PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-AA-167-SCFI-2012

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SECRETARÍA DE ECONOMÍA

PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-AA-167-SCFI-2012

ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACION DE ENTEROCOCOS FECALES EN AGUAS NATURALES Y

MARINAS.

WATER ANALYSIS - DETERMINATION OF FECAL

ENTEROCOCCI IN NATURAL AND MARINE WATERS

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ECONOMÍA

P R E F A C I O

En la elaboración del presente proyecto de norma mexicana participaron las siguientes empresas e instituciones:

- ANÁLISIS DE AGUA, S.A. DE C.V.

- ARVA, LABORATORIO DE ANÁLISIS INDUSTRIALES, S.A. DE C.V.

- ATLATEC, S.A. DE C.V.

- CENICA

- CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO TECNOLÓGICO EN ELECTROQUÍMICA, S.C.

- CENTRO NACIONAL DE METROLOGÍA - CIATEC, A. C.

- COMISIÓN DEL AGUA DEL ESTADO DE MÉXICO - COMISIÓN NACIONAL DEL AGUA.

- CONTROL QUÍMICO NOVAMANN INTERNACIONAL, S.A. DE C.V.

- ECCACIV, S. A. DE C. V.

- ENTIDAD MEXICANA DE ACREDITACIÓN, A.C.

 EVALUACIÓN Y ANÁLISIS AMBIENTAL, S. A. DE C. V.

- FASIQ INTERNACIONAL, S.A. DE C.V.

- GRUPO ECOTEC, S.A. DE C.V.

- HACH COMPANY

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- INDEX-LAB

- INSTITUTO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE TAMAULIPAS, A.C.

Centro de Investigación y Tecnología en Saneamiento Ambiental (CITSA)

- INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGÍA DEL AGUA - INSTITUTO MEXICANO DEL PETRÓLEO

- INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

- LABORATORIO DE CALIDAD QUÍMICA VERACRUZANA, S.C.

- LABORATORIO DE QUÍMICA DEL MEDIO E INDUSTRIAL, S.A. DE C.V.

- LABORATORIO DE SERVICIOS CLÍNICOS Y ANÁLISIS

TOXICOLÓGICOS S.A. DE C.V.

- LABORATORIO FERMI, S.A. DE C.V.

- LABORATORIO IDECA, S.A. DE C.V.

- LABORATORIO SERVICIOS AMBIENTALES

- LABORATORIOS ABC QUÍMICA, INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS, S.A.

DE C.V

- MERCURY LAB, S.A. DE C.V.

- MÓNICA OROZCO MÁRQUEZ

- PEMEX PETROQUÍMICA COMPLEJO PETROQUÍMICO CANGREJERA - PEMEX PETROQUÍMICA COMPLEJO PETROQUÍMICO MORELOS - PERKIN ELMER DE MEXICO, S.A.

- PROTECCIÓN AMBIENTAL Y ECOLOGÍA, S.A. DE C.V.

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- PROYECTOS Y ESTUDIOS SOBRE CONTAMINACIÓN INDUSTRIAL, S.A. DE C.V.

- SERVICIOS DE AGUA Y DRENAJE DE MONTERREY, I.P.D.

Laboratorio Central de Calidad de Aguas

- SISTEMA DE AGUAS DE LA CIUDAD DE MÉXICO DEL GOBIERNO DEL DISTRITO FEDERAL

- UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA, UNIDAD IZTAPALAPA

División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Ciencia y Tecnología Ambiental,

Depto. Biotecnología UNIDAD AZCAPOTZALCO

División de Ciencias Básicas e Ingeniería Depto. de Ciencias Básicas,

Área de Química

- UNIVERSIDAD DEL NORESTE, A.C.

UNELAB - Centro multidisciplinario de servicios ambientales y de alimentos

- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Química

Instituto de Biología

Instituto de Ingeniería

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ÍNDICE DEL CONTENIDO

Número del capítulo Página

0 INTRODUCCIÓN 1

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN 1

2 REFERENCIAS 2 3 DEFINICIONES 2 4 PRINCIPIO 3 5 RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS 3

6 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO 4

7 EQUIPO Y MATERIALES 8

8 PROCEDIMIENTOS 9

9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS 13

10 REPORTE DE LA PRUEBA 15

11 TABLAS ESTADÍSTICAS 16

12 VIGENCIA 31 13 BIBLIOGRAFÍA 31

14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 31

APÉNDICE INFORMATIVO 32

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ECONOMÍA

PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-AA-167-SCFI-2012

ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACION DE ENTEROCOCOS FECALES EN AGUAS NATURALES Y

MARINAS.

WATER ANALYSIS - DETERMINATION OF FECAL ENTEROCOCCI IN NATURAL AND MARINE WATERS.

0 INTRODUCCIÓN

Las bacterias de origen fecal del género Enterococos son un valioso indicador útil para determinar la amplitud de la contaminación fecal reciente de las aguas recreativas y la calidad del tratamiento del agua residual que puede destinarse a reúso.

Los estudios realizados en sitios de recreo de aguas naturales salinas y dulces indican que las gastroenteritis y otras infecciones están asociadas a aguas contaminadas con este tipo de bacterias e indican directamente la calidad del agua, siendo los enterococos los mejores indicadores bacterianos de dicha calidad.

1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Este proyecto de norma mexicana específica el método para la determinación y enumeración de enterococos fecales mediante cultivo en:

a) Medio líquido contenido en tubos múltiples y cálculo del número más probable;

b) técnica de filtración por membrana, y

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c) método del sustrato cromogénico.

Es aplicable en aguas naturales y marinas.

La técnica de filtrado por membrana no resulta recomendable en caso de agua muy turbia.

La técnica sustrato cromogénico es una prueba enzimática rápida (requiere 24 h máximo), es aplicable a todo tipo de agua.

2 REFERENCIAS

Para la correcta aplicación de este proyecto de norma se deben consultar las siguientes normas mexicanas vigentes:

-NMX-AA-089/1-SCFI-2010 Protección al ambiente - calidad del agua - vocabulario - parte 1. Declaratoria de vigencia publicada en el diario Oficial de la Federación el 3 de marzo de 2011.

-NMX-AA-089/2-1992 Protección al ambiente - calidad del agua - vocabulario - parte 2. Declaratoria de vigencia publicada en el diario Oficial de la Federación el 24 de marzo de 1992.

