Evaluación de la actividad antiviral de la Frenatina 2.3 S frente al virus del Dengue (DEN-2) usando docking molecular y otras herramientas
computacionales
Proyecto de tesis de pregrado por DANIEL FELIPE ABRIL ALFARO
Director de Tesis Gian Pietro Miscione, Ph.D
Computational Bio-Organic Chemistry Group Codirectora de Tesis
Helena Groot de Restrepo, M. Sc Directora de Laboratorio Genética Humana
Contenido
1. Resumen ... 4
2. Introducción ... 5
3. Objetivos ... 15
3.1. Objetivo general ... 15
3.2. Objetivos específicos ... 15
4. Métodos ... 16
4.1. Modelado de péptidos ... 16
4.2. Dinámicas moleculares ... 16
4.3. Clustering ... 18
4.4. Docking molecular ... 18
5. Metodología ... 21
5.1. Modelamiento estructuras terciarias de los péptidos ... 21
5.2. Dinámicas moleculares para minimizar las estructuras peptídicas ... 21
5.3. Clustering de estructuras minimizadas de los péptidos ... 22
5.4. Docking molecular de los sistemas péptido-glicoproteína E del DENV-2 ... 23
6. Resultados ... 25
6.1. Visualización estructura terciaria de péptidos y gráfica RMSF ... 25
6.1.1. Visualización de Frenatina 2.3S ... 25
6.1.2. Visualización de DN59: ... 26
6.1.3. Visualización de DET4: ... 27
6.1.4. Visualización 1OAN1: ... 28
6.2. Resultados Docking Proteína-Péptido ... 29
6.2.1. Docking 1OAN1/F 2.3S-Proteína E ... 29
6.2.2. Docking DET4/F 2.3S- Proteína E DENV-2 ... 33
6.2.3. Docking DN59/F 2.3S- Proteína E DENV-2 ... 35
7. Discusión ... 39
8. Conclusiones ... 45
Referencias ... 47
Tabla de figuras
Figura 1. Estructura y conformación de la Glicoproteína E - A. Secuencia de aminoácidos y sus respectivos dominios. B. Conformación dimérica de la proteína y proceso de fusión con endosoma celular. C.
Conformación de la proteína E pre-infección y su anclaje a la membrana viral. Tomado de: Su et al., (2020) ... 8 Figura 2. Metodología utilizada por el programa BioLuminate. Tomado de: Kozakov et at., (2017) ... 20
Figura 3. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para Frenatina 2.3S - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF ... 26
Figura 4. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF, RMSD para DN59 - A. Estructura terciaria
minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF C. Gráfica de RMSD ... 27
Figura 5. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para DET4 - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF ... 28
Figura 6. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para 1OAN1 - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF ... 29
Figura 7. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido 1OAN1 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 31
Figura 8. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido Frenatina 2.3S y
glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 32
Figura 9. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido DET4 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 34
Figura 10. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido F2.3S y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 35
Figura 11. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido DN59 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 37 Figura 12. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido F2.3S y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres ... 38
1. Resumen
El dengue es una enfermedad producida por el virus del Dengue, el cual, cuenta con cuatro serotipos y pertenece a la familia de virus Flaviviridae, la cual hace parte de los virus conocidos como Arbovirus. Este virus es transmitido por el mosquito Aedes aegypti y A. albopictus, y su distribución es global. Se estima que anualmente entre 280 a 520 millones de personas se infectan con este virus (OMS, 2020). El dengue hoy en día no cuenta con una vacuna o medicamento específico para su tratamiento, por lo tanto, es importante el estudio y la búsqueda de tratamientos que sean efectivos contra este virus dada su importancia a nivel de salud pública mundial. En este sentido, los péptidos antimicrobianos (AMP) han despertado interés dadas sus características de inhibir el crecimiento de microorganismos como bacterias, hongos y virus. En este trabajo se estudió el AMP Frenatina 2.3 S extraída de glándulas de la piel de la especie de anuro Sphaenorhynchus lacteus distribuida en la zona del Orinoco colombiano. La F 2.3S fue caracterizada y descrita por Camargo y colaboradoras (2018) y Benitez (2019) ha demostrado tener actividad antimicrobiana y antiviral. Sin embargo, no se conoce su mecanismo de acción e interacción con las células virales, por lo tanto, con este proyecto se espera dilucidar las interacciones del sistema compuesto de la F 2.3 S y la glicoproteína de envoltura E del serotipo DENV-2 haciendo un paralelo con péptidos bien estudiados como son el 1OAN1, DET4 y DN59, mediante el uso de herramientas y protocolos computacionales como docking molecular, dinámicas moleculares clásicas y clustering.
2. Introducción
El dengue es una enfermedad producida por el virus del Dengue, el cual provoca fiebre, dolor en las articulaciones y en los casos más avanzados Dengue hemorrágico, provocando incluso la muerte (OMS, 2020). El número de casos en el mundo ha aumentado en los últimos años con aproximadamente 280 a 520 millones cada año, de los cuales, entre 67 y 136 millones presentan síntomas y algunos de ellos cierto grado de gravedad. Se estima que unos 3900 millones de personas están en riesgo de contraer esta enfermedad (Mirza et al., 2018; OMS, 2020). Esta es una enfermedad que está ampliamente distribuida por todo el mundo, sin embargo, afecta principalmente a los países en zonas tropicales o subtropicales, como es el caso del continente americano, en 2015 la OMS notificó unos 2,3 millones de casos confirmados, 10.200 casos graves y 1181 fallecimientos (OMS, 2020). En Colombia para el año 2019 se reportaron 124.989 casos, 64.716 con signos de alarma y para la semana epidemiológica 23 de 2020 del Instituto Nacional de Salud (del 31 de mayo al 6 de junio de 2020) se han reportado 56.923 casos, de los cuales, 29.296 (51,5 %) presentaron signos de alarma y 604 (1,1%) de dengue grave o hemorrágico, presentándose en mayor medida en niños menores de 5 años, adultos mayores de 65 años, madres gestantes, poblaciones indígenas y afrocolombianas (INS, 2019; INS, 2020).
El virus del Dengue, el cual pertenece al género Flavivirus en la familia Flaviviridae, es transmitido por la picadura de las hembras del mosquito Aedes aegypti (Vector principal) y Aedes albopictus (Mirza et al., 2018; OMS, 2020). Esta enfermedad es causada por cuatro
serotipos de los virus conocidos como DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, los cuales comparten aproximadamente un 65% de identidad en sus genomas, compuestos por una única hebra de RNA, la cual codifica directamente para 10 proteínas (Mirza et al., 2016; Mirza et al.,
2018). Los cuatro serotipos se caracterizan por compartir el mismo nicho ecológico y geográfico, variando su incidencia dependiendo de la región (Mirza et al., 2018). Tres de las diez proteínas codificadas son estructurales: una que compone la capsula o proteína C, otra denominada proteína de envoltura o proteína E y la proteína M o proteína de membrana; siete proteínas son no estructurales: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5, las cuales tienen una función en la replicación y ensamblaje del virus (Mirza et al., 2018). La superficie de las partículas de un virus maduro está compuesta por 180 moléculas de glicoproteína de envoltura E y de la misma cantidad de proteínas de membrana M (Anasir et al., 2020).
