimento aumentando así el riesgo de contacto del insecto con el ser humano (Schofield et al. 1999).

4.1.2. Posición Taxonómica

Esta clasificación es propuesta para el orden Hemiptera por Rupert y Barnes en 1990.

Eukaryota; Metazoa;

Phylum: Arthropoda

Sub Phylum: Hexapoda Clase: Insecta

Sub. Clase: Pterygota Orden: Hemiptera

Sub. Orden: Gymnocerata Familia: Reduviidae Sub. Familia: Triatominae

La siguiente clasificación taxonómica es la que actualmente se encuentra en GenBank, 2002 y es la que se propone para la familia Reduviidae1:

Eukaryota , Metazoa, Arthropoda, Hexapoda, Insecta, Pterygota , Neoptera, Paraneoptera, Hemiptera, Euhemiptera, Heteroptera, Panheteroptera, Cimicomorpha

1

La clasificación taxonómica se encuentra disponible por medio del sistema de búsqueda y recuperación de información en línea del Centro Nacional para Información en Biotecnología–EUA (NCBI–National Center for Biotechnology Information;

4.1.3. Distribución Geográfica

Dentro de las 5 tribus conocidas de la familia Reduviidae hay dos principalmente que han sido estudiadas ya que son éstas, en las que se han encontrado mayor número de especies que sirven como vectores de la enfermedad de chagas para los humanos, puesto que han logrado llegar a colonizar las viviendas de gran parte de las zonas rurales e incluso algunas pequeñas zonas urbanas de América Latina convirtiéndose en un factor de alto riesgo para la salud de la población humana. Estas dos tribus son la tribu rhodniini y la tribu triatomini. La distribución geográfica de estas dos tribus es alarmante ya que se encuentran ubicadas a lo largo de todos los países tanto de Centro como de Sur América haciendo de esta enfermedad una situación muy riesgosa para las poblaciones rurales.

Según datos estadísticos recogidos por parte de la Organización Mundial de la Salud países como Brasil, Argentina y Chile son las regiones con un mayor índice de pacientes afectados por el Trypanosoma cruzi e igualmente son los que presentan a una mayor proporción de su población en un riesgo latente de contraer la enfermedad. Esto se debe a que una buena parte de los pobladores tienen sus lugares de residencia en áreas rurales cerca de cultivos de plantas y de criaderos de animales domésticos que son los lugares óptimos para el desarrollo y proliferación de estos hemípteros ya que por sus hábitos hematófagos necesitan huéspedes cerca para alimentarse. Además las condiciones de construcción de sus viviendas como lo son los materiales utilizados o la cercanía a criaderos de animales domésticos sumado a las mínimas condiciones de salubridad que se presentan aumentan aun más el riesgo de infestación de los domicilios por parte de los vectores y por tanto el riesgo de contagio de la población sea mas elevado.

Todo lo anterior sumado a la gran diversidad de especies de Reduvidos que se encuentran a lo largo de toda la geografía Americana y que son vectores de

Trypanosoma cruzi, ha llevado a que se realicen numerosas investigaciones en

todos los campos de la biología de estos insectos, (ecología, biología molecular, anatomía, evolución, etc.) con el fin de tener un mejor conocimiento del ciclo de vida y características de ellos, para detectarlo fácilmente y así tomar medidas efectivas de erradicación frente a estos organismos tratando así de evitar una mayor propagación de la enfermedad y disminuir o eliminar la domiciliación.

Figura 1: Mapa de la distribución geográfica de las principales especies de insectos vectores de la enfermedad de chagas pertenecientes a la tribu Rhodniini. (Tomado de http://lanic.utexas.edu/la/region/map/ y adaptado por Juan Eduardo Ruiz)

Figura 2: Mapa de la distribución geográfica de las principales especies de insectos vectores de la enfermedad de chagas pertenecientes a la tribu Triatomini. (Tomado de http://lanic.utexas.edu/la/region/map/ y adaptado por Juan Eduardo Ruiz)

4.1.4. Especies mas Estudiadas

A pesar de la existencia de aproximadamente 128 especies conocidas dentro de la subfamilia Triatominae, no todas representan un peligro para la salud de los seres humanos, de hecho son relativamente pocas las especies consideradas peligrosas para el hombre, ya que no todas estas especies son vectores del Trypanosoma

cruzi, o bien otra gran parte de ellas son especies que se encuentran

exclusivamente distribuidas en un hábitat silvestre, de tal forma que normalmente no están en contacto con las poblaciones humanas, y por lo tanto no representan un alto riesgo para el contagio de la enfermedad.