3 DEFINICIONES

Para los propósitos de este proyecto de norma, aplican los términos y definiciones contenidos en: NMX-AA-089/1-SCFI-2010 y NMX-AA-089/2-1992;

y se establece la siguiente definición:

3.1 Género Enterococos

Se denominan Enterococos aquellas bacterias de forma cocoide Gram positivas, aerobias o anaerobias facultativas, catalasa negativas, inmóviles, que no forman endoesporas o cápsulas y capaces de fermentar la glucosa con producción de ácido a 37 °C en un período máximo de 48 h. Entre las características fisiológicas que distinguen al género Enterococcus se encuentra la capacidad para crecer en presencia de 6,5 % de NaCl; de 10 °C a 45 °C y pH 9,6. Son capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis.

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4 PRINCIPIO

4.1 Método del Número más Probable

Consiste en la inoculación de alícuotas de muestra, diluida o no diluida, en una serie de tubos con medio líquido selectivo conteniendo glucosa como prueba presuntiva. Se examinan los tubos después de 24 h y de 48 h incubados de 35

°C a 37 °C.

Proceder a hacer subcultivos de cada tubo que muestre turbidez y producción de gas en agar selectivo incubado de 35 °C a 37 °C por 22 h a 26 h y éstos a su vez en un medio líquido selectivo confirmativo que contenga NaCl al 6.5 % incubados a 45 °C por 24 h. Mediante tablas estadísticas, calcular el número más probable (NMP) de organismos expresado como el número más probable de unidades formadoras de colonias en 100 mL de la muestra, consultando las tablas del capítulo 11.

4.2 Filtración por membrana

Consiste en filtrar la muestra a través de una membrana estéril que retendrá a los microorganismos. El filtro se deposita en una caja de Petri conteniendo un medio de cultivo sólido selectivo apropiado para una prueba presuntiva que se incuba por 24 h de 35 °C a 37 °C. Las colonias sospechosas se subcultivan en medio líquido para una prueba confirmativa de 43,5 °C a 44,5 °C por 24 h, posteriormente aplicar pruebas serológicas y bioquímicas para la identificación de especies.

4.3 Método de sustrato Cromogénico

El método emplea un sustrato cromogénico tal como el 4-metil-umbeliferil-β- D-glucósido (MUG) u otro equivalente que emite fluorescencia cuando es hidrolizado por la enzima β-glucosidasa presente en las bacterias del género Enterococcus, la fluorescencia producida es detectada cuando el líquido es expuesto a la luz ultravioleta de onda larga (365 nm).

Este método evita el uso de azida de sodio utilizada en los métodos tradicionales y sustenta una prueba positiva después de 24 h sin procedimientos adicionales.

5 RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

5.1 Recolección: en frascos y/o bolsas estériles, mínimo 125 mL de muestra.

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5.2 Almacenamiento: después de la recolección de muestras y durante un máximo de 24 h después de la recolección de la última muestra.

5.3 Preservación: conservar las muestras en hielo y/o criogeles congelados para su traslado de 2 °C a 6 °C.

5.4 Conservar dentro del laboratorio en refrigeración de 2 °C a 6 °C.

Atemperar la muestra a temperatura ambiente antes del análisis sin exceder en todo el proceso las 24 h después de la recolección de la última muestra.

6 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO

Se describe a continuación los diluyentes y medios de cultivo utilizados para las técnicas de NMP, filtración por membrana y sustrato cromogénico:

Usar ingredientes de calidad uniforme y sustancias químicas de grado analítico para la preparación de los medios de cultivo y reactivos, usar medios completamente deshidratados y seguir estrictamente las instrucciones del fabricante.

Para la preparación de medios, usar agua destilada o agua desionizada libre de sustancias que puedan inhibir el crecimiento bacteriano bajo las condiciones de la prueba.

6.1 Diluyentes:

Cuando se requieran diluciones de la muestra, usar uno de los diluyentes recomendados:

6.1.1 Solución fisiológica al 0,85 %:

6.1.1.1 Pesar 0,85 g de cloruro de sodio y disolver en agua destilada y/o desionizada a un volumen de 100 mL. Esterilizar de 120 °C a 122

°C durante 15 min. Conservar en refrigeración hasta su uso.

6.1.2 Solución madre amortiguadora de fosfato:

Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 42,5 mg;

cloruro de magnesio (MgCl2) 190,0 mg, y

agua grado reactivo 1 L.

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6.1.2.1 Solución de fosfato:

6.1.2.1.1 Disolver 34 g de fosfato monobásico de potasio (KH₂PO₄) en 500 mL de agua. Ajustar a pH de 6,7 a 7,7 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L y aforar a 1 000 mL con agua.

6.1.2.1.2 Solución de cloruro de magnesio:

Disolver 38 g de cloruro de magnesio anhidro ó 81 g de cloruro de magnesio hexahidratado en 1 000 mL de agua.

6.1.3 Solución de trabajo amortiguadora de fosfatos:

6.1.3.1 Añadir 1,25 mL de solución madre amortiguadora de fosfato y 5 mL de solución de cloruro de magnesio a 500 mL de agua. Ajustar a pH de 6,7 a 7,7 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L y aforar a 1 000 mL con agua. Distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar de 120 °C a 122 °C durante 15 min, conservar en refrigeración hasta su uso.

6.2 Medios de cultivo 6.2.1 Caldo azida dextrosa:

a) Extracto de carne 4,5 g;

b) triptona o polipeptona 15,0 g;

c) glucosa 7,5 g;

d) cloruro de sodio, NaCl 7,5 g;

e) azida de sodio, NaN3 0,2 g, y f) agua grado reactivo 1 L.

Disolver los ingredientes en agua, calentar si es necesario, adicionar la azida de sodio al final. Esterilizar de 120 °C a 122 °C por 15 min. Ajustar el pH de 7,0 a 7,4 a 25 °C después de la esterilización con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L.

Si se usan fórmulas deshidratadas se preparan de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

Verter el caldo en los tubos de prueba e incluir un tubo de Durham invertido para observar la producción de gas.

