BIOP Desarrollo Inoculo y Cultivo Por Lote (2) (1)

(1)

PROFESOR: PROFESOR:

AUGUSTO CASTILLO CALDERÓN AUGUSTO CASTILLO CALDERÓN

INTEGRANTES INTEGRANTES

Burgos Ramirez Jamir Burgos Ramirez Jamir Chumpitaz Ayala Lizardo Chumpitaz Ayala Lizardo Gamarra Corman Jairo Gamarra Corman Jairo Guillen Vega Maximo Guillen Vega Maximo Polo Laguna Jason Polo Laguna Jason

Y CULTIVO POR LOTES

(2)

(3)

C C a a p p í í t t u u l l o o : : D D E E S S A A R R R R O O L L L L O O D D E E L L I I N N O O C C U U L L O O Y Y C C . . L L . .

DESARROLLO DEL INOCULO Y

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

CULTIVO CELULAR

POR LOTES

OBJETIVOS:

1.1.

1.1. Objetivos Objetivos Generales:Generales:



 Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes enDiseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

matraces empleando una cepa de

matraces empleando una cepa de SaccharomycescerevisiaeSaccharomycescerevisiae ATCC ATCC

4126, evaluánd

4126, evaluándose ose el efecto el efecto de la razde la razón de Són de S0/X0 en l0/X0 en la cinética a cinética dede crecimiento microbiano.

crecimiento microbiano.

1.2.

1.2. Objetivos Objetivos Específicos:Específicos:



 Diseñar y preparar el medio de cultivo.Diseñar y preparar el medio de cultivo. 

 Activación celular y des Activación celular y desarrollo del inóculoarrollo del inóculo 

 Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa. 

 Determinar de la cinética de Determinar de la cinética de consumo de la fuente de carbono.consumo de la fuente de carbono. 

 Determinar la cinética de producción de Etanol.Determinar la cinética de producción de Etanol. 

 Determinación delDeterminación del   _M_M y los rendimientos del nutriente limitante eny los rendimientos del nutriente limitante en

células y en etanol además de las respectivas productividades en células y en etanol además de las respectivas productividades en células y en etanol.

células y en etanol.

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Antes

Antes de de comenzar comenzar a a trabajar trabajar el el desarrollo desarrollo experimental experimental del del cultivo cultivo deldel microorganismo, es importante siempre recalcar, cuál será la metodología microorganismo, es importante siempre recalcar, cuál será la metodología experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podrían darse en: las técnicas asépticas, en la obtención de los mismos que podrían darse en: las técnicas asépticas, en la obtención de cultivos puros, en la preparación de los medios de cultivo, en las tomas de cultivos puros, en la preparación de los medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el cre

(4)

C C a a p p í í t t u u l l o o : : D D E E S S A A R R R R O O L L L L O O D D E E L L I I N N O O C C U U L L O O Y Y C C . . L L . .

proporcionar los requerimientos nutritivos básicos, que incluyen los

proporcionar los requerimientos nutritivos básicos, que incluyen los siguientes:siguientes: una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, y varios minerales, como el hierro y el magnesio. A este una fuente de azufre, y varios minerales, como el hierro y el magnesio. A este tipo de medio de cultivo se llama

tipo de medio de cultivo se llama definido o sintéticodefinido o sintético, porque se conoce, porque se conoce

exactamente su composición química. Sin embargo en el trabajo laboratorial exactamente su composición química. Sin embargo en el trabajo laboratorial rutinario, a menudo se emplean también medios

rutinario, a menudo se emplean también medios complejos.complejos. Por ejemplo, el Por ejemplo, el

extracto

extracto de de levaduras levaduras y y las las peptonas peptonas (proteínas (proteínas hidrolizadas). hidrolizadas). EstosEstos materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono; nitrógeno, materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono; nitrógeno, fosforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una mezcla de fosforo y azufre en forma de péptidos y aminoácidos; y una mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un medio cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un medio líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua líquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. La adición de agar (un carbohidrato complejo extraído de algas destilada. La adición de agar (un carbohidrato complejo extraído de algas marinas da lugar a un medio sólido. El agar es un agente solidificante ideal marinas da lugar a un medio sólido. El agar es un agente solidificante ideal para los medios microbiológicos por sus propiedades reológicas y porque no para los medios microbiológicos por sus propiedades reológicas y porque no posee ningún valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. posee ningún valor nutritivo para la inmensa mayoría de bacterias y hongos. El agar solido funde a 90

El agar solido funde a 90 – – 100°C, y se solidifica 100°C, y se solidifica a unos a unos 42°C.42°C.

DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

A

A la la hora hora de de diseñar diseñar un un medio medio de de cultivo cultivo no no sólo sólo hay hay que que tener tener enen cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan cuenta los nutrientes sino también las condiciones físicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir.

de biomasa se desea producir.

 Estado:Estado: Medio líquidoMedio líquido

 Volumen del medio:Volumen del medio: 1010 – – 30 % del volumen del matraz 30 % del volumen del matraz

 Temperatura:Temperatura: 35°C 35°C

 pH:pH: 4.2 (ajustar pH con tampón citrato) 4.2 (ajustar pH con tampón citrato)

 Velocidad de agitación:Velocidad de agitación: 150rpm en el agitador orbital (shaker) 150rpm en el agitador orbital (shaker)

-- _Se_{Se utilizará}_{utilizará como}_{como fuente}_{fuente de}_{de carbono}_{carbono y}_{y energía:}_energía:

(5)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .  http://es.scribd.com/doc/20375393/30/Requerimientos-nutricionales  http://html.rincondelvago.com/fermentacion.html

COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN, ACTIVACIÓN Y CULTIVO PARA Saccharomycescerevisiae ATCC 4126PARA LA

PRODUCCIÓN DE ETANOL

 Medio Sólido de Mantención (YM sólido): Se calcularon los

compuestos para el medio Al 20% de 250 ml

Tabla 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50 mL)

NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (G/L) PESO (G) PARA 50 ML Extracto de Levadura 3 0.15 Peptona 5 0.25 Extracto de Malta 3 0.15 Agar 20 1.00 Glucosa 10 0.5

(6)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .  Medio de Activación: Al 20% de 150 ml

Tabla 02: Concentración de Nutrientes para un medio de activación (30mL)

NUTRIENTE CONC ENTRA CIÓN (g/L) PESO (gr.) Para 30 ml* Sacarosa 10.0 0.3 Extracto de levadura 3.00 0.09 Peptona 5.0 0.15 MgSO 4 . 7H 2 O 0.65 0.0195

Se debe tener un Toptima= 35°C y 150rpm

 Medio Fermentación:

Tabla 03: Concentración de Nutrientes para un medio de fermentación

(Para un volumen de medio = 20% del volumen del matraz de 500ml) (Para una concentración final = 5 g/l)

(7)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . Nutriente Fuente Concentración

(g/l) Peso (g) Para 100 ml C12H22O11 C 10.72 1.072 Extracto de Levadura - 1.8 0.18 (NH4)2SO4 N 0.255 0.0255 MgSO4.7H2O Mg 0.24 0.024 KH2PO4 P 0.53 0.053 Soluciones de Sales Concentradas - 10 ml/L 1ml/L

Se debe tener un pHoptimo=4.2 (sino se debe ajustar con Tampón citrato)

Tabla N° 04: Solución de sales

Nutriente Concentración (g/l) CaCl2.2H2O 1.12 ZnSO4.7H2O 0.11 FeSO4.7H2O 0.06 CuSO4.5H2O 0.05 CoCl2.6H2O 0.01 MoO3 0.0005 MnCl26H2O 0.027 NaCl 0.28

(8)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . CONDICIONES DE CULTIVO  Temperatura: 35°C

 Velocidad de Agitación: 150 rpm en shaker.  pH: 4.2 (ajustar pH con Tampón Citrato)

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Preparación de los materiales para el medio de cultivo 1. Lavar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar.

2. Luego colocarlos en la estufa en posición vertical los vasos precipitados, matraces y tubos de ensayo.

3. Las pipetas a utilizar deber ser puestas en la estufa previamente recubierta de papel aluminio.

4. Esterilizar a 121 °C por 15 minutos.

5. Pesar la sacarosa requerida y los demás fuentes de nutrientes. 6. En un matraz de 125ml diluir las sales con 5 ml de agua destilada. 7. En un matraz de 125 ml diluir la galactosa con 5 ml de agua

destilada.

