UNIVERSIDAD DE COLIMA Maestría en Ciencias: Área Biotecnología

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(1)UNIVERSIDAD DE COLIMA Maestría en Ciencias: Área Biotecnología Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre de Perote. Tesis Que para obtener el grado de:. Maestro en Ciencias, Área Biotecnología Presenta: ANGEL ENRIQUE NÚÑEZ SÁNCHEZ. Asesores: DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZ. M. en C. GLORIA LUZ LAURA CARRIÓN VILLARNOVO. Tecomán, Colima, México. Septiembre del 2002..

(2) UNIVERSIDAD. DE. COLIMA. FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS OFICIO No. 440/2002.. C. ANGEL ENRIQUE NUÑEZ SANCHEZ EGRESADO DE LA MAESTRIA EN CIENCIAS AREA: BIOTECNOLOGIA PRESENTE.. Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: de Biotecnología de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Maestría y en virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado los integrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis " Aislamiento y evaluación de hongos nemátofagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll) en la región Cofre de Perote ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Oscar Rebolledo Dominguez y la M.C. Gloria Luz Laura Carrión Villarnovo, Profesor-Investigador de la Universidad de Colima e Investigadora del Instituto de Ecología de Xalapa, Veracruz. Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias; Area: Biotecnología y fue revisado en cuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Alfonso Pescador Rubio. Dr. Oscar Rebolledo Domínguez y la M.C. Edelmira Galindo Velasco, Profesores-Investigadores de la Universidad de Colima. Sin otro particular de momento. me despido de usted muy cordialmente.. ATENTAMENTE “ESTUDIA * LUCHA * TRABAJA” TECOMÁN, COL., A 27 DE AGOSTO DEL 2002.. ING. RODOLFO VALENTINO MORENTÍN DELGADO DIRECTOR. C.C.P. EXPEDIENTE ACADEMICO DEL ALUMNO C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE. C.C.P. ARCHIVO. Of. No. 44012002. RVMD/Lety* *. Km 40 Autopista Colima-Manzanillo • Tecomán, Colima, México • C.P. 28100 Tel. 01 (313) 322 94 05 • Ext. 52251 • Fax 52252 • [email protected].

(3) DEDICATORIA A mi esposa Conchita, mis hijos María del Carmen, Luisa Fernanda y Angel Enrique, por enseñarnos que este logro es el resultado de el esfuerzo conjunto, con todo lo que exige de renuncia y entrega, de lucha y de esperanza, de contagiar valores, de soñar utopias y generar proyectos, de señalar causes y seguir con constancia nuestro propio camino. A mis padres José Cruz y María del Carmen, por tanto ejemplo por tanto orgullo, por su invaluable apoyo y su lucha incansable para sacarnos adelante. A mis hermanos, María Araceli, Luis Carlos, Marco Antonio, Carmen Patricia, Mario Alberto, María Cristina, Edna Guadalupe, José Cruz y José Manuel, Angel Armando y Alma Angelina, Gerardo Alonso; por ese espíritu de lucha que los caracteriza y la seguridad de saber que nunca hemos estados solos. A mis cuñados y cuñadas, nuestros sobrinos por formar parte una gran familia. A Don Norberto y Lola Gámes de Ocoroni Sinaloa por demostrarme que la humildad es toda una virtud. A los amigos de ayer generación 1959-1965 de la Escuela Primaria Enrique Quijada de Nogales Sonora, por todas las vivencias de esa época que fuerte influencia género en mi formación. Donde quiera que estén, los recuerdo; desde siempre y hasta siempre..

(4) AGRADECIMIENTOS A Dios, por permitir encontrar en mi camino a personas generosas y comprensivas, que con su apoyo pude alcanzar es meta....Gracias Señor A mí hija María del Carmen, por su apoyo, su dedicación y esfuerzo, deseando que este estudio sea muy significativo en tu formación profesional. Al Dr. Oscar Rebolledo Domínguez, Profesor investigador de la Universidad de Colima, a quien agradezco su invaluable asesoramiento, apoyo y dedicación para la realización de esta trabajo y por ser un autentico tutor y amigo. A la M. En C. Gloria L. L. Carrión V. Investigadora del Instituto de Ecología Xalapa A.C. por darme la oportunidad de superarme por su comprensión y valioso apoyo en el asesoramiento y realización de esta investigación eternamente agradecido. A la comisión revisora, integrada por el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Dr. Oscar Rebolledo Domínguez y M. en C. Edelmira Galindo Velazco por su dedicación, observaciones y sugerencias al manuscrito del presente trabajo. A la Universidad Veracruzana, por otorgarme la oportunidad de participar en los programas de posgrado. A la Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación por su apoyo para llevar acabo esta etapa de capacitación. A la Universidad de Colima, por permitirme realizar con el apoyo de su personal académico y administrativo los estudios de Maestría en Ciencias en Biotecnología..

(5) Al Instituto de Ecología Xalapa, A.C. por permitirme desarrollar el presente estudio en sus instalaciones mí reconocimiento al personal académica y administrativo por su apoyo en pro de la investigación. A Promep, por el apoyo económico y moral otorgado para proseguir estudio de posgrado. Al Dr. Jaime Molina Ochoa, por apoyar mi ingreso a la Universidad de Colima, por su amistad y ayuda desinteresada. Al Dr. Roberto Lezama Gutiérrez de la Universidad de Colima por su simpatía a este proyecto, sus acertado consejos y conocimientos para logar culminar este estudio. A la M. en C. Marycruz Abato Zarate de la Facultad de Ciencias Agrícolas de Universidad Veracruzana por su orientación y apoyo tan valioso para la realización de este trabajo, pero ente todo por su alegría y entusiasmo. Al Químico Jesús Gerrero de la Falcultad de Ciencias Agrícolas de Universidad Veracruzana por la ayuda durante el desarrollo de este estudio. A la M. en C. Irma López Guerrero,. al M. en C. Santiago Chacón Zapata,. investigadores del Instituto de Ecología por sus recomendaciones en la realización de esta Tesis. Al Técnico Tiburcio Laez Aponte, del Instituto de Ecología Xalapa A.C. por su ayuda en la toma de fotografías en el microscopio electrónico de barrido. Al Ing. José Regalado Aguayo, Jefe de Distrito de Desarrollo Rural Coatepec por su apoyo y autorización para continuar estudio de posgrado..

(6) Al Lic. Mario Urbina de la Unidad de Capacitación de la Delegación SAGARPA en Veracruz, por su entusiasta apoyo. Al Ing. Arturo Paredes Tenorio, por la formación aportada sobre el nematodo dorado de la papa en Perote. A Doña Chepi, por su apoyo moral, pero sobre todo por su confianza y amistad. A mi compañero de Maestría en Ciencias Ing. Rubén Ramiro Sandoval por su apoyo y amistad. A todas aquellas personas que de alguna o otra manera contribuyeron a la realización de un sueño de tantos.........

(7) INDICE Página RESUMEN ABSTRACT. ......................................................................................... ......................................................................................... I.- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... HIPÓTESIS ......................................................................................... OBJETIVOS ......................................................................................... II.-ANTECEDENTES . ......................................................................................... 2.1. Síntomas y daño ocasionado por Globodera rostochiensis........................... 2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochienis.................................... 2.3. Característica morfológicas de Globodera rostochiensis................................ 2.4.Biología..................................................................................................... 2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos........................................... 2.5.1. Control químico.................................................................................. 2.5.2. Control físico....................................................................................... 2.5.3. Inundación Artificial y Natural............................................................... 2.5.4. Rotación de Cultivos............................................................................ 2.5.5. Control genético.................................................................................. 2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas................................................ 2.5.7. Legislación de control......................................................................... 2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos............................................. 2.6.1. La bacterias en el control biológico de nematodos fitopatogenos............. 2.6.2. Rickettisas.......................................................................................... 2.6.3. Nematodos Depredadores.................................................................... 2.6.4. Depredadores Heterogéneos................................................................ 2.7. Hongos parásitos de nematodos................................................................. 2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos........................... 2.7.2. Los Hongos endoparásitos.................................................................. 2.7.3. Productores de toxinas....................................................................... 2.7.4. Hongos facultativos antagonistas de nematodos................................... 2.7.5. Hongos parásitos de huevos, hembra y quistes..................................... 2.7.6. Distribución de hongos parásitos de nematodos.................................... III.- MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................ 3.1. Ubicación y descripción del área de estudio................................................. 3.1.1. Clima................................................................................................. 3.1.2. Geología............................................................................................. 3.1.3. Suelos................................................................................................ 3.1.4. Hidrografía.......................................................................................... 3.1.5. Topografía.......................................................................................... 3.1.6. Vegetación......................................................................................... 3.1.7. Toma de muestra............................................................................... 3.1.8. Extracción de quistes.......................................................................... 3.1.9. Densidad de la población de quistes...................................................... 1 2 3 7 7 8 11 15 16 18 20 21 22 22 22 23 24 24 25 26 26 26 27 28 28 31 34 34 35 39 42 42 42 42 44 44 44 44 47 47 48.