6.2.2 Agar selectivo PSE:

a) Peptona C (triptona) 17,0 g;

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b) peptona B (peptona proteasa) 3,0 g;

c) extracto de levadura 5,0 g;

d) bilis bacteriológica 10,0 g;

e) cloruro de sodio, NaCl 5,0 g;

f) citrato de sodio 1,0 g;

g) esculina 1,0 g;

h) citrato de amonio hierro 0,5 g;

i) azida de sodio, NaN3 0,25 g;

j) agar 15,0 g, y

k) agua grado reactivo 1 L.

Disolver los ingredientes en agua, calentar si es necesario, adicionar la azida de sodio al final. Esterilizar de 120 °C a 122 °C por 15 min. Ajustar el pH final de 6,9 a 7,3, después de la esterilización con solución de hidróxido de sodio ó ácido clorhídrico 1 mol/L. Enfriar aproximadamente a 45 °C y verter el medio en las placas.

6.2.3 Medios de cultivo para filtración por membrana:

6.2.3.1 Agar mE:

a) Peptona 10,0 g;

b) cloruro de sodio, NaCl 15,0 g;

c) extracto de levadura 30,0 g;

d) esculina 1,0 g;

e) actidiona (ciclohexamina) 0,05 g;

f) azida de sodio, NaN3 0,15 g;

g) agar 15,0 g, y

h) agua grado reactivo 1 L.

Calentar para disolver los ingredientes, esterilizar y enfriar en un baño de agua de 44 °C a 46 °C. Mezclar 0,25 g de ácido nalidíxico en 5 mL de agua, añadir algunas gotas de NaOH 0,1 mol/L para disolver el antibiótico que se incorpora al medio básico. Añadir 0,15 g de cloruro de 2, 3, 5 trifenil tetrazolio y mezclar para una buena disolución. Verter alrededor de 4 mL a 6 mL de agar en cajas de Petri de 9 mm x 50 mm hasta conseguir un grosor de la placa de agar de 4 mm a 5 mm y dejar solidificar. Ajustar el pH final de 6,9 a 7,3 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L. Almacenar las placas en la oscuridad de 2 °C a 10 °C. Desechar las placas no utilizadas en un plazo no mayor de 30 días.

NOTA 1: Este medio es recomendado para el cultivo de enterococos en aguas recreativas dulces y marinas.

6.2.3.2 Substrato esculina-hierro (EIA):

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a) Esculina 1,0 g;

b) citrato de hierro 0,5 g;

c) agar 15,0 g, y

d) agua grado reactivo 1 L.

Calentar hasta que se disuelvan los ingredientes, ajustar a un pH de 6,9 a 7,3 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L, esterilizar y dejar enfriar en un baño de agua de 44 °C a 46 °C. Verter alrededor de 4 mL a 6 mL de agar en cajas de Petri de 9 mm x 50 mm hasta conseguir un grosor de la placa de agar de 4 mm a 5 mm y dejar solidificar. Almacenar las placas en la oscuridad de 2 °C a 10 °C y desechar después de 30 días.

6.2.3.3 Agar m Enterococcus:

a) Triptosa 20,0 g;

b) extracto de levadura 5,0 g;

c) glucosa 2,0 g;

d) fosfato dipotásico, K₂HPO₄ 4,0 g;

e) azida de sodio, NaN₃ 0,4 g;

f) cloruro de 2,3,5- trifenil tetrazolio 0,1 g;

g) agar 10,0 g, y

h) agua grado reactivo 1 L.

Calentar hasta que se disuelvan los ingredientes. No esterilizar. Verter alrededor de 4 mL a 6 mL de agar en cajas de Petri de 9 mm x 50 mm hasta conseguir un grosor de la placa de agar de 4 mm a 5 mm y dejar solidificar.

Preparar este medio cada vez que sea necesario.

NOTA 2: Se recomienda este medio para la detección de enterococos en aguas dulces y saladas.

6.2.3.4 Caldo infusión de cerebro-corazón:

a) Infusión de cerebro de vaca 200,0 g;

b) infusión de corazón de buey 250,0 g;

c) proteosa peptona 10,0 g;

d) glucosa 2,0 g;

e) cloruro de sodio, NaCl 5,0 g;

f) fosfato de hidrógeno dipotasio, K₂HPO₄ 2,5 g, y

g) agua grado reactivo 1 L.

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Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Esterilizar de 120

°C a 122 °C por 15 min. Ajustar el pH a 7,4 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L después de la esterilización.

6.2.3.5 Agar infusión de cerebro-corazón:

Añadir 15,0 g de agar a los ingredientes del medio líquido de cerebro corazón.

Ajustar el pH a 7,4 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L después de la esterilización. Verter el medio en tubos y dejarlos solidificar inclinados.

6.2.3.6 Agar bilis-esculina:

a) Extracto de buey 3,0 g;

b) peptona 5,0 g;

c) oxgall 40,0 g;

d) esculina 1,0 g;

e) citrato de hierro 0,5 g;

f) agar 15,0 g, y

g) agua grado reactivo 1 L.

Calentar los ingredientes hasta disolución y dividir en tubos de 10 mL y dejar solidificar inclinado o introducir un volumen adecuado en un matraz para verter posteriormente en cajas de Petri. Esterilizar en autoclave de 120 °C a 122 °C durante 15 min. No sobrecalentar, ya que puede oscurecerse el medio. Enfriar de 44 °C a 46 °C y dejar solidificar los tubos inclinados o verter porciones de 15 mL en cajas de Petri de 15 mm x 100 mm. Ajustar el pH final debe llegar de 6,4 a 6,8 con solución de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico 1 mol/L después de la esterilización. Almacenar de 4 °C a 10 °C.

6. 3 Opcionalmente, utilizar los medios de cultivo comerciales preparados.

6.4 Método del sustrato Cromogénico:

Para el método del sustrato cromogénico adquirir el paquete de reactivo y seguir las instrucciones del fabricante para su uso.

7 EQUIPO Y MATERIALES

7.1 Balanza analítica y granataria.

7.2 Medidor de pH.

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7.3 Incubadoras que controlen temperaturas de 35 °C a 37 °C y de 40

°C a 45 °C.

7.4 Esterilizadores de presión a temperatura de 120 °C a 122 °C con manómetros.

7.5 Horno de secado para esterilizar a temperaturas de 170 °C durante 2 h o a 180 °C durante 1 h con termómetro calibrado y/o verificado.