El virus del Dengue así como otros Flavivirus tiene proteínas de fusión de membrana viral de clase II, es decir, presentan un reordenamiento de estas para posteriormente realizar una fusión mediada por endosomas (Yang et al., 2007). El ectodominio de la glicoproteína E realiza un reordenamiento a una forma de espina de pescado lo cual le permite la unión y fusión de la membrana del virus a la célula hospedera por endocitosis mediada por receptores y por disminución en el pH alrededor del endosoma (Chen et al., 1996). La glicoproteína E es entonces el principal mediador en la unión y entrada del virus del Dengue en las células, por lo tanto, se ha convertido en un objetivo para el desarrollo de nuevas moléculas o péptidos que tengan afinidad de unión alta por esta región y puedan devenir en posibles candidatos a tratamientos o vacunas efectivas. Es importante destacar que esta glicoproteína adopta dos conformaciones, las cuales son conocidas como dimérica y trimétrico, que corresponden a la estructura del virus en su etapa madura pre-infectiva y a la estructura del virus en la etapa inmadura o en el pH ácido del endosoma antes de entrar a la célula hospedera, respectivamente (Modis et al., 2003; Zhang et al., 2013).
Cada monómero de la proteína E se compone de tres dominios, dominio I (DI), dominio II (DII) y dominio III (DIII), y la parte del C-terminal compuesta por la parte stem y una región de anclaje a la membrana interna, ver Figura 1 (Costin et al., 2010; Zhang et al., 2013). El DI o dominio central está conformado por 8 láminas Beta, el DII es un dominio alargado con un bucle de fusión con tres aminoácidos muy conservados en toda la familia Flaviviridae (W101, L107 y F108), los cuales son muy importantes en la forma trimérica de la proteína para su inserción en la membrana del endosoma en el proceso de fusión, sin embargo, estos residuos están escondidos en la forma dimérica (Alhoot et al., 2013; Anasir et al., 2020; Modis et al., 2003). El dominio III es un dominio de inmunoglobulina responsable y mediador en el proceso de unión del virus al receptor, asimismo conecta los tres dominios con la región stem (Hung et al., 2004; Mazumder et al., 2007). Esta región stem es bastante conservada entre la familia Flaviviridae y tiene una forma de dos alfa hélices anfipáticas H1 y H2 conectadas por una región extendida bastante conservada, ubicadas justo debajo de la glicoproteína E e incrustada en la membrana lipídica del virus, por lo que lo hace bastante atractivo para el estudio de nuevos tratamientos antivirales que tengan una inhibición cruzada con otros virus de la misma familia (Anasir et al., 2020; Su et al., 2020). En seguida de la región stem se encuentra el C-terminal del dominio Transmembranal (TM). Este dominio comprende un par de alfa-hélices antiparalelas conocidas como TM1 y TM2, las cuales contribuyen a la estabilidad de la proteína E con la membrana viral y son importantes en el proceso de fusión con las células hospederas (Anasir et al., 2020; Zhang et al., 2013). Asimismo, el ectodominio cuenta con un bolsillo hidrofóbico compuesto por los aminoácidos V130, L135, F193, L198 y F279, los cuales son compartidos por los cuatro serotipos del virus del Dengue, además este bolsillo se encuentra cubierto a su vez por lo que se conoce como la horquilla kl (residuos 268-280) (Anasir et al., 2020; Modis et al., 2003). Se ha propuesto que el bolsillo hidrofóbico actúa como un punto de bisagra en el cambio conformacional que activa la fusión tras la reducción del pH (Anasir et
al., 2020; Hung et al., 2004). Es entonces este sitio un lugar atractivo que sirve como objetivo para diferentes medicamentos que pueden servir para neutralizar todos los serotipos del virus, ya que también cuenta con una tasa de mutación bastante baja (Anasir et al., 2020; Modis et al., 2003).
Figura 1. Estructura y conformación de la Glicoproteína E - A. Secuencia de aminoácidos y sus respectivos dominios. B.
Conformación dimérica de la proteína y proceso de fusión con endosoma celular. C. Conformación de la proteína E pre- infección y su anclaje a la membrana viral. Tomado de: Su et al., (2020)
Recientemente, ha incrementado el estudio de compuestos, moléculas o medicamentos que ayuden en la formulación de un tratamiento o vacuna efectiva contra el Dengue. Una de las moléculas que ha despertado interés en la comunidad científica han sido los Péptidos Antimicrobianos o AMP (por sus siglas en inglés), debido a su gran capacidad de atacar y destruir células microbianas como bacterias, hongos, parásitos y virus (Mihajlovic, M., &
Lazaridis, T., 2010; Moravej et al., 2018). Estos péptidos son de gran importancia biológica debido a que son moléculas presentes en plantas, anfibios, mamíferos o reptiles, son una de las primeras líneas de defensa que tienen los organismos contra los patógenos, son liberados por
glándulas especializadas en diferentes órganos del cuerpo como los ojos, estómago, intestino o la piel (Mihajlovic, M., & Lazaridis, T., 2010; Moravej et al., 2018; Vilas Boas et al., 2019).
Los AMP se caracterizan por ser moléculas pequeñas de entre 10 a 50 aminoácidos, los cuales atacan principalmente las proteínas estructurales o membranales de los organismos microbianos, por ejemplo, uniéndose a las proteínas de membrana, en el ADN o ARN provocando cambios conformacionales y de composición en las células, generalmente originando la formación de poros toroidales, promoviendo la apoptosis y evitando la replicación del material genético de las células del patógeno dentro del hospedero (Leontiadou et al., 2006; Sengupta et al., 2008; Mihajlovic, M., & Lazaridis, T., 2010; Vilas Boas et al., 2019).
Es bien conocido que la piel de los anfibios es un importante productor de AMP, sin embargo, aún no existen muchos reportes en la literatura sobre la actividad antiviral de estos péptidos (Groot et al., 2012; Muñoz-Camargo et al., 2018; Vilas Boas et al., 2019). Estas moléculas son producidas en glándulas dermales, principalmente en situaciones de estrés o peligro, son catiónicas, anfipáticas y con estructuras α-hélice, predominantemente (Leontiadou et al., 2006;
Muñoz-Camargo et al., 2018; Vilas Boas et al., 2019). Un ejemplo de esto, son las Magaininas 1 y 2 extraídas de la rana Xenopus laevis, de 23 residuos de aminoácidos cada una y que han demostrado efectividad en su actividad antiviral frente al virus del herpes (HSV, Herpes Simplex Virus) (Vilas Boas et al., 2019). Egal et al. (1999) sugieren que la carga catiónica y la
estructura anfipática de las Magaininas les podrían conferir la habilidad para interactuar con la membrana viral aniónica de fosfolípidos, en consecuencia, provocar un cambio conformacional en la célula viral ejerciendo así un impedimento para la replicación del virus. Camargo y colaboradores (2016, 2018) han caracterizado y descrito un nuevo AMP denominado Frenatina 2.3S (F 2.3S) conformada por 17 aminoácidos [GLVGTLLGHIGKAILGG] perteneciente a la
familia de AMP de las Frenatinas, con un radio hidrofóbico de 47%, encontrado en glándulas de la piel de la especie de anuro Sphaenorhynchus lacteus, conocida también como Rana Fantasma del Orinoco. Esta familia ha tenido gran atención por parte de la comunidad científica debido a que presenta gran similitud con algunos péptidos antimicrobianos de mamíferos que tienen funciones inmunomodelatorias y antitumorales. De acuerdo con los estudios realizados en 2016 y 2018 por Camargo y colaboradores, la F 2.3S tiene un alto potencial antimicrobiano contra bacterias Grampositivas y Gramnegativas y son capaces de proteger las células de la infección del virus de la fiebre amarilla, interactuando principalmente con las membranas de estos. Esto puede ser de gran utilidad para el desarrollo de nuevos tratamientos contra microorganismos que muestran resistencia o baja respuesta frente a los medicamentos ya existentes, como las bacterias y los virus (Groot et al., 2012; Muñoz-Camargo et al., 2016;
Muñoz-Camargo et al. 2018). Además, en el trabajo realizado por Benítez (2019) se demuestra el efecto antiviral de la F 2.3S frente a la infección de células Vero con el virus del Dengue-2 (DENV-2) con valores cercanos al 80% de protección, pero aún no se verifica a nivel molecular como es el mecanismo de acción ni el sitio de unión entre el virus y el péptido.