(8) Página 3.2. Aislamiento de hongos asociados a quistes................................................. 48 3.2.1. Identificación de hongos...................................................................... 49 3.2.2. Conservación de los aislamientos.......................................................... 49 3.3. Bioensayo del proceso de infección de hongos sobre quistes de Globodera rostochienis.............................................. .............................................. 50 3.3.1. Preparación del inoculo........................................................................ 50 3.3.2. Obtención de quistes sanos.................................................................. 50 3.3.3. Inoculación de los quistes de Globodera rostochiensis............................ 51 3.3.4. Pruebas de patogenicidad.................................................................... 51 IV.- RESULTADOS................................. ........................................................... 53 4.1. Densidad de población de Globodera rostochiensis en las localidades de estudio .................................................................................................. 53 4.2. Análisis de suelo........................................................................................ 56 4.3. Correlación entre materia orgánica y densidad de población ........................ 57 4.4. Hongos aislados de los quistes de Globodera rostochiensis en la región de Cofre de Perote....................................................................................... 58 4.5. Proceso de infección de tres hongos aislados de quistes de Globodera rostochiensis...... .............................................. ..................................... 60 4.6. Patogenicidad y esporulación de tres hongos sobre Globodera rostochiensis................. ......................................................................... 66 V.- DISCUSIÓN................................................................................................ 72 VI.- CONCLUSIÓN............................................................................................ 80 VII.- LITERATURA CITADA .............................................................................. 81.

(9) INDICE DE CUADROS. Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa Globodera rostochienis en México.. Página 11. Cuadro 2. Hongos predadores y endoparásitos de larvas de nematodos.. 33. Cuadro 3. Reportes de parasitismo naturales por hongos en hembras, huevos y quistes de nematodos en diferentes regiones en el mundo. 41. Cuadro 4. Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición. 54. Cuadro 5. Proporciones de cada localidad en sus tres categorías.. 55. Cuadro 6: Análisis de los datos de densidad de población de quistes en las localidades de estudio, con la Prueba ”G” de Bondad de Ajuste con Repetición.. 56. Cuadro 7. Niveles de pH y contenido de materia orgánica en las muestras de las localidades estudiadas.. 56. Cuadro 8. Resultado de la correlación entre la cantidad de materia orgánica, el pH, la cantidad total de quistes y las condiciones físicas de los quistes en las seis localidades estudiadas.. 57. Cuadro 9. Hongos nativos asociados a quistes de Globodera rostochiensis en la región Cofre de Perote. 58 Cuadro 10. Clasificación taxonómica de los hongos aislados a quistes de Globodera rostochienis.. 59. Cuadro 11. Análisis de varianza de la patogenicidad de hongos nativos sobre quistes de Globodera rostochiensis.. 66. Cuadro 12. Porcentajes de quistes de G. rostochiensis con la esporulación de hongos nativos inoculados. 67.

(10) INDICE DE FIGURAS Página FIGURA 1. Dispersión Globodera rostochiensis en el mundo.. 9. FIGURA 2: Cuello y puntuaciones del quistes 750x.. 17. FIGURA 3: Corte transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x.. 17. FIGURA 4: Cono vulvar 500x.. 17. FIGURA 5: Estrías del corión 1000x.. 17. FIGURA 6. Ciclo biológico de Globodera rostochiensis.. 19. FIGURA 7. Ubicación geográfica de zona de estudio.. 43. FIGURA 8. Diagrama de flujo de Materiales y Métodos.. 52. FIGURA 9. Total de quistes obtenidos por kilogramo de suelo en las localidades de estudio.. 53. FIGURA 10. Clasificación de los quistes obtenidos de acuerdo a condiciones físicas por localidad.. 55. FIGURA 11. Acremonium incrustatum esporas de sobre el corión 12 hrs después de la inoculación 2,000x.. 61. FIGURA 12: Acremonium incrustatum Tubos germinativos vistos en la parte interna del corión 24 hrs después de la inoculación 1,500x.. 61. FIGURA 13: Acremonium incrustatum tubos germinativos a las 48 hrs 1,500x.. 61. FIGURA 14: Huevos de Globodera rostichienis con micelio de Acremonium incrustatum a las 72 hrs 1,000x.. 61. FIGURA 15: Acremonium incrustatum micelio de saliendo del corión 96 hrs 1,000x.. 61.

(11) FIGURA 16: Acremonium incrustatum conidióforo emergiendo del corión 120 hrs 2,000x.. 61. FIGURA 17: Paecilomyces carneus grupo de esporas germinando 12 hrs después de la inoculación 3,500x.. 63. FIGURA 18: Paecilomyces carneus esporas con tubos germinativos inmersos y superficiales 24 hrs después de la inoculación 1,500x.. 63. FIGURA 19: Paecilomyces carneus micelio desarrollado sobre el corión a las 72 hrs 500x.. 63. FIGURA 20: Paecilomyces carneus formación de fialides y conidióforos esporulando a las 96 hrs 1,500x.. 63. FIGURA 21: Paecilomyces carneus cadenas de esporas sobre el corión 750x.. 63. FIGURA 22: Huevos rodeados de micelio de Paecilomyces carneus 100x.. 63. FIGURA 23: Phialophora malorum germinación de una espora 12 hrs después de la inoculación 3,500x. 65. FIGURA 24: Phialophora malorum tubos germinativos 72 hrs 1,500x.. 65. FIGURA 25: Phialophora malorum micelio desarrollándose sobre el corión a las 96 hrs 750x.. 65. FIGURA 26: Phialophora malorum micelio sobre huevos 120 hrs después de la germinación 750x.. 65. FIGURA 27: Parte interna del corión con micelio de a Phialophora malorum los 18 días 750x. 65 FIGURA 28: Quiste cubierto de micelio de Phialophora malorum a los 28 días.. 65. FIGURA 29: Porcentaje de quistes infectados.. 66.

(12) FIGURA 30: Acremonium incrustatum conidióforo y micelio sobre el corión 2,000x.. 68. FIGURA 31: Huevo enrollado de micelio de Acremonium incrustatum 500x. 68 FIGURA 32: Micelio de Acremonium incrustatum interior del quiste 500x.. 68. FIGURA 33: Quiste cubierto de micelio Acremonium incrustatum 100x.. 68. FIGURA 34: Testigo quiste de Globodera rostochienis 750x.. 68. FIGURA 35: Testigo huevos de en el interior del quiste de Globodera rostochiensis 500x.. 68. FIGURA 36: Paecilomyces carneus conidióforo 2,000x.. 69. FIGURA 37: Paecilomyces carneus cadenas de conidios y micelio sobre el quiste 750x.. 69. FIGURA 38: Micelio de Paecilomyces carneus sobre la masa de huevos 750x.. 69. FIGURA 39: Quiste cubierto por micelio y conidióforos de Paecilomyces carneus 150x.. 69. FIGURA 40: Testigo quiste sano 100x.. 69. FIGURA 41: Huevos de Globodera rostochiensis en el interior del quiste 500x.. 69. FIGURA 42: Phialophora malurum grupo de esporas 1,500x.. 70. FIGURA 43: Espora y micelio de Phialophora malurum sobre el quiste 100x. 70 FIGURA 44: Micelio de Phialophora malurum sobre el corión 200x.. 70. FIGURA 45: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos 750x.. 70. FIGURA 46: Micelio de Phialophora malurum en la masa de huevos y corión 500x.. 70. FIGURA 47: Quiste cubierto por micelio de Phialophora malurum 150x.. 70.

(13) FIGURA 48: Testigos de Globodera rostochiensis 250x.. 71. FIGURA 49: Conjunto de huevos de Globodera rostochiensis en el interior del quiste 500x. 71.