7.6 Unidad de filtración con vacío (para filtración por membrana).

7.7 Cuenta colonias, para el conteo de colonias en membranas, o bien, lupa para ayuda en el conteo e identificación de características de las colonias.

7.8 Lámpara de luz ultravioleta de onda larga de 365 nm o equivalente para detectar fluorescencia (utilizada para el método cromogénico).

Usar material de vidrio y equipo libre de agentes que pueden afectar el crecimiento bacteriano.

a) Botellas de muestreo;

b) pipetas graduadas estériles;

c) contenedores para medio de cultivo, y

d) cajas de cultivo de Petri, puede utilizarse vidrio o cajas plásticas preesterilizadas.

8 PROCEDIMIENTOS

8.1 Procedimiento para el NMP: Preparación de la muestra e inoculación de tubos.

8.1.1 Siembra en tubos múltiples

Para preparar la muestra, realizar las diluciones necesarias, usar sólo múltiplos decimales de 1 mL. Inocular las alícuotas en los tubos que contienen el caldo azida dextrosa (medio de aislamiento presuntivo). Para alícuotas superiores a 5 mL, usar tubos conteniendo el medio en concentración doble. Las porciones usadas pueden llegar a variar en tamaño y número de acuerdo al tipo de muestras.

8.1.2 Incubación de los tubos

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Incubar los tubos inoculados por 48 h de 35 °C a 37 °C.

8.1.3 Prueba presuntiva

Examinar los tubos de cultivo después de incubarlos por 18 h a 24 h y registrar como resultado positivo aquellos que muestren turbidez debido al crecimiento bacteriano y/o formación de gas en el interior del tubo de Durham. Reincubar aquellos tubos que no muestren alguno o ninguno de estos cambios y examinar nuevamente para reacciones positivas de 45 h a 51 h.

8.1.4 Prueba Confirmativa

Realizar subcultivos de cada tubo que haya dado un resultado positivo en cajas con agar selectivo PSE.

8.1.4.1 Incubación

Incubar las cajas invertidas de 35 °C a 37 °C por 22 h a 26 h. Las colonias cafés negruzcas con halos de color café confirman la presencia de enterococos fecales. Transferir a tubos que contengan medio líquido de infusión cerebro- corazón que contenga NaCl al 6.5 % e incubar de 44,3 °C a 44,7 °C. El crecimiento en este medio indica que las colonias pertenecen al género Enterococcus.

8.1.4.2 Cuantificación de resultados

Estimar la densidad microbiana de enterococos fecales a partir del número de tubos de cada serie de diluciones que fueron positivos en agar PSE. De la misma forma, estimar la densidad de enterococos a partir de los tubos de cada serie de diluciones que crezcan en el medio con NaCl al 6.5 %. Para la expresión de resultados, véase 9.1.

8.1.5 Interpretación de resultados

Después de la incubación, contar y registrar el número de resultados positivos en cada serie de tubos, en el capítulo 11 se presentan las tablas de 11.1 a 11.5.

Las características que distinguen las reacciones positivas de las negativas varían con cada microorganismo o grupo de microorganismos y con el medio de cultivo utilizado.

Estos procedimientos confirmativos permiten identificar resultados positivos verdaderos y utilizarlos para la determinación de valores de NMP. Para concluir

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sobre los resultados confirmados, es necesario poder realizar el seguimiento del resultado de la prueba de confirmación hasta el tubo presuntamente positivo (al menos en el nivel de dilución).

8.2 Procedimiento de filtración por membrana 8.2.1 Siembra en medio mE

Seleccionar un volumen de muestra y una dilución adecuada y filtrar a través de una membrana cuadriculada estéril de 0,45 µm de tamaño de poro, para obtener de 20 a 60 colonias en la superficie de la membrana. Transferir la membrana al agar mE contenido en una caja Petri, evitando la formación de burbujas de aire bajo la membrana. Invertir las placas de cultivo e incubar de 40,8 °C a 41,2 °C por 48 h.

8.2.1.1 Prueba de sustrato

Después de 48 h de incubación en el medio mE, transferir cuidadosamente la membrana al agar esculina-hierro (medio EIA). Incubar de 40,8 °C a 41,2 °C por 20 min. Las colonias de enterococos desarrollan un color rosa a rojo y un precipitado negro o rojo-pardo. El conteo de colonias se hace con ayuda de lámpara fluorescente y lupa.

8.2.2 Siembra en medio agar m Enterococcus

Seleccionar un volumen de muestra y una dilución adecuada y filtrar a través de una membrana cuadriculada estéril de 0,45 µm de tamaño de poro, para obtener 20 a 60 colonias en la superficie de la membrana. Transferir la membrana al agar contenido en una caja Petri, evitando la formación de burbujas de aire bajo la membrana. Dejar reposar durante 30 min e incubar las cajas invertidas de 35 °C a 37 °C por 48 h. Las colonias formadas son rojas claras u oscuras. El conteo de colonias se hace usando lámpara fluorescente y lupa.

8.2.2.1 Cuantificación de resultados

Calcular el número de microorganismos a partir de las cantidades de muestra que produzcan recuentos en las membranas comprendidos entre 20 y 60 colonias, calcular de acuerdo a lo indicado en el capítulo 10, registrar las densidades como enterococos fecales por 100 mL.

8.2.3 Pruebas Confirmativas

De manera opcional se pueden hacer pruebas confirmativas a las colonias sospechosas obtenidas en 8.2.1.1 ó en 8.2.2. Tomar colonias típicas de una

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membrana y sembrar para aislamiento en la superficie de una placa con agar infusión cerebro corazón, incubar de 35 °C a 37 °C por 24 h a 48 h.

Transferir con asa una colonia aislada al medio líquido de infusión de cerebro corazón y a dos portaobjetos. Incubar el medio líquido de 35 °C a 37 °C durante 24 h.

Transferir una asada del crecimiento de cada tubo de medio líquido de infusión de cerebro corazón a cada uno de los siguientes medios: agar bilis esculina (incubación de 35 °C a 37 °C durante 48 h), medio líquido de infusión de cerebro y corazón (incubación de 44,0 °C a 45,0 °C durante 48 h) y medio líquido de infusión de cerebro corazón más NaCl al 6,5 % (incubación de 35 °C a 37 °C durante 48 h).