El problema se hace grave para la salud humana a causa de algunas especies que tienen la facultad de domiciliarse. Es decir, que pueden acceder a las viviendas humanas y encontrar en ellas un lugar apropiado para su desarrollo y proliferación, haciendo del hombre un huésped adecuado que le suministra alimento ya que como se menciono anteriormente estos insectos presentan una dieta netamente hematófaga, además se ha logrado determinar que la gran mayoría de estas especies que llevan a cabo el proceso de domiciliación son portadoras naturales del parásito causante de la enfermedad (Diotaiuti et al. 1997).

Es por lo anterior que la gran mayoría de investigaciones alrededor de toda América Latina se han concentrado en el estudio de estas especies domiciliarias las cuales son básicamente todas pertenecientes a las tribus Rhodniini y Triatomini. Dentro de estas especies las que son consideradas como las que presentan un mayor peligro para el ser humano son Triatoma infestans y Rhodnius

prolixus, ya que se encuentran distribuidas en prácticamente todos los países de

América Latina. También se han encontrado en varios de los domicilios de personas que han sido infectadas con el parásito, y así mismo por medio de diferentes técnicas moleculares se ha logrado verificar que en la gran mayoría de

casos de muestreos de poblaciones domiciliarias de insectos los individuos recolectados de estas especies son portadores del parásito.

Fotografía 1: (A) Espécimen de Triatoma infestans. (B) Espécimen de Rhodnius prolixus. (C) Espécimen de Triatoma sordida. (D) Espécimen de Rhodnius neglectus (Fotos A, C y D tomadas de www.sucen.sp.gov.br, Foto B tomada de www.techne.com.ar).

(A) (B)

(C)

(D)

Sin embargo no solo las especies Triatoma infestans y Rhodnius prolixus son los únicos vectores que causan preocupación por la enfermedad. Existen otras variedades de especies que también han sido identificadas como vectores del parásito, y en algunos casos se han encontrado especies que incluso son endémicas de determinadas regiones como lo es el caso de Rhodnius ecuadoriensis que es una especie propia de Ecuador o Triatoma brasiliensis brasiliensis el cual se encuentra distribuido en gran parte del territorio de Brasil pero no se ha logrado detectar en ningún otro lugar (Borges et al. 2000).

Por otra parte algunas especies presentan una distribución geográfica que solamente se ve entre países vecinos; es decir, algunas de ellas se encuentran ubicadas en regiones fronterizas, lo cual muestra una uniformidad de la distribución de las mismas, de acuerdo a determinadas características físicas del medio ambiente como lo son la temperatura, la humedad, la altura, etc. Este es el caso de Triatoma rubrovaria del cual se ha visto que presenta una distribución muy definida a lo largo de Argentina, Uruguay y la zona sur de Brasil, que son regiones relativamente muy cercanas y en

cierta forma presentan muchas características tanto físicas como climáticas muy similares entre ellas (Oscherov et al. 1998).

Tabla 1: Especies de la tribu Triatomini que son vectores de la enfermedad de acuerdo a su distribución geográfica por países en Latino América y que han sido objeto de mayor estudio.

ORIGEN ESPECIE TRIBU

Méjico Triatoma peninsularis Triatomini

Méjico Triatoma dimidiata Triatomini

Méjico Triatoma infestans Triatomini

Méjico Triatoma barberi Triatomini

Méjico Triatoma sinaloensis Triatomini

Méjico Triatoma protacta woodi Triatomini

Méjico Triatoma p. protacta Triatomini

Méjico Triatoma p. zacatecensis Triatomini

Colombia Triatoma dispar Triatomini

Colombia Triatoma infestans Triatomini

Colombia Triatoma dimidiata Triatomini

Colombia Triatoma maculata Triatomini

Colombia Triatoma venosa Triatomini

Venezuela Triatoma maculata Triatomini

Venezuela Triatoma infestans Triatomini

Venezuela Triatoma dimidiata Triatomini

Perú Triatoma infestans Triatomini Perú Triatoma dimidiata Triatomini Perú Triatoma carrioni Triatomini Perú Triatoma nigromaculata Triatomini Perú Cavernicola pilosa Triatomini