(14) Aislamiento y evaluación de hongos nematófagos asociados a quistes de Globodera rostochiensis (Woll.) en la región del Cofre de Perote. Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.. RESUMEN El nematodo dorado Globodera rostochiensis es una de las principales plagas en el cultivo de la papa Solanum tuberosum a nivel mundial; en México se encuentra extendido prácticamente en toda las regiones donde se cultiva. Diversas especies de hongos funcionan en la naturaleza como reguladores de poblaciones, sin embargo sobre este nematodo pocas especies se conocen. Los objetivos de este trabajo fueron aislar y determinar los hongos parásitos de G. rostochiensis en cultivos de papa de la región del Cofre de Perote, Veracruz, México y describir el proceso de infección sobre los quistes de especies seleccionadas. Se tomaron muestras de suelo de seis localidades (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados y Los Altos). Los quistes se obtuvieron mediante la técnica del flotador de Fenwick, se cuantificaron. La cantidad de quistes obtenida fue de 300 hasta 2216 quistes/kg de suelo. De cada muestra se tomaron al azar 100 quistes jóvenes para aislar hongos parásitos. El parasitismo natural obtenido del total de muestras trabajadas fue de 3.5%. Se obtuvieron 21 cepas de hongos: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2). Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus y Phialophora malorum, fueron seleccionados para estudiar el proceso de infección. En los quistes inoculados con A. incrustatum y P. carneus se encontró evidencia de germinación, penetración y desarrollo del micelio sobre el corión y en los huevos, la capa vitalina se separó y se observó vacuolización en la superficie de los huevos y el mucílago desapareció; los conidióforos emergieron del quiste, y se formaron las primeras esporas a las 72hrs. Sin embargo, en los quistes inoculados con P. malorum no se observó la germinación de las esporas hasta 5 días después de la inoculación, el micelio dentro de los quistes continuó su crecimiento y 15 días después se encontraron algunos quistes negros, esto debido a que gran cantidad de micelio estaba desarrollado en el interior del quiste, posteriormente entre los 18-20 días se observó su esporulación. A. incrustatum y P. carneus pueden ser considerados buenos candidatos para usarlos en pruebas de control biológico a nivel de parcelas experimentales, por la velocidad para infectar y destruir los quistes. Palabras clave: Control biológico, papa, nematodo enquistado, Globodera rostochiensis, hongos nematofagos.. 1.

(15) Isolation and evaluation of nematophagus fungi associated to cyst of Globodera rostochiensis in the region Cofre de Perote. Núñez Sánchez, Angel Enrique. Facultad de Ciencias Biológicas Agropecuarias, Universidad de Colima.. ABSTRACT The golden cyst nematode Globodera rostochiensis is one of the main pest in the crop potato Solanum tuberosum to world level; in Mexico is extended practically in the whole regions where it cultivated. Diverse species of fungi work in the nature like controllers of populations, however on this nematode few species know. The objectives of this work were isolate and determine parasites fungi parasites of G. rostochiensis in cultivation potato of the region of Cofre de Perote, Veracruz, México and describe the process of infection on the cysts of selected species. Were taken samples of soil of six localities (Conejos, Tembladeras, Rancho Nuevo, Escobillo, Pescados and Los Altos). The cysts were obtained by means of the technique of the float of Fenwick, were quantified. The amount of obtained cysts was from 300 up to 2216 cysts/kg soil. From each sample taken 100 young cysts at random in order to isolate parasites fungi . The natural parasitism obtained of the total of worked samples was from 3.5%. 21 stumps were obtained: Aspergillus sp. (1), Chetomidium sp. (1), Cladosporium sp. (3), Drechslera sp. (1), Fusarium sp. (1), Micelia sterilia (1), Pteroconium sp. (1), Trichocladium asperum (2), Ulocladium atrum (1), Acremonium incrustatum (1), Paecilomyces carneus (5), Phialophora malorum (1), Phialophora sp. (2). Acremonium incrustatum, Paecilomyces carneus and Phialophora malorum, were selected to study the process of infection. In the cysts inoculated with A. incrustatum and P. carneus was evidence of germination, penetration and mycelium was development on the chorion and in the eggs, the vitelline membrane separated and was observed vacuolization in the surface of the eggs and the mucilage disappeared; the conidiophore emerged of the cyst, and they were formed the first spores to the 72hrs. However, in the cysts inoculated with P. malorum was not observed the germination of the spores up to 5 days after the inoculation, the mycelium inside the cysts continued its growth and 15 days later were some black cysts, this because great amount of mycelium was developed inside the cyst, later on between the 18-20 days their sporulation was observed. A. incrustatum and P. carneus could be considered good candidates to use them in tests of biological control to level of experimental parcels, for the speed in order to infect and destroy the cysts. Key words: Biological control, potato, golden cyst nematode, Globodera rostochiensis, nematophagus fungi.. 2.

(16) I.- INTRODUCCIÓN. La papa, Solanum tuberosum L., es originaria de Sudamérica de la región de los Andes y es uno de los cultivos más extendidos en el mundo (FAO, 1996). Entre los parásitos que la afectan, los nematodos son muy importantes; en Norteamérica más de 20 especies de nematodos han sido registrados asociados al cultivo de papa (MacGuidwin, 1993). Globodera rostochiensis (Woll.) es uno de los nematodos que causa más estragos en la mayoría de las zonas productoras de papa (Eppo, 1994). Globodera rostochiensis es un nematodo endoparásito sedentario, con alta capacidad de reproducción y sobrevivencia ya que las hembras están cubiertas por una capa dura (corión) formando un quiste, de manera que los huevos están bien protegidos. Los quistes permanecen normalmente en el suelo hasta 20 años. Cada quiste joven contiene entre 200-500 huevos (Evans y Trudgill, 1993; Franco, 1994). Este nematodo se ha registrado en más de 90 especies de Solanáceas, aunque los hospederos más susceptibles, además de la papa, son el tomate, Lycopersicum esculentum Mill. y la berenjena, Solanum melongena L. (Greco y Moreno, 1992). Afecta el sistema radicular de la planta, disminuyendo la cantidad de minerales absorbidos (fósforo, potasio, magnesio y calcio) y su translocación; además aumenta la concentración de sodio (Perry, 1996; Trudgill, 1991). De manera que al dañar a las membranas de la raíz de la planta, facilita la entrada de hongos y bacterias (Evans y Trudgill, 1992). El efecto de este nematodo en el rendimiento del cultivo, varía de acuerdo a la densidad de población. El límite de tolerancia establecido en Europa hacia los nematodos formadores de quistes, para no afectar el rendimiento, es de 1.9 huevos/g de suelo o de hasta 40 quistes/kg de suelo.. 3.

(17) Cuando el nivel poblacional del nematodo en el suelo alcanza 16 y 32 huevos/g de suelo, el rendimiento de la papa puede ser reducido entre 20 y 50% respectivamente; y puede disminuir completamente cuando la población inicial del nematodo es de 64 huevos/gr de suelo (EPPO, 1994; Perry, 1996; Greco, 1993). Debido a la fuerte infestación de G. rostochiensis, en la región de Perote, donde se han registrado en promedio 1000 quistes/kg de suelo, la Secretaria de Agricultura estableció la Cuarentena Interior Permanente No. 17 (SARH, 1987), que comprende 6,000 hectáreas dedicadas al cultivo de la papa. La alta densidad de la población del nematodo, obliga a la aplicación de agroquímicos, utilizando hasta 50 kg de nematicidas por hectárea al momento de la siembra; las consecuencias son: el incremento en los costos de producción, aumento de los riesgos de la salud humana por los residuos químicos (Gommers et al., 1992), la contaminación del suelo y mantos freáticos y el desarrollo de resistencia del nematodo a los nematicidas (Whitehead et al., 1994). El control de los nematodos enquistados sobre el cultivo de la papa, se realiza con el uso de los nematicidas químicos, sin embargo, por razones del peligro que representan para la salud y las dificultades en el desarrollo comercial han llevado a la búsqueda de alternativas de control que reduzcan los riesgos del uso de los productos químicos. Un acercamiento lógico a esta alternativa, es la implementación de prácticas que incluyan la aplicación de microorganismos antagonistas, que suceden de forma natural o que pueden ser establecidos en el desarrollo de un ecosistema (Sikora, 1992). El hecho, de que los niveles de parasitismo de hongos sobre los nematodos enquistados, donde son introducidos, sea mucho menor, que en los centros de origen, pareciera indicar, que estos fitopatógenos no tienen enemigos naturales y que el control biológico para ellos no tendría grandes expectativas (Sayre et al., 1991; Sikora, 1992; Dackman y Norbring-Hertz, 1992).. 4.