8.2.3.1 Prueba de catalasa

Añadir unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3 % recién preparado en toda la extensión de uno de los portaobjetos. La aparición de burbujas constituye una prueba positiva de catalasa e indica que la colonia no pertenece al grupo de los enterococos fecales. Si la prueba de catalasa es negativa, es decir, no aparecen burbujas, se hace una tinción de Gram del segundo portaobjetos y se observa al microscopio. Los enterococos fecales son células ovoides Gram positivas de 0,5 µm a 1,0 µm de diámetro que se disponen en su mayoría en pares o en cadenas cortas.

8.2.3.2 Interpretación de resultados

El crecimiento de cocos catalasa negativa y Gram positivos en agar bilis esculina o en medio líquido de infusión de cerebro y corazón a 44 °C es la prueba de que las colonias pertenecen al género Enterococcus. El crecimiento a 44 °C y en el medio líquido de infusión de cerebro corazón con NaCl al 6.5 % indica que las colonias pertenecen al género Enterococcus. Para la identificación de las especies individuales de enterococos fecales utilizar el apéndice informativo A que indica las características bioquímicas de las especies de enterococos.

8.3 Procedimiento para el método del sustrato cromogénico:

8.3.1 Preparación de diluciones

Preparar una dilución 1:10 con agua destilada estéril. Por ejemplo, 10 mL de muestra adicionados con 90 mL de agua estéril.

8.3.2 Preparación de la prueba

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Agregar el reactivo a la muestra previamente diluida o directamente según el tipo de muestra de agua. Tapar y sellar el recipiente utilizado de forma aséptica. Agitar para disolver el reactivo por completo. Verter la mezcla de muestra y reactivo en el recipiente o dispositivo suministrado por el proveedor para llevar a cabo la prueba. Seguir siempre las especificaciones del fabricante ya que las instrucciones de uso pueden variar según la marca, así como el uso de las tablas correspondientes a NMP de enterococos en charola con pozos.

8.3.3 Incubación

Incubar durante 24 h de 40,5 °C a 41,5 °C. Contar el número de pruebas positivas fluorescentes utilizando una lámpara de luz ultravioleta al cabo de 24 h. Es posible que la intensidad de las pruebas positivas varíe. Consultar las tablas del NMP correspondientes para determinar el NMP de enterococos en la muestra.

8.3.4 Interpretación de resultados

Cuando el sustrato es hidrolizado por la enzima-galactosidasa las bacterias producen fluorescencia de color azul cuando las celdas son expuestas a la luz ultravioleta, esta respuesta cromogénica descrita es una reacción positiva para enterococos fecales. Las muestras son negativas si no se observa fluorescencia.

La respuesta cromogénica es cuestionable si el tiempo de incubación sobrepasa las 24 h, si se incubó por 28 h puede haber poco desarrollo de fluorescencia e interpretarse como negativo o puede desarrollarse más celdas fluorescentes e interpretarse con falsos positivos.

8.4 Control de calidad: cepas control para las pruebas

Probar al azar un lote del sustrato comercial desarrollando la prueba por inoculación de tres cepas control: Enterococcus faecium ATCC, Serratia marcescens (Gram negativa) ATCC o Aerococcus viridans (Gram positiva) ATTC. El primero produce fluorescencia pero el segundo y tercero no la producen.

9 EXPRESIÓN DE RESULTADOS

9.1 Si se desarrolló el procedimiento de NMP de tubos múltiples calcular el valor de NMP del número de tubos positivos, de acuerdo a las tablas de número más probable, en el capítulo 11 tablas 11.1 a 11.5 de acuerdo a número de tubos y diluciones utilizadas. Si se ocuparon diluciones utilizar la fórmula siguiente:

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mayor Dilución

tablas en contenido Valor

NMP 

9.1.1 En caso de no encontrar en las tablas la combinación obtenida utilizar la siguiente fórmula:

) (

* ) (

100

/₁₀₀ ^.

tubos los todos en muestra de

mL negativos

tubos en muestra de

mL

tubos de N

NMP _mL ^O 



9.2 Expresión de resultados para el método de filtración por membrana.

9.2.1 Para el conteo en membrana de 20 a 60 colonias y no más de 200 colonias, se utiliza la siguiente ecuación:

filtrada muestra

de mL

das cuantifica Colonias

colonias de

Total 100

100

/  

Cuando no se observan colonias reportar = < 1 colonias / 100 mL.

En caso de haber llevado a cabo pruebas confirmativas, utilizar:

ón verificaci a

sujetas colonias

de total Número

s Verificada Colonias

de Número s

verificada colonias

de

Fracción 

es Verificabl Colonias

de Número

s Verificada Colonias

de Número s

verificada colonias

de

Fracción 100

9.2.2 Calidad de agua utilizando duplicados de 50 mL. Utilizar el conteo de colonias para total de 100 mL, por ejemplo:

 

 

 

8colonias 100/ ^mL 50

50

100 3

5 







(20)

9.2.3 En forma similar, si se examinan porciones de 50 mL, 25 mL y 10 mL por las características del agua, se cuentan colonias presentadas en cada caja, esto es una manera de prevención para tener controlados los conteos , ya que si hay una sobrepoblación de colonias presentes en las cajas, puede presentarse no tener otras opciones. Ejemplo de conteos por placa en 50 = 5, en 25 = 6, en 10 = 0 queda:

 

 

 

25colonias 100/ ^mL 10

25 50

100 0 6

5 







9.3 Expresión de resultados para el método del sustrato Cromogénico En el capítulo 11 se presentan las tablas 11.6 a 11.8 denominadas Tablas de resultados para el Método del Sustrato Cromogénico, donde en la columna izquierda recuenta el número de pocillos grandes positivos, cruzar el dato encontrado en esta columna con la fila superior de la tabla que corresponde al número de pocillos pequeños positivos, encontrar la lectura y reportar el número más probable (NMP) en 100 mL.

10 REPORTE DE LA PRUEBA

El reporte de la prueba debe contener la siguiente información:

a) Una referencia a este PROY-NMX-AA 000 SCFI -2012;

b) todos los detalles necesarios para la completa identificación de la muestra,

c) los resultados expresados de acuerdo al inciso 9, y d) cualquier otra información relevante al método.

(21)

11 TABLAS ESTADÍSTICAS

Tablas estadísticas para interpretación de resultados por el método de número más probable (NMP) en la determinación de Enterococos fecales (véase 13.2).