No obstante, en el pasado se han estudiado otros péptidos que buscan atacar la región de las proteínas estructurales que recubren la cápside de los virus como el Dengue, y que interfieren con el proceso de unión e infección viral (Costin et al., 2010; Hrobowski et al., 2005; Lok et al., 2012). Estos péptidos tienen un mecanismo de acción comparable a los péptidos antimicrobianos por lo que se tuvieron en cuenta en este estudio. Dichos péptidos han sido desarrollados a su vez para el tratamiento de infecciones virales como la causada por el VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana), para la cual se desarrolló el péptido T20, aprobado para su tratamiento, el cual mimetiza una parte de la región del C-terminal de la glicoproteína gp41 de dicho virus, impidiendo que el proceso de unión con las células hospederas se lleve a cabo
(Isa et al., 2019; Lok et al., 2012; Su et al., 2020). Para el desarrollo de este tipo de péptidos se tienen dos estrategias: cribado de alta resolución y generación de péptidos miméticos (Isa et al., 2019). La primera de ellas usa información estructural de las proteínas de envoltura, así como sus sitios de unión a receptores y realiza una búsqueda de péptidos generados aleatoriamente o por algún algoritmo (Isa et al., 2019). La segunda estrategia se concentra en el desarrollo de péptidos basados en las secuencias de determinadas regiones de las proteínas de envoltura, por ejemplo, del Dengue, que probablemente juegan un rol importante en los procesos de fusión, entrada o infección viral (Anasir et al., 2020; Isa et al., 2019).
Con respecto a la primera estrategia, el DIII y la región stem de la glicoproteína E del virus del Dengue han sido objeto de estudio por su principal rol en mediar la entrada y fijación de este a la célula hospedera (Isa et al., 2019). Este dominio tiene un bucle externo de diez residuos (380-IGVEPGQLKL-389, PBD:3J2P) los cuales son los encargados de la unión virus-receptor del endosoma bajo pH ácido (6,1-6,8) cuando ocurre la reorganización de la proteína E (Alhoot et al., 2013; Isa et al., 2019). Es por esto que se han desarrollado algunos péptidos que tienen como objetivo unirse en este bucle para poder inhibir la entrada a las células. Una de las moléculas desarrolladas basadas en esta secuencia es la DET4 de diez residuos, la cual se ha visto que es capaz de inhibir la entrada del DENV-2 hasta en un 84,6% en ensayos de formación de placas, RT-qPCR y Western Blot, con un IC50 contra el DENV-2 de 35uM (Alhoot et al., 2013). También, por microscopía electrónica de transmisión se pudo observar que este como otro compuesto nombrado DET2 son capaces de alterar estructuralmente la proteína de envoltura del DENV-2, lo cual genera que el virus no se una ni se fusione efectivamente con las células (Alhoot et al., 2013; Isa et al., 2019). Este péptido al igual que otros tres péptidos (DET1, DET2 y DET3) fue diseñado usando el algoritmo BioMoDroid calculando un índice de compatibilidad de carga y la suma total de hidrofobicidad del DIII, pero el DET4 es el que
demostró mayor afinidad de unión (-9,6 kcal/mol) y de inhibición (84,6%) del DENV-2 (Isa et al., 2019). Es por esto que el DET4 es utilizado como molécula estándar para el estudio de cálculos de energías de unión o de interacciones, para el estudio de mejoramiento o diseño de nuevos péptidos en el tratamiento contra el virus del Dengue cuando el objetivo es la glicoproteína E.
Por otro lado, tomando la segunda estrategia de diseño y construcción de péptidos antivirales que atacan las proteínas estructurales, el DN59 es un péptido mimético diseñado a partir de la región anfipática correspondiente a la región stem (residuos 412-444) de la membrana de envoltura E del serotipo DENV-2 (Hrobowski et al., 2005; Lok et al., 2012). Se ha demostrado que este péptido tiene un potencial inhibitorio para los cuatro serotipos de Dengue, así como de otros flavivirus (Hrobowski et al., 2005; Lok et al., 2012). Asimismo, mediante microscopía Crioelectrónica se comprobó que las cápsides de los virus incubados con el DN59 estaban vacías, lo cual puede estar relacionado también con la visualización de la formación de hoyos en la membrana de envoltura y glicoproteína E (Lok et al., 2012). También, se conoce que el DN59 interactúa fuertemente con vesículas lipídicas ocasionando una ruptura de membranas, sin embargo, no tiene una cualidad tóxica frente a células de insectos y mamíferos (Lok et al., 2012). El DN59 ha demostrado que es capaz de inhibir la infectividad en un 50% de los cuatro serotipos del Dengue en concentraciones de 2-5 uM en ensayos de infección FFU (Focus Forming Unit) en células epiteliales, y entre 20-30uM para otros flavivirus como la fiebre amarilla (20 uM) (Hrobowski et al., 2005; Lok et al., 2012). También, se conoce que este péptido actúa directamente sobre el virus provocando la liberación de su material genético y no sobre otro tipo de células o virus. Esto es consistente con que el DN59 es capaz de inducir la formación de agujeros en las membranas virales y en las proteínas de envoltura (Hrobowski et al., 2005). Asimismo, el DN59 no demostró tener efectos tóxicos sobre células de mamíferos
y mosquitos en concentraciones de hasta 50 uM, tampoco demostró tener efectos hemolíticos en eritrocitos en concentraciones de 100 uM, por lo tanto, no genera disrupciones en las membranas de las células del plasma de seres humanos (Hrobowski et al., 2005; Lok et al., 2012).
Así como el DN59 otros péptidos de este tipo han demostrado que son capaces de inhibir la infección del virus del Dengue provocando cambios conformacionales en las estructuras membranales de unión de estos. Por ejemplo, el péptido 1OAN1 que fue diseñado a partir de la secuencia de aminoácidos correspondientes a la posición 41-60 de la glicoproteína E del DENV-2, el cual demuestra una efectiva inhibición de este serotipo con un IC50 de 7uM y una inhibición máxima del 99% a una concentración de 50uM aproximadamente (Costin et al., 2010). Este péptido fue diseñado por Costin et al. (2010) a partir de la primera unión entre los dominios I y II que es una región lámina beta extendida, la cual juega un papel importante en la unión del virus a la célula, por lo que convierte a este péptido en un inhibidor de unión y de entrada a la célula hospedera (Anasir et al., 2020; Costin et al., 2010).