(18) Sin embargo en la naturaleza las poblaciones de los animales mantienen una fluctuación cíclica, cuyo número varia año con año y de generación en generación. Los nematodos son muy pequeños y sus hábitats han sido raramente estudiados. En este aspecto los nematodos no se diferencian de los animales (Varley et al. 1973; Knipling, 1979; Berryman, 1981). Hay dos factores que gobiernan la abundancia de los animales; una, que opera independientemente de la densidad y otra, que depende de la densidad. Pero en el suelo, la más común, son los factores que actúan independientemente de la densidad. Los factores que más influyen sobre las poblaciones de los nematodos fitoparásitos son la humedad y la temperatura, así como, las prácticas agrícolas, además de los parásitos facultativos y depredadores (Stirling, 1991; Varley et al., 1973; Knipling, 1979; Berryman, 1981). Estas fuerzas son impredecibles, pero juegan un importante papel en la determinación de las áreas ecológicas, en las cuales estos organismos pueden existir permanentemente, y determinan la fluctuación de la población (Stirling, 1991). Los factores densodependientes son la clave para los procesos regulatorios del tamaño poblacional de las especies. Esta acción tiende a crear un efecto estabilizador sobre una población que esta arriba de su punto de equilibrio, de manera que la reduce y si la población está por debajo de ese punto, la aumenta. Como consecuencia de lo anterior, los hongos habitantes del suelo de la Clase, Hyphomycetes, consistentemente colonizan quistes de nematodos fitoparásitos y que son, en gran medida, la causa del control de las poblaciones de estos nematodos, logrando penetrar al quiste, destruir los huevecillo y a las larvas, por varios medios (Dackman y Nordbring-Hertz, 1985; Gintis et al., 1983; Morgan-Jones y RodriguezKabana, 1988). Esto, hace suponer, que si bien es cierto, que el nematodo en quistado G. rostochiensis, no se le han reportado enemigos naturales fuera de su centro de origen,. 5.

(19) según Tribe (1980), no se puede concluir que este exento de microorganismos parásitos y depredadores. El uso de microorganismos para el control de plagas y enfermedades de las plantas por otros microorganismos es una alternativa al uso del control químico; y estimula la búsqueda de agentes de biocontrol (Inbar y Chet, 1997; Lindow y Wilson, 1998). Los organismos que abundan en el suelo, particularmente con potencial antagonista, han sido propuestos como un marcador biológico útil para la sanidad del ecosistema (Niles y Freckman, 1998; Stork y Eggleton, 1992; Yeates, 1994) y han impulsado el estudio de los enemigos naturales para el control de nematodos (Sayre et al., 1991), y que en alguna etapa del ciclo de vida los utilizan como una fuente de nutrientes, y desempeñan un importante papel en el reciclaje del carbono, nitrógeno y otros elementos de la biomasa. El aumento de la población de nematodos en el suelo va acompañada por epizootias de hongos antagonistas (Sikora, 1992; Stirling et al., 1990); de esta forma atacan a los nematodos continuamente en todos los suelos (Uziel y Sikora, 1992). Las plagas de la raíz son generalmente raras en los ecosistemas no perturbados o naturales, mientras que en los sistemas de producción convencionales, los patógenos del suelo y las enfermedades que causan, son severas y a menudo, un factor limitante de la producción (Cook y Baker, 1983).. Los hongos nativos son reconocidos como. contribuidores comunes para la supresión de plagas en sistemas de cultivo (Dackman y Norbring-Hertz, 1992). El control biológico es efectivo cuando un antagonista tiene un alto grado de adaptabilidad al medio donde se va a establecer (Lindow y Wilson, 1998). Generalmente, el suelo no estéril, es considerado un ambiente hostil para la introducción de microorganismos, incluyendo agentes de control biológico, ya que los microorganismos nativos frecuentemente son rivales superiores ó de lo contrario son antagonistas (Cook y Baker, 1983).. 6.

(20) El nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis representa un grave problema en la Región Cofre de Perote, sin embargo poco es el conocimiento, sobre la diversidad de especies de hongos nematofagos asociados y el potencial de estos como agentes de control biológico. De tal forma que la investigación parte de la siguiente hipótesis HIPÓTESIS Las poblaciones de hongos nativos de la zona productora de papa en el Cofre de Perote tienen actividad nematofaga contra G. rostochiensis. OBJETIVOS Evaluar el estado actual de la población de G. rostochiensis en las localidades de estudio en la región Cofre de Perote. Aislar e identificar hongos nativos parásitos de quistes de G. rostochiensis en la región del Cofre de Perote, Veracruz. Evaluar la patogenicidad de hongos nativos sobre quistes de G. rostochiensis, in vitro.. 7.

(21) II.-ANTECEDENTES El nematodo dorado se considera originario de los países andinos (Perú y Bolivia). Se detectó por primera vez en Alemania en 1881 y fue descrito en 1923 por Wollenweber (Franklin, 1971). La introducción original del nematodo a Europa fue muy probablemente durante el establecimiento del cultivo en 1850 y se dispersó a países de Asia (India, Pakistán Japón y Malasia), África (Egipto, Marruecos, Sierra Leona y Sudáfrica), Australia y centro y norte de América, probablemente con el comercio de tubérculos de papa para semilla. Actualmente se registra en 65 países (Jones, 1976) (Fig.1). Otro aspecto que influye en la magnitud del daño ocasionado por este nematodo, son los cinco patotipos identificados; (Ro1, Ro2, Ro3, Ro4, Ro5) a nivel mundial (Evans y Trudgill, 1993; Greco, 1993). Globodera pallida (Stone) es otra especie de nematodo que forma quistes, llamada quiste blanco de la papa y al igual que G. rostochiensis causa graves daños. Se ha registrado en el centro y oeste de Europa. En América se le conoce de Colombia, Ecuador y gran parte del Perú. (Evans y Trudgill, 1993; Greco, 1993). Seis patotipos se han determinado en G. pallida: tres en Europa (Pa1, Pa2, Pa3) y tres en la zona andina (P4A, P5A, P6A). Ambas especies se tienen registradas para el sur del Perú, Bolivia, y Argentina, donde han cohabitado con sus hospederos por cientos de años (Stone, 1986). Sin embargo solo se ha registrado G. rostochiensis en Chile, Venezuela, Centro América, México y EUA (Stone, 1979; Sosa-Moss, 1986).. 8.

(22) 9.

(23) La papa que se produce en México se siembra en 25 estados de la República en tres ciclos agrícolas otoño-invierno, invierno-primavera y primavera-verano en este último se hace el 80% de la siembra. La superficie cultivada es de alrededor de 70 mil hectáreas aproximadamente, con una producción de 1’200,000 toneladas los principales estados productores de papa son: Chihuahua, Sinaloa, Sonora, Guanajuato, México, Nuevo León, Coahuila, Puebla y Veracruz (ASERCA, 1999). La producción comercial en la región montañosa de México se concentra entre los 2,000-3,000 m de altitud, en zonas de temporal y se distingue en seis áreas: Puebla, Toluca, Sierra Tarasca de Michoacán, La Malinche en Tlaxcala, Pico de Orizaba y Cofre de Perote, que en conjunto comprenden una superficie de 25,000 hectáreas aproximadamente (CONPAPA, 1994). Se tienen registros de Globodera spp. de muestras de suelo tomadas de un carro de carga americano utilizado para transporte de papas en el centro de México en 1953. Sin embargo la presencia de G. rostochiensis fue confirmada en Guanajuato por Iverson (1972); por lo cual se inició la inspección de las zonas productoras de papa. Hasta 1986 se tenía registrado el nematodo dorado en 46 zonas de 9 estados; México, Puebla y Tlaxcala son los estados más infectados (Sosa-Moss, 1986). Actualmente esta disperso en la mayoría de las zonas en las que se cultiva papa en México (Cuadro 1).. 10.

