Componentes Autonómicos de la
Rama Sensorial del Nervio Pudendo
en la Rata Macho
T E S I S
Que para obtener el grado de:
DOCTOR EN NEUROETOLOGÍA
Presenta:
M. en C. César F. Pastelín Rojas
Directora de Tesis:
Dra. Yolanda Cruz Gómez
Xalapa de Enríquez, Veracruz Marzo 2012
Universidad Veracruzana
AGRADECIMIENTOS
Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología, CONACyT. Por el apoyo y la
oportunidad de realizar estudios de posgrado y estancia en el extranjero.
Instituto de Neuroetología, Universidad Veracruzana. Por la realización de
estudios de Doctorado en el programa Doctorado en Neuroetología.
Centro Tlaxcala de Biología de la Conducta, Universidad Autónoma de Tlaxcala.
Por la realización de mis experimentos dentro de sus instalaciones e impartición
de cátedras para mi formación como estudiante de Doctorado.
A la Dra. Yolanda Cruz Gómez por la realización y culminación de mi proyecto de
tesis de Doctorado. Gracias por transmitirme sus conocimientos y por brindarme la
oportunidad de realizar ciencia básica en su laboratorio y sobre todo por tener
paciencia y mucha dedicación hacia mi persona.
A los miembros del comité tutoral: Dr. Pablo Pacheco Cabrera, Dr. Miguel Ángel
Camacho Pernas por sus múltiples recomendaciones y atinadas aportaciones
hacia mi proyecto de tesis.
A la Dra. Carolina Morán Raya por estar siempre en el momento adecuado de mi
formación profesional con sus muy atinados consejos y por brindarme su más
sincera amistad.
A los integrantes del centro Tlaxcala de Biología de la Conducta y a los
compañeros del laboratorio de Neurofisiología y Biología de la reproducción.
A los miembros del Jurado del examen por sus recomendaciones y sus
Dra. Yolanda Cruz Gómez
Dra. Mayvi Alvarado Olivares
Dr. Pablo Pacheco Cabrera
Dr. Miguel Ángel Camacho Pernas
Í N D I C E
Pág.
RESUMEN……… i
ABSTRACT……….. iii
INTRODUCCIÓN………. 1
• Ganglios autonómicos de la rata……… 2
• Nervios del aparato urogenital de la rata……….. 3
Nervio peneano o nervio cavernoso……….. 4
Nervio pélvico……… 5
Nervio hipogástrico………... 5
Nervio pudendo…….………. 6
Rama sensorial del nervio pudendo (Rsnp)……….. 6
• Origen y organización de la Rsnp……….. 8
• Axones somáticos de la Rsnp……….……….……… 9
Aferentes……… 9
Eferentes……… 10
ANTECEDENTES………. 12
• Componentes autonómicos de la Rsnp……….… 12
HIPÓTESIS……… 14
OBJETIVO GENERAL………. 14
DISEÑO EXPERIMENTAL……….. 15
• Animales………... 15
EXPERIMETO 1. Neuronas autonómicas posganglionares que inervan al pene……….. 16
OBJETIVO………. 16
OBJETIVOS PARTICULARES………... 16
MATERIALES Y MÉTODOS………... 16
• Anatomía gruesa………... 16
• Estudio histológicos ………. 17
Procedimiento……… 17
• Marcaje de neuronas posganglionares………. 18
• Mediciones, procesamiento de imágenes y análisis estadístico…….. 19
RESULTADOS………. 20
• Anatomía gruesa……….. 20
• Características histológicas……… 22
• Neuronas posganglionares………. 24
DISCUSIÓN……….. 25
CONCLUSIÓN……….. 27
EXPERIMETO 2 Inervación de estructuras penenas a través de la Rsnp…. 28
OBJETIVO……….… 28
MATERIALES Y MÉTODOS……….…. 29
• Animales……….… 29
• Inyección del trazador y análisis estadístico………... 29
RESULTADOS……….…. 29
• Intactos………... 31
• Denervados……….... 31
DISCUSIÓN………... 32
CONCLUSIÓN….……….…. 33
DISCUSIÓN GENERAL………... 34
CONCLUSIÓN GENERAL……… 37
PERSPECTIVAS………... 38
REFERENCIAS………... 39
APÉNDICE I………... 47
• Participación en congresos nacionales……….. 47
Morelia 2009………... 48
Tabasco 2010……….… 49
APÉNDICE II……….. 50
• Artículo científico……… 50 Pastelin CF, Pacheco P, Camacho M y Cruz Y. Another component of
APÉNDICE III………. 51