TABLA 11.1 - Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (para diversas combinaciones de resultados positivos cuando se utilizan tres alícuotas de muestra de 10 mL, tres

de 1 mL y tres de 0,1 mL).

Número de tubos que dieron

reacción positiva NMP por 100

mL

Límite de confianza al 95 %

3 de 10

mL 3 de 1

mL 3 de 0.1

mL Inferior Superior

0 0 0 <3 ---- ---

0 0 1 3 < 1 9

0 1 0 3 < 1 13

1 0 0 4 < 1 20

1 0 1 7 1 21

1 1 0 7 1 23

1 1 1 11 3 36

1 2 0 11 3 36

2 0 0 9 1 36

2 0 1 14 3 37

2 1 0 15 3 44

2 1 1 20 7 89

2 2 0 21 4 47

2 2 1 28 10 149

3 0 0 23 4 120

3 0 1 39 7 130

3 0 2 64 15 379

3 1 0 43 7 210

3 1 1 75 14 230

3 1 2 120 30 380

3 2 0 93 15 380

3 2 1 150 30 440

3 2 2 210 35 470

3 3 0 240 36 1300

3 3 1 460 71 2400

3 3 2 1100 150 4800

3 3 3 ≥2400 --- ---

(22)

TABLA 11.2- Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utilizan cinco alícuotas de muestra de

10 mL, cinco de 1 mL y cinco de 0,1 mL).

mL

5 de 10

mL 5 de 1 mL 5 de 0.1

0 0 0 < 2 < 1 7

0 1 0 2 < 1 7

0 2 0 4 < 1 11

1 0 0 2 < 1 7

1 0 1 4 < 1 11

1 1 0 4 < 1 11

1 1 1 6 < 1 15

2 0 0 5 < 1 13

2 0 1 7 1 17

2 1 0 7 1 17

2 1 1 9 2 21

2 2 0 9 2 21

2 3 0 12 3 28

3 0 0 8 1 19

3 0 1 11 2 25

3 1 0 11 2 25

3 1 1 14 4 34

3 2 0 14 4 34

3 2 1 17 5 46

3 3 0 17 5 46

4 0 0 13 3 31

4 0 1 17 5 46

4 1 0 17 5 46

4 1 1 21 7 63

4 1 2 26 9 78

4 2 0 22 7 67

4 2 1 26 9 78

4 3 0 27 9 80

4 3 1 33 11 93

4 4 0 34 12 93

(23)

TABLA 11.2 (concluye)

mL

95 % Límite de confianza 5 de 10

mL 5 de 1 mL 5 de 0.1

5 0 0 23 7 70

5 0 1 31 11 89

5 0 2 43 15 110

5 1 0 33 11 93

5 1 1 46 16 120

5 1 2 63 21 150

5 2 0 49 17 130

5 2 1 70 23 170

5 2 2 94 28 220

5 3 0 79 25 190

5 3 1 110 31 250

5 3 2 140 37 340

5 3 3 180 44 500

5 4 0 130 35 300

5 4 1 170 43 490

5 4 2 220 57 700

5 4 3 280 90 850

5 4 4 350 120 1000

5 5 0 240 68 750

5 5 1 350 120 1000

5 5 2 540 180 1400

5 5 3 920 300 3200

5 5 4 1600 640 5800

5 5 5 ≥ 1800 - -

(24)

TABLA 11.3 -Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utiliza una alícuota de ensayo de 50 mL

y cinco de 10 mL).

Número de tubos que

dieron reacción positiva NMP por 100 mL

Límite de confianza al 95

%

1 de 50 mL 5 de 10 mL Inferior Superior

0 0 < 1

0 1 1 < 1 4

0 2 2 < 1 6

0 3 4 < 1 11

0 4 5 1 13

0 5 7 2 17

1 0 2 < 1 6

1 1 3 < 1 9

1 2 6 1 15

1 3 9 2 21

1 4 16 4 40

1 5 > 18

(25)

TABLA 11.4 – Valores de NMP por cada 100 mL de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utilizan cinco alícuotas de muestra de

100 mL, una de 10 mL y una de 1 mL).

mL

mL 1 de 10

mL 1 de 1 mL Inferior Superior

1^a < 1 < 1 1

0 1 0 < 1 < 1 1

1 0 0 < 1 < 1 1

1 1 0 < 1 < 1 2

2^a < 1 < 1 2

2 0 0 < 1 < 1 2

2 1 0 < 1 < 1 2

3^a < 1 < 1 3

3 0 0 < 1 < 1 3

3 0 1 1 < 1 3

3 1 0 1 < 1 4

4^a 2 < 1 5

4 0 0 2 < 1 5

4 0 1 2 < 1 6

4 0 0 2 < 1 6

5 0 0 4 2 36

5 0 1 10 3 54

5 1 0 20 10 380

a Estos resultados se expresan para el caso en el que se utiliza un sólo nivel con 5 tubos.

(26)

TABLA 11.5 - Valores de NMP por cada 100 ml de muestra y 95 % de límite de confianza (cuando se utiliza una alícuota de muestra de 50

mL, cinco de 10 mL y cinco de 1 mL).

mL

1 de 50

mL 5 de 10

0 0 0 < 1

0 0 1 1 < 1 4

0 0 2 2 < 1 6

0 1 0 1 < 1 4

0 1 1 2 < 1 6

0 1 2 3 < 1 8

0 2 0 2 < 1 6

0 2 1 3 < 1 8

0 2 2 4 < 1 11

0 3 0 3 < 1 8

0 3 1 5 < 1 13

0 4 0 5 < 1 13

1 0 0 1 < 1 4

1 0 1 3 < 1 8

1 0 2 4 < 1 11

1 0 3 6 < 1 15

1 1 0 3 < 1 8

1 1 1 5 < 1 13

1 1 2 7 1 17

1 1 3 9 2 21

1 2 0 5 < 1 13

1 2 1 7 1 17

1 2 2 10 3 23

1 2 3 12 3 28

1 3 0 8 2 19

(27)

TABLA 11.5 (concluye) Número de tubos que dieron

mL

mL 5 de 10

1 3 1 11 3 26

1 3 2 14 4 34

1 3 3 18 5 53

1 3 4 21 6 66

1 4 0 13 4 31

1 4 1 17 5 47

1 4 2 22 7 69

1 4 3 28 9 85

1 4 4 35 12 101

1 4 5 43 15 117

1 5 0 24 8 75

1 5 1 35 12 101

1 5 2 54 18 138

1 5 3 92 27 217

1 5 4 161 3 450

1 5 5 > 180 - -

(28)

TABLA 11.6 - Tablas de resultados para el Método del Sustrato Cromogénico.