(24) Cuadro 1. Zonas más infestadas con nematodo dorado de la papa Globodera rostochiensis en México. ESTADO MUNICIPIO Coahuila Arteaga Distrito Federal. Delegación Tlalpan y Delegación Milpa Alta. Hidalgo. Metztitán. Guanajuato. León, San Francisco del Rincón, Silao, Romita, Purísima del Rincón.. Estado de México. Zinantepec, Temascaltepec, Calimaya, San Antonio de la Isla, Santa María Rayón, Amanalco de Becerra, San Bartolo Morelos, Naucalpan, Donato Guerra, Lerma, San Felipe del Progreso, Valle de Bravo, Joquincingo y Metepec.. Nuevo León. Galeana. Puebla. Ixtacamaxtitlán, Saltillo Lafragua, Tlapanala, Guadalupe Victoria, Atzitzintla, Tehuacan, Chalchicomula de Sesna, Huitzilán, de Serdán y Tlachichuca.. Tlaxcala. Cuapiaxtla, Altzayanca, El Carmen, Huamantla, Terrenate, Tlaxco y Santa Ana Chiautempan. Veracruz. Altotonga, Ayahualulco, Perote y Xico. 2.1. Síntomas y daño ocasionado por G. rostochiensis El síntoma típico de la presencia de nematodo dorado de la papa en el suelo es la marchites temprana en las plantas de papa asociado con estrés hídrico (Evans y Stone, 1977). Como consecuencia de la alimentación del nematodo, el daño histológico es manifestado por necrosis de las células de las raíces, perforadas por los estados juveniles larvarios, cuando éstos se detienen en el lugar definitivo de alimentación, las células de las raíces alrededor de la cabeza del nematodo sufren una profunda transformación.. 11.

(25) La hembra se adhiere y alimenta cerca del cilindro vascular, dando origen a unidades multinucleadas denominadas sincitio (hiperplasia de las células) cerca de la cabeza del nematodo, las que se forman por incorporación de un conjunto de las células adyacentes cuyas paredes se han disuelto. La formación del sincitio ocasiona una interrupción de los vasos cribosos y leñosos limitando notablemente la funcionalidad de las raíces. Las plantas de papa atacadas por el nematodo presentan crecimiento y rendimiento reducidos, la senectud se anticipa y en suelos muy infestados, el follaje presenta un ligero amarillamiento; las hojas individuales de las plantas infectadas son pequeñas por la pobre división celular. Por consiguiente las plantas infestadas tienen una mayor proporción de materia en la pared celular, el volumen de materia seca es mayor que en las plantas sanas. La presencia de nematodos enquistados causa la reducción fotosintética (por la ruptura del translocamiento de nutrientes, la relación planta-agua); incrementa la materia seca, la adhesión de raíces y por consiguiente la producción de menos tallos y hojas pequeñas poco suculentas y mueren tempranamente, hay poca formación de nuevas hojas, el número de tubérculos decrece. Las altas densidades del nematodo reducen el rendimiento y es más difícil decir debido a que combinación, la reducción del crecimiento de la planta es causado por una reducción de la absorción, incrementando el contenido de materia seca, la necrosis del follaje y la muerte temprana del mismo. El decremento de agua absorbida por las plantas altamente infestadas por el nematodo debido al mal funcionamiento del sistema radicular, tiene como consecuencia el desprendimiento de las hojas. Finalmente la muerte ocurre cuando el nivel de agua continua decreciendo y se prolonga la resistencia estomática (Evans y Trudgill, 1992).. 12.

(26) Las larvas se vuelven activas a 10°C y la máxima invasión de las raíces se realiza a 16°C. Temperaturas del suelo de 26°C, en períodos prolongados limitan el desarrollo del nematodo y reducen su reproducción. El nematodo dorado de la papa se desarrolla bien en los suelos arcillosos medianos a pesados, bien drenados o arenosos con aireación, suelos sedimentados o de musgo con un contenido de humedad de 50 a 75% de capacidad de campo. El pH del suelo tolerado por la planta de papa, es aparentemente aceptado por los nematodos (Stone, 1979). En ausencia del cultivo de la papa, en zonas de clima templado, el nivel poblacional disminuye en un 50% cada año, mientras que en países con clima cálido, como Marruecos, puede ocurrir una reducción de casi 100% (Schuster y Sikora, 1992a). En países con clima cálido, la superficie del suelo, en el verano, se calienta mucho y los nematodos que se encuentran en los primeros 5-10 cm mueren naturalmente. Por lo tanto, las prácticas agrícolas en la preparación del suelo en esta época del año, reducen sensiblemente el nivel poblacional del parásito. Los huevos enquistados toleran la desecación y pueden sobrevivir 20 años o más en suelos bajo condiciones extremas del medio ambiente. Cuando la cosecha se realiza al final del ciclo biológico de la papa, todos los nematodos que han penetrado en las raíces alcanzan el estado de quiste, logrando un nivel poblacional muy alto. No ocurre así cuando se cosecha temprano la papa; de esta forma muchos nematodos se encuentran todavía en los estados juveniles y el nivel poblacional en el suelo permanece bajo. La diseminación local o a gran distancia se realiza por la movilización de suelo infestado, como por ejemplo el que se adhiere a la maquinaria, semillas o envases para almacenaje. Los tubérculos contaminados proporcionan durante la siembra, condiciones ideales para la diseminación y constituyen el factor principal en la distribución mundial del nematodo.. 13.

(27) En la ausencia de un hospedero viable en suelos infectados los quistes del nematodo de la papa pueden persistir por 20-30 años. Dentro del quiste pueden pasar al segundo estado juvenil (J2) o bien entrar en extrema inactividad conocida como letargo. Generalmente el letargo se presenta algunas veces antes del establecimiento del próximo cultivo de papa y la mayoría de los J2 solo entran en letargo durante el 1er año. Después de esta estimulación la mayoría de los juveniles eclosionará. Así las poblaciones del nematodo de la papa son introducidas a nuevas regiones y pueden adaptarse a diferentes etapas de desarrollo del cultivo hospedante con 2-3 años de establecimiento (Mulvey y Stone, 1976). La cantidad de J2 que eclosiona es variable. En la ausencia de una planta hospedante, algunos juveniles eclosionan espontáneamente en ciertas épocas del año, cuando la temperatura del suelo y la humedad sean adecuadas. En suelos de Europa estas eclosiones espontáneas son en promedio de 30-33% anualmente, pero esto es influenciado por las condiciones ambientales (Mulvey y Stone, 1976). En general se ha registrado mayor eclosión en suelos arenosos que en suelos de turba y arcilla (Berry et al., 1977). La textura de suelos arcillosos sedimentados puede estimular la eclosión de la población del nematodo en un 32%, cuando hay presencia de restos de raíces de un cultivo, pueden estimular la eclosión de los J2 en un 60-80%. Como parte de la estrategia de sobrevivencia del nematodo dorado de la papa, nunca eclosiona el 100% de las larvas de los quistes, algunos juveniles llegan a permanecer en letargo por varios años antes de eclosionar. La raíz de la planta hospedante también influye en las proporciones de multiplicación, generalmente sistemas radiculares grandes toleran altos niveles de invasión.. 14.

(28) En un campo, el primer foco de infección se manifiesta en una pequeña área circular que luego se agranda hasta afectar toda la superficie. El nematodo, por acción propia, puede moverse 1-2 m/año; sin embargo, el movimiento pasivo es más rápido. El suelo adherido a los implementos agrícolas, zapatos y patas de los animales, puede contener quistes, favoreciendo la diseminación de los nematodos dentro de la misma unidad de producción o a otras unidades. Todo sistema de riego que favorezca la escorrentía del agua, así como las inundaciones pueden ser importantes. Sin embargo, el comercio de la papa, y especialmente los tubérculos utilizados como semilla, son la forma más eficaz de diseminar los quistes entre estados, países y continentes. La limpieza de la maquinaria agrícola, uso de tubérculos-semilla sanos y medidas cuarentenarias son muy eficaces para evitar la diseminación de los nematodos (Matos y Canto-Sáenz, 1993). 2.2. Clasificación taxonómica de Globodera rostochiensis (Mulvey y Stone, 1976). Phylum: Nematelmintos Clase: Nematoda Subclase: Secernentea Orden: Tylenchida Suborden: Tylenchinae Superfamilia: Tylenchoidea Familia: Heteroderidae Género: Globodera Especie: rostochiensis. 15.