• Artículo científico: Realizado durante la estancia de investigación Con el apoyo de la Beca Mixta del CONACYT…...…..…. 51
Pastelin CF, Juárez R, Damaser MS y Cruz Y. Neural pathways of somatic and visceral reflexes of the external urethral sphincter in female rats. J. Comp. Neurol. 1-40. 2012. ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Aparato urogenital de la rata macho………... 1
Figura 2. Ganglio pélvico mayor de la rata macho…………... 2
Figura 3. Nervios periféricos en la rata macho...…... 3
Figura 4. Distribución del nervio cavernoso en la rata macho... 4
Figura 5. Organización del plexo sacro y del nervio pudendo en la rata macho.. 7
Figura 6. Topografía de la Rsnp en la rata macho.………... 8
Figura 7. Registro de la actividad eléctrica de la Rsnp...…... 9
Figura 8. Músculo uretralis de la rata macho...………....……… 11
Figura 9. Organización de la Rsnp en la rata macho………....……... 12
Figura 10. Anatomía gruesa de la inervación de los órganos pélvicos…...…….. 21
Figura 11. Plexo pélvico menor en la rata macho... 22
Figura 12. Plexo pélvico menor de la rata teñido con Nissl………....……… 23
Figura 13. Plexo pélvico menor teñido con HRP-WGA...………...………. 24
Figura 14. Ganglios pélvicos de la rata macho……….... 31
Figura 15. Organización de los axones somáticos y autonómicos de la Rsnp en la rata macho………. 36
RESUMEN
En los mamíferos, el aparato urogenital masculino está formado por la vejiga urinaria,
la uretra, el pene y las glándulas sexuales accesorias. Este aparato realiza funciones
sexuales y urinarias, las cuales están reguladas por el sistema nervioso mediante su
inervación somática y autonómica. La mayor parte de la regulación autonómica es
provista por los ganglios pélvicos, cuyas células posganglionares proyectan sus
axones por los nervios periféricos.
Los principales nervios perifericos del área pélvica son: el cavernoso, el pélvico, el
hipogástrico y el pudendo. Del nervio pudendo emerge una rama sensorial (Rsnp)
cuyos axones inervan al cuerpo del pene, al glande y a la piel prepucial. También
inerva al músculo uretralis. Por otra parte, dos ramas provenientes del ganglio
pélvico mayor (GPM) se anastomosan a la Rsnp para formar un pequeño plexo en la
base del pene. El propósito general de este estudio fue determinar si la Rsnp de la
rata macho tiene componentes autonómicos parasimpáticos que inervan a
estructuras peneanas. Para ello, se realizaron dos experimentos.
En el experimento uno, se usaron técnicas histológicas e histoquímicas para
determinar si el plexo pélvico menor contiene neuronas posganglionares que inervan
al tejido eréctil y la uretra peneana. La localización de las neuronas posganglionares
fue mediante la técnica de marcaje neuronal usando peroxidasa de rábano
conjudado con aglutinina de germen de trigo (HRP-WGA). En el plexo pélvico menor
y en el GPM se encontraron células que marcaron positivamente a HRP-WGA. El
GPM proporciona el 75 % de esta inervación.
En el experimento dos, usando HRP-WGA como marcador retrogrado, se determinó
si los axones de las células posganglionares autonómicos que inervan a la uretra
peneana, a los cuerpos cavernosos y al cuerpo esponjoso del pene viajan por la
Rnsp. Se encontró que el número de neuronas positivas a HRP-WGA en el ganglio
pélvico menor, en el GPM y en los ganglios accesorios se redujo en el grupo de
animales cuya Rsnp fue seccionada previa a la inyección del trazador neuronal.
importante inervación autonómica a la uretra peneana, a los cuerpos cavernosos y al
cuerpo esponjoso.