ORIGEN ESPECIE TRIBU

Ecuador Triatoma dimidiata Triatomini

Ecuador Triatoma infestans Triatomini

Ecuador Triatoma carrioni Triatomini

Ecuador Triatoma dispar Triatomini

Ecuador Triatoma venosa Triatomini

Bolivia Triatoma infestans Triatomini

Bolivia Triatoma melanosoma Triatomini

Bolivia Triatoma carrioni Triatomini

Bolivia Triatoma venosa Triatomini

Bolivia Cavernicola pilosa Triatomini

Brasil Triatoma brasiliensis melanica Triatomini

Brasil Triatoma b. brasiliensis Triatomini

Brasil Triatoma b. macromelasoma Triatomini

Brasil Triatoma infestans Triatomini

Brasil Triatoma melanosoma Triatomini

Brasil Triatoma rubrovaria Triatomini

Uruguay Triatoma rubrovaria Triatomini

Uruguay Triatoma circunmaculata Triatomini

Uruguay Triatoma infestans Triatomini

Uruguay Triatoma platenses Triatomini

Uruguay Triatoma sordida Triatomini

Argentina Triatoma maculata Triatomini

Argentina Triatoma pseudomaculata Triatomini

Argentina Triatoma sordida Triatomini

Argentina Triatoma rubrovaria Triatomini

Argentina Triatoma infestans Triatomini

Argentina Triatoma melanososma Triatomini

ORIGEN ESPECIE TRIBU

Paraguay Triatoma sordida Triatomini

Paraguay Triatoma guasayana Triatomini

Tabla 2: Especies de la tribu Rhodniini que son vectores de la enfermedad de acuerdo a su distribución geográfica por países en Latino América y que han sido objeto de mayor estudio.

ORIGEN ESPECIE TRIBU

Méjico Rhodnius prolixus Rhodniini

Colombia Rhodnius prolixus Rhodniini

Colombia Rhodnius colombiensis Rhodniini

Colombia Rhodnius robustus Rhodniini

Colombia Rhodnius brethesi Rhodniini

Colombia Rhodnius pallascens Rhodniini

Venezuela Rhodnius prolixus Rhodniini

Venezuela Rhodnius neivas Rhodniini

Venezuela Rhodnius neglectus Rhodniini

Venezuela Rhodnius pictipes Rhodniini

Venezuela Rhodnius robustus Rhodniini

Venezuela Rhodnius nasutus Rhodniini

Perú Rhodnius robustus Rhodniini Perú Rhodnius prolixus Rhodniini Perú Rhodnius pictipes Rhodniini

Ecuador Rhodnius ecuadoriensis Rhodniini

Ecuador Rhodnius robustus Rhodniini

Ecuador Rhodnius pictipes Rhodniini

Ecuador Rhodnius prolixus Rhodniini

Bolivia Rhodnius stali Rhodniini

Brasil Rhodnius neglectus Rhodniini

Brasil Rhodnius nasutus Rhodniini

Brasil Rhodnius brethesi Rhodniini

Brasil Rhodnius prolixus Rhodniini

ORIGEN ESPECIE TRIBU

Brasil Rhodnius robustus Rhodniini

Uruguay Rhodnius prolixus Rhodniini

Uruguay Rhodnius neglectus Rhodniini

Argentina Rhodnius prolixus Rhodniini

Argentina Rhodnius neglectus Rhodniini

Argentina Rhodnius pictipes Rhodniini

Argentina Rhodnius nasutus Rhodniini

Argentina Rhodnius pallescens Rhodniini

Argentina Rhodnius robustus Rhodniini

Argentina Rhodnius neivas Rhodniini

Paraguay Rhodnius neglectus Rhodniini

Paraguay Rhodnius robustus Rhodniini

Paraguay Rhodnius prolixus Rhodniini

4.1.5. Hábitat Silvestre de Reduviidae

En la gran mayoría de las especies como fue mencionado anteriormente se ha logrado determinar un modo de vida silvestre. Gran parte de ellas se distribuyen normalmente en zonas de abundante vegetación donde se encuentran nidos o lugares de vivienda tanto de aves como de diferentes especies de mamíferos silvestres, que son las principales fuentes de alimento de estos insectos que como ya es bien conocido presentan una dieta netamente hematófaga.

La presencia de una abundante vegetación hace del hábitat de los triatominos un lugar apropiado para su desarrollo y reproducción, ya que estos insectos raramente han mostrado un comportamiento en el cual se les vea volar largas distancias a pesar de tener alas muy bien desarrolladas que les permitirían hacerlo pero, por el contrario suelen utilizar otro comportamiento distinto para conseguir alimento, la estrategia de esperar entre la vegetación el paso de mamíferos, o bien caminar a lo largo de los árboles hasta los nidos de las aves que allí habiten para

esperar su llegada y una vez se encuentren en sus viviendas proceder a picarlos y así alimentarse de su sangre (Schofield et al. 1999).

En algunas regiones de Latinoamérica, especialmente en los países del cono sur se ha logrado determinar que el lugar habitualmente seleccionado por la mayoría de las especies de triatominos, de las cuales algunas son vectores de

Trypanosoma cruzi tales como Rhodnius prolixus, Rhodnius robustus, Rhodnius neglectus, Triatoma sordida entre otros, son las palmas. Por esta razón los

palmares son lugares de un elevado interés por parte de los científicos, ya que son considerados como posibles centros de dispersión de estas especies hacia otros hábitats especialmente peridomésticos como lo son corrales de aves e incluso hábitat artificiales como lo son las viviendas humanas (Bar, M.E. 1998).