(29) 2.3. Características morfológicas de Globodera rostochiensis Hembras cuerpo esferoidal a piriforme, sin cuello protuberante y carente de protuberancia en el cono terminal; diámetro longitudinal de 420-640 µm y ecuatorial de 270-430 µm. Longitud del estilete de 22-24 µm, con un ángulo del nódulo dorsal del estilete de 136°. Distancia del extremo de la cabeza al cono excretor de 105-175 µm. Altura vulvar de 6-11 µm. Distancia del ano al margen más cercano de la fenestra (áreas membranosas de pared delgada sobre el cono vulvar) de 39-80 µm. Quistes color café dorado a oscuro, superficie arrugada, formando patrones acanalados, lo cual puede ser diferente sobre el cono vulvar, circunfenestrados y con ano subterminal, diámetro longitudinal de 450-999 µm, diámetro ecuatorial de 250-810 µm, diámetro longitudinal/ecuatorial de 1-1.4 µm; distancia del ano al margen más cercano de la fenestra de 29-116 µm, y radio de Granek de 2-7 µm, con 16-31 estrías entre el ano y fenestra vulvar (Figs. 2 a 5). Huevos elipsoidales, hialinos de 95-115 x 42-48 µm. Larvas de 370-470 µm, cuya anchura a la mitad del cuerpo de 19-26 µm. Longitud del estilete de 21-23 µm, distancia de la base de los nódulos a la desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-6.7 µm. Longitud de la cola de 44-57 µm, y la porción hialina de la cola 18-30 x 16-23 µm. Glándula esofágica dorsal 2.2-2.5 µm disco oral subcircular con sectores labiales. Machos con cuerpo vermiforme con torcedura axial de 890-1270 x 22-36 µm y de 3146 µm de ancho a la mitad del cuerpo, disco labial de bajo perfil. Estilete fuerte de 2527 µm con protuberancias bien formadas. Distancia de la base de los nódulos a la desembocadura de la glándula esofágica dorsal de 5-7 µm. Cola de 1.6-6.7 µm; una bolsa seminal, y una sola espícula en la punta (Franklin, 1971).. 16.

(30) Figs. 2-5. Globodera rostochiensis. 2:Cuello y puntuaciones del quistes 750x; 3: Corte transversal del quiste, corión y masa de huevos 750x; 4:Cono vulvar 500x; 5:Estrías del corión 1000x.. 17.

(31) 2.4. Biología. Después de la siembra, las raíces de la planta de papa, producen exudados radicales que estimulan la eclosión de los huevos (cada quiste contiene de 200-500 huevos) de los cuales emergen los juveniles de segundo estadío. El nematodo al salir del huevo, se encuentra en un estadio infectivo, migra hacia el ápice radical y después de recorrer algunos milímetros de la raíz, el juvenil se fija a las raíces y continúa su desarrollo como sedentario, pasando por tres estados juveniles (segundo, tercero y cuarto) antes de lograr el estado adulto (Mulvey y Stone, 1976). El periodo de tiempo que el nematodo necesita para cumplir una generación, desde la penetración del juvenil de segundo estadío hasta la formación de quistes con huevos, es de 45-60 días, según las condiciones ambientales. Si se considera una temperatura de 10°C como la mínima a la cual el nematodo puede comenzar su desarrollo, puede desarrollarse una generación después de 40 días (Fig. 6). En Globodera rostochiensis existe un dimorfismo sexual muy marcado, el segundo estado juvenil es móvil y vermiforme; en las hembras el tercero y cuarto estado juvenil, así como las adultas, son inmóviles y abultadas. La hembra posee un aparato reproductivo muy desarrollado y después de ser fecundada produce gran cantidad de huevos que retiene en el interior del cuerpo. La hembra adulta adquiere una coloración amarillenta, luego se transforma en quiste. El macho adulto es móvil y su capacidad patogénica no ha sido demostrada. El tamaño de los individuos es afectado por el huésped y por el nivel poblacional del nematodo, siendo más pequeños cuando la población es elevada o el huésped se encuentra fuertemente dañado (Greco et al., 1982). Las hembras fecundadas aumentan de tamaño y se vuelven subesféricas, lo cual depende probablemente de las características de la planta hospedante y de la nutrición durante su desarrollo. En comparación con la hembra madura el quiste tiene una cutícula más gruesa y de color castaño oscuro para proteger los huevos contenidos. 18.

(32) Fig. 6. Ciclo biológico del nematodo Globodera rostochienis.. 19.

(33) Globodera rostochiensis posee un promedio de 21.6 estrías y G. pallida 12 (Stone, 1979). A veces, el número promedio puede ser de 15, lo cual causa confusión; en este caso, es necesario identificar la especie. A la madurez tanto G. rostochiensis como G. pallida se convierten en quistes redondeados de color castaño oscuro, con un diseño irregular de puntuaciones en la superficie del cuerpo. El largo del cuerpo de las larvas, del estilete y de la cola son generalmente mayores en G. pallida que en G. rostochiensis (Mulvey y Stone, 1976). Los quistes no se alimentan y se desprenden fácilmente de las raíces o de los tubérculos. Los huevos, al final del desarrollo embrionario, aproximadamente después de 2-3 semanas, contienen juveniles de segundo estadío. Las condiciones que lo favorecen son una temperatura de 20-26°C, una humedad en el suelo y pH de 2.6-4. Cuando las condiciones ambientales son desfavorables, como en casos de alta temperatura (28°C), sequías, cuando la planta se aproxima al final del ciclo, o bien las raíces están muy dañadas; las hembras se transforman temprano en quiste y el ciclo es más corto; en cambio si la temperatura del suelo es menor de 20°C, el ciclo de vida es más largo. Estudios comparativos han demostrado que G. pallida se desarrolla mejor que G. rostochiensis a bajas temperaturas (Greco et al., 1982). 2.5. Métodos de control de nematodos fitoparásitos Con el fin de evitar que el ataque de nematodos afecte el crecimiento y desarrollo de las plantas cultivadas, es necesario efectuar una evaluación de los niveles de población que desde un punto de vista económico y ecológico justifique, dependiendo de la condición específica de cada sistema productivo, la inversión que implica la utilización de uno o varios de los métodos de control.. 20.

(34) 2.5.1. Control químico En países europeos donde se cultiva papa, la aplicación de nematicidas esta dirigida a los nematodos formadores de quistes (Mulder et al., 1990). Winslow y Willis (1972) indican que, en general, el tratamiento con nematicidas para el control de G. rostochiensis no ha sido económicamente recomendable, debido a sus altos costos, los implementos especiales requeridos para su aplicación y la fitotoxicidad de algunos de ellos. Muchos de los nematicidas inician su actividad cuando el crecimiento de la planta es avanzado, sin embargo, hacen notar que cuando el suelo esta mojado y frío los materiales o substancias aplicadas tienden a difundirse menos, a degradarse y a disminuir su efectividad aunque las condiciones sean óptimas, la eliminación de las larvas casi siempre es incompleta. Los principales nematicidas utilizados son el DD (1,3 dicloropropeno, 1,2diclopropano con hidrocarbono, el DB (etileno dibromo) y el DBCP (1,2 dibromo-3 cloropropano) los cuales son altamente tóxicos y solubles en agua. El DD ha sido el nematicida mas ampliamente utilizado y es fitotóxico. El uso del DBCP fue suspendido en California durante 1977 y cancelado su registro en diversos lugares de Estados Unidos, ya que se demostró que los mantos freáticos estaban contaminados con nematicidas como el EDP y el DD (Whitehead et al., 1994). En México los nematicidas que más se utilizan son los carbamatos, aldicarb (Temik) carbofuran (Furadan) y oxamyl (Vydate) (CONPAPA, 1994). Los nematicidas además de ser costosos sus residuos pueden permanecer en el tubérculo hasta después de la cosecha (Gommers et al., 1992).. 21.

(35) 2.5.2. Control físico Una técnica no contaminante es el uso de la energía solar, la cual consiste en calentar el suelo hasta una temperatura letal para los estados móviles del nematodo. El efecto invernadero que se produce bajo el plástico permite que la temperatura del suelo alcance valores de 5-12°C, superiores a los del aire, esto es letal para los nematodos hasta 20-30 cm de profundidad. Este método es efectivo con niveles poblacionales medios-bajos del nematodo del quiste de la papa (25 huevos/g de suelo). Sin embargo es poco utilizado ya que se requiere que el terreno este libre de cultivos en el verano y que la temperatura sea muy elevada, lo cual no es factible donde se cultiva papa ya que las temperaturas a lo largo del año son muy bajas. El efecto detrimente en otros agentes de control biológico en el suelo tiene que ser también considerado (Mani et al., 1993). 2.5.3. Inundación Artificial y Natural Las inundaciones matan a los nematodos del suelo, pero las inundaciones artificiales resultan ser una herramienta costosa en el control de nematodos, aún para los productores comerciales, y no es recomendable para los pequeños productores (Bridge, 1996). En México, la mayoría de la superficie dedicada al cultivo de papa se localiza en zonas de montaña bajo régimen de temporal (CONPAPA, 1994). 2.5.4. Rotación de cultivos La rotación de cultivos es efectiva en la lucha contra G. rostochiensis, que tiene un rango de hospedantes limitado, se pueden lograr buenos resultados cultivando papa cada cuatro o cinco años en suelos infectados. Estudios dirigidos en Bolivia demostraron que la mejor secuencia después de cultivar papa para reducir densidades de quistes, fue cultivando cebada y frijol lima, por un año, posteriormente barbechar y sembrar papa otra vez (Canto-Sáenz y Mayer de Scurrach, 1993).. 22.