Se concluye que en la rata macho la Rsnp es un nervio mixto que contiene axones
aferentes y eferentes somáticos así como eferentes simpáticos y parasimpáticos. Los
somas de los axones posganglionares parasimpáticos que inervan a estructuras del
pene así como a la uretra peneana se localiza en el ganglio pélvico menor, en el
ganglio pélvico mayor y en los ganglios accesorios. Estas neuronas contribuyen a la
regulación de funciones sexuales y urinarias del tracto urogenital. Dado que el
principal modelo animal de laboratorio para estudios de urología es la rata, es
importante considerar estos hallazgos, a la hora de diseñar los experimentos o
ABSTRACT
In male mammals, the urogenital tract is made up of the bladder, urethra, penis and
accessory glands. Sexual and urinary functions are regulated by the nervous system
through its somatic and autonomic innervation. Most of the autonomic innervations is
provided by the pelvic ganglia, Whose axons travel in the peripheral nerves. The
main peripheral nerves in the pelvic area are cavernous, pelvic, hypogastric and
pudendal. The pudendal nerve has a sensory branch (SBPdn), with axons innervating
the body of the penis, the glans and foreskin, as well as the uretralis muscle. Two
branches from the major pelvic ganglion anastomose to SBPdn to form a small pelvic
plexus located at the base of the penis. The purpose of this study was to determine if
the SBPdn of the male rat has autonomic components that supply parasympathetic
innervations to penile structures. For this, two experiments were conducted. The
are provided by the small plexus. The small plexus could be named the minor pelvic ganglia and considered a component of the pelvic plexus.
In the second experiment, using HRP-WGA as a retrograde labeling, we
investigated whether postganglionic autonomic axons innervating the penile urethra,
cavernosum corpora and corpus spongiosum travel through the SBPdn. It was found
that in the group of animals whit transected SBPdn prior to neuronal tracer injection,
the number of HRP-WGA positive neurons in the small pelvic ganglion, in the major
pelvic ganglion and in the acessory ganglia decreased, indicating that the SBPdn,
although is not the only neuronal pathway, carries autonomic innervations to the
urethra, penis, the cavernosum corpora and corpus spongiosum.
We conclude that in the male rat the SBPdn is a mixed nerve containing
afferent and efferent somatic, as well as sympathetic and parasympathetic axons to
the penis, with neurons located in three pelvic ganglia. These neurons contribute to
the regulation of sexual and urinary functions of the urogenital tract. Since the rat is
the main laboratory animal model for urological studies, it is important to consider
INTRODUCCIÓN
En los mamíferos, el aparato urogenital masculino realiza funciones sexuales y urinarias. Estas funciones son reguladas por el sistema nervioso mediante la inervación somática y/o autonómica de la vejiga urinaria y de la uretra. Así, la micción, la erección y la eyaculación requieren de la activación de reflejos espinales y supraespinales que coordinan la actividad de la musculatura lisa y estriada de los elementos del aparato urogenital (AUG) y el daño a su circuito neural o a la musculatura misma genera disfunciones urinarias y sexuales.
El tratamiento de las disfunciones del AUG requiere del conocimiento de su anatomía, inervación y fisiología. Ello implica la necesidad de usar técnicas invasivas en modelos animales. El animal más usado en el análisis de la anatomía y fisiología del AUG es la rata de laboratorio.
En la rata macho el AUG está formado por la vejiga urinaria, la uretra y el pene, así como por las glándulas sexuales accesorias tales como las seminales, las coagulantes, las bulbouretrales y la próstata (Figura 1). La actividad de estas estructuras está regulada por circuitos neuronales en los que participan ganglios y nervios periféricos que se originan en los segmentos lumbosacros de la médula espinal. V S C Pv Pd Bul Gp G Up D Um Upr M o di fic ado de H ebel y S tr omber g 1986
Figura 1. Aparato urogenital de la rata macho.
V Vejiga urinaria
S Vesícula seminal
C Glándula coagulante
Pd Lóbulo dorsalateral de la próstata Pv Lóbulo ventral de la próstata Upr Uretra prostática
Um Uretra membranosa
Bul Glándula bulbouretral
D Divertículo uretral
Up Uretra peneana
Gp Glándula prepucial
Ganglios autonómicos de la rata
El sistema nervioso autónomo (SNA) está constituido por nervios y ganglios simpáticos y parasimpáticos. Los ganglios están formados por cúmulos de cuerpos neuronales. Los ganglios simpáticos se localizan en la cadena simpática ganglionar (ganglios paravertebrales) y en los ganglios prevertebrales. Los ganglios parasimpáticos se encuentran adyacentes a la pared de los órganos blanco (Berkley 1999). La mayor parte de la regulación autonómica del AUG es provista por los ganglios pélvicos, que contienen elementos simpáticos y parasimpáticos. En varias especies la estructura ganglionar pélvica es comúnmente referida como un plexo pélvico (Keast 2006).