Un estudio realizado durante un periodo de un año en la provincia de Corrientes (Argentina) mostró la notable preferencia que presentan los triatominos por las palmas. En este caso se utilizó como lugar de estudio una comunidad de palmas donde se procedió a realizar la identificación de las especies vegetales y posteriormente realizar la disección de algunos ejemplares con el fin de determinar la presencia de triatominos en ellas dando como resultado un importante grado de infestación por parte de estos insectos. Aproximadamente el 96.2 % de las palmas muestreadas mostró presencia de alguna de las diferentes especies de triatominos en sus distintos estadios especialmente etapas ninfales. Anexo a esto se logró determinar que un buen porcentaje de estas plantas presentaban nidificación de aves. Por otra parte esta comunidad de palmas se encuentra ubicada en cercanías de residencias humanas lo que llevó a muestrear las residencias cercanas encontrando que el 85.7 % de las viviendas estudiadas presentaban infestación de insectos, llevando esto a concluir que se está dando un proceso de domiciliación de las especies residentes de esta comunidad de palmas hacia las viviendas humanas circundantes al palmar (Bar, M.E. 1998)

A causa de la gran cantidad de disturbios provocados por parte del hombre al hábitat silvestre de estos triatominos, se han visto obligados a buscar nuevas fuentes de alimento en hábitat artificiales como se mencionó en el párrafo anterior, lo cual hace que la vivienda humana sea un hábitat donde hay una fácil consecución de recursos alimenticios.

4.1.6. Proceso de Infestación de Viviendas

Dentro de las distintas y variadas especies de la subfamilia Triatominae se ha determinado que la gran mayoría son poblaciones que presentan un hábito silvestre; es decir, que viven en regiones donde normalmente no están en un continuo contacto con el ser humano y con su vivienda, ya que por la dieta hematófaga que presentan, sus hospederos naturales tienden a ser mamíferos y aves silvestres. Debido a esto normalmente se encuentran en plantas donde anidan pájaros, especialmente en palmas que están asociadas a aves (Guarneri et al. 2000) y en territorios de residencia y lugares de alimentación de mamíferos, especialmente roedores (Dujardin et al. 1999).

Diferentes estudios como los de Dujardin, Schofield, Guarneri entre otros han mostrado que en los últimos años se ha dado un aumento en el establecimiento de especies en colonias domésticas como lo es el caso de Triatoma dimidiata, el cual incluso ha invadido residencias en áreas urbanas. Gracias a varios estudios en algunos casos se ha logrado determinar que muchas de las infestaciones se han dado por parte de especies poco conocidas, las cuales en un principio eran consideradas como poblaciones exclusivas de hábitat silvestres como lo es el caso de Rhodnius stali y Eratyrus mucronatus en Bolivia (Noireau et al. 1995).

A causa de lo anterior se ha tratado de tomar medidas de erradicación de las diferentes poblaciones domésticas por medio de la fumigación con insecticidas

residuales de las residencias en las que se han encontrado insectos en cualquiera de sus distintas etapas de desarrollo, bien sean huevos, cualquiera de las cinco etapas ninfales o como adulto (Milano et al. 1998). Sin embargo, después de algún tiempo de llevar a cabo la fumigación al realizar nuevos muestreos en estas residencias que se creían estar libres de insectos, se ha encontrado nuevamente triatominos lo cual indica un muy probable proceso de reinfestación por parte de nuevas poblaciones silvestres como se ha logrado ver en el departamento del Tolima (Colombia). Esta situación que llevado a buscar distintas técnicas, bien sean moleculares, anatómicas, o morfométricas con el fin de lograr la identificación y así mismo poder determinar el origen de estos insectos reinfestantes para tomar nuevas medidas de control epidemiológico (Jaramillo et al. 2001).

Se explica de cierta manera la aparición en domicilios de estas nuevas especies reinfestantes por la necesidad que tienen estos insectos de alimentarse, situación que es básicamente la clave del proceso de colonización, ya que la ocurrencia de eventos ecológicos como la deforestación pueden provocar una alta tasa de mortalidad de los vertebrados hospederos silvestres de estas especies, causando un bajo nivel nutricional a las especies de reduvidos asociados a estos vertebrados; situación que los obliga a buscar nuevos hábitat donde puedan fundar nuevas poblaciones, de tal manera que las residencias humanas aparecen como una buena opción por las distintas condiciones que presentan y aún mas cuando se tienen cultivos y criaderos de animales domésticos (Schofield et al. 1999). Así mismo otra posible explicación es que por accidente lleguen estos insectos a los domicilios humanos de una forma pasiva siendo cargados por los distintos vertebrados que son sus hospederos silvestres (Dujardin et al.1998). En los dos casos está actuando el efecto fundador ya que la formación de una nueva colonia se está dando solo por la llegada de una fracción de la variación genética total que conforma a la población (Futuyma, D.J. 1998)