(36) Para poder recomendar una rotación efectiva, es necesario determinar el nivel poblacional de los nematodos (Trudgill, 1991). El ciclo de siembra primavera-verano es el más favorable para la reproducción del nematodo y ocasiona el daño más grave, la tasa de reproducción de G. rostochiensis es en promedio de 39% con siembra de primavera y el 8-9% con siembra en verano e invierno (Greco y Moreno, 1992). 2.5.5. Control genético El cultivar de papa juega un papel importante sobre la dinámica de Globodera pallida y G. rostochiensis. Se conocen cultivares susceptibles a ambas especies y cultivares resistentes o parcialmente resistentes a una sola de ellas, que afectan la tasa de reproducción de los nematodos. En presencia de cultivares resistentes los juveniles de segundo estadío salen del quiste, penetran en las raíces, pero no se desarrollan. A veces, la reducción poblacional, utilizando un cultivar resistente, puede ser mayor que utilizando un cultivo no huésped o dejando el suelo en barbecho. El uso de cultivares resistentes ejerce una presión selectiva sobre el nematodo, debido a que no existen cultivares resistentes a ambas especies o a todos los patotipos de la misma especie (Greco y Moreno, 1992). La resistencia a G. rostochiensis ha sido buscada en Solanum tuberosum, subespecies andigena y la resistencia de los híbridos resultantes de las cruzas con S. andigena, lo que ha hecho necesario continuar con las investigaciones teniendo en cuenta al patotipo presente en cada región, puesto que las variedades resistentes no se comportan de igual manera con todos los patotipos existentes (Kirkham y Marshall, 1996).. 23.

(37) Por otro lado, ambas especies o diferentes patotipos de ellas, pueden encontrarse en el mismo campo, de manera que el uso de un cultivar resistente puede reducir la incidencia de una especie o patotipo, pero favorece el desarrollo de la otra. Se ha determinado que el uso continuo de un mismo cultivar resistente ocasiona la selección de patotipos que antes no eran importantes. Las razas se diferencian por su patogenicidad o por la habilidad que tienen de multiplicarse en los clones con resistencia proveniente ya sea de S. tuberosum subsp. andigena, S. multidissectum, S. vernei y S. kutzianum (Evans y Stone, 1977). 2.5.6. Plantas antagonistas y cultivos trampas Muchas plantas poseen propiedades nematicidas; las más reportadas son las Tagetes spp. como las caléndulas africanas T. erecta, caléndula francesa T. patula, la caléndula sudafricana T. minuta, al igual que la mostaza y espárragos que al producir elementos tóxicos son factibles para el control o reducción de nematodos y otros en ciertas circunstancias (Sukul, 1992). Sin embargo pocas veces las legumbres son utilizadas por los productores, porque los abonos verdes no generan ganancia directa y al usarlos solo para el control de quistes de nematodos no será económicamente viable (Prot et al., 1992). 2.5.7. Legislación del control En los países donde se encuentra presente el nematodo dorado de la papa, una de las primeras prácticas llevadas acabo son las cuarentenas, ya que es la manera inmediata de prevención que impide la diseminación del parásito (EPPO, 1997).. 24.

(38) Es por ello que la Secretaria de Agricultura, con base en la Ley de Sanidad Fitopecuaria de los Estados Unidos Mexicanos y su Reglamento en materia de Sanidad Vegetal establece cuarentenas en regiones afectadas, la cual comprende aspectos oficiales que deben cumplirse para fomentar y proteger contra el ataque del nematodo dorado a la producción nacional de papa (siembra, cosecha, tratamiento, transporte y movilización de semillas, entre otras). Sin embargo, está cuarentena no se ha cumplido en la región del Cofre de Perote, ya que se continua sembrando papa en los campos abiertos y se siguen eliminando áreas de bosque para dicho cultivo. El quiste de la papa puede difundirse con los tubérculos utilizados como semilla, es necesario que la papa para semilla sea producida en áreas donde estos parásitos no estén presentes y debe ser certificada como libre de nematodos y otros patógenos. En muchos países el uso de semilla certificada es limitado; mucha semilla es producida por los mismos agricultores o por otros de la misma zona, sin ningún tipo de control fitosanitario (Trudgill, 1991). 2.6. Control biológico de nematodos fitoparásitos Varios aspectos del control biológico de los nematodos parásitos de plantas han sido revisados por Mankau (1981) y han impulsado, el estudio de los enemigos naturales para el control de nematodos (Sayre y Walter, 1991). El manejo apropiado de organismos antagónicos dispuestos a la protección de la. planta contra patógenos. constituyen una forma de control biológico y una alternativa para el control de nematodos (Azcon Aguilar y Barea, 1997). Organismos como hongos, bacterias, virus y protozoarios han sido identificados como parásitos o predadores de nematodos (Dackman et al., 1992; Adams, 1990; Deacon, 1991; Stirling, 1991). 25.

(39) 2.6.1. Las bacterias en el control biológico de nematodos fitopatógenos No obstante que las bacterias son el grupo más abundante dentro de los microorganismos del suelo, poco esfuerzo ha sido dirigido a su estudio como agentes potenciales de control biológico para nematodos (Sayre y Walter, 1991). Diferentes bacterias se ha reportado asociadas con la cutícula, cavidad del cuerpo, aparato digestivo y las gónadas de nematodos; sin embargo como lo señala Sayre y Walter (1991) la naturaleza parasítica de tales asociaciones es dudosa debido a la ausencia de la aplicación rigurosa de los postulados de Koch (Stirling et al., 1990). Uno de los mayores problemas al utilizar bacterias como agentes de control biológico, es la dificultad de cultivarlas “in vitro” en cualquiera de los medios bacteriológicos estándar. Ni las células vegetativas ni las esporas del organismo pueden ser cosechadas en cantidades suficientes para examinarlas extensivamente en el laboratorio o para infestar suelos en los que se puedan realizar exámenes de campo a gran escala con el fin de determinar la viabilidad del organismo como un agente de control biológico contra nematodos (Mankau, 1981). 2.6.2. Rickettsias Son microorganismos intracelulares que fueron encontrados en especies de quiste de nematodos: Heterodera goettingiana (Woll.) y G. rostochiensis por Shepherd et al. (1972). 2.6.3. Nematodos Depredadores Son importantes en la dinámica de población de numerosas especies de nematodos del suelo puesto que su biomasa en algunos suelos son sustanciales, sin embargo, su papel en el control biológico de nematodos fitófagos es poco conocido. Los nematodos Monochida, Dorylaimida y Diplogasterroidea son considerados como predadores y posibles agentes de biocontrol de nematodos parásitos de plantas. El género Monochida ha llamado más la atención que cualquier otro depredador que. 26.

(40) vive en el suelo, hay observaciones de laboratorio sobre la alimentación de los monochidos que concluye que estos depredadores no tienen eficiente habilidad de alcance o tropismo hacia la presa (Nelmes y Mculloch, 1975). Ciertas especies de Dorylaimida son abundantes en suelos, aunque su diversidad de números y especies parecen declinar en suelos removidos por frecuentes operaciones agrícolas. Mientras muchas especies son omnívoras, un número sustancial de especies son depredadoras. En general los hábitos alimenticios de este grupo de nematodos son poco conocidos, su ciclo de vida tiende a ser relativamente largo y bajas tasas de productividad por individuo. 2.6.4. Depredadores Heterogéneos Otro grupo importante de depredadores de nematodos son los ácaros Sayre et al. (1991). Los colémbolos y ácaros están entre los más numerosos artrópodos del suelo, la mayoría de los colémbolos se alimentan de materia descompuesta de plantas, hongos, humus y a veces son depredadores de nematodos (Mankau, 1981). De manera similar, los ácaros de suelo muestran una variedad de hábitos alimenticios, incluyendo la depredación. Se ha demostrado que los colémbolos se alimentan vorazmente de Heterodera y nematodos que viven libremente (Gilmore, 1970). Además su distribución en el suelo difiere de la de los nematodos parásitos de plantas. Las densidades mas altas de microartropodos se encuentran en la capa superior del suelo, particularmente en basureros o en capas orgánicas en la superficie y también están restringidas, por su tamaño a suelos con aberturas de poros suficientemente grandes para que se puedan mover (Mankau, 1981).. 27.