Es por esta razón, que en el presente trabajo mediante estudios computacionales de dinámicas moleculares, docking molecular y desarrollo de una estructura terciaria del péptido F 2.3S (ya que su estructura terciaria tridimensional no es conocida), se logró una aproximación en la interacción entre la F 2.3S y la célula del virus del Dengue-2, específicamente con la glicoproteína de envoltura E en su estructura dimérica pre-infectiva (PDB 3J2P Zhang et al., 2013), la cual juega un papel importante en la unión del virus a la célula. Asimismo, se hará una comparación con tres péptidos previamente estudiados que han demostrado alta eficiencia en inhibir la unión del virus impidiendo su entrada a las células hospederas o alterando las
estructuras externas de envoltura de las partículas virales, lo que los hizo atractivos para cotejar sus características con las que se encontraron de la F 2.3S; los péptidos a usar son el 1OAN1 (19 residuos), DET4 (10 residuos) y DN59 (33 residuos) (Alhoot et al., 2013; Costin et al., 2010; Hrobowski et al., 2005; Isa et al., 2019; Lok et al., 2012). En consecuencia, este estudio es de gran utilidad para dilucidar el mecanismo de acción que le confiere la actividad antiviral a la F 2.3S tomando como objeto de estudio la proteína de envoltura E del serotipo 2 del Dengue. Asimismo, promueve el avance y la profundización en el estudio y desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de enfermedades infecciosas de gran interés a nivel de salud pública, y que aún no cuentan con un tratamiento específico cien por ciento efectivo, como es el caso del virus del Dengue y otras enfermedades provocadas por virus de la familia Flavivirus. Además, profundizar en este tipo de estudios podría ayudar en el avance hacía la búsqueda de nuevos medicamentos que contribuyan a mejorar la calidad de vida de las personas que pueden estar en mayor riesgo de contraer esta enfermedad.
3. Objetivos
3.1. Objetivo general
Dilucidar el mecanismo de acción y la interacción entre el Péptido Antimicrobiano Frenatina 2.3S y la glicoproteína E del virus del Dengue-2 haciendo comparaciones con otros péptidos previamente estudiados y reportados en literatura, mediante el uso de herramientas computacionales.
3.2. Objetivos específicos
• Modelar una estructura terciaria tridimensional de la Frenatina 2.3 S, DN59, DET4 y 1OAN1 partiendo de su secuencia codificante realizando modelamiento proteico mediante herramientas computacionales.
• Obtener una estructura estable de los péptidos utilizados obtenidos por los servidores de modelamiento proteico realizando dinámicas moleculares clásicas.
• Visualizar y analizar las interacciones moleculares y mecanismos de unión entre la Frenatina 2.3 S y la glicoproteína E del serotipo DENV-2 realizando docking molecular.
• Visualizar, comparar y analizar las interacciones moleculares y mecanismos de unión entre los péptidos antivirales DET4, DN59 y 1OAN1 y la glicoproteína E del serotipo DEN-2 realizando docking molecular.
4. Métodos
4.1. Modelado de péptidos
Se modeló la estructura tridimensional de los péptidos usando herramientas computacionales como el servidor PEP-FOLD3, que utiliza parámetros de simulación y alineamiento para desarrollar estas estructuras. PEP-FOLD3 es un servidor con una aproximación de novo destinado a predecir estructuras peptídicas a partir de secuencias de aminoácidos. Es un método basado en letras SA del alfabeto estructural para describir las conformaciones de cuatro residuos consecutivos, acopla las series predichas de letras SA a un algoritmo y un campo de fuerza tipo coarse-grained (Lamiable et al., 2016).
4.2. Dinámicas moleculares
En la química computacional, las dinámicas moleculares son una técnica utilizada para simular a nivel computacional sistemas complejos. Una de las ventajas de este método es que permite el análisis del sistema a nivel atómico por lo que es posible hacer descripciones más detalladas de los mismos (Alder & Wainwright, 1959; Hollingsworth & Dror, 2018). Hoy en día, esta técnica es ampliamente utilizada para estudiar sistemas biológicos como proteínas lo que permite hacer inferencias sobre su estructura y función (Hollingsworth & Dror, 2018). En principio, con este método se busca reproducir las condiciones de un sistema en un modelo computacional para explorar sus movimientos físicos durante un periodo determinado de tiempo (Alder & Wainwright, 1959; Hollingsworth & Dror, 2018). Para determinar estos movimientos, se utilizan algoritmos de mecánica clásica donde se resuelve la ecuación de Newton (F = m*a) en un sistema de partículas que interactúan entre sí (Alder & Wainwright, 1959). Cada átomo dentro del sistema se asume como una partícula, y los enlaces entre estas
partículas se comportan como resortes en donde la distancia del enlace es igual a la distancia de equilibrio del resorte (Alder & Wainwright, 1959; Hollingsworth & Dror, 2018). Las fuerzas en una dinámica molecular se calculan haciendo uso de un modelo conocido como campo de fuerza de mecánica molecular, que se ajusta a los resultados de los cálculos de la mecánica cuántica y, por lo general, a ciertas mediciones experimentales (Hollingsworth & Dror, 2018).
Por ejemplo, un campo de fuerza típico incorpora términos que capturan interacciones electrostáticas entre átomos, términos similares a resortes que modelan la longitud preferida de cada enlace covalente y términos que capturan otros tipos de interacciones interatómicas (Hollingsworth & Dror, 2018). Estos campos de fuerza son inherentemente aproximados (Hollingsworth & Dror, 2018). Teniendo en cuenta estas asunciones, el campo de fuerza asociado a un sistema de partículas se puede describir en varios términos que representan los distintos tipos de interacciones entre las partículas (Alder & Wainwright, 1959; Hollingsworth
& Dror, 2018). Al resolver la ecuación de Newton podemos encontrar la aceleración de este sistema dada la fuerza (Alder & Wainwright, 1959; Hollingsworth & Dror, 2018). Al derivar la aceleración obtenemos la velocidad, y de esta forma podemos predecir el movimiento y la posición de las partículas de un sistema dado durante un periodo de tiempo (Alder &
Wainwright, 1959).
La aplicabilidad de este método se centra en la posibilidad de obtener información valiosa sobre un sistema. En el caso en donde el sistema corresponda a una proteína, se pueden analizar las interacciones del sitio activo de una proteína con moléculas pequeñas. En consecuencia, esta técnica es frecuentemente utilizada para el diseño de fármacos, en donde se busca encontrar una molécula cuya interacción con la proteína de interés sea lo suficientemente fuerte como para inhibir su función.
4.3. Clustering
Este procedimiento se realizó con el programa CPPTRAJ (Roe & Cheatham, 2013) que pertenece a su vez al software AMBER, el cual está diseñado para el procesamiento de trayectorias de coordenadas y otros archivos de datos. También, es capaz de unir todas las trayectorias creadas en la dinámica en una misma y así poder observar lo que ocurrió en el tiempo corrido en la dinámica. Es capaz de mostrar cómo se comportó la molécula en cada paso o cada residuo, lo cual lo hace mediante cálculos de RMSD (Root-Mean-Square-Deviation) y RMSF (Root-Mean-Square-Fluctuations)(Martinez, L., 2015). El RMSD es el promedio del desplazamiento de los átomos en un instante de la simulación con respecto a una estructura de referencia, la cual puede ser el primer instante de dicha simulación (Martinez, L., 2015). Por otra parte, el RMSF hace referencia a la medida del desplazamiento de un átomo o residuo en particular, relativo a una estructura de referencia como en el punto anterior, y promediado sobre el número total de átomos o residuos (Martinez, L., 2015). Entonces, el RMSD es útil para análisis de movimientos dependientes de tiempo, es decir, para observar si la estructura es estable a través de la simulación o si tiene cambios significativos. El RMSF no es dependiente del tiempo sino es relativo a la estructura evaluada.
4.4. Docking molecular
La aproximación del docking molecular puede ser usada como modelo de interacción entre una molécula pequeña, péptido y una proteína. Este procedimiento puede caracterizar o predecir el comportamiento de una molécula pequeña, péptido o proteina (ligando) en el sitio de unión (sitio activo) de una proteína de interés; lo cual es bastante importante ya que son procesos bioquímicos fundamentales que continuamente están ocurriendo en las células, tejidos,
organismos, etc. (Meng et al., 2011). El método de docking molecular abarca dos pasos básicos, los cuales son:
• Predecir la conformación correcta del ligando, tanto su posición como su orientación dentro de los sitios de unión.
• Evaluar la afinidad de enlace según un puntaje de energía atómica sencillo que permite separar aquellas conformaciones más probables de aquellas que no lo son. Una función de puntuación tiene en cuenta la energía libre de unión al ligando, también, incluye contribuciones de campo de fuerza (electrostática, Van der Waals) y términos que recompensan o penalizan las interacciones que se sabe influyen en la unión del ligando (Meng et al., 2011).
Para realizar los docking moleculares péptido-proteína se utilizó el algoritmo PIPER del software Schrödinger el cuál es especial para péptidos de más de 10 residuos y de dominios de proteínas grandes como la glicoproteína E del DENV-2 usada en este proyecto (Beard et al., 2013; Salam et al., 2014; Zhu et al., 2014). Este es ejecutado en la plataforma o interfaz gráfica del programa BioLuminate (Beard et al., 2013; Salam et al., 2014; Zhu et al., 2014) en donde se realizan los ensayos del docking rígido péptido-proteína con dicho algoritmo, el cual, consiste en permitir el movimiento de ciertos residuos en el sitio de unión de la proteína y restringir su esqueleto peptídico o backbone, siendo esto un acercamiento a lo que ocurre naturalmente (Friesner et al., 2004). El algoritmo de PIPER está diseñado para realizar docking rígido entre proteína-proteína, el cuál selecciona las poses más significativas en función de la cantidad de estructuras parecidas que pueblan un mismo clúster, es decir, entre más poblado esté un clúster mejor será la pose representada (Kozakov et al., 2017). El programa muestra los resultados en orden desde los clústeres más poblados hasta los que tienen menos conformaciones por grupo, sin importar la energía libre de unión. Por lo tanto, este es un programa que se basa en la población de los clústeres más no en un valor de energía. Sin
embargo, regiones de baja energía tienden a generar grandes grupos de estructuras acopladas, y el tamaño de un grupo es aproximadamente proporcional a su probabilidad, y así la variable energética determina indirectamente la conformación más probable del complejo (Kozakov et al., 2017). Este algoritmo emplea una aproximación FFT (Fast Fourier Transform), el cual permite evaluar una gran cantidad de poses o conformaciones en un tiempo reducido (Bhachoo
& Beuming, 2017; Kozakov et al., 2017). Luego, cuando las poses relativas son generadas estas son calificadas según un puntaje de energía atómica sencillo que permite separar aquellas conformaciones más probables de aquellas que no lo son. Después, estas poses son utilizadas para desarrollar el siguiente paso, que consiste en rotar un número determinado de veces el ligando (para este proyecto se utilizaron 70,000) alrededor del receptor, y cada una de las conformaciones que adopte el ligando son traducidas para encontrar el mejor puntaje de acoplamiento con el receptor (Bhachoo & Beuming, 2017). Las mejores 1000 rotaciones se agrupan utilizando la distancia RMS entre los átomos que coinciden en cada par de estructuras rotadas. La estructura que se toma de cada clúster es la que tiene más conformaciones vecinas en dicho clúster (Bhachoo & Beuming, 2017). Una vez realizado el docking, se realiza un refinamiento de forma predeterminada en las cadenas laterales de residuos dentro de los 5 Å de la interfaz, esto con el fin de minimizar los choques y optimizar las interacciones (Bhachoo
& Beuming, 2017; Kozakov et al., 2017). Este proceso se ilustra en la Figura 2
Figura 2. Metodología utilizada por el programa BioLuminate. Tomado de: Kozakov et at., (2017)
5. Metodología
5.1. Modelamiento estructuras terciarias de los péptidos
Con la secuencia codificante del péptido F 2.3S caracterizada por Camargo y colaboradoras (2016, 2018), y las de los péptidos DN59, 1OAN1 y DET4 (Alhoot et al., 2013; Costin et al., 2010; Hrobowski et al., 2005; Isa et al., 2019; Lok et al., 2012) se modeló la estructura tridimensional de los péptidos usando el servidor PEP-FOLD3. De las estructuras obtenidas de cada péptido se utilizó la estructura mejor punteada con respecto a los puntajes y criterios del servidor, además de aquellas conformaciones más acordes a las ya reportadas en literatura.
Realizar este tipo de procedimientos es necesario ya que ninguno de estos péptidos cuenta con una estructura cristalizada previamente.
5.2. Dinámicas moleculares para minimizar las estructuras peptídicas
Mediante dinámicas moleculares clásicas con el software AMBER (Case et al., 2018) se realizó una minimización de las estructuras obtenidas de cada uno de los péptidos en el servidor de modelamiento. Con ello se buscó evaluar, analizar y estudiar las conformaciones que le otorguen mayor estabilidad a dichas estructuras, así poder utilizarlas en los posteriores ensayos de docking molecular.
Antes de realizar las dinámicas moleculares se utilizó el servidor PDB2PQR (Dolinsky et al., 2004) el cual analiza la protonación y cambia las cargas de residuos como las Histidinas de acuerdo al pH en el que está envuelto la proteína o el péptido. Para el caso de los péptidos a
utilizar se realizó este cálculo a un pH neutro de 7.35 que es aproximadamente el que se encuentra en el medio extracelular donde sucedería la reacción entre cada péptido y la proteína de envoltura E en su forma dimérica. Posteriormente, para realizar las minimizaciones de cada uno de los péptidos (DET4, 1OAN1, DN59 y F 2.3S) se siguió el siguiente protocolo de dinámicas para un tiempo total de 50 ns:
• Minimización del solvente
• Dinámica molecular del solvente
• Minimización del solvente
• Minimización congelando el Backbone (átomos pesados)
• Minimización del sistema completo
• Dinámica molecular NVT 100K
• Dinámica molecular NPT 100K
• Dinámica molecular NPT 200K
• Dinámica molecular NPT 300K
• Equilibración
• Dinámica molecular a 310.15 K, ya que esta es la temperatura promedio corporal de un ser humano, y a la cual los péptidos serían sometidos en una eventual prueba experimental para validar su capacidad inhibitoria viral.
5.3. Clustering de estructuras minimizadas de los péptidos
Con la estructura terciaria modelada previamente de cada uno de los péptidos se pretende realizar el procedimiento de clustering después de la estabilización realizada por dinámicas
moleculares clásicas, el cual permite agrupar aquellas conformaciones más probables y estables que adoptará cada péptido, las cuales son diferentes para cada uno.
En este proyecto se tendrá en cuenta en mayor medida el RMSF, ya que al ser péptidos nos interesa evaluar más como fluctúa la estructura en sus diferentes partes y no en el tiempo, ya que por su tamaño y dependiendo sus residuos pueden llegar a tener diferentes fluctuaciones en el tiempo. Además, como estos serán los ligandos que queremos evaluar, no nos interesa que tome una estructura estable en el tiempo sino saber cuáles son los residuos que más movilidad tienen y posiblemente roles más importantes en el momento de unirse a la proteína.
Asimismo, como se mencionó anteriormente CPPTRAJ es capaz de reunir las trayectorias en una misma y agruparlas en grupos o clúster de acuerdo con la conformación que adoptaron a lo largo de la dinámica. Entonces, agrupa aquellas conformaciones que se asemejan más y que mantienen dicha estructura en el mayor tiempo posible. Luego de hacer esto se escoge aquella estructura o clúster que sea más significativo para la simulación y es esta la que se utilizará para los posteriores ensayos de docking molecular.
5.4. Docking molecular de los sistemas péptido-glicoproteína E del DENV-2
Para estos péptidos que tienen un interés terapéutico este procedimiento es de gran ayuda ya que permite acoplar dicha estructura a la proteína madura del virus y con ello predecir o estimar los lugares más probables en donde se unirá el péptido, según las restricciones impuestas o donde el software encuentre la mejor posición teniendo en cuenta la rotación del ligando alrededor de la proteína receptora. Para ello, con la estructura terciaria modelada previamente
de cada uno de los péptidos se pretende realizar el procedimiento de docking molecular entre cada péptido (F2.3S, 1OAN1, DET4 y DN59) y la proteína de envoltura E (PBDID: 3J2P) de DENV-2 en su forma madura dimérica. Se tomó la estructura de la glicoproteína E madura como receptor y cada uno de los péptidos como ligandos. Luego, se impuso una restricción de atracción en cada uno de los cálculos. Esta restricción consiste en proporcionar un término de atracción adicional al potencial, seguido de una magnitud de dicha restricción nombrada como bonus, la cual incrementa o disminuye la intensidad en un rango que va de 0.11-0.99, siendo 0.11 la intensidad más baja y 0.99 la más alta. Para cada docking realizado se impuso una restricción de atracción con un bonus de 0.81 hacía el receptor (glicoproteína E) y la secuencia de interés como se ilustra en la Tabla 1, sometiendo a la F 2.3S a las mismas restricciones de cada uno de los péptidos. Es importante aclarar que las restricciones no garantizan que un residuo participe o no en la unión; más bien modifican la función potencial para facilitar o dificultar la unión a un respectivo residuo o secuencia de residuos.
Tabla 1. Ubicaciones de unión de péptidos a proteína E de DENV-2
Restricción
Docking Target Tipo Bonus Secuencia
objetivo Región
DET4-
Proteína E Receptor Atracción 0.81 380-389 DIII
F2.3S-Proteína E
Receptor
Atracción 0.81
380-389 DIII
1OAN1- Proteína E
Receptor Atracción 0.81
41-60 DI- DII
F2.3S-Proteína E
Receptor Atracción 0.81
41-60 DI- DII
DN59- Proteína E
Receptor Atracción 0.81
394-450 Stem
F2.3S-Proteína E
Receptor Atracción 0.81
394-450 Stem
6. Resultados
6.1. Visualización estructura terciaria de péptidos y gráfica RMSF
Se realizó el análisis y las gráficas moleculares con el visualizador UCSF Chimera desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics en la Universidad de California, San Francisco (Pettersen et al., 2004).
6.1.1. Visualización de Frenatina 2.3S
Se pudo observar que la estructura con mejor puntaje en el servidor de modelamiento, luego de hacer la estabilización correspondiente mediante dinámicas moleculares clásicas y el posterior procedimiento de clustering, la estructura de la F 2.3S corresponde a una α -hélice en la gran mayoría de su estructura (residuos 1-14), lo cual concuerda con lo encontrado previamente por Camargo y colaboradoras (2016, 2018). Por otra parte, la gráfica de RMSF obtenida demuestra qué tanto se mueven los residuos en Ångström durante la dinámica. De ella se puede deducir que los residuos o las partes que más movimiento tienen son los extremos del péptido, mientras la parte central es más bien estable debido posiblemente a su conformación estable de α-hélice (Figura 3-A).
A. B.
Figura 3. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para Frenatina 2.3S - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF
6.1.2. Visualización de DN59:
En la Figura 4-A se ilustra la conformación resultante de la minimización realizada con dinámicas moleculares, y según el clustering hecho ésta es la conformación que el péptido tiene en la mayor parte de la dinámica, por lo tanto, podría decirse que es las más probable de encontrar en determinado intervalo de tiempo. Además, de acuerdo con la gráfica de RMSD (Figura 4-C) esta conformación es una de las más estables a través de la dinámica, ya que alcanzó la estabilidad muy pronto y se mantuvo así durante la gran mayoría de los pasos o frames y según el clustering esta era la que se encontraba en mayor proporción. También, según
la gráfica de RMSF (Figura 4-B) se pudo demostrar que la parte del péptido que menos tenía oscilaciones era la correspondiente a la conformación de α-hélice que concierne a los residuos 14-29, esto debido a que esta zona es la más estable por el tipo de estructura que adopta. Siendo las zonas que no corresponden a la α-hélice las que más rango de movimiento tienen.
A.
B. C.
Figura 4. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF, RMSD para DN59 - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF C. Gráfica de RMSD
6.1.3. Visualización de DET4:
En la Figura 5-A se observa la conformación que adopta la estructura del péptido DET4 luego de la minimización y de seleccionar el clúster con la estructura más probable de encontrar. Su estructura es principalmente dos láminas-Beta unidas, esta conformación coincide con la reportada por Isa et al., (2019). En la gráfica de RSMF (Figura 5-B) se puede observar que aquellos residuos que tienen mayor movimiento son los tres primeros, sin embargo, toda la molécula no presenta mayores oscilaciones.
A. B.
Figura 5. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para DET4 - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF
6.1.4. Visualización 1OAN1:
En la Figura 6-A se puede visualizar que el péptido 1OAN1 tiene como estructura terciaria principal dos α-hélices unidas por una región extendida de aminoácidos. Las α-hélices van desde los residuos 2-9 y 13-19. Asimismo, en la gráfica de RMSF (Figura 6-B) se observa que casi todo el péptido oscila bastante siendo las α-hélices las que más lo hacen, probablemente debido a que se encuentran unidas por una estructura no muy bien definida, por lo tanto, permite que haya un movimiento casi que independiente de las dos estructuras de α -hélice lo cual puede tener ciertas implicaciones al momento de interactuar con otras proteínas. Asimismo, se puede observar que las estructuras tanto del 1OAN1 como del DN9 y la F 2.3S comparten en su estructura principal la conformación de α-hélice.
A. B.
Figura 6. Visualización estructura terciaria y gráfica de RMSF para 1OAN1 - A. Estructura terciaria minimizada por dinámicas moleculares B. Gráfica de RMSF
6.2. Resultados Docking Proteína-Péptido
Para realizar este procedimiento se utilizó el programa Bioluminate donde se corrió el programa Docking Protein-Protein que usa el algoritmo PIPER. Se hizo docking rígido entre la cadena A de la proteína E del DENV-2 y los péptidos 1OAN1, DET4, DN59 y el péptido antimicrobiano de interés F 2.3S. En cada uno de los cálculos se utilizó como proteína receptora la glicoproteína E del DENV-2 (PDB: 3J2P; Zhang et al., 2013), y como ligando cada uno de los péptidos. Se expondrán aquellas estructuras o poses más significativas con energías de unión más bajas y clústeres más poblados.
6.2.1. Docking 1OAN1/F 2.3S-Proteína E
Para el docking entre el péptido 1OAN1 se encontraron 15 poses distintas con diferentes puntajes de docking y sitios de unión. Los dockings con el péptido 1OAN1 se realizaron con una restricción de atracción (bonus: 0,81) hacía los residuos de los cuales este procede (aa 41- 60), sin embargo, como se puede observar en cada una de las poses más significativas el péptido
se ensambló en otra parte de la glicoproteína (Figura 7). Además, en ninguna de las otras poses se unió cerca a dicha región. Asimismo, se puede observar que en las tres poses el péptido se encuentra interactuando con los residuos pertenecientes a la región stem de la proteína como la G450 o G433, y a algunos del DII como la H209 y T265 (horquilla kl). También, siendo estas las poses más representativas implican que tengan los niveles de energía más bajos, sin embargo, la pose con el clúster más poblado es la que mayor energía libre tiene y la que menos energía tiene es la del clúster menos poblado, entre las poses más representativas presentadas.
A.
B.
C.
Figura 7. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido 1OAN1 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
Por otra parte, para el docking entre la F 2.3S y la proteína E se encontraron un total de 14 poses con la misma restricción de atracción que en el realizado con el 10AN1, con el mismo potencial y los mismos residuos como objetivos (aa 41-60). Sin embargo, se encontró que ninguna de las poses encontradas correspondía a esta región, por el contrario, se encontraron en otra región muy diferente. La pose más representativa de todo el cálculo tuvo un clúster de 227 conformaciones y una energía libre de –853.943 kcal/mol y se encontró en la región entre el DII y la región stem y transmembranal de la glicoproteína (Figura 8-A). De igual modo ocurrió con la segunda pose más representativa, la cual tiene más interacción con las dos α- hélices de la región stem además del DII (Figura 8-B). Esta pose tiene una energía libre calculada más baja (-900.496 kcal/mol) pero cuenta con una población más pequeña en su respectivo clúster. Por otra parte, la última pose más representativa expuesta es la que menor energía libre tiene, pero la que menos conformaciones tiene en el clúster, sin embargo, las interacciones que esta pose representa son muy similares a las dos anteriores dado que se encuentra muy cercana a la región stem y a la región transmembranal conformadas principalmente por α-hélices (Figura 8-C). Teniendo en cuenta lo anterior se pudo observar que tanto el péptido 1OAN1 como la F 2.3S se unen en otro lugar de la glicoproteína E a pesar de
imponer las restricciones descritas anteriormente, uniéndose prácticamente en la misma zona entre el DII y la región stem.
A.
B.
C.
Figura 8. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido Frenatina 2.3S y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
6.2.2. Docking DET4/F 2.3S- Proteína E DENV-2
Para los cálculos de docking entre el péptido DET4 y la proteína E del DENV-2 se encontraron un total de 9 poses, con una restricción de atracción (bonus: 8.1) hacía la zona del bucle del DIII que comprende los residuos 380-389 kcal/mol, donde se conoce por trabajos realizados por Isa et al., (2019) que es allí en dónde este péptido se acopla. Sin embargo, la pose que mayor tamaño de clúster tuvo (428) se unió en la región stem y transmembranal, además, fue aquella que tuvo una energía libre menor (-620.217 kcal/mol) (Figura 9-A). Las siguientes poses más representativas y las únicas que se encontraron en la región determinada fueron la número 2 y la número 3 con un tamaño de clúster de 286 y 108, respectivamente (Figura 9- B,C). Asimismo, contaron con una energía libre muy similar de –584.042 kcal/mol para la pose 2 y –579.327 kcal/mol para la pose 3, por lo que se pudo comprobar que en este lugar es probable que el péptido sea capaz de unirse, y, en consecuencia, de interactuar con la proteína de la forma descrita por Isa et al., (2019).
A.
B.
C.
Figura 9. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido DET4 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
Luego de correr los docking de la F 2.3S contra la proteína E con las restricciones de atracción descritas para el péptido DET4, se encontraron un total de 14 poses, de las cuáles las más significativas eran bastante similares en cuanto a posición, tamaño de los clústeres y energías libres a las encontradas de la F 2.3S con las restricciones del péptido 1OAN1. La energía libre de la pose 1 fue de 853.943, la de la pose número 2 fue de –900.496 kcal/mol y la de la pose 3 fue de –902.885 kcal/mol (Figura 10), las cuales coinciden totalmente con las encontradas en el cálculo de la F 2.3S con las restricciones del péptido 1OAN1 (Tabla 1). Sin embargo, existe una diferencia en el tamaño del clúster 1 el cuál fue de 229 y en el anterior fue de 227, pero para los clústeres 2 y 3 fueron iguales de 199 y 136, respectivamente. Por lo tanto, se puede afirmar que a pesar de las restricciones impuestas el péptido F 2.3S tenderá a unirse a la región entre el DII y la región stem y TM de la proteína E. Teniendo en cuenta lo anterior se pudo observar que tanto el DET4 como la F 2.3S prefieren unirse en la zona comprendida entre el DII y la región stem y TM de la glicoproteína E a pesar de las restricciones impuestas, por lo que estos lugares se convierten en lugares probables en las interacciones entre estos péptidos y la proteína estructural del DENV-2.
A.
B.
C.
Figura 10. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido F2.3S y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
6.2.3. Docking DN59/F 2.3S- Proteína E DENV-2
Para el docking realizado entre el péptido DN59 y la proteína E del DENV-2 se encontraron un total de 25 poses, lo cual lo convierte en el péptido con el mayor número de conformaciones
encontradas. Asimismo, este péptido tiene los valores de energía libre más bajos de todos a través de cada uno de los clústeres, donde el más alto es de –1337.532 kcal/mol. Sin embargo, es importante recordar que, aunque se muestran los valores de energía la selección del modelo se basa en el tamaño del clúster en lugar de por energía, a pesar de ello, sigue siendo un valor importante ya que los valores bajos de energía también están asociados a generar clústeres más grandes de las estructuras ensambladas. Este docking se realizó con una restricción de atracción (bonus: 8.1) a la zona de la región stem y TM ya que según Lok et al., (2012) es allí en dónde el péptido desarrolla su mecanismo de acción y tiene mayor incidencia teniendo en cuenta que fue diseñado a partir de la secuencia de aminoácidos 412-444 pertenecientes a la región stem de la proteína E. De acuerdo con lo anterior, la pose con un clúster de mayor tamaño (203) tuvo una energía libre de –1428.616 kcal/mol y se encontró interactuando en la región stem y TM (Figura 11-A). La siguiente pose más significativa tuvo un tamaño de clúster de 86 y una energía libre de –1372.070 kcal/mol encontrándose, también, interactuando entre las regiones stem y TM (Figura 11-B). Por otra parte, la pose con el valor más bajo de energía libre (-
1630.201 kcal/mol) y un tamaño de clúster de 63 conformaciones, se ubicó en la zona entre el dominio II y las regiones stem y TM ejerciendo una interacción con estas, acercándose más a las dos primeras (Figura 11-C).
A.
B.
C.
Figura 11. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido DN59 y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
Para este procedimiento entre la F 2.3S y la glicoproteína E se utilizó la misma restricción de atracción (bonus: 8.1) hacía la región stem y TM que la del DN59, se encontraron un total de 11 poses significativas. La pose con el clúster más grande obtuvo 452 conformaciones y una energía libre de –1116.290 kcal/mol, encontrándose entre las dos α-hélices de la región stem (Figura 12-A). La siguiente pose obtuvo un tamaño de clúster de 201 y una energía libre de – 1108.072 kcal/mol ejerciendo una interacción entre la región stem y la región TM (Figura 12- B). Por último, la pose con la menor energía libre fue que fue de –1263.874 kcal/mol y un tamaño de clúster de 176 conformaciones, la cual se encontró entre las dos α-hélices de la región stem y el DII (Figura 12-C). Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto se pudo demostrar que el DN59 se unió en el lugar impuesto por las restricciones y por lo tanto en el
lugar esperado. Además, la F 2.3S también se unió en esta misma zona teniendo sus mejores energías de unión lo que implicaría que es allí en donde posiblemente este péptido se acoplaría, es decir, entre la región stem y TM de la glicoproteína E del DENV-2.
A.
B.
C.
Figura 12. Estructuras con mayor representación obtenidas del docking entre péptido F2.3S y glicoproteína E – A. Pose más representativa B. Pose Dos C. Pose Tres
7. Discusión
Se logró desarrollar mediante servidores de modelado de proteínas las estructuras terciarias de los péptidos 1OAN1, DET4, DN59 y F 2.3S. Se pudo observar que tanto el péptido 1OAN1 como el DN59 y la F 2.3S están estructurados principalmente por α-hélices, lo cual concuerda con lo encontrado en estudios previos (Costin et al., 2010; Lok et al., 2012; Muñoz-Camargo et al., 2016, 2018). Además, es importante haber obtenido estas estructuras ya que no habían sido reportadas anteriormente. Por otra parte, el péptido DET4 es el único de los cuatro que no tiene estructuras de α-hélice, ya que su estructura es principalmente dos láminas-beta plegadas, cuya estructura coincide por la reportada anteriormente por Isa et al. (2019). Asimismo, mediante el desarrollo de dinámicas moleculares clásicas se logró hacer una minimización de las estructuras de los péptidos modelados y, posteriormente, con la técnica de clustering se logró observar aquellas estructuras con sus conformaciones más probables. El uso de estas dos técnicas permite tener una aproximación más cercana a la realidad de cómo se pueden encontrar los péptidos, ya que se realizan simulaciones durante un periodo de tiempo (50 ns en este caso) a condiciones específicas para que esta adopte las conformaciones más probables y de menor energía libre. Con esto se obtuvo que los péptidos que tenían estructuras de α-hélices no tenían tanto movimiento en las regiones donde ésta estructura estaba presente, seguramente porque son estructuras estabilizadas por enlaces de hidrógeno que no permiten que los residuos se muevan con libertad. Sin embargo, en el péptido 1OAN1 el cual está conformado por dos α- hélices unidas por una sección de aminoácidos extendida, fueron estas las que mayor movimiento tuvieron, probablemente debido a que la región extendida no es rígida y permite un movimiento libre de las dos estructuras secundarias. Por otra parte, el DET4 es un péptido que no presentó mayores oscilaciones entre sus residuos dado que como se mencionó
anteriormente tiene una estructura de dos láminas-beta plegadas, las cuales son estructuras secundarias que se estabilizan entre sí.
Con la minimización de las estructuras terciarias de los péptidos se realizó el procedimiento de docking molecular entre cada uno de los péptidos y la glicoproteína E del DENV-2, esto con
el fin de tener una aproximación de las interacciones intermoleculares entre cada una de las estructuras. En el docking realizado entre el péptido 1OAN1 y la proteína E se encontró que a pesar de que se impuso una restricción de atracción este no se unió en dicha región, sino predominantemente en la región stem y TM. De este péptido no existen aún estudios computacionales de docking o dinámicas moleculares, por lo tanto, esta es una aproximación importante para conocer con qué lugares específicos de la glicoproteína interactúa. Entonces, estos resultados pueden ser una primera aproximación para deducir que el péptido 1OAN1 no interactúa específicamente con la región a la cual imita (aa 41-60, DI-DII) sino con otra región de la glicoproteína como lo es la región terminal del Dominio II y la región stem y TM. Por otra parte, en el docking entre el DET4 y la glicoproteína se encontraron dos poses significativas en donde se esperaba que ocurriera dicha unión, allí el péptido estaba interactuando con la región conocida como el loop FG compuesta por dos láminas-beta (F-G) presentes en la región restringida (aa 380-389), con una energía muy baja y clústeres con un tamaño considerablemente alto, lo cual concuerda con el trabajo realizado por Isa et al. (2019).
Sin embargo, la pose con la energía más baja y clúster más poblado corresponde a la conformación en donde el péptido se encuentra en otro lugar diferente al lugar específico de unión, el cual es en la región stem y TM. Asimismo, las otras poses con clústeres menos poblados se encontraban en esta última zona, por lo tanto, se recomienda que mediante dinámicas moleculares y otros análisis informáticos estudiar esta región como un posible lugar adicional de unión del DET4 diferente al bucle del Dominio III (aa 380-389), ya que en el
estudio realizado por Isa et al. (2019) solo tuvieron en cuenta esta región, y la región stem y TM parecen ser lugares estables para la interacción entre este péptido y la glicoproteína.
También, es importante destacar que las energías libres obtenidas en este ensayo fueron las más altas de todas, alrededor de –500.00, lo cual quiere decir que las poses no son las más estables de todos los ensayos realizados, por lo tanto, es necesario profundizar en los ensayos y tener en cuenta otras regiones como las acá presentadas para cerciorarse de que las poses reportadas previamente son las más estables y acordes a lo que sucede a nivel molecular.
Por otra parte, al realizar los dockings entre la F 2.3S con las mismas restricciones impuestas para los péptidos DET4 y 1OAN1 se pudo determinar que la F 2.3S no se unió en los lugares determinados para dicha unión (Tabla 1) según los datos obtenidos por Isa et al., (2019) y Costin et al., (2010), respectivamente. Al igual que el 1OAN1 la F 2.3S se acopló principalmente en la región comprendida entre el Dominio II y las regiones stem y TM de la glicoproteína. Adicionalmente, tanto los resultados obtenidos con la restricción de atracción del 1OAN1 como la del DET4 fueron muy similares, ya que se obtuvieron la misma cantidad de poses (14), las poses correspondían a los mismos lugares de unión, las energías libres de cada clúster eran idénticas a los del otro tratamiento y los tamaños poblacionales de los clústeres era muy similar y en la mayoría de los casos igual. Esto probablemente se debe a que a pesar de los condicionamientos la F 2.3S no tiene afinidad por ninguna de las regiones a las cuales la restricción afectaba (Tabla 1), por lo tanto, el algoritmo al no encontrar poses estables en dichas zonas busca en otros lugares en donde el ligando tuviese más estabilidad, siendo estas entre el DII y la región stem y TM de la proteína E.
Adicionalmente, se realizó el docking con el péptido DN59 y la glicoproteína E encontrándose las poses con menor energía libre de todos los tratamientos, la menor de todos de –1630.201 kcal/mol correspondiente a la Figura 11-C. A pesar de que el programa utilizado no arroja los resultados de acuerdo a la energía libre, aquellas poses con la menor energía tenderán a hacer clústeres más densamente poblados. Es por esto que podemos afirmar que los resultados obtenidos del docking entre el péptido DN59 y la proteína E corresponden a los que tienen mayor estabilidad. Las restricciones impuestas para este procedimiento validan lo encontrado por Lok et al. (2012), que afirma que este péptido interactúa directamente con la región stem y la TM. Este es un péptido que fue diseñado a partir de la secuencia de aminoácidos 412-444 de la región stem por lo que se esperaba que interactuara directamente en esta zona, lo cual nuestros resultados lo comprueban; a diferencia de, por ejemplo, el 1OAN1 que no ejerció ningún tipo de interacción con la región a la cual este imita o mimetiza.
Por último, al realizar el docking entre la F 2.3S y el ectodominio de la glicoproteína E con las mismas restricciones impuestas para el DN59 se encontró que las poses allí reveladas son las que menor energía tienen para la F 2.3S, en comparación con los dockings realizados con las delimitaciones de los péptidos DET4 y 1OAN1. Esto quiere decir que cuando se le impuso la restricción de atracción dirigida a la región stem (Tabla 1), la F 2.3S tuvo mayor afinidad por este sitio que por las impuestas en los otros ensayos. Por ejemplo, la pose más representativa con un tamaño poblacional del clúster de 452 conformaciones y una energía libre de –1116.290 kcal/mol se encontró interactuando directamente con la región stem así como las conformaciones encontradas del péptido DN59 (Figura 12-A). Según estos resultados la F 2.3S cuando tiene contacto con el DENV-2 entraría a ejercer una influencia directa con la región stem de la glicoproteína, de manera similar a como lo haría el péptido DN59. Lok et al. (2012) descubrieron que el DN59 se acoplaba a la glicoproteína E cuando esta se encontraba en su