# Pocillos Tabla de NMP

Grandes # Pocillos Pequeños

Positivos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

0 < 1 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,1 15,6

1 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,1 9,1 10,1 11,1 12,1 13,2 14,2 15,2 16,2 17,3

2 2,0 3,0 4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 9,1 10,1 11,1 12,1 13,2 14,2 15,2 16,2 17,3 18,3 3 3,1 4,1 5,1 6,1 7..2 8,2 9,2 10,3 11,3 12,4 13,4 14,4 15,5 16,5 17,8 18,8 19,7 4 4,1 5,2 6,2 7,2 8,3 9,3 10,4 11,4 12,5 13,5 14,6 15,6 16,7 17,8 18,8 19,9 21,0 5 5,2 6,3 7,3 8,4 9,4 10,5 11,5 12,6 13,7 14,7 15,8 16,9 17,9 19,0 20,1 21,2 22,2 6 6,3 7,4 8,4 9,5 10,6 11,6 12,7 13,8 14,9 15,9 17,0 18,1 19,2 20,3 21,4 22,5 23,6 7 7,4 8,5 9,6 10,7 11,8 12,8 13,9 15,0 16,1 17,2 18,3 19,4 20,5 21,6 22,7 23,8 24,9 8 8,8 9,7 10,8 11,9 13,0 14,1 15,2 16,3 17,4 18,5 19,6 20,7 21,8 22,9 24,1 25,2 26,3 9 9,8 10,9 12,0 13,1 14,2 15,3 16,4 17,5 18,7 19,8 20,9 22,0 23,2 24,3 25,4 26,6 27,7 10 11,0 12,1 13,2 14,3 15,5 16,6 17,7 18,9 20,0 21,1 22,3 23,4 24,6 25,7 26,9 28,0 29,2 11 12,2 13,4 14,5 15,6 16,8 17,9 19,1 20,2 21,4 22,5 23,7 24,8 26,0 27,2 28,3 29,5 30,7 12 13,5 14,6 15,8 16,9 18,1 19,3 20,4 21,6 22,7 23,9 25,1 26,3 27,5 28,6 29,8 31,0 32,2 13 14,8 16,0 17,1 18,3 19,5 20,6 21,8 23,0 24,2 25,4 26,6 27,8 29,0 30,2 31,4 32,6 33,8 14 16,1 17,3 18,5 19,7 20,9 22,1 23,3 24,4 25,7 26,9 28,1 29,3 30,5 31,7 33,0 34,2 35,4 15 17,5 18,7 19,9 21,1 22,3 23,5 24,7 25,9 27,2 28,4 29,6 30,9 32,1 33,3 34,6 35,8 37,1

(29)

TABLA 11.6 (continúa)

16 18,9 20,1 21,3 22,6 23,8 25,0 26,2 27,5 28,7 30,0 31,2 32,5 33,7 35,0 36,3 37,5 38,8 17 20,3 21,6 22,8 24,0 25,3 26,5 27,8 29,1 30,3 31,6 32,9 34,1 35,4 36,7 38,0 39,3 40,6 18 21,8 29,1 24,3 25,6 26,9 28,1 29,4 30,7 32,0 33,3 34,6 35,9 37,2 38,5 39,8 41,1 42,4 19 23,3 34,6 25,9 27,2 28,5 29,8 31,1 32,4 33,7 35,0 36,3 37,6 39,0 40,3 41,6 43,1 44,3 20 24,9 26,2 27,5 28,8 39,1 31,4 32,8 34,1 35,4 36,8 38,1 39,5 40,8 42,2 43,6 44,9 46,3 21 26,5 27,8 29,2 30,5 31,8 33,2 34,5 35,9 37,3 38,6 40,0 41,4 42,8 44,1 45,5 46,9 48,4 22 28,2 29,5 30,9 22,3 33,6 35,0 36,4 37,7 39,1 40,5 41,9 43,3 44,7 46,2 47,6 49,0 50,5 23 29,9 31,3 32,7 34,1 35,4 36,8 38,2 39,7 41,1 42,5 43,9 45,4 46,8 48,3 49,7 51,2 52,7 24 31,7 33,1 34,5 35,9 37,3 38,8 40,2 41,6 43,1 44,8 46,0 47,5 49,0 50,5 51,9 53,4 55,0 25 33,5 35,0 36,4 37,9 39,3 40,8 42,2 43,7 45,2 46,7 48,2 49,7 51,2 52,7 54,3 55,8 57,3 26 35,5 36,9 38,4 39,9 41,3 42,8 44,3 45,9 47,4 48,9 50,4 52,0 53,5 55,1 56,7 58,2 59,8 27 37,4 38,9 40,4 41,9 43,5 45,0 46,5 48,1 49,6 51,2 52,8 54,4 56,0 57,6 59,2 60,8 62,4 28 39,5 41,0 42,6 44,1 45,7 47,2 48,8 50,4 52,0 53,6 55,2 56,9 58,5 60,1 61,8 63,5 65,2 29 41,6 43,2 44,8 46,4 48,0 49,6 51,2 52,8 54,5 56,1 57,8 59,5 61,2 62,9 64,6 66,3 68,0 30 43,9 45,5 47,1 48,7 50,4 52,0 53,7 55,4 57,1 58,8 60,5 62,2 64,0 65,7 67,5 69,3 71,0 31 46,2 47,9 49,5 51,2 52,9 54,6 56,3 58,1 59,8 61,6 63,3 65,1 66,9 58,7 70,5 72,4 74,2 32 48,7 50,4 52,1 53,8 55,6 57,3 59,1 60,9 62,7 64,5 66,3 68,1 70,0 71,9 73,8 75,7 77,6 33 51,2 53,0 54,7 56,5 58,3 60,1 52,0 53,8 65,7 67,6 69,5 71,4 73,3 75,2 77,2 79,2 81,2 34 53,9 55,7 57,6 59,4 61,3 63,1 65,0 66,9 68,9 70,8 72,8 74,8 76,8 78,8 80,8 82,9 85,0 35 56,8 58,6 60,5 62,4 64,4 66,3 68,3 70,3 72,3 74,3 76,3 78,4 80,5 82,6 84,7 86,9 89,1 36 59,8 61,7 63,7 65,7 67,7 69,7 71,7 73,8 75,9 78,0 80,1 82,3 84,5 86,7 88,9 91,2 93,5