(41) 2.7. Hongos parásitos de nematodos Diversos investigadores han agrupado a los hongos según el modo de infectar o el estadío del nematodo que infecta: predadores o atrapadores de nematodos, endoparásitos, parásitos de huevos, hembras y productores de toxinas. 2.7.1. Los Hongos predadores o atrapadores de Nematodos Desarrollan. hifas,. ramificaciones,. redes. semejantes. a. una. telaraña. y. protuberancias pegajosas, o bien forman anillos que pueden ser constrictores o noconstrictores, con los cuales atrapan las larvas de nematodos (Dackman y NorbringHertz, 1992). Los mecanismos de adhesión de nematodos, las estructuras del hongo infecciosas y la competencia por infección han sido también investigadas (Barron, 1992). Después de la captura, los hongos desarrollan un apresorio, el cual se ramifica y crece a lo largo del cuerpo. Este tipo de hongos esta relacionado con los estados larvarios y las especies de hongos pertenecen a grupos diversos como Zygomycetes, Deuteromycetes y Basidiomycetes. Han sido considerados prometedores agentes biológicos para control de nematodos. Arthrobotrys. oligospora (Corda). forma. redes. de. hifas,. Monacrosporium. cianopagun (Oudem) desarrolla ramificaciones, Dactylaria candida (Sacc.) produce protuberancias y también es considerada como un hongo no constrictor. Stylopage sp. y Cytopage sp. tiene hifas inmodificadas. Entre los formadores de anillos constrictores están D. brochopaga y A. dactyloides. En hongos endoparásitos los conidios también muestran sofisticadas adaptaciones morfológicas para habilitar su interacción con los nematodos. Su comportamiento predador en las placas de agar los convierte en fascinantes organismos de estudio y especialización. Algunos de los primeros exámenes en invernadero o en el campo probablemente tendieron a exagerar su potencial y no fueron diseñados para evaluar críticamente los efectos sobre los nematodos. La mayoría de esos experimentos consistieron generalmente en añadir un hongo en un suelo modificado con materia orgánica, con el objetivo de que los hongos aumentaran en la. 28.

(42) modificación y especialmente los parásitos atacan a los nematodos, antes o después de haber utilizado el sustrato. Todo lo que se conoce sobre el hongo examinado es que en algún punto, este había atrapado a los nematodos. El criterio general que se empleó para escoger a un hongo como agente de control fue que éste debía ser útil y fácilmente cultivado (Abawi y Thurston, 1992). Cook y Baker (1983) demostraron que la oportunidad de establecer especies “foráneas” en la fase predatoria es pequeña. Ninguno de los hongos que examinaron parecieron ser capaces de colonizar y explotar rápidamente el micro hábitat del suelo. Fueron considerados saprofitos poco competitivos y fueron susceptibles al antagonismo de otros organismos del suelo ; además demostraron persistencia en el suelo, incluso en la presencia de fuentes de energía. Así mismo Cook y Baker (1983) reexaminaron algunas de las relaciones ecológicas en que se incluyen a los hongos predadores e identificaron algunos de los problemas asociados al utilizarlos como agentes de control biológico antes de que suceda la depredación, el crecimiento micelial y la formación de la trampa. Ambos procesos requieren energía la cual puede ser proporcionada por una fuente de nutrientes fácilmente disponible. Por lo tanto la adición de modificaciones orgánicas en el suelo es seguida generalmente por un corto periodo, en el cual aumenta la actividad de los hongos predadores de nematodos. Cook y Baker (1983) indicaron que la captura de los nematodos podría ser un medio de actividad en el microhábitat con sustratos orgánicos fácilmente disponibles. También notaron que la depredación no se relacionó aparentemente con la densidad de la población del nematodo a pesar de que la adaptación de modificaciones. 29.

(43) orgánicas en el suelo resulta en un aumento de la población de nematodos disolutos; de hecho el incrementar el número de modificaciones podría resultar en una reducción en la actividad de depredación de los hongos. Esto sucede debido a la intensificación en la actividad de los microbios del suelo que compiten con los hongos predadores por los nutrientes. Obviamente, las interacciones complejas entre los hongos predadores, que descomponen sustancias orgánicas y el remanente de la población microbiana del suelo determinan el final de cada uno de ellos en el suelo. Las capacidades nutricionales de los predadores del nematodo siguen siendo un aspecto enigmático de su biología que se requiere de próximas investigaciones para comprender que es lo que inicia la actividad predadora y cuanto tiempo puede durar. El factor que requieren los hongos depredadores para ser activados cuando la materia orgánica es adicionada al suelo ha sido auxiliar para mantener a los hongos de interés como agentes biológicos (Mankau, 1981; Gray, 1988). Sin embargo los estudios sobre ecología nutricional tienen poco interés en este grupo de hongos como mayores contribuidores de un control biológico (Cook y Baker, 1983). Además la actividad trampa fue descrita como un mecanismo utilizado por el hongo para contrarrestar el estrés nutricional, asociados con efectos de competencia de otros organismos saprofitos usando la materia orgánica como su principal substrato (Quinn, l987).. Las adaptaciones de las hifas que hacen las trampas de hongos predadores son comunes, sin embargo, estudios recientes han demostrado que especies que producen. 30.

(44) trampas o clavijas de infección que penetran a los nematodos capturados, despiden una sustancia o toxina que inmoviliza al nematodo casi inmediatamente. Algunos hongos predadores tienen órganos que expulsan sustancias atractivas para los nematodos (Jansson, 1982). 2.7.2. Los hongos endoparásitos Estos hongos no forman hifas para atrapar los nematodos, en estos hongos las esporas hacen contacto con la cutícula del nematodo o por la ingestión de ellas, posteriormente germinan en el esófago y desarrollan su micelio en el interior del nematodo, hasta que las estructuras reproductoras de los hongos rompen su pared debido a la esporulación. Pueden parasitar larvas, hembras, quistes y huevos. Los grupos a los que pertenecen son Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes, Deuteromycetes y Basidiomycetes. La habilidad saprofitica/parasitica de los hongos nematófagos es importante en la relación de biocontrol de nematodos por hongos (Kerry y De Leij 1992; Barron, 1992). Esto sugiere que poseen similitudes que los habilitan para alimentarse sobre los nematodos y sobrevivir en el ecosistema del suelo (Nordbring-Hertz et al., 1993). Más que hongos endoparásitos son considerados como específicos para desarrollarse sobre nematodos, aunque varían en la especialidad del hospedero atacan quistes y huevos de nematodos (Barron, 1977; Bird, 1987). Los endoparásitos han sido estudiados principalmente en laboratorio e invernadero y aunque se han hecho aplicaciones de este tipo de hongos directamente en suelos para el control de nematodos, los resultados han sido variados (Jaffee y Zehr, 1982; Jansson, 1982; Kerry, 1990a; Schuster y Sikora 1992b; Sikora, et al., 1990; Uziel y Sikora, 1992; Roessner, 1987; Morgan-Jones et al., 1986).. 31.

(45) Aunque el interés en los endopatógenos ha sido poco por la búsqueda de antagonistas comercialmente viables; el potencial antagonista de los endoparásitos puede ser manejado. Las relaciones bioquímicas, parásitas y predadores con los nematodos han evolucionado entre los diferentes grupos de hongos del suelo (Gray, 1988). La función de estos hongos juega un papel en el control natural y también por el interés biológico y bioquímico asociado con los procesos de captura, penetración y digestión (Dackman et al., 1992; Barron, 1992). Las esporas de los hongos se han adaptado y especializado en la captura o penetración de los nematodos. Entre los hongos inferiores, las zoosporas móviles parecen tener tropismo positivo hacia los nematodos. La mayoría de las especies con zoosporas no móviles poseen propiedades adhesivas especiales para adherirse instantáneamente a las cutículas de los nematodos transeúntes. También parece ser buena evidencia que las hifas asimilativas o haustorios de los hongos predadores encontrados dentro del nematodo liberan un antibiótico que impide el desarrollo de microorganismos competidores en el nematodo capturado (Barron, 1977). El contenido de los cuerpos de los nematodos capturados es consumido solamente hasta que una cutícula llena de hifas asimilativas lisas, permanece. Existen aberturas naturales tales como la cavidad bucal, poro excretorio, vulva, y ano, a través de las cuales microorganismos secundarios pueden introducirse. No obstante, los organismos competidores rara vez se desarrollan en los nematodos capturados en las trampas de hifas de la mayoría de las especies de hongos predadores.. 32.