8. En un matraz de 125 ml diluir el extracto de levadura con 5 ml de agua destilada.

9. Colocar los matraces previamente recubierto con papel aluminio en la estufa.

10. Esterilizar a 121 °C por 15 minutos.

11. En un matraz de 1 L agregar las 3 disoluciones antes hechas. 12. Elaborar la curva de calibración para la determinación de

(9)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . Condiciones de Asepsia

Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.

1. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre

del alumno o grupo.

2. Encender el mechero Bunsen.

3. Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapón de

algodón, sácalo un poco de manera que no esté muy apretado.

4. Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un área de

desinfección de 30 cm a la redonda.

5. Retirar una tapa con el meñique, mientras sostienes los matraces.

Nunca poner las tapas sobre la mesa.

6. Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier

microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones.

7. Los matraces abiertos deben mantenerse en posición inclinada

para que el riesgo de contaminación sea mínimo.

8. Sembrar en el matraz estéril el inoculo.

9. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tápalos de nuevo.

Asegúrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado.

(10)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . CONFECCIÓN DE LOS CAPACHOS

 Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que

pueda ser suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea confeccionar.

 Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca encima del

molde y se empieza a dar forma de éste.

 Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del

molde.

 Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no

se puede manipular directamente, sino que debe hacerse por medio de pinzas.

CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES

 Para confeccionar este tapón se cortará un pedazo de gasa, el cual

debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapón.

 Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la

boca del matraz.

 Después se hundirá con algodón hasta que cubra todo el cuello del

matraz, pero este llenado deberá ser a presión para que no deje entrar mucho aire, sólo el necesario para el microorganismo

 Luego de haber culminado se realizarán los nudos respectivos para

sujetar el algodón y así impedir su caída, pero también servirá para poder manipular los matraces a través de estos nudos.

(11)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS

 Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de

tiempo.

 Después se colocará algodón la boquilla de la pipeta, cuidando de no

presionarse mucho ya que cumplirá la función de un filtro.

 Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas

y al mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas las pipetas y marcando la sección en donde está colocado el filtro de la pipeta para que así al manipularlas no se contaminen.

 Se introducirán las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas.

 Pasado este tiempo se sacarán de la estufa, pero cuidando de no

desenvolver las pipetas, para evitar su contaminación.

Preparación del medio de mantención, según la tabla Nº1 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la

producción de etanol.

 Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composición de

medios de cultivo de mantención para Saccharomycescerevisiae

ATCC 4126

 Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 anterior se pesan las cantidades

requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analítica.

 Medir en un vaso de precipitados cierta cantidad de agua destilada

para diluir todos los compuestos pesados anteriormente.

 Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se

requiere.

 Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz;

agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.

(12)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .

 Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de

la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos.

 Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a

presión, previamente aflojar las tapas, para evitar el rompimiento de tubos.

 Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC (hasta la

primera burbuja) y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilización.

 Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla,

luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.

Preparación del medio de activación, según los la tabla Nº2 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la

 Pesar los componentes descritos en la tabla Nº2

 Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de

malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada),la glucosa en un matraz de 125 ml (con 15ml de agua destilada); esto para evitar la reacción entre estos dos componentes; y por último las sales (tabla 04) en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml). Se completa en total un volumen de 25ml.

 Esterilizar a 121ºC por 15 minutos

 Previamente a la esterilización utilizar ajustar el pH a 4.2 de la

solución de que contiene glucosa.

 Mezclar todo en un matraz el mismo matraz de 125ml, en un

ambiente aséptico (según los pasos indicados).

(13)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . Preparación del medio de fermentación, según la tabla Nº3 para

el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la

Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 3

Disolver completamente cada compuesto con agua destilada Regular el pH de la solución de sacarosa 4.2

Esterilizar las diluciones por separado.

Terminada la esterilización dejar enfriar y guardar en refrigeración hasta su posterior uso.

Regulación de pH en Sustrato

En los medios de cultivo es deseable mantener un pH relativamente constante durante el crecimiento microbiano, y esto se consigue mejor con el uso de sustancias reguladoras (sustancias tampón). Estas son sales de ácidos o bases débiles que toman o liberan iones hidrogeno a medida que cambia la concentración de hidrogeniones del medio, y de este modo mantienen constante la concentración de hidrogeniones. Existen cientos de sustancias tampón en potencia, pero siempre es esencial tener la seguridad de que esta sustancia no tiene un efecto directo sobre el organismo.