Por otra parte se ha logrado determinar que la gran mayoría de las especies silvestres presentan una especial habilidad para adaptarse a estos nuevos medios como lo es el domicilio humano, o las zonas peridomésticas (Guarneri et al., 2000), pero por el contrario, se hace muy complicado que una vez se han domiciliado puedan readaptarse a su estado silvestre a causa de la pérdida de variabilidad y por la acción de la simplificación genética la cual actúa como un proceso de especialización hacia el hábitat doméstico que hace que se pierdan las características necesarias para el éxito adaptativo en el medio silvestre que a su vez es un hábitat mucho mas variable y por tanto se hace mas difícil la supervivencia; es decir, que el proceso de domesticación de estas especies al ser explicado desde este punto de vista es prácticamente irreversible (Jaramillo et al. 2001, Schofield et al. 1999)

Se ha podido observar en algunos estudios realizados en su mayoría en Brasil que determinadas especies llegan incluso en ambientes artificiales a presentar una preferencia muy marcada por la sangre humana y por la sangre de animales domésticos mas que por la sangre de sus hospederos silvestres una vez se ha dado el proceso de domesticación. Un caso documentado en Brasil con las especies Triatoma pseudomaculata y T. infestans los cuales al haber pasado por el proceso de domiciliación y posteriormente ser expuestos nuevamente a sus fuentes silvestres de alimento seguían mostrando una preferencia por las condiciones alimenticias que se les proporcionaban en los ambientes artificiales, es decir los domiciliarios o peri domiciliarios (Pereira et al. 2000).

De igual forma algunas de estas especies mostraron la capacidad de reinfestar domicilios humanos como se mencionó anteriormente, pero lo mas interesante es el hecho de llegar a reemplazar especies naturales en hábitat domiciliarios. Este fue el caso de Triatoma infestans en el estado de Minas Gerais en Brasil. Después de una fumigación en la que se erradico la presencia de Triatoma

pseudomaculata, T. brasiliensis y Panstrongylus megistus, al realizar nuevos

mismo domicilios con individuos de T. infestans que hasta ese momento no se había detectado como una especie domiciliaria de alto impacto en Brasil (Silveira et al. 1984). Así mismo ocurrió con la especie T. pseudomaculata que era conocida como una especie que presentaba predilección por alimentarse de la sangre de aves silvestres y de los predadores asociados a las mismas, pero que después de un proceso de erradicación entró a reemplazar a T. brasiliensis formando así nuevas colonias a nivel tanto domiciliario, como peri domiciliario.

Todas estas evidencias experimentales de los procesos de domiciliación llevan a sugerir el desarrollo de mecanismos adaptativos y por tanto de carácter evolutivo por parte de las diferentes especies de triatominos a causa de la acción de una fuerte presión de selección, esto conduce a aumentar el interés por parte de los científicos para llevar a cabo nuevas investigaciones relacionadas con la filogenia y procesos evolutivos de estas distintas especies de insectos.

P

II

4.2. I

4.2.1. Generalidades de las Investigaciones

De las 17 investigaciones que se tuvieron en cuenta para esta revisión bibliográfica, varias de ellas se enfocan en la búsqueda e implementación de técnicas moleculares, genéticas y morfométricas, para poder así identificar, clasificar y relacionar filogenéticamente las diferentes especies de Reduvidos que se han encontrado a lo largo de toda Latinoamérica y que han sido detectados como vectores para los humanos de la enfermedad de chagas.

De igual forma se busca poder determinar que cambios sufridos en el medio ambiente silvestre causados por intervenciones humanas, donde se encuentran normalmente la mayoría de las diversas especies de Reduvidos han causado el cambio de hábitat de algunas de estas especies llevándolas a domiciliarse, y así mismo se pretende poder determinar como estos cambios medio ambientales han llevado a modificaciones a un nivel evolutivo de estas especies, conduciéndolas por medio de una fuerte presión de selección a adquirir una serie de nuevas adaptaciones hacia medios ambientes artificiales para ellas como lo es el ambiente domiciliario o peri domiciliario de los humanos, situación que ha llevado a un aumento en el riesgo de propagación y contagio de la enfermedad.

Para poder llegar a alguna conclusión sobre estos diversos temas se han utilizado diferentes técnicas como lo es a nivel molecular la implementación de RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), utilización de secuencias de segmentos de genomas o de genes nucleares y mitocondriales de algunas especies, las cuales son analizadas posteriormente mediante programas filogenéticos y estadísticos de computador

como Statatistix, Clustal W, BioEdit, que permiten llegar a establecer patrones de semejanza o diferencia entre las secuencias de las especies permitiendo así determinar relaciones evolutivas entre ellas (Bargues et al. 2000, Jaramillo et al. 2001, Lyman et al. 1999, Monteiro et al. 1999,). De igual manera se han realizado investigaciones a nivel morfológico y en especial, mediante morfometría, que compara diferentes medidas anatómicas que son consideradas como caracteres diagnósticos para la clasificación de las diferentes especies. Es este el caso de la comparación realizada entre varias poblaciones de Triatoma brasiliensis llevada a cabo en distintos estados de Brasil, que permitió ver algunas diferencias anatómicas notorias entre las poblaciones y los sexos de un lugar y otro a pesar de pertenecer a la misma especie permitiendo llegar a diferenciar las distintas poblaciones (Borges et al. 2000). Por otra parte, no han faltado estudios a nivel ecológico que han tenido como fin el dar a conocer relaciones estrechas de estas especies con el medio ambiente que las rodea y como este afecta su comportamiento llevándolas en ocasiones a modificar sus hábitos alimenticios de tal forma que convierten a animales domésticos y al ser humano en su fuente de alimento cuando en estado silvestre esto no ocurre de forma natural (Oscherov et al. 1998, Bar M.E. 1998).

Por otra parte muchas investigaciones se han enfocado en buscar respuesta a diferentes preguntas relacionadas con el proceso evolutivo de domiciliación de las especies de triatominos y la relación que este proceso presenta con la evolución de la dieta hematófaga en estos insectos la cual es considerada un factor adaptativo antiguo pero que desde hace relativamente poco tiempo (48.9 a 64.4 millones de años) ha mostrado que se encuentra en estrecha relación con el hecho de presentar un cambio de hábitat de un medio ambiente silvestre a uno artificial como lo es el domicilio humano. De acuerdo a algunas de estas investigaciones la adaptación de estos insectos hacia el hábito hematófago se dio en varias oportunidades y en distintas condiciones a lo largo de toda América siguiendo así diferentes rutas evolutivas, lo que ha llevado a que los científicos clasifiquen al género Triatoma como un grupo de origen polifilético, es decir que es

un grupo que se encuentra compuesto por diferentes miembros muy relacionados entre si pero que en sus orígenes no descienden en su totalidad de un único ancestro común (Futuyma, D.J. 1998, Schofield et al. 1999)

A nivel de estudios genéticos también se ha llevado a cabo un amplio número de investigaciones las cuales han permitido llegar a conocer segmentos de secuencias genómicas de algunas especies de triatominos y de algunos marcadores moleculares tanto nucleares como mitocondriales como es el caso del gen del cytocromo B (mtCytB) entre otros, los cuales han sido utilizados para realizar la identificación de especies y determinar la filogenia de las mismas (Lyman et al. 1999). Sin embargo no solo se han utilizado los segmentos de secuencias sino también otras técnicas como lo son la variabilidad de isoenzimas, caracteres citogenéticos, etc. todas llevando a resultados similares en cuanto a la posición taxonómica y a las relaciones filogenéticas de las distintas especies de triatominos. Estas investigaciones han permitido llegar a concluir que este grupo es polifilético, y no monofilético como se consideró en un principio al encontrar las primeras relaciones entre las distintas especies (Lyman et al. 1999, Schofield et al. 1999).

Estas diversas investigaciones se han llevado a cabo a lo largo de todos los países Latinoamericanos, pero especialmente se ha observado un gran interés para realizar estos estudios en Brasil, Argentina y Chile que son los países que han presentado un mas elevado índice de su población rural infectada con el parásito o bien son países que se encuentran ubicados en regiones que se consideran estar en un alto riesgo para que sus pobladores sean contagiados con la enfermedad, de tal forma que esta enfermedad es considerada un problema de salud publica de alto impacto y se hace necesario un conocimiento inmediato y profundo del problema, para así poder llegar a plantear soluciones efectivas y rápidas en el control de estos insectos y por consiguiente en la propagación de la enfermedad (World Health Organization 1995).

4.2.2. Técnicas Utilizadas en las Diferentes Investigaciones

Como se pudo observar a grandes rasgos en la sección anterior existen varios protocolos y técnicas utilizadas en algunos de los campos de la biología (biología molecular, genética, ecología, etc.) para el desarrollo de las diferentes investigaciones realizadas con respecto a la identificación de especies y relaciones filogenéticas entre los distintos miembros de los triatomidos. A continuación se realizara una revisión un poco mas profunda de las diferentes técnicas que fueron utilizadas a lo largo de las investigaciones que se revisaron para este trabajo.

Dentro de las investigaciones realizadas mediante la parte de morfología externa de las diferentes especies, para su respectiva identificación, en varios de los estudios se utilizaron herramientas como las claves taxonómicas y el uso de caracteres diagnósticos los cuales tienen como función primaria por medio de la observación detallada de algunas características físicas especificas de los insectos poder determinar a que géneros y especies corresponden pudiendo así diferenciarlas unas de otras, estos mecanismos presentan problemas graves en cuanto a la certeza de la clasificación dada, ya que la similitud existente entre algunas de las especies puede llegar a ser tanta que existe la posibilidad de caer en confusiones en cuanto a la clasificación exacta de determinados individuos. Por otra parte como ventaja que presenta la implementación de estas técnicas esta el hecho de ser relativamente económicas ya que no necesita la utilización de implementos muy sofisticados y de alto costo (Oscherov et al. 1998, Bar, M.E. 1998).

Otro mecanismo utilizado para la identificación y clasificación de estas especies es el uso de las relaciones morfométricas las cuales se basan en la comparación de distancias especificas entre determinados órganos como antenas, ocelos, etc, y así mismo funcionan igualmente como caracteres diagnósticos de los individuos,

lo que permite llegar a diferenciar entre las distintas especies e incluso entre poblaciones de una misma especie que se encuentran ubicadas en diferentes lugares, esto da una ventaja frente a la clasificación taxonómica por claves en cuanto a que da la posibilidad de diferenciar entre poblaciones domiciliadas de poblaciones silvestres, ya que a causa de factores de presiones evolutivas las poblaciones que se domicilian presentan cambios en su tamaño y por consiguiente en las medidas que son utilizadas para identificarlas. Sin embargo al igual que todas no es una técnica perfecta ya que en algunas ocasiones se encuentran individuos que presentan características extremas bien sean mas pequeños o mas grandes que el tamaño promedio normal de los individuos de la especie o de la población, de tal forma que esto puede llevar a crear incongruencias en los resultados. Igualmente en algunos casos las diferencias entre las medidas anatómicas de las especies pueden ser tan pequeñas que estadísticamente se consideren iguales y a causa de esto se agrupen especies o poblaciones diferentes en taxones iguales (Borges et al. 2000).

Figura 3: Muestra algunas de las medidas anatómicas utilizadas para la identificación de poblaciones de Brasil. AT medida de las antenas, AO distancia ante ocular, EO distancia externa entre los ocelos, OE distancia externa entre los ojos, PO distancia postocular. (Tomado del artículo Genetic Variability of Triatoma brasiliensis Populations Borges et al. 2000)

Otros mecanismos que también han sido utilizados en las investigaciones son algunas de las técnicas de biología molecular y genética usadas con el fin de poder llegar a la identificación de las especies de triatomidos y de las relaciones filogenéticas existentes entre ellas, igualmente son utilizadas como mecanismo de diferenciación entre poblaciones silvestres y domiciliarias e incluso en algunos casos pueden ser útiles para la diferenciación entre poblaciones domiciliarias de la misma especie pero que se encuentran ubicadas en distintas regiones geográficas. Estas técnicas suelen ser mucho más exactas que las identificaciones morfológicas, pero tienen como inconveniente principal un elevado costo en reactivos al igual que la necesidad de usar equipos específicos para lograr la obtención de resultados. De igual forma exigen un mayor cuidado en la manipulación y tratamiento de las muestras para evitar contaminaciones o daños en el material por posibles errores en el uso de los reactivos necesarios para su tratamiento.

Una herramienta de gran utilidad es el uso de comparaciones de isoenzimas que por definición son una de las varias formas que puede presentar una enzima, producida por diferentes loci en el genoma de un organismo individual (Futuyma, D.J. 1998) y con las cuales se busca contrastar los perfiles enzimáticos de las diferentes especies de triatominos mediante corridos electroforéticos en gel, los cuales tienen como fin poder determinar diferencias en la movilidad de las enzimas de acuerdo a su número y tamaño al exponerlas a un campo eléctrico. Estas enzimas son extraídas normalmente a partir de muestras de tejido muscular de los insectos para posteriormente ser tratadas mediante procedimientos químicos para purificarlas y conservarlas. El fin de esta prueba es en el revelado hacer una comparación de la distancia que hay entre las bandas que están en diferentes carriles (teniendo en cuenta que cada carril es un individuo) agrupadas por poblaciones o por especies bien se quieran comparar unas u otras y de acuerdo a la diferencia entre las distancias y en el numero de bandas presentes en los diferentes carriles se puede llegar a determinar que enzimas están presentes en cada especie o en cada población logrando así diferenciarlas.