El plexo pélvico de la rata macho tiene un ganglio principal alimentado por dos nervios; el nervio hipogástrico y el pélvico (Cruz y cols. 2009; Puriton y cols. 1973) y un cúmulo de dos a cuatro microganglios conocidos como ganglios accesorios que se localizan en el ligamento lateral, distal y craneal al GPM, entre la uretra y los ductos deferentes (Puriton y cols. 1973). Dos de ellos se conectan con el GPM y tienen axones preganglionares y posganglionares que inervan órganos pélvicos vía GPM (Keast 2006). Del GPM emergen varios nervios eferentes que provén inervación a la vejiga, al recto, a la glándula bulbouretral, a la próstata, a la uretra rostral, al pene y a la piel del perineo (Puriton y cols. 1973; Langworthy 1965; Keast 2006; Steers y cols. 1988; Canguven y Burnett 2008; Cruz y cols. 2009). Tres nervios del GPM se dirigen al pene; la rama principal (nervio cavernoso), la rama lateral y la rama ventral (Puriton y cols. 1973 Figura; 2). Los dos últimos se anastomosan a la rama sensorial del nervio pudendo (Pastelín y cols. 2008).
3 2 1
GPM
Nervios del aparato urogenital de la rata
Los nervios están integrados por axones aferentes y eferentes. Los principales nervios del área pélvica son: cavernoso, pélvico, hipogástrico y pudendo (Helbel y Stromberg 1986). Estos se originan de los segmentos lumbosacros de la médula espinal y son los responsables de regular las funciones del AUG (Martínez-Gómez 1991; Figura 3). Cada nervio es bilateral y está constituido por uno o varios fascículos de fibras nerviosas o axones. Hay básicamente dos tipos de nervios, somáticos y autónomos, aunque parece ser que no hay nervios puros. La mayoría son mixtos.
El nervio peneano o nervio cavernoso (NC) ha sido ampliamente estudiado. Emerge del GPM y lleva axones aferentes y eferentes hacia la crus de los cuerpos cavernosos, al cuerpo esponjoso y a las glándulas bulbouretrales (Dail y cols. 1989; Steers y cols. 1988; Canguven y Burnett 2008). Las ramas lateral y ventral que emergen mediales al cavernoso han sido consideradas como vías accesorias vasodilatadoras que llegan al pene a través de la Rsnp (Dail y cols. 1999; Pastelín y cols. 2008; Figura 4).
El nervio pélvico (Pv) está formado por fibras provenientes del sexto segmento lumbar (L6) y el primer segmento sacro (S1) de la médula espinal (McKenna y Nadelhaft 1986, Purinton y cols. 1973). Es un nervio mixto que posee componentes motores y sensoriales. Se divide en dos ramas; la somatomotora y la viscerocutánea (Pacheco y cols. 1989; Lucio y cols. 1992; Figura 3). En la rata la rama viscerocutanea inerva a la piel perineal, a la uretra proximal, a la vejiga urinaria, a las glándulas sexuales accesorias y al recto (Pacheco y cols. 1989; Wail y cols. 2004; Cruz y cols. 2004). También inerva a la vagina y al cérvix (Berkley y cols. 1993). La rama somatomotora inerva a los músculos estriados pélvicos iliococcílgeo y pubococcígeo (Pacheco y cols. 1989; Lucio y cols. 1994). A estos dos músculos se le conoce como levator ani (Poortmans y Wyndaele 1998) y son importes para que se lleve a cabo la postura de lordosis durante el apareamiento (Martínez-Gómez y cols. 1992). En la rata macho el Pv es parte de la vía autonómica parasimpática que controla la erección peneana (Manzo y cols. 1998; Quinlan y cols. 1989) y la micción. Lo axones que viajan por el Pv excitan a la vejiga urinaria y relajan a la musculatura lisa de la uretra durante la expulsión de orina (Holstege y cols. 1995).
colon y a las glándulas sexuales accesorias (de Groat 1988; Steers y cols. 1988). Este nervio se activa sinérgicamente con el Pv para controlar la erección peneana y su papel en la relajación del tejido de los cuerpos cavernosos del pene durante la erección es fundamental (Manzo y cols. 1998), por lo que su denervación bilateral afecta la conducta sexual y el potencial fértil del macho (Loranca 1994). También juega un importante papel en la regulación de la continencia urinaria ya que su actividad inhibe la contracción de la vejiga urinaria y excita a la base de la misma, y a la uretra proximal, evitando así el flujo de la orina por la uretra durante el