Aunque los microorganismos se encuentran en hábitats de un amplio margen de pH, el del interior de sus células está probablemente cerca de la neutralidad. En un ambiente ácido, el organismo puede un pH próximo al neutral o bien no permitiendo la entrada de iones H+ o bien expulsándolos de modo activo tan rápidamente como entran. Probablemente la pared celular desempeña también algún papel para mantener fuera los hidrogeniones.

Cada organismo tiene un margen de pH dentro del cual es posible su crecimiento, y generalmente tiene también un pH óptimo bien definido. Los mismos organismos, a través de sus actividades, alteran el valor del pH de sus ambientes.

(14)

CULTIVO DEL MICROORGANISMO

Inoculación de m.o.

Su crecimiento del m.o es: Es el incremento ordenado de todos los componentes de la célula viva, arribando a la duplicación de todas las estructuras, orgánulos y componentes celulares, así como la biogénesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos microorganismos se ven súbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgánulos son esenciales. En la mayoría de los organismos unicelulares, la reproducción es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el número de individuos de la población, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamaño del organismo.

La figura muestra una curva general del crecimiento de un

microorganismo unicelular.

Después de la inoculación de una porción de medio con unas pocas células, transcurre un período de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metabólica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanzó una velocidad constante de crecimiento se dice que está en la fase exponencial debido a que el número de células se puede expresar como función de 2n, donde n es el número de ciclos de duplicación experimentado por la población.

(15)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . En condiciones ideales el tiempo de generación de las bacterias puede

ser de 20 minutos, de esta forma una única célula producirá 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas.

Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el número de células. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo décadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre será seguida, más temprano o más tarde, por la fase de muerte.

 RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO )

 Para la resiembra se siguen las técnicas de asepsia y colocando bajo

mechero con lo que se mantendrá un ambiente estéril.

 El asa bacteriológica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar

el rojo vivo.

 Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que

contiene las células desarrolladas en medio sólido, se extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.

 El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos

preparados con medio sólido (con agar).

 La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera.

 Se llevan a la incubadora a 35 º C durante 48 horas. Luego se

refrigera para parar el crecimiento.

 ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO

Se tuvo el lugar bien desinfectado, se colocaron los mecheros se prosigue de la siguiente manera:

 Para la inoculación partimos con la cepa incubada en medio sólido

(16)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . activación

 Tapamos el tubo con un tapón de gasa y algodón.

 Llevamos al Shaker a 200 rpm, Tº = 30 ºC y un t = 10 hasta alcanzar un

desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.

 El procedimiento de inoculación se hará por duplicado es decir 2 azadas.

 INOCULACIÓN AL MEDIO DE FERMENTACION

 Inocular los 25 ml de caldo (medio rico de activación + biomasa) a un

matraz de 500ml conteniendo el medio definido para fermentacioón. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.

 Inmediatamente después, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y

medir X0y S0 con D.O.

 Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido

del mechero.

 La toma de muestras se inicia desde la dilución del medio de activación

en el medio de fermentación.

 Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y

posteriormente cada hora de la siguiente manera:

 Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del

espectrofotómetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado.

 Se mide su absorbancia a una determinada log. de onda

(640nm)y pH; luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la máxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de después determinar el consumo de sustrato.

(17)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . CRECIMIENTO CELULAR:

CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___ Microorganismo: ___________________________

Fuente Carbono: ____________________________

Nª HORA TIEMPO Abs.(640 nm)

Nombre del alumno

(18)

 DETERMINACIÓN DE LOS RENDIMIENTOS DEL NUTRIENTE

LIMITANTE EN CÉLULAS.

Fuente de carbono y energía: SACAROSA (C12 H22 O11), M= 342 g YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula

% de C en el nutriente = 12(12) x 100 / 342 = 42.11 % % de C en la célula = 45 %

YX/S = (42.11/45) x 0.5 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.95 x 0.5 = 0.47 g/g

 DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES: MÉTODO DEL

DNS (ÁCIDO DINITROSALICÍLICO)

La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

 10 g/l de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)  200 ml/l de NaOH 2N

 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

1. Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar.

2. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego dejar enfriar.

(19)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . 3. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada.

4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.

5. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.

6. La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.

 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:

1. Se toman 4 muestras de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm. Durante 15 - 20 minutos.

2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con tampón citrato (aprox. 3ml)

3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.