(30)

TABLA 11.6 (concluye)

37 62,9 65,0 67,0 69,1 71,2 73,3 75,4 77,6 79,8 82,0 84,2 86,5 88,8 91,1 93,4 95,8 98,2 38 66,3 68,4 70,6 72,7 74,9 77,1 79,4 81,6 83,9 86,2 88,6 91,0 93,4 95,8 98,3 100,8 103,4 39 69,9 72,2 74,4 76,6 78,9 81,3 83,6 86,0 88,4 90,9 93,3 95,9 98,4 101,0 103,6 106,3 109,0 40 73,8 76,2 78,5 80,9 83,3 85,7 88,2 90,7 93,3 95,9 98,5 101,2 103,9 106,7 109,5 112,4 115,3 41 78,0 80,5 83,0 85,5 88,0 90,6 93,3 95,9 98,7 101,4 104,3 107,1 110,0 113,0 116,0 119,1 122,2 42 82,6 85,2 87,8 90,5 93,2 96,0 98,8 101,7 104,6 107,6 110,6 113,7 116,9 120,1 123,3 126,7 130,1 43 87,6 90,4 93,2 96,0 99,0 101,9 105,0 108,1 111,2 114,5 117,8 121,1 124,6 128,1 131,7 135,4 139,1 44 93,1 96,1 99,1 102,2 105,4 108,6 111,9 115,3 118,7 122,3 125,9 129,6 133,4 137,4 141,4 145,5 149,7 45 99,3 102,5 105,8 109,2 112,6 116,2 119,8 123,6 127,4 131,3 135,4 139,6 143,9 148,3 152,9 157,6 162,4 46 106,3 109,8 113,4 117,2 121,0 125,0 129,1 133,3 137,6 142,1 146,7 151,5 156,5 161,6 166,9 172,5 178,2 47 114,3 118,3 122,4 126,6 130,9 135,4 140,1 145,0 150,0 155,3 160,7 166,4 172,3 178,5 185,0 191,8 198,9 48 123,9 128,4 133,1 137,9 143,0 148,3 153,9 159,7 165,8 172,2 178,9 186,0 193,5 201,4 209,8 218,7 228,2 49 135,5 140,8 146,4 152,3 158,5 165,0 172,0 173,9 187,2 195,6 204,8 214,3 224,7 235,9 248,1 261,3 275,5

NOTA La distribución de las celdas en la charola corresponde a las tablas de NMP con 95 % de límite de confianza.

(31)

TABLA 11.7 - Tablas de resultados para el Método del Sustrato Cromogénico.

# Pocillos Tabla de NMP

Grandes # Pocillos Pequeños

Positivos

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

0 17,1 18,1 19,1 20,2 21,2 22,2 23,2 24,3 25,3 26,3 27,4 28,4 29,5 30,5 31,5 32,6 33,6 1 18,3 19,3 20,4 21,4 22,4 23,5 24,5 25,6 26,6 27,6 28,7 29,7 30,8 31,9 32,9 34,0 35,0 2 19,3 20,4 21,4 22,4 23,5 24,5 25,6 26,9 27,9 29,0 30,0 31,1 32,2 33,2 34,3 35,4 36,5 3 20,8 21,8 22,9 23,9 25,0 26,1 27,1 28,2 29,3 30,3 31,4 32,5 33,6 34,7 35,7 36,8 37,9 4 22,0 23,1 24,2 25,2 26,3 27,4 28,5 29,6 30,7 31,7 32,8 33,9 35,0 36,1 37,2 38,3 39,4 5 23,3 24,4 25,5 26,6 27,7 28,8 29,9 31,0 32,1 33,2 34,3 35,4 36,5 37,6 38,7 39,8 41,0 6 24,7 25,8 26,9 28,0 29,1 30,2 31,3 32,4 33,5 34,6 35,8 36,9 38,0 39,1 40,3 41,4 42,6 7 26,0 27,1 28,3 29,4 30,5 31,6 32,8 33,9 35,0 36,2 37,3 38,4 39,6 40,7 41,9 43,0 44,2 8 27,4 28,6 29,7 30,8 32,0 33,1 34,3 35,4 36,5 37,7 38,9 40,0 41,2 42,3 43,5 44,7 45,9 9 28,9 30,0 31,2 32,3 33,5 34,6 35,8 37,0 38,1 39,3 40,5 41,6 42,8 44,0 45,2 46,4 47,6 10 30,3 31,5 32,7 33,8 35,0 36,2 37,4 38,6 39,7 40,9 42,1 43,3 44,5 45,7 46,9 48..1 49,3 11 31,9 33,0 34,2 35,4 36,6 37,8 39,0 40,2 41,4 42,6 43,8 45,0 46,3 47,5 48,7 49,9 51,2 12 33,4 34,6 35,8 37,0 38,8 39,4 40,7 41,9 43,1 44,3 45,6 46,8 48,1 49,3 50,5 51,8 53,1 13 35,0 36,2 37,5 38,7 39,9 41,1 42,4 43,6 44,9 46,1 47,4 48,6 49,9 51,2 52,4 53,7 55,0 14 36,7 37,9 39,1 40,4 41,6 42,9 44,2 45,4 46,7 48,0 49,3 50,5 51,8 53,1 54,4 55,7 57,0 15 38,4 39,6 40,9 42,2 43,4 44,7 46,0 47,3 48,6 49,9 51,2 52,5 53,8 55,1 57,4 58,8 59,1 16 40,1 41,4 42,7 44,0 45,3 46,6 47,9 49,2 50,5 51,8 53,2 54,5 55,8 57,2 58,5 59,9 61,2 17 41,9 43,2 44,5 45,9 47,2 48,5 49,8 51,2 52,5 53,9 55,2 56,6 58,0 59,3 60,7 62,1 63,5