Estudio preliminar de los efectos de los inhibidores de la
sintesis de eicosanoides sobre la actividad de fenoloxidasa
del acocil (Cambarellus montezumae)
Vinnitsa Buzoianu1, Mónika Garrido1, Marisela Villalobos1, Itsel Alva1
Antonio García1, Fernando García1 y Fidel Hernández1-2.
1Universidad Simón Bolívar, 2CINVESTAV-IPN
Resumen
Uno de los mecanismos de defensa mejor caracterizados en crustáceos, es el sistema
feno-loxidasa, éste es activado por componentes de pared celular microbiana como
lipopolisacá-ridos (LPS), péptidoglicanos y b 1-3 glucanos (zimosan). En el presente estudio se midió la
ac-tividad de fenoloxidasa (FO) en la hemolinfa (HL) de Cambarellus montezumae en ausencia
y presencia de inhibidores de la síntesis de eicosanoides. Los resultados obtenidos muestran
que la dexametasona abate la actividad de la fosfolipasa A
2, disminuyendo
significativa-mente su actividad, en contraste al naproxeno, no modificó la actividad de fenoloxidasa.
Palabras clave: respuesta inmune, dexametasona, naproxeno; hemolinfa, camarón, Cambarellus,
artrópodo.
Abstract:
One of the main characteristic mechanisms of defense in crustaceans is the phenoloxidase
(cyclooxigenase) system, which is activated by microbial components like lipopolysaccharide
(LPS), peptideglicans and b 1-3 glucans (zymosan). The current study measured the
prophe-noloxidase (FO) effect on the hemolymph of Cambarellus montezumae, in the absence and
presence of inhibitors of eicosanoids synthesis.
The results show that dexamethasone eliminates the activity of phospholipase A2,
dimin-ishing its activity considerably in contrast to naproxen, which did not show any change.
Keywords: immune response, dexamethasone, naproxen, hemolymph, shrimp,
Cambarel-lus, arthropod.
Introducción
Cambarellus montezumae, es un crustáceo que se cultiva a escala comercial en México, el cual constituye una fuente de alimento rico en proteínas para humanos. Este camarón es afectado por enfermedades infecciosas, micóticas, virales y bacterianas que ponen en riesgo su cultivo. Como todos los invertebrados, C. montezumae, posee un sistema inmune innato caracterizado por ser inespecífico y no estar mediado por anticuerpos, lo que impide el diseño de vacunas. Los elementos principales del sistema inmune de los crustáceos están en la hemolinfa (HL) donde actúan y los descritos hasta ahora incluyen: la fagocitosis, nodulación, encapsulación, coagulación y producción de péptidos antimicrobianos. En la mayoría de estos mecanismos está involucrado el sistema de la proFenoloxidasa (proFO) el cual es un mecanismo tanto efector como regulador del sistema
inmune, compuesto por un conjunto de proteí-nas, aun no totalmente conocidas, que se activan en cascada y desencadenan la melanización del agente invasor. Algunos miembros de la cascada son proteasas en forma inactiva (zimógenos) que al ser activados, adquieren capacidad proteolítica llegando finalmente al corte de la proFO para generar la forma activa (FO). La FO participa en la melanización y formación de nódulos y cápsulas, así como en la liberación de moléculas opsonizantes, quimiocinesis celular y coagulación (Söderhäll y Cols., 1990; Ashida, 1991).
El sistema proFO está ampliamente descrito en los invertebrados y actúa en la amplificación de la reac-ción inmune y en la inactivareac-ción de microorganismos invasores; para dispararse requiere:
1.- Reconocimiento: el reconocimiento de partículas ajenas al cuerpo de los artrópodos ocurre cuando cé-lulas de la hemolinfa (hemocitos) o de otros órganos como el cuerpo graso reconocen específicamente (aunque aún no esta definido molecularmente cómo), componentes microbianos de la pared celular de bac-terias, como lipopolisacáridos de las Gram (-), los pepti-doglicanos de las Gram (+), el zimosán (
b
1,3 glucanos) de levaduras y hongos, así como células o parásitos de mayor tamaño (Johansson y Söderhäll 1989; Söderhäll y Cols., 1990; Ashida, 1990) y reaccionan liberando al medio los componentes del sistema proFO.2.- Activación: una vez en la hemolinfa, las enzimas de la vía proFO se activan una tras otra ("reacción en cascada") comenzando con la activación de al menos dos serina-proteasas llamadas proteínas activadoras de la profenoloxidasa 1 y 2. La serina-proteasa 1 actúa sobre la número dos, amplificando la reacción, y la enzima dos a su vez sobre la profenoloxidasa convirtiéndola en fenoloxidasa y activándola. Ésta última, al estar activa, es la encargada de la con-versión, por oxidación, de fenoles en quinonas, las cuales se polimerizan formando melanina. La mela-nina inhibe la actividad enzimática tanto bacteriana como fúngica (Cerenius y Söderhall, 2001).
En los últimos años se ha descrito, a las prosta-glandinas (PGs) como moléculas moduladoras de la respuesta inmune en algunos artrópodos (Rowley et al., 2005). Las PGs derivan de los ácidos grasos esenciales de 20 carbonos, y el ácido araquidónico es el precursor más abundante; el cual puede a su vez, formarse a partir del ácido linoléico. Dado que la concentración de ácido araquidónico libre
dentro de la célula es muy baja, su disponibilidad resulta de la liberación de los depósitos celulares de lípidos mediante numerosas hidrolasas (fosfoli-pasa A2, fosfolipasa C y la lipasa diacilglicerol. Estas
fosfolipasas son activadas por diferentes estímulos físicos, químicos y hormonales, como son: trau-ma, infección, infusión con solución hipertónica, trombos, endotoxinas, estiramiento mecánico, esteroides sexuales y catecolaminas. La fosfolipasa A2 (PLA2) hidroliza la unión éster de los fosfolípidos de membrana, particularmente los que contienen fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina y liberan ácido araquidónico. En contraposición la fosfoli-pasa C separa el puente fosfodiéster, provocando una liberación de fosfatidilinositol, que libera ácido araquidónico a través de ladesintegración de la lipasa diacilglicerol. Una vez liberado el ácido araquidónico, la vía de síntesis puede tomar dos direcciones: la vía de la lipooxigenasa o la vía de la ciclooxigenasa (Stanley, 2005).
Los inhibidores de la respuesta inmune seleccio-nados para este trabajo fueron: naproxeno, com-puesto que en mamíferos causa la disminución de los mediadores de inflamación al inhibir la Ciclooxi-genasa tipo I de tipo constitutivo. Por otro lado, la dexametasona que induce la lipocortina, proteína anti-inflamatoria, que inhibe la fosfolipasa A2, lo
cual inhabilita la síntesis de PGS y lipooxigenasa (Stanley, 2006).
Objetivo
En este trabajo se evaluó la actividad de la proFO en la hemolinfa de C. montezumae en ausencia y pre-sencia los inhibidores de la síntesis de eicosanoides naproxeno (npx) y dexametasona (dexa).
Método
Reactivos: los reactivos utilizados en este trabajo
fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compañías Sigma Chem (St. Louis Missouri), Invitrogen y PE Applied Biosystems. Los reactivos para electroforesis provinieron de Gibco- BRL Life Technologies.
Material Biológico: para este trabajo se utilizaron
(Saussure, 1857) obtenidos comercialmente, los cua-les se mantuvieron en peceras con agua corriente a una temperatura de 20 a 22 °C, alimentados con peces pequeños.
Obtención y cuantificación de proteínas: para
llevar a cabo la obtención y cuantificación de proteínas, a los acociles se les inyectó al hemo-cele (entre la cabeza y el tórax) 100 ml de solu-ción salina al 0.9% con los inhibidores de PGS (Npx y Dexa 100 mg / ml). La HL fue obtenida por perfusión (30 minutos post-inoculación). A las muestras se les agregaron 10 ml de un mezcla de inhibidores de proteasas (TLCK 10 mM; TPCK 10 mM y o-fenantrolina 50 mM) posteriormente se incubaron en una temperatura de 60 °C durante 10 minutos, a continuación se separó la fase acuosa por centrifugación a 13000 rpm / 5min y se tomó el empastillado, el cual se resuspendió en 40 ml ual de amortiguador de muestra 2X. La pastilla se guardó a -20 °C para cuantificación y ensayos; la cuantificación se realizó por el método de Bra-dford (Smith, 1989).
Separación de Proteínas: las muestras de proteínas
fueron analizadas por medio de electroforesis en geles de acrilamida (PAGE-SDS) al 10% (pH 8.8), preparados según métodos estándar (Smith, 1989). Posteriormente el gel se colocó en una cámara de electroforesis agregándole amortiguador de corrida (0.025 M de Tris- glicina 0.192 M pH 8.3, SDS 0.1%). La electroforesis se realizó a 40 – 60V y a temperatura ambiente durante 16 horas. Des-pués se tiñó el gel con azul de Coomassie (Smith, 1989).
Medición Espectrofotométrica de la actividad de la proFO: para determinar por un método
colori-métrico la actividad de la FO se tomaron 20 ml de la HL, se colocaron en pozos de una multiplaca para ELISA de 96 posiciones, se les agregaron 20 ml de PBS 1X (pH de 7.4), y 10 ml de Laminarina (1 mg / ml; componente de pared celular de levaduras). Posteriormente se les agregó L-dihidroxifenilala-nina (L-Dopa) (4 mg / ml en amortiguador PBS 1X), se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos en oscuridad, se observaron los resulta-dos y se midieron las densidades ópticas a 570 nm (Lanz, 1993).
Los experimentos se hicieron por triplicado y se les aplicó la prueba estadística de Kruskal-Walis
para evaluar si existieron diferencias significativas entre los diferentes tratamientos.
Resultados
Análisis de la actividad de proFO en HL de C. montezumae y efecto de los inhibidores: en un
ensayo in vitro la HL de C. montezumae se puso en contacto con laminarina, compuesto de la pared de hongos que en otros artrópodos se ha descrito que es capaz de iniciar la cascada de la FO y en presencia de L-DOPA, el cual de manera natural esta presente en la HL y es oxidado y polimeriza-do por acción de la FO generanpolimeriza-do el compuesto colorido melanina y se observó la formación de un precipitado negro que indicó la funcionalidad del sistema. Cuando la L-DOPA se sustituyó por el ácido carmínico, pigmento presente en la HL del homóptero Dactylopius coccus, también se observó la formación de color, indicando que este sustrato, el cual es el que utiliza este insecto durante sus reacciones de melanización, también es utilizable por el sistema de FO de C. montezu-mae (figura 1a).
Cuando se añadieron al sistema los inhibidores dexa y npx aún hubo actividad de melanización in vitro (figura 1b).
Pozos
La HL fue incubada con diferentes sustratos (L-Dopa y carmín) durante 10 minutos; posteriormente se trató con un componente patógeno (laminarina) durante 30 minutos. a) A1: HL de acocil; pozo control. A2: HL + Laminarina + L-Dopa (sustrato). A3: HL + Laminarina+ Carmín (sustrato). A4: HL + npx + Laminarina + L-Dopa (sustrato) A5 : HL + npx + Laminarina + Carmín. A6: HL + L-Dopa (sustrato). A7: HL + npx + L-Dopa (sustrato). En los pozos A2 a A7 se observa melanización.
Figura 1a. Ensayo espectofotométrico in vitro de la actividad de proFO de la HL de C. montezumae
A1 HL Control A1
A2 HL Control + Laminarina + L-Dopa A2 A3 HL Control + Laminarina + Carmín A3 A4 HL npx + Laminarina + L-Dopa A4 A5 HL npx + Laminarina + Carmín A5 A6 HL Control + L-Dopa A6 A7 HL npx + L-Dopa A7
Sin embargo, cuando se midieron espectrofotométricamente las cantidades de melanina producida y se compara-ron estadísticamente los valores se encontró una ligera, pero significativa, disminución con la dexa (figura 2).
Figura 2. Disminución con la dexa por presencia de melanina
Figura 3. Resultados del tratamiento con naproxeno
1 2 3 kDa 68 43 29 50 25
Cuantificación de actividad de profenoloxidasa en la respuesta inmune de C. montezumae en presencia de diferentes inhibidores (dexa y npx), por método espectofotométrico a 570nm. Observándose en el tratamiento con dexa un ligero descenso en la absorbancia, mientras que en el tratamiento con npx no se presenta ninguna disminución en la actividad ( n=3;Kruskal-Wallis, p < 0.05).
Electroforesis en gel de poliacrilamida PAGE-SDS al 10%. Carril 1: Tratamiento con npx. Carril 2: Tratamiento con dexa. Carril 3: Control.
En los patrones proteícos de HL se observa un enriquecimiento en la banda de 50 kDa en el tratamiento con npx (1), a diferencia de los otros dos tratamientos (2 y 3).
Pozos
A1 HL Control A1
A2 HL Control + Laminarina + L-Dopa A2
A3 Vacío A3
A4 HL npx + Laminarina + L-Dopa A4 A5 Dexa1+ Laminarina + L-Dopa A5 A6 Dexa2+ Laminarina + L-Dopa A6
Figura 1b. Actividad de melanización por inhibidores
A1: HL de acocil; pozo control. A2: HL + Laminarina + L-Dopa (sustrato). A3: Blanco. A4: HL + npx + Laminarina + L-Dopa (sustrato) A5 : HL + dexa + Laminarina + L-Dopa (sustrato). A6: HL + dexa+ Laminarina + L-Dopa (sustrato).
Discusión
En el presente trabajo se observó el efecto de la dexa y npx en la ruta proFO en C. montezumae.
En el lepidoptero Galleria mellonella se reportó que la melanización producida en HL por la acción de agentes microbianos es inhibida totalmente en presencia de dexa y npx (Mandato, Moore, Downer, 1996). En con-traste en C. montezumae el efecto no fue tan radical. Sin embargo, quedan otras condiciones por probar como por ejemplo analizar dosis más altas de los inhibi-dores. Cabe aclarar, que esta es la primera descripción de la interacción de estos compuestos con la HL del crustáceo. Aunque la inhibición de la melanización fue parcial, se puede observar, al realizar la cuantificación de la actividad profenoloxidasa, que la dexa tiene un efecto parcial sobre la melanización, indicando que ha actuado como inhibidor; a diferencia de lo observado en npx, donde no se apreció ningún cambio.
Al analizar las proteínas de la HL por medio de elec-troforesis en gel de acrilamida, se observó que una banda de 50 kDa solamente se presentan en los carriles de npx y de control, no así en el carril de dexa. Con el antecedente de que las moléculas del sistema inmune de artrópodos se ven afectadas en actividad y síntesis por los inhibidores de la síntesis de eicosanoides la (s) proteína (s) de 50kDa pueden ser consideradas a candidatos a participar del sistema inmune. Por otra parte, también se observó la presencia de una banda prominente de 20 kDa, que solamente aparece en el carril de dexa. Tomando como referencia su peso, po-dría especularse de que se trate de un posible péptido antimicrobiano, sintetizado como una ruta alternativa por el organismo, al verse inhibidas algunas rutas de respuesta inmune. Para conocer la identidad y posible papel de estas moléculas se recurrirá a su caracteriza-ción en trabajos posteriores por medio de electroforesis bidimensional y MALDI-TOF.
Se tiene también contemplado evaluar la activi-dad de melanización en presencia de otros inhibidores de PGS no esteroidales (AINs) como son los ibuprofenos, ácido acetilsalicílico, ácido mefenámico o bien la indometacina, actuando de manera similar que el npx con el fin de inhibir las diferentes isoformas de ciclooxigenasas (I y II) que están involucradas en la formación de PGs, en el caso de compuestos de naturaleza corticosteroides, los cuales su mecanismo de acción inhibe la producción de la fosfolipasa A2,
la 5-lipo-oxigenasa y la ciclooxigenasa; se pretende realizar ensayos de dosis-respuesta para estudiar la posible acción de estos fármacos.
Conclusión
El estudio de la acción de las prostaglandinas y su papel en la inmunidad de crustáceos, es de gran interés comercial ya que abre una enorme posibilidad para diseñar medidas más eficientes de control de enfermedades en estos invertebrados, con el propósito de incrementar las producciones comerciales.
Referencias
Ashida, M: (1990). The profenoloxidasa cascade in insect immunity. Response Immunologic. 141, 898.
Cerenius L, Söderhäll K, (2001). The prophenoloxidase-activat-ing system in invertebrates. Immunological Reviews 198, 116-126
Johansson, M. W, y Söderhäll, K. (1989). Cellular immunity in crustaceans and the proPo System. Parasitology Today. 5: 171.
Lanz-Mendoza H, Hernández S, Garrido-Guerrero E, Tsutsumi V, Aréchiga H. (1993). Prophenoloxydase system activation in the Crayfish: Procambarus clarki. Dev Comp Immunol 17, 399-406.
Mandato, C. Diehl-Jones. W, Moore, S. Downer, R. (1996). The effects of eicosanoid biosynthesis inhibitors on prophe-nolxidase activation, phagocytosis and cell spreading in Galleria mellonella. Insect Physiology. 43, 1 – 8 Miller, J. et al., (1994). Eicosanoids mediate insect nodulation
responses to bacterial infections, Insect Biochemistry/ Phisiology Laboratory, Department of Entomology, Uni-versity of Nebraska, Lincon.
Ratcliffe, N. A. y Götz, P. (1990). Funcional studies on insect haemocytes including non-self recongnition. Response Immunologic. 141, 919.
Rowley, A, Vogan, C, Taylor G, Clare A. (2004). Prostanglandins in non- insectan invertebrates: recent insights and unsolved problems. Experimental Biology, 208,3-14.
Smith J. (1989). Electrophoretic separation of proteins. In: Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J, Struhl K, Editors. Current protocols in molecular biology. New York: Green Publishing and John Wiley and Sons. 10.2.1-10.2.9. Stanley, D., (1998). Eicosanoids mediate insect celular inmune
reactions to bacterial infections. Recent Advanced in Prostanglandin, Tromboxane an Leucotriene Research, Edit by Sinzinger et al., Plennum Press, New York. Stanley, D. (2006). Prostanglandins and other eicosanoids in Insects:
Detección de hongos y oomycetos en cultivos de peces
dul-ceacuícolas empleando el kit BIAADETECT, producto
desa-rrollado a partir del homóptero Dactylopius coccus.
Rocío Parra Laca1, Fernando García-Gil de Muñoz 1, Laura E. Borrego Enríquez1, Humberto Lanz-Mendoza3,
Ignacio Del Río Dueñas4 y Fidel de la Cruz Hernández-Hernández 2
1Universidad Simón Bolívar, México, D.F., 2CINVESTAV-IPN, México, D.F., 3CISEI-INSP, Cuernavaca, Mor., 4Colorantes Naturales de
Oaxaca Fundación “Tlapanochestli”, Coyotepec, Oaxaca
Resumen
En los cultivos de peces dulceacuícolas existen numerosos organismos patógenos que causan
grandes pérdidas. Dentro de estos patógenos se encuentran los hongos y oomycetos y, dado
que existen pocos tratamientos eficaces para combatirlos en los estanques de cultivo, se hace
fundamental poseer métodos que permitan detectarlos y prevenirlos. Con la finalidad de
re-solver esta problemática, en los últimos años se ha desarrollado el uso de herramientas
mole-culares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las cuales tendrían un alto costo
para su aplicación en la acuicultura. El producto biotecnológico BIAADETECT desarrollado a
partir del homóptero Dactylopius coccus reacciona al ponerse en contacto con componentes
de pared celular de los hongos como el zymosan y b 1-3 glucanos, lo que sugiere una posible
aplicación como un detector de la presencia de patógenos en agua.
Palabras clave: Dactylopius coccus, BIAADETECT, cultivos dulceacuícolas, hongos, Saprolegnia
Abstract
There are numerous pathogenic microorganisms which cause important losses in fresh water
fish cultures. Fungi and Oomycetes are included among these pathogens. Due to there are hot
treatments to eliminate this pathogens in the culture tanks, it is important to design methods
to detect and prevent their development.
Laspite of in the last years, a number of cheap diagnostics tools, based on polymerase chain
reaction (PCR) have been developed there are not methods for fungi/oomycete detection. The
product BIAADETECT, developed from the Homoptera Dactylopius coccus, reacts contact with
celular wall compounds of fungi like zymosan and b 1-3 glucans, which suggests a possible
application as a predictor of pathogens in water.
Introducción
Los peces dulceacuícolas frecuentemente sufren infecciones por hongos como Phoma sp., Trichoderma sp. y Aspergillus sp. y oomycetos como Aphanomyces invadens, Achlya sp. y Saprolegnia sp. (figura 1), tanto en vida libre como en granjas de producción acuícola siendo, en estas últimas, factores importantes de pérdidas económicas (Torto-Alalibo, Tian, Gajendran, Waugh, West & Kamoun, 2005). Estas enfermedades se presen-tan al coincidir parásitos viables, en número suficiente y con sobrevida larga con un hospedador susceptible. Para generarse la oportunidad de infección también debe darse una ruta de infección adecuada, como en la ruptura de las barreras mucosas y epiteliales, acompañado de cambios en los parámetros físico-químicos de la calidad del agua (Bondad-Reantaso, Subasinghe, Arthur, Ogawa, Chinabut, Adlard, Tan & Shariff, 2005).
Figura 1. Infección por Saprolegnia sp. en peces adultos (A) y huevos (B)
Algunos problemas causados por micosis en peces son controlables por la aplicación de Verde Malaquita, un colorante que puede ser aplicado solo o en combinación con otros fungicidas. Sin embargo, en los últimos años el uso de este compuesto ha sido prohibido en muchos países ya que se le han atribuido propiedades teratogénicas, de modo que este tipo de patologías han vuelto a ser un problema de importancia en la acui-cultura (Alderman, 1982; Torto-Alalibo et al., 2005). Por estas razones, recientemente se han desarrollado herramientas moleculares para la detección de Saprolegnia sp. (Torto-Alalibo et al., 2005; Kamoun, 2003) como la creación de una base de datos genómica de oomycetos OGD (www.oomycete.org) en la busca de posibles métodos de detección y/o tratamiento de infecciones; sin embargo, aún no se han generado solu-ciones prácticas para su aplicación en la acuicultura.
Los oomycetos son microorganismos capaces de infectar individuos de muy diversos tipos, incluyendo plantas (Phytophtora sp.), animales (Aphanomyces sp.) y microbios como Pseudomonas fluorescens (Pythium sp.), por lo que su estudio es importante desde el punto de vista de la ecología y de la producción (Kamoun, 2003, Rezzonico F, Bonder C, Defago C & Moenne-Loccaz Y, 2005).
Hasta hace algunos años se consideró a los oomycetos dentro de los hongos debido a su crecimiento en forma hifal. Sin embargo los análisis moleculares recientes de estos microorganismos han mostrado diferencias con los hongos verdaderos o eumicetos como la presencia de: b 1-3 glucanos, polímeros de celulosa, micolaminarinas (carbohidratos encontrados principalmente en el alga kelp y diatomeas), poca quitina en su pared celular y un ciclo reproductivo complejo con diploidia en la fase vegetativa. Estos datos han indicado que los oomycetos presentan muy poca afinidad taxonómica con los hongos y, en cambio, están muy emparentados con las algas cafés, agrupándose dentro de los Stramenopiles (Torto-Alalibo et al., 2005; Kamoun, 2003).
Infección por Saprolegnia sp. en epidermis de pez adulto (A) y capas externas en huevos (B) del bacalao de Murray (Maccullochella macquariensis). Imágenes de acceso abierto en el sitio: http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/apr2003.html,http://www.natfish.tafensw.edu.au/
Por otro lado, aunque no se sabe la posible infectividad de los oomycetos sobre insectos se conoce que la hemolínfa (HL) de la grana fina del nopal, Dactylopius coccus, la cual posee disuelto y dentro de cé-lulas sanguíneas (hemocitos) al ácido carmínico, que se consume en presencia de componentes propios de la pared celular de hongos, activan la ruta de la profenoloxidasa, produciéndose una reacción de melanización (Hernández-Hernández, García-Gil, Rojas-Martínez, Hernández-Martínez y Lanz-Mendo-za, 2003) con el consecuente consumo del pigmento rojo y generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (García, Calzada, Rangel, Castro, Lanz, Del Río y Hernández, 2005; Nappi, Carton & Vass, 1995) los cuales son capaces de destruir a los agentes invasores (Carton & Nappi, 1992) (figura 2). Recientemente se ha desarrollado un procedimiento para preparar un sistema de detección de patógenos a partir de componentes del sistema inmune de D. coccus (BIAADETECT, patente en trámite) del cual en este trabajo se evaluó su capacidad de detectar diferentes hongos y oomycetos.
Figura 2. Esquema de la activación del sistema de la profenoloxidasa y su participación en la formación de melanina
El proceso de melanización requiere de la activación en cascada de la fenoloxidasa para la formación de difenoles y quinonas las cuales en presencia de compuesto nucleofílicos se ciclan formando los precursores de la melanina como la DHI (dihidroxi-indolquinona).
Melanización b 1-3 glucanos
(componente de pared celular de hongos)
Serina proteasas
inactivas Serina proteasas activas
Profenoloxidasa Fenoloxidasa
Difenoles Quinonas
Objetivo
En este trabajo se propuso aislar e identificar hon-gos y oomycetos de muestras de peces Carasssius auratus con infección micelial evidente y muestras de agua de estanques de peces dulceacuícolas. Dada la capacidad de los oomycetos para infectar organismos de distintos tipos se analizó también la respuesta del kit BIAADETECT obtenido a partir de D. coccus, insecto de importancia económica, ante la presencia de los hongos y oomycetos ais-lados de peces y muestras de agua.
Método
Reactivos. Los reactivos utilizados en este
traba-jo fueron de la más alta calidad y se obtuvieron de las compañías Sigma Chemical Co. (St. Louis Missouri).
El kit BIAADETECT se obtuvo de la compañía pro-ductora de colorantes naturales Tlapanochestli Coyotepec, Oaxaca (www.aztecacolor.com).
Obtención de muestras de estanques y aislamien-to de colonias fúngicas. Se aislamien-tomaron muestras de
500 ml de estanques de peces dulceacuícolas, las cuales se procesaron en el menor tiempo posible después de su obtención para evitar así cambios en los parámetros de pH, temperatura, oxígeno, entre otros, que pudieran causar alteraciones en los patógenos presentes, producción de bacterias y formación de hongos externos a la muestra. Para obtener muestras de los peces infectados (Carassius auratus) se realizó un raspado superfi-cial de la epidermis con asa de siembra, tomando el material a partir de la parte media lateral del cuerpo. El material obtenido se suspendió en 100 ml de agua estéril.
Cultivo de hongos y oomycetos. A partir de las
muestras de agua y raspados se hicieron dilucio-nes con solución salina amortiguadora de fos-fatos estéril (PBS 1X), para cultivarlas según las condiciones de la norma oficial mexicana (NOM-111-SSA1-1994) para la identificación de hongos. Para este fin alícuotas de 25 ml se sembraron por extensión sobre la superficie de medio
papadex-trosaagar (PDA) incubados a 26º C. Transcurridas 120 h se realizaron preparaciones en fresco (KOH al 10% y azul algodón) observadas en microsco-pia de luz. Los hongos y oomycetes obtenidos se enviaron para su identificación al departamento de Botánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN.
Determinación de la presencia presuntiva de patógenos mediante el kit BIAADETECT. Para las determinaciones se uso el kit BIAADETECT según las especificaciones de uso del fabricante. Se uti-lizaron alícuotas de 100 µl de muestras de estan-ques y las obtenidas de epidermis. Las muestras se incubaron con 50 ml de BIAADETECTdurante 20 min a 37º C, centrifugando a 14000 rpm por 3 min y se leyó la absorbancia del sobrenadante a 495 nm (pico máximo de absorbancia del ácido carmínico) (Schmitt, P & Gunter, H, 1984).
Resultados
Aislamiento e identificación de hongos presentes en muestras de estanques dulceacuícolas. A partir
de las muestras de estanques y raspado de epider-mis de peces infectados se aislaron cultivos puros de ocho diferentes especies de hongos y oomyce-tos, de los cuales se identificaron tres géneros de hongos: Phoma sp., Trichoderma sp. y Aspergillus sp., y un genero de oomyceto: Saprolegnia sp. Los organismos A (Phoma sp.), B (Trichoderma sp.), D (Saprolegnia sp.) y H fueron obtenidos de mues-tras de estanques dulceacuícolas, por otro lado, los organismos C (Aspergillus sp.), E, F, y G fueron obtenidos del raspado de epidermis de la parte media lateral de peces infectados (figura 3). De los organismos aislados se hizo su identificación con claves taxonómicas y reacciones con el kit BIAADETECT obtenido a partir de D. coccus.
Pruebas de consumo de BIAADETECT. Los componentes de la pared celular de los hongos y oomycetos indu-cen cambio colorimétrico al estar en contacto con el producto BIAADETECT el cual se consume durante la reacción, midiendo el consumo por espectrofotometría (tabla 1).
Figura 3. Crecimiento e identificación de los hongos y oomycetos aislados de muestras de estanques y peces infectados
Muestras de raspados de piel de peces infectados (C, E, F, y G) y de agua de tanques de cultivo (A, B, D y H), cultivados en medio PDA durante 120 h. Se hizo una identificación al microscopio con la utilización de claves taxonómicas, identificando los siguientes géneros: Phoma sp. (A), Trichoderma sp. (B), Aspergillus sp. (C) y Saprolegnia sp. (D). P.- Picnidio; C.- Conidias; H.- Hifas; O.- Oosporangios.
Tabla 1. Reacción de BIAADETECT a la presencia de hongos y oomycetos presentes en los estanques de cultivos y en peces infectados Control BIAADETECT Abs. absoluta Abs. ajustada Porcentaje Muestra A Phoma sp. Muestra B Trichoderma sp. Muestra C, E, F y G Raspado (Aspergillus sp.) Muestra D Saprolegnia sp Muestra H 0.332 0.202 100 0.2001 0.0701 34.70 0.165 0.035 17.32 0.182 0.052 25.74 0.225 0.098 48.51 0.21 0.08 39.6
Muestras de los hongos y oomycetos aislados de aguas y pieles de peces infectados (Véase figura 3) se incubaron con BIAADETECT, mi-diendo su consumo espectofotométricamente (495 nm).
Espectro de absorción de BIAADETECT incubado con hongos y oomycetos y zymosan. Para analizar si
exis-ten componentes que interfieran en las mediciones espectofotométricas en las muestras obexis-tenidas de los estanques, en muestras de piel de peces infectados y el zymosan, sometidas a interacción con BIAADETECT, se hicieron espectros de absorción en el rango de 400-700 nm después del consumo de BIAADETECT. En todo el espectro analizado, las diferencias en la absorbancia entre las muestras se dieron alrededor del pico de absorción a 495 nm. El zymosan (componente de la pared celular de hongos) presentó una absorbancia de 0.13 respecto al pico del 495 nm (0.35), las muestras incubadas con hongos y oomycetos presentaron una absorbancia menor respecto al control dándose el reconocimiento de los componentes de la membrana celular y el consecuente consumo del pigmento rojo durante el proceso de melanización, sugiriéndose una posible relación entre la absorbancia y la cantidad de hongo presente en la muestra (figura 4.)
Figura 4. Espectro de absorción de BIAADETECT obtenido a partir de D. coccus incubado en presencia de hongos y oomycetos aislado de estanques dulceacuícolas
Las muestras obtenidas de agua de estanques de peces dulceacuícolas (A, B, D y H) así como la muestra de raspado de piel de peces infectados que contenía los hongos C ( Aspergillus sp.), E, F, y G (Véase figura 3) se mezclaron con BIAADETECT e incubaron por 30 min. haciendo un espectro de absorción en el rango 400-700 nm.
Discusión
Al analizar las muestras de agua obtenidas de estanques dulceacuícolas se determinó la presencia de tres hongos, de los cuales, se cuenta con la identificación de los géneros Phoma sp. y Trichoderma sp. así como la presencia e identificación del oomyceto Saprolegnia sp. En los raspados de epidermis realizados a peces visiblemente infectados se obtuvo el crecimiento de cuatro especies de hongos de los cuales se identificó el genero Aspergillus sp. Los hongos y oomycetos cultivados a partir de las muestras son organismos co-múnmente patógenos en cultivos dulceacuícolas siendo el oomyceto Saprolegnia sp. el agente infeccioso con mayor patogenicidad para los peces dulceacuícolas cultivados. La identificación de Saprolegnia sp. en los cultivos es un avance importante para así poder prevenir la infección de este oomyceto en peces dulceacuícolas, ya que al contar con este agente patógeno en el agua, aunado a factores como el estrés provocado por densidad de siembra y cambio en la temperatura del cultivo, se favorecería en los peces la invasión al ocurrir ruptura de la barrera mucosa epitelial dándose la enfermedad conocida como sapro-legniosis; disminuyendo así la calidad y número de animales.
En las pruebas realizadas con el kit BIAADETECT con los hongos y oomycetos aislados se presentó una reacción positiva al darse el consumo del pigmento rojo con un cambio en la coloración en respuesta a un reconocimiento de los organismos presentes en la muestra del cultivo incubada con BIAADETECT, esta respuesta se ve reflejada cuando la lectura espectrofotométrica disminuyó, lo cual sugiere que el sistema no sólo tiene la capacidad de interactuar con componentes de la pared pu-rificados como es el zymosan, sino también con la presencia de hongos y oomycetos presentes. Tanto en el caso de las muestras donde se presentó un mayor crecimiento de hongos como en las alícuotas que contenían el raspado de epidermis, se da un decremento en la absorbancia, esto sugiere una relación entre la concentración de los componen-tes de pared celular de hongo y oomyceto y la variación espectrofotométrica y con esto podría determinarse la probabilidad de infección del cul-tivo y tomarse medidas para evitar la parasitosis.
Conclusión
La detección de oomycetos y hongos patógenos en el cultivo complementados con una supervi-sión constante de los parámetros temperatura, nitritos y oxigeno, entre otros, da la posibilidad de implementar tratamientos profilácticos, dando como resultado la disminución en el desarrollo de parásitos y la reducción de infecciones en los organismos acuáticos.
Los datos obtenidos del estudio del sistema BIAA-DETECT en presencia de estos patógenos propor-cionan herramientas para la evaluación diagnósti-ca y su aplidiagnósti-cación en cultivos comerciales.
Agradecimientos
Agradecemos la asesoría durante el trabajo de identificación de hongos a la Biol. Rosario Vázquez Bravo del Departamento de Botánica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Poli-técnico Nacional (IPN).
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Reducción de bacterias de origen fecal presentes en zanahoria,
espinaca, cilantro y lechuga escarola, cultivadas en la zona de
chinampas de Xochimilco
Marybell Vega González, Rosa Salgado Brito y Gabriel Pineda Flores Universidad Simón Bolívar
Resumen
El objetivo principal del trabajo fue reducir el número de coliformes fecales aplicando
desin-fectantes económicos de cuatro hortalizas cultivadas en Xochimilco. Cada una se sumergió 15
minutos en soluciones con yodo, plata coloidal, cloro, detergente para trastes y para ropa. Las
bacterias coliformes fecales fueron determinadas por cuenta viable en agar EMB. El
desinfectan-te que redujo el número de estos microorganismos, en dos de las cuatro hortalizas, por debajo
del valor permitido fue el detergente para ropa y al aumentar su concentración de 0.1 a 0.5 g/l
produce la reducción de los coliformes fecales en las cuatro hortalizas a un nivel no detectable.
Palabras clave: hortalizas, desinfectantes, coliformes fecales.
Abstract
The main aim of this work was to reduce fecal coliforms on four vegetables cultivated in
Xochimilco, by applying economic disinfectants. Vegetables were submerged 15 minutes
in iodine, colloidal silver, chlorine, frets detergent and clothes detergent solutions. Fecal
coliforms were determined by viable count on EMB agar. Clothes detergent was the
disin-fectant that reduced the fecal coliforms below the allowed value, in two of four vegetables.
Increase in concentration of the clothes detergent from 0.1 to 0.5 g/l reduces the fecal
coli-forms in the analyzed vegetables to a non detectable level.
Keywords: vegetables, desinfectants, fecal coliforms
.Introducción
El deterioro de la salud de los habitantes del Distri-to Federal por consumir alimenDistri-tos de baja calidad sanitaria, es un tema conocido y muy documentado (Rosas, Báez y Coutiño, 1984, Cifuentes, Suárez, So-lano y Santos, 2002). Una de las principales causas de este problema es el consumo de alimentos prepara-dos con hortalizas crudas contaminadas con materia fecal (Murthy et al. 1989; Acevedo, Mendoza y Oyon, 2001). El consumo de este tipo de alimentos puede ocasionar enfermedades como cólera, fiebre tifoidea, shigelosis, amibiasis, hepatitis, giardiasis y criptospo-ridiasis, entre otras (Caccio, De Giacomo, Alucinio y Pozio, 2003; Vega, Jiménez, Salgado y Pineda, 2005). También se ha demostrado la presencia combinada de Escherichia coli, Salmonella enteritidis y Listeria monocytogenes en vegetales crudos (Venkitanara-yanan, Ezeike, Hung y Doyle, 1999).
La zona de chinampas del lago de Xochimilco es una fuente importante de hortalizas del Distrito Federal, ya que se cultiva una variedad considerable y son comercializadas en la explanada de la delegación, así como en la central de abastos de la Ciudad de México. Las hortalizas producidas en Xochimilco tienen gran aceptación entre los consumidores por su buen aspec-to y bajo cosaspec-to. Sin embargo, se ha demostrado que estas hortalizas presentan un número muy elevado de bacterias de origen fecal ya que son regadas con agua de los canales que también posee una gran cantidad de estos microorganismos (Pineda-Flores, Hernández, Cruz y Gutiérrez-Castrejón, 1999; Vega et al. 2005). Desafortunadamente, el consumo de hortalizas contaminadas no es la única fuente de enferme-dades diarreicas, ya que se ha demostrado que el consumo de productos de carne, contacto persona a persona, el consumo de sidra de manzana y la
leche sin pasteurizar son otras fuentes de conta-gio que también pueden estar relacionadas con el contacto con agua contaminada con materia fecal (Lisle, Broadawey, Prescott, Pyle, Frincker y McFeters, 1998).
El método más utilizado para eliminar la presencia de microorganismos patógenos de las hortalizas, es la aplicación de sustancias químicas desinfectantes sobre su superficie. De los diferentes compuestos que existen, el cloro en forma de hipoclorito de sodio es la sustancia que más se utiliza en la actuali-dad para este fin (Zhuang, Beuchat y Angulo, 1995; Miché y Balandreau, 2001).
A pesar del uso tan difundido del cloro como agente desinfectante y del conocimiento de otras sustancias con la misma actividad, como el yodo y el nitrato de plata, estos compuestos no son ampliamente cono-cidos por las personas que preparan alimentos en instalaciones semifijas o ambulantes con hortalizas crudas que provienen de Xochimilco, por lo que no son empleados en su actividad diaria.
La sustancia con efecto desinfectante más conocida por este sector de la población es el detergente. Sin embargo, se desconoce la capacidad de este producto para eliminar a las bacterias de origen fecal presentes en las hortalizas cultivadas en Xochimilco.
Si el detergente cumple con la acción desinfectante deseada, similar a la obtenida con el hipoclorito de sodio, nitrato de plata o yodo, la aplicación de este producto para desinfectar las hortalizas cultivadas en Xochimilco sería una actividad que de manera efectiva eliminaría a las bacterias de origen fecal y evitaría la propagación de enfermedades diarreicas. Por otro lado, sería más accesible implementar la desinfección con detergentes, ya que estos produc-tos son económicos y de uso cotidiano para las per-sonas que preparan alimentos en establecimientos semifijos y ambulantes en el Distrito Federal.
Objetivo
Determinar el efecto desinfectante de cinco produc-tos químicos para reducir la cantidad de bacterias de origen fecal, presentes en hortalizas que se consumen crudas y que son regadas con agua de los canales de Xochimilco.
Método
a) Selección de las hortalizas
Se escogieron las hortalizas zanahoria, espina-ca, cilantro y lechuga escarola debido a que son consumidas crudas en diferentes alimentos de los habitantes del D.F., además de que fueron culti-vadas con agua de los canales de Xochimilco y se demostró que todas ellas presentaban una cantidad de bacterias coliformes fecales superior a los 100 NMP/100 ml (Vega et al., 2005).
Las hortalizas fueron adquiridas en la delegación Xochimilco, de manera aleatoria y transportándolas de acuerdo a la NOM-109-SSA1-1994 (SE 2006b). b) Determinación del efecto desinfectante de di-ferentes productos químicos
En condiciones asépticas y utilizando material estéril, se obtuvieron trozos pequeños irregulares de cada hortaliza por analizar hasta completar cinco muestras de 10g cada una. Posteriormente se sumergieron en cinco recipientes individuales que contenían 100 ml cada uno de la solución desinfec-tante por probar. Éstas fueron hipoclorito de sodio (0.1 ml/l), yodo (0.05 ml/l), plata coloidal (0.4 ml/l), detergente para trastes (0.1 g/l) y detergente para ropa (0.1 g/l). Se seleccionó la concentración de los desinfectantes de acuerdo a la recomendada como efectiva para desinfectar hortalizas, la cual estaba indicada en la etiqueta de cada producto.
Cada muestra de 10 g se sumergió durante 15 mi-nutos en la solución desinfectante. Posteriormente se eliminó la solución y la hortaliza fue colocada en un vaso de licuadora que contenía 90 ml de agua peptonada estéril. Se licuó el contenido durante un minuto y se tomó una alícuota de 1 ml para realizar diluciones decimales hasta 10-3 en tubos de ensaye de 16x 150 mm con tapón de rosca que contenían 9 ml de agua peptonada estéril. De cada dilución se tomó una alícuota de 0.1 ml y se sembró en cajas de Petri con agar Eosina Azul de Metileno por dis-persión con varilla de vidrio estéril. Cada dilución se sembró por duplicado.
Las cajas se incubaron a 37 °C durante 48 horas, posteriormente se contó el número de colonias pertenecientes al grupo de coliformes fecales y se comparó con el reportado en la norma NOM-093-SSA1-1994 (SE, 2006a).
Cada hortaliza fue tratada por separado de la manera antes descrita.
Resultados
Al observar las figuras 1 a 3 se percibe que el yodo, la plata coloidal y el detergente para trastes sólo fueron capaces de reducir el número de coliformes fecales presentes en el cilantro, por debajo del valor permitido. El hipoclorito de sodio (figura 1) no fue capaz de reducir la cantidad de bacterias de origen fecal por debajo del valor permitido, en ninguna de las hortalizas del estudio.
El efecto desinfectante del detergente para ropa (figura 3) fue el mejor de los compuestos evaluados, ya que al aplicarlo disminuyó el número de coliformes fecales por debajo del valor permitido, en zanahoria y cilantro. Este efecto sólo fue observado al utilizar este compuesto. El resto, con excepción del hipoclorito de sodio, sólo disminuyó el contenido de bacterias de origen fecal en una hortaliza.
De acuerdo a la cantidad de coliformes fecales, después de los tratamientos con los desinfectantes, la hortaliza que presentó la menor reducción en la cantidad de estas bacterias fue la espinaca. En orden descendente le siguen la lechuga escarola, la zanahoria y por último el cilantro (figura 2).
Figura 1. Comportamiento del hipoclorito de sodio (a) y del yodo (b) en las hortalizas del estudio
6000 4500 3000 1500 0 Zanahoria Espinaca Hortaliza Cilantro Lechuga escarola
Coliformes fecales (UFC/g)
b)
Bacterias coliformes fecales presentes en las hortalizas evaluadas después del tratamiento a) 0.1 ml/l de hipoclorito de sodio y b) 0.05 ml/l de yodo. La línea representa la cantidad máxima permitida de coliformes fecales en alimentos preparados con vegetales que se consumen crudos (NOM-093-SSA1-1994).
Figura 2 Reducción de bacterias por tratamiento con desinfectante plata coloidal (a) y detergente para trastes (b) en las hortalizas
del estudio
Bacterias coliformes fecales presentes en las hortalizas evaluadas después del tratamiento a) 0.4 ml/l de plata coloidal y b) 0.1 g/l de de-tergente para trastes. La línea representa la cantidad máxima permitida de coliformes fecales en alimentos preparados con vegetales que se consumen crudos (NOM-093-SSA1-1994).
Lechuga escarola Cilantro Espinaca Zanahoria 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 Hortaliza a)
Coliformes fecales (UFC/g)
Lechuga escarola Cilantro Espinaca Zanahoria 2100 1800 1500 1200 900 600 300 0 Hortaliza b)
Figura 3. Comportamiento del detergente para ropa en la desinfección de las hortalizas del estudio
Bacterias coliformes fecales presentes en las hortalizas evaluadas después del tratamiento con 0.1 g/l de detergente para ropa. La línea representa la cantidad máxima permitida de coliformes fecales en alimentos preparados con vegetales que se consumen crudos (NOM-093-SSA1-1994). Debido a la acción desinfectante producida por el detergente para ropa, se evaluó el efecto de 0.1, 0.5 y 1.0 g/l de este producto sobre las cuatro hortalizas estudiadas. En la tabla 1 se muestran estos resultados, y se observa que a partir de la concentración de 0.5 g/l del detergente para ropa, la cantidad de coliformes fecales se redujo drásticamente.
0.1 0.5 1.0
Detergente para ropa (g/l)
Coliformes fecales por hortaliza (UFC/g)
Zanahoria 100 0.0 0.0 Espinaca 1900 0.0 0.0 Cilantro 0.0 ND1 ND Lechuga escarola 250 0.0 0.0
Efecto de diferentes concentraciones de detergente para ropa sobre la cantidad de bacterias coliformes presentes en las hortalizas es-tudiadas
1: No se determinó
Tabla 1. Resultados de la acción desinfectante en las hortalizas estudiadas
Lechuga escarola Cilantro Espinaca Zanahoria 2100 1800 1500 1200 900 600 300 0 Hortaliza
reducir su tamaño poblacional (Cooley, William y Manderll, 2003). La presencia de estructuras natu-rales como los estomas de las hojas de la espinaca, cilantro y lechuga escarola, pueden servir como sitios para que las enterobacterias se protejan del contacto directo con las soluciones de los desin-fectantes (Guo, Chen, Brackett y Beuchat, 2001). En comparación, la zanahoria presentó números más bajos de coliformes fecales que las hortalizas antes mencionadas, debido posiblemente a que ésta presenta una estructura dura que carece de estomas y no permite el paso ni adhesión de estos microorganismos (Rosas et al., 1984), además de crecer dentro del suelo.
El tiempo entre la cosecha y la venta de las hor-talizas favorece la supervivencia de los coliformes fecales presentes, ya que al cultivarse y venderse en sitios muy próximos, no se favorece la muer-te de estas bacmuer-terias por la desecación y baja temperatura particulares de las condiciones de almacenamiento (Jaquette et al., 1996).
Por otra parte, es notable la falta de efectivi-dad desinfectante del cloro en la concentración aplicada (figura 1). Estos resultados son similares a los encontrados por otros autores, en donde demuestran que con altas concentraciones de cloro (320 y 2040 mg/l respectivamente), no es posible eliminar totalmente a Salmonella monte-video y Salmonella stanley de jitomate y alfalfa respectivamente (Zhuang et al., 1995; Jaquette et al., 1996).
Es posible que el ambiente en el cual se aplicó este desinfectante haya contribuido a la falta de eliminación de las bacterias de origen fecal. Se ha demostrado que la materia orgánica presente puede inhibir la acción desinfectante de una alta concentración de cloro (Jonson, Rice y Reasoner, 1997; Lisle et al., 1998, Virto, Mañas, Álvarez, Condon y Raso, 2005). La capacidad del cloro para oxidar a los componentes de los coliformes fecales se inhibe al existir sustancias que compiten con él para ser oxidados. En el caso de estos resulta-dos, la presencia de materia orgánica propia de los exudados de las hortalizas y el uso del agua peptonada para hacer las diluciones, pueden reducir el cloro libre para eliminar a las bacterias de origen fecal presentes. También se ha demos-trado que la materia orgánica puede estabilizar
Discusión
Se determinó que las hortalizas que presenta-ron el mayor número de coliformes fecales, aun después del tratamiento con los desinfectantes, fueron la lechuga escarola y la espinaca. Este re-sultado es el mismo que el encontrado por Rosas, Báez y Coutiño (1984) hace más de 20 años. Esto significa que las condiciones del agua con la que son regadas las hortalizas cultivadas en Xochimil-co no han cambiado de manera significativa Xochimil-con el paso del tiempo.
Las concentraciones de los desinfectantes eva-luados para disminuir el número de coliformes fecales presentes en las hortalizas, fueron las señaladas en los productos comerciales para aplicarse con ese propósito. Es claro que ninguno de ellos fue capaz de reducir el número de estos microorganismos por debajo del valor permitido en las cuatro hortalizas analizadas (figuras 1 a la 3). Una razón de esto es la elevada cantidad de coliformes presentes en el agua de riego, la cual puede superar los 2400 NMP/100 ml (Pineda-Flo-res et al., 1999), lo que rep(Pineda-Flo-resenta una concentra-ción muy elevada de estos microorganismos en el agua. Las cantidades determinadas de coliformes fecales en lechuga escarola y espinaca después de la acción del hipoclorito de sodio y yodo respecti-vamente (figura 1), son casi diez veces superiores a la reportada como una concentración impro-bable que se presente en productos de venta al público (339 UFC/g de bacterias de origen fecal) (Jaquette, Beucaht y Mahon, 1996).
Otros factores que pueden provocar la ineficacia de los desinfectantes utilizados están relaciona-dos con el tipo de crecimiento en el cultivo y las propiedades de las hortalizas. En el primer caso, la zanahoria crece dentro del suelo y la lechuga escarola, cilantro y espinaca presentan un creci-miento de tipo rastrero. Esto se relaciona con un mayor contacto con el agua contaminada y las hortalizas, lo que produce que éstas posean una gran cantidad de coliformes fecales.
En relación con las propiedades de las hortalizas, se ha determinado que se establece una interac-ción planta-bacteria patógena que le permite sobrevivir al coniforme fecal hasta 15 días sin
la membrana externa de estos microorganismos, favoreciendo su efecto protector sobre la acción del cloro (Virto et al., 2005).
Por otra parte, es importante señalar que el detergente para ropa disminuyó la cantidad de coliformes fecales en dos hortalizas y este efecto no se observó al aplicar los cuatro desinfectantes restantes. Por tal motivo se evaluó el efecto de concentraciones más altas de detergente para ropa para eliminar a los coliformes fecales de las cuatro hortalizas. A partir de 0.5 g/l se eliminan estos microorganismos a un nivel no detectable (tabla 1). La presencia combinada de un blan-queador y del tensoactivo del producto pueden ser las causas que permitan una eliminación tan completa de estas bacterias.
Conclusión
La elevada cantidad de coliformes fecales sobre las hortalizas cultivadas en Xochimilco provoca que los desinfectantes comunes no sean capaces de eliminarlos. Sin embargo, es muy importante resaltar que el detergente para ropa redujo el número de estos microorganismos por debajo del valor permitido y que al aumentar su con-centración, los reduce a niveles no detectables. Este producto puede ser una alternativa para desinfectar hortalizas en lugares semifijos y am-bulantes, donde se vendan alimentos preparados con hortalizas crudas, ya que es económico y muy efectivo contra las bacterias de origen fecal. Sin embargo es necesario determinar si la hortaliza conserva su buen sabor, aspecto y si es inofensiva para el consumidor, para evitar que el alimento preparado con ella no sea rechazado.
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Descripción histológica de la regeneración ósea en conejos
implantados con hueso de bovino liofilizado (NUKBONE®)
Aline Domínguez Alonso y M. en C. Claudia Karina Torres Villaseñor Universidad Simón Bolívar
Resumen
El tejido óseo es rígido y resistente, sin embargo, puede sufrir fracturas y fisuras causadas por
accidentes y enfermedades. Actualmente, los tratamientos para fracturas se basan en la
regene-ración ósea utilizando injertos que promuevan mecanismos de osteogénesis, osteoconducción
y osteoinducción para reemplazar osteocitos y matriz extracelular pérdidas hasta formar hueso
nuevo. Con base en lo anterior, el Instituto de Investigaciones en Materiales de la UNAM; creó
el biomaterial Nukbone®, un xenoinjerto libre de materia orgánica con la finalidad de utilizarlo
para la reconstitución ósea. Se evaluó histológicamente la respuesta del tejido óseo al
Nukbo-ne®; trabajando con conejos implantados en la cresta iliaca, del lado derecho Nukbone®, y
del lado izquierdo se realizó una perforación como control; a los tiempos de 1, 2 y 5 semanas,
al término de los cuales se sacrificaron los conejos y se disectó el hueso para procesarlo por la
técnica histológica y teñirlos con H-E, Tricrómica de Gallego e impregnación argéntica. También
se realizó la implantación de Nukbone® al tiempo de 5 semanas a nivel muscular, y se aplicó
el mismo proceso histológico. En hueso, se observó la invasión de células mesenquimatosas y
osteoblastos en el implante, y la formación de trabéculas, así como la formación de una nueva
matriz extracelular. Mientras que, en músculo se observó el inicio de la formación de hueso
nuevo a partir de células mesenquimatosas. Por lo anterior, podemos concluir que Nukbone®
favorece la regeneración ósea. Sin embargo, es necesario trabajar con mayores tiempos para
confirmar si el proceso es causado por osteoconducción y/o osteoinducción.
Palabras clave: histología, regeneración ósea, xenoinjerto Nukbone®.
Abstract
Bone tissue is rigid and resistant, and can suffer fractures and fissures caused by accidents and
diseases. Lately, fracture treatments are based on bone regeneration using grafts that promote
mechanisms of osteogenesis, osteoconduction and osteoinduction to replace lost osteocytes
and extracellular matrix forming new bone. Based on the above mentioned method, the
Insti-tute of Investigation on Materials of the UNAM created a biomaterial called Nukbone®, a graft
free of organic material, with the purpose of using it for bone regeneration. The present article
evaluated the histological response of the bone tissue to Nukbone®. It was implanted on the
right iliac crest of rabbits, and the left iliac crest was perforated for control. Rabbits were
sac-rificed and dissected to obtain the hip bone by weeks 1, 2 and 5. Bones were stained with H-E,
Gallego’s trichromic stain and argentic impregnation. Nukbone® was also implanted in
muscu-lar tissue on the 5th week, and it was processed with the same technique. Mesenchymal cells
and osteoblast invasion in the graft were observed in bone tissue. The formation of trabecula
bone and a new extracellular matrix formation were also observed. Furthermore, the beginning
of a new bone formation from mesenchymal cells was also observed. Because of this evidence, it
can be concluded, that Nukbone® allows bone regeneration, although it is necessary to analyze
longer terms to confirm if it is an osteoconduction and/or osteoinduction process.
Introducción
El tejido óseo se caracteriza por su rigidez y re-sistencia. También posee cierta elasticidad al ser una forma de tejido conectivo denso especializa-do. Estas características le permiten desarrollar dos importantes funciones: una es como sostén y la segunda es la homeostasis de calcio, ya que los huesos contienen más del 99% del calcio del cuerpo (Geneser, 2000).
Macroscópicamente, existen dos tipos de tejido óseo: esponjoso y compacto. Ambos se encuen-tran rodeados por dos capas de tejido conectivo: la interna o endosito que recubre el espacio medular y los espacios del hueso esponjoso, y la externa o periostio que recubre a todo el hueso (Geneser, 2000).
Microscópicamente se encuentra formado por la matriz ósea compuesta por una porción orgánica formada por fibras de colágena, agua, proteínas séricas, electrólitos, osteocalcina, osteonectina, osteopontina y una parte inorgánica que se for-ma por cristales de hidroxiapatita, en relación estrecha con las fibras de colágeno, así como por otros minerales como magnesio, sodio, potasio, carbonato y citrato.Por otro lado, en esta matriz se encuentran las células óseas de diferentes tipos, como las osteoprogenitoras y los osteo-blastos, que son células formadoras de hueso; los osteocitos, cuya función más importante es sintetizar y reabsorber componentes de la ma-triz ósea, pero pueden presentar dos destinos posibles: ser osteocitos o formar parte de las células de revestimiento óseo. Por último, están los osteoclastos que son células especializadas en la remodelación del tejido óseo.
Todos los componentes del hueso antes mencio-nados poseen una organización histológica, for-mando conductos y sistemas donde se distribuyen los osteocitos. El hueso compacto se organiza en láminas con osteocitos que se comunican a través de canalículos para intercambiar diversas sustancias. Las láminas se organizan en forma concéntrica alrededor de los conductos de Havers formando osteonas y, a su vez, estos conductos de Havers se comunican por conductos de Volk-mann.En cambio, el tejido óseo esponjoso se compone por láminas paralelas y osteonas
trabe-culares, sin la presencia de conductos de Havers ni de Volkmann (Geneser, 2000).
A pesar de lo antes mencionado y de las eficien-tes características de este tejido, es factible a alteraciones como fracturas y fisuras producidas por diversas causas como accidentes, golpes y enfermedades óseas. La Organización Mundial de la Salud (OMS, 1995) asegura que las fracturas son el sexto lugar de ingreso hospitalario con 3.2 % de casos, y afirma que la osteoporosis, al ser el segundo problema de salud pública, oca-siona cada 30 segundos una fractura en todo el mundo. De esta manera se invierten alrededor de 730 millones de dólares para atender 36 mil 500 fracturas de fémur, cadera, antebrazo y vér-tebras. Todo esto es ocasionado porque la masa ósea está completamente formada a los 30 años, misma edad a la que ésta empieza a decaer es entre 1-4%, mayor en mujeres que en hombres a causa de los procesos hormonales.
Los tratamientos aplicados a fracturas son placas y tornillos que fijan el hueso hasta soldar, en su mayoría elaborados de materiales ajenos a la composición del hueso. Es por esto que cada día se elaboran materiales nuevos para obtener mejores resultados en el estudio del proceso de regeneración que consiste en reemplazar con células de la misma estirpe el tejido desaparecido mediante mecanismos de osteogénesis, osteo-conducción y osteoinducción, para realizar una serie de procesos de angiogénesis, migración, proliferación de células indiferenciadas, diferen-ciación a osteoblastos, producción de osteoides, mineralización y remodelación (Reddi, et al., 1977). Esta regeneración del tejido óseo ha po-tenciado el incremento de sustitutos y materiales de implante (Valle, et al., 2000).
Objetivo
Describir y comparar histológicamente la regene-ración del tejido óseo de la cresta iliaca de conejo con y sin xenoinjerto Nukbone® al tiempo de 1, 2 y 5 semanas.
Describir e identificar la formación de hueso en tejido muscular con el xenoinjerto Nukbone® a las 5 semanas después del implante.
Método
Se utilizaron 28 conejos machos de la raza Nueva Zelanda, con un peso de 2.5 a 3.5 Kg.; estos se dividieron en forma aleatoria en 3 grupos con cuatro conejos cada uno, para los tiempos de evaluación a 1, 2 y 5 semanas. En el Departa-mento de Cirugía de la Facultad de Medicina de la UNAM, se realizó la cirugía en la cresta iliaca de la cadera (figura 1a), la cual consistió en la elaboración de una perforación de 3 mm de diá-metro por 10 mm de longitud en ambas crestas iliacas de cada conejo. La cresta iliaca derecha fue experimental (figura 1b), en la cual se implantó el xenoinjerto Nukbone® de hueso de bovino liofilizado de forma cilíndrica, mientras que la cresta iliaca izquierda fue control (figura 1b), en donde la perforación no tuvo ningún tratamiento para la regeneración ósea.
Figura 1. Descripción ósea del conejo
Todos los procedimientos de manejo, anestesia y cirugía se realizaron de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana relacionada con los animales de laboratorio. De esta manera, se sacrificaron los conejos con una dosis de 60 mg/kg de pentobarbital sódico a las 1, 2 y 5 semanas. Las muestras de las crestas iliacas se obtuvieron por medio de una disección con una sierra de diamante. Por último, las muestras se fijaron en formol al 10% durante 24 hrs.
Posteriormente, en el Laboratorio de Ciencias Morfológicas de la Facultad de Ciencia y Tecnología de la Universidad Simón Bolívar, las muestras fijadas fueron lavadas con agua corriente y se descalcificaron con ácido nítrico al 15%, a temperatura ambiente y durante un periodo de 5 a 21 días dependiendo del tamaño de la muestra. A continuación, se lavaron con agua corriente, se deshidrataron con alcoholes graduales y fueron aclaradas con xilol para ser incluidas en parafina con un punto de fusión de 54 ºC. Después se realizaron cortes utilizando el microtomo por rotación con un grosor de 7 µm y se tiñeron con las técnicas de Hematoxilina-Eosina (H-E), Nitrato de Plata (N.P.) y Tricrómica de Gallego (T.G.) (Aguilar, et al., 1996). Por último, se observaron al microscopio óptico para determinar el proceso celular durante la regeneración ósea.
Resultados
La cresta iliaca de cadera de conejo se encuen-tra formada por hueso compacto (figura 2a) y hueso esponjoso (figura 2b). El primero muestra una formación de láminas con osteocitos orga-nizados en un acomodo concéntrico alrededor del conducto de Havers, mientras que el hueso esponjoso se dispone en trabéculas formadas por osteocitos y una matriz extracelular de láminas paralelas.
a) Localización general de la cresta iliaca de conejo (il). b) Cresta iliaca control (sin injerto; Ctrl) y Cresta iliaca experimental (con Nukbone®; Exp).
El Nukbone® consiste de una matriz extracelular inorgánica formando una red, la cual se observa tanto en hueso calcificado (figura 3) como en des-calcificado (figura 4a, b y c).
Figura 3. Nukbone® calcificado. Vista macroscópica, en la cual se
distinguen luces (L) rodeadas por matriz extracelular (ME). Azul de metileno, 60x.
La invasión de tejido durante la primera semana de regeneración ósea es diferente para ambos grupos. En la muestra control (sin Nukbone®; figura 5a) existe una invasión de tejido conectivo laxo producido por los osteoblastos del hueso compacto adyacente (figura 5b). El tejido conectivo laxo se transforma a conectivo denso regular para la formación de trabéculas (figura 5c). Mientras tanto, en la muestra experimental (con Nukbone®; figura 6a) se observa el injerto unido al tejido conectivo adyacente; y también existe una in-vasión de fibras de colágena (figura 6b) en las cuales están presentes fibroblastos, células mesenquimatosas y osteocitos sobre el xenoinjerto (figura 6c). Alrededor de esta zona se observan eritrocitos extravasados.
Figura 4. Nukbone® descalcificado
Vista panorámica: (a) Azul de metileno, 60x. (b) H-E, 400x y (c) H-E, 1000x, en donde se observan luces (L) rodeadas de matriz extracelular inorgánica (ME).
Figura 2. Estructura de la cresta iliaca
a) Hueso compacto, se observaron osteocitos (Os), el conducto de
Havers (CH) y la matriz extracelular (ME) con un acomodo concéntrico de láminas. H-E, 100x. b) Hueso esponjoso, se observaron osteocitos (Os) y la matriz extracelular con láminas paralelas (ME). H-E, 400x.