4. Se añade un poco de agua destilada (agua que se evapora posteriormente) para redisolver todo el precipitado y se seca en la estufa a 80 ºC hasta peso constante. (24horas)

(20)

 DETERMINACIÓN DE ETANOL POR CROMATOGRAFÍA DE GASES.

A. REACTIVOS Y SOLUCIONES

 Etanol  Propanol

B. PROCEDIMIENTO

 Preparación de 50 ml de solución patrón de Etanol a 6 g/L.

Concentración de solución patron etanol = 6 g/l Volumen solución patrón etanol a 6 g/L = 50 ml Volumen solución etanol 99.7 % = 0.3809 ml

 Preparación de 50 ml de solución patrón de Propanol a 4 g/L

Concentración de solución patrón propanol = 4 g/l Volumen solución patrón etanol a 4 g/L = 50 ml Volumen solución etanol 99.5 % = 0.2487 ml Estándar interno

Análisis Cromatográfico

1. Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas de grafito para asegurar conexiones herméticas.

2. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula a media luna del gas portador (helio, aire e hidrógeno) y regular cuidadosamente su flujo.

3. Ajustar las condiciones cromatográficas.

4. Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y luego el hidrógeno.

5. Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas de gases en todas las conexiones.

6. Encender el detector y obtener una línea de base estable.

(21)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . Condiciones Cromatografícas

Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede a la determinación de los parámetros en estudio.

Tº inicial del horno 55ºC. Tº final del horno 120ºC.

Tiempo inicial 3min. Tiempo final 2min

Velocidad de calentamiento 10 ºC/min.(RATE =rampa) Tº inyector 200ºC

Volumen de inyeccion 1µl. Modo de inyección Split

Radio Split 300

(22)

MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

Material Biológico: Cepa de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126

 PREPARACIÓN DE SÓLIDO DE MANTENCIÓN:  Materiales y Equipos:

 Balanza analítica

 Matraz Erlenmeyer de 250 ml.  Mechero Bunsen

 Gradilla

 6 Tubos de ensayo con tapas.  Centrifuga.  Pipeta de 10 ml.  Vaso de precipitado.  Cocina a gas  Olla a presión.  Varilla de vidrio  Guantes.  Espátula  Reactivos y nutrientes:  Agua destilada.  Extracto de levadura.  Peptona.  Extracto de malta

21

(23)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .  Agar.

 PREPARACIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN:  Materiales y Equipos:  Balanza analítica  2 Matraz de 125 ml.  Una probeta de 100ml  Micropipeta  Estufa  Algodón  Gasa  Varilla de vidrio  Espátula  Reactivos y nutrientes:  Glucosa  Extracto de levadura  Solución de sales  Agua destilada  Alcohol

 PREPARACIÓN DE MEDIO DE FERMENTACIÓN:  Materiales y Equipos:

 Matraz de 1 L

 2 Matraces de 125 ml.  Varilla de vidrio

(24)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .  Gasa y algodón  Olla a presión  Reactivos y nutrientes:  Glucosa  (NH4)2SO4  KH2PO4  MgSO4.7H2O  Extracto de Levadura  Agua destilada  Alcohol

 INOCULACIÓN AL MEDIO DE ACTIVACIÓN:  Materiales y equipos  Matraz de 125 ml.  Algodón  Gasa  Agua destilada  Aza bacteriológica  Shaker

 Mechero Bunsen, trípode y rejilla

(25)

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Saccharomycescerevisiae ATCC 4126

DÍA ACTIVIDAD

30/09/13  Presentación del pre-informe.

 Esterilización de material de vidrio

03/10/13

 Preparación de medio de mantención,

agar nutriente, esterilizar y refrigerar.

 Preparación Tampón pH 4.2

10/10/13

 Resembrado de células en el medio de

mantención agar sólido

 Preparación de reactivos DNS.

 Obtención de las curvas de calibrado de

azúcares reductores DNS (Glucosa y Sacarosa).Obtención de la curva de

calibrado Etanol, cromatógrafo de gases. 16/10/13  Preparar capachos (6unid.) Secarlos.

17/10/13  Obtención de la curva de calibrado de Biomasa.

23/10/13

 Preparación y esterilización del medio

rico líquido para inoculo y fermentación.

 Preparar material de vidrio estéril.

24/10/13

 Inoculación de medios y seguimiento de

la cinética de crecimiento microbiano.