Igualmente el uso de RAPD ha sido de gran éxito en el proceso de identificación de especies y especialmente en la identificación de variaciones intraespecíficas como lo es el caso de poblaciones silvestres y domiciliarias ya que permite determinar diferencias a nivel de variabilidad genética entre ellas, de tal forma que cada especie es analizada de acuerdo a marcadores moleculares que permiten la diferenciación de cada una de ellas basándose en la detección de polimorfismos genéticos que son normalmente cambios puntuales en los sitios de homología con el primer e inserciones o deleciones de segmentos dentro de la zona amplificable cambiando así la longitud del fragmento, este mismo principio es utilizado en la amplificación de genes ribosomales (Jaramillo et al. 2001). Este procedimiento se realiza mediante la extracción de ADN del tejido del insecto, el cual es tomado a partir de muestras de patas, las cuales son maceradas y tratadas químicamente para lograr la purificación del ADN, posteriormente se realiza la cuantificación del ADN extraído mediante la comparación con muestras de concentraciones ya conocida que son visualizadas mediante electroforesis en gel de agarosa o mediante espectrofotometría. Posteriormente se realiza el proceso de anillaje con primers que para el caso de los RAPD suelen ser oligonucleotidos cortos y de secuencia arbitraria, para esta técnica de amplificación es necesario que el primer anille dos veces al mismo tiempo, en los extremos de la secuencia que se desea amplificar. A continuación se realiza la visualización de las bandas y se procede a comparar la presencia o ausencia de bandas en los diferentes individuos, con esta información se tabula una matriz binaria donde los 1 son presencia de determinada banda en el individuo y el 0 ausencia de ella, luego mediante el uso de programas estadísticos de computador se determina el grado de similitud o diferencia entre los individuos lo cual permite agruparlos y diferenciar así unas especies de otras. El uso de esta matriz igualmente permite generar árboles filogenéticos en los cuales se pueden establecer relaciones de cercanía entre las diferentes especies estudiadas de acuerdo a su similitud en las regiones de ADN amplificadas. Por otra parte esta técnica presenta como principales desventajas la subjetividad en la lectura de las bandas ya que en ocasiones no son muy nítidas o la distancia que migran los segmentos de ADN por el campo eléctrico es muy

similar y por esta razón se observan muy cercanas entre ellas, razón por la cual puede llegar a ser difícil diferenciarlas, también hay dificultad en la reproducibilidad de las bandas delgadas. A causa de esto siempre es recomendable tener en cuenta solo las bandas mucho más nítidas y reproducibles (Borges et al. 2000, Jaramillo et al. 2001).

En algunas de las investigaciones llevadas a cabo recientemente se ha implementado el uso de secuencias genómicas bien sea de segmentos de los cuales son conocidas sus codificaciones especificas para ser comparadas y analizadas estadísticamente mediante programas de computador que tienen como función especifica comparar las secuencias de ADN de las distintas especies unas con otras y determinar de acuerdo a la cantidad de nucleótidos similares o diferentes, el grado de diferenciación genética y de divergencia existente entre las especies, es decir; que tanto se han diferenciado entre ellas a través del proceso de evolución que han sufrido las especies, estos análisis comparativos de las secuencias han permitido crear e implementar otros programas que permiten crear árboles o representaciones gráficas de estas diferencias entre especies, para una mas fácil interpretación de que tanta diferencia existe y por tanto que tan relacionados pueden llegar a encontrarse los diferentes grupos taxonómicos estudiados. Una de las grandes ventajas de estas técnicas es la gran velocidad con la que es posible analizar o comparar un buen número de especies simultáneamente ya que si esta comparación entre secuencias fuera hecha a mano implicaría un gasto de tiempo extremo, por otra parte los árboles obtenidos presentan distancias exactas de acuerdo a las comparaciones genómicas lo que los hace de fácil interpretación para determinar relaciones filogenéticas entre las especies estudiadas. Sin embargo presenta como desventajas que algunas secuencias son difíciles de obtener o no se encuentran aun publicadas, por otra parte a pesar de no ser un gran problema en algunas ocasiones implica un costo elevado la consecución de algunos de los programas que no se consiguen de manera gratuita en Internet, es necesario tiempo de capacitación para lograr un manejo óptimo de los mismos ya que a pesar de ser de un relativo fácil manejo

algunos de estos programas presentan muchas herramientas adicionales muy útiles pero sin embargo para su uso se hace necesario un conocimiento previo de su funcionamiento por la gran cantidad de variables que pueden llegar a afectar el proceso de alineamiento o de construcción de árboles, al igual que sensibilidad de los índices de similitud con los que son comparadas estadísticamente las secuencias a estudiar (Borges et al. 2000, Lyman et al.1999).

Figura 4: Ejemplo de un fenograma generado mediante programas de computador para poblaciones silvestres y domiciliarias de Rhodnius en Colombia, usando el índice de disimilaridad de Jaccards y el algoritmo UPGMA.

(Tomado del artículo Differentiation and Genetic Analysis of Rhodnius prolixus and Rhodnius

colombiensis by rDNA and RAPD Amplification. Jaramillo et al. 2001)

Otra herramienta en el campo de la biología molecular ampliamente utilizada para llevar a cabo estas investigaciones es el PCR (Reacción en Cadena de la Polimeraza). Esta técnica tiene como fin el producir muchas copias de un segmento específico de ADN como por ejemplo genes ribosomales, secuencias conservadas, entre otras, en un corto lapso de tiempo a partir de la reacción natural de la polimeraza que es una enzima que tiene como función catalizar la