(26)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . 30/10/13 sustentación.

PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES ACTIVIDAD

DIA miércoles 10/10/13 HORARIO

INICIO TERMINO Preparación de materiales para la

inoculación en medio de activación y el medio rico para la cinética de fermentación.

7:30 a.m. 8:00 a.m. Inoculación con aza bacteriológica desde la

cepa en agar a medio rico de activación.

8:00 a.m. 8:20 a.m. Tiempo de referencia para la activación del

inóculo en el medio de activación.

8:20 a.m. 11:20 a.m. Inoculación de medios para cinética

(fermentación)

11:20 a.m. 11:40 a.m. Seguimiento de la cinética por cada hora

( programación y registro de datos)

11:40 a.m. 7:40 p.m.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=q

uimicos

 QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería

Bioquímica.http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5 CKits-C.pdf.

 http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml  THOMAS D. BROCK, Biología de los Microorganismos

(27)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L .  http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-de-Cultivo  http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/fi le/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9c nica%20as%C3%A9ptica.pdf ANEXOS

DISEÑO DEL MEDIO DE ACTIVACIÓN Y DE FERMENTACIÓN

 Rendimiento: Fermentación aeróbica

f en biom asa %Elemento te en nutrien %Elem ento S X Y S X       º ... (1)

Para fuente de carbono, fermentación aeróbica: f =0.5

Para otra fuente, f =1

Donde: f en biomasa %Elemento te en nutrien %Elemento Y S X   º … (2) S X Y S X     º … (3) De (3): |



f i



S X S S X Y     º … (4) De (4): Si _ 0 f S . Entonces;





n Y X L g S S X i    _º … (5)

(28)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . Para otra fuente, n=1

Nota: El nutriente limitante en esta investigación se considerará a la fuente de carbono que en este caso es la Sacarosa.

PARA LA SACAROSA: %C nutriente = 42.11%; %C. en biomasa= 45% 5 . 0 . % . % º       enbiomasa C e ennutrient C S X Y X _C g g Y X _C 0.6 0.56 % 45 % 11 . 42 º    PARA KH2PO4: FUENTE ELEMENTO %

CELULA % NUTRIENTE Yx/s S (G/L) (G/L)S °

SACAROSA C 45 42 0.56 10.72 16.080 MgSO4.7H2O S 0.25 13.01 52 0.12 0.173 MgSO4.7H2O Mg 0.4 9.87 24.7 0.24 0.365 (NH4)2SO4 lim. N 9 21.21 2.4 0.255 2.547 KH2PO4 K 0.5 28.73 57.5 0.10 0.157 KH2PO4 P 2 22.79 11.4 0.53 0.790

27

(29)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . enbiomasa P e ennutrient P S X Y X _P . % . % º      % 79 . 22 136 100 31 . %_P_ennutrient_e _  _ g g Y X _P 1 11.395 % 2 % 794 . 22 º    % 73 . 28 136 100 39 . %_K_ennutrient_e _  _ g g Y X _K 1 57.5 % 5 . 0 % 676 . 28 º    PARA (NH4)2SO4: enbiomasa N e ennutrient N Y X _N . % . % º  % 21 . 21 100 132 2 14 . %_N_ennutrient_e _  _ _ g g Y X _N 1 2.4 % 9 % 21 . 21 º    PARA MgSO4.7H2O: enbiomasa Mg e ennutrient Mg Y X _S . % . % º  % 87 . 9 100 246 24 . %_Mg_ennutrient_e _ _ _ g g Y X _Mg 1 24.7 % 4 . 0 % 7561 . 9 º   

(30)

C a p í t u l o : D E S A R R O L L O D E L I N O C U L O Y C . L . 246 g g Y X _S 1 52 % 25 . 0 % 0081 . 13 º   

REFERENCIAS DE COMPOSICION DE MEDIOS DE MANTENCION, ACTIVACION Y CULTIVO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACION

(g/L) Solidos de mantención (YM solido) Extracto de levadura Peptona Extracto de malta Agar Glucosa 3 5 3 20 10 Activación Glucosa Extracto de levadura Extracto de malta Solución de sales T 35ºC, 200 rpm 10 3 5 5 ml/L Fermentación Sacarosa Extracto de levadura (NH4)2SO4 kH2PO4 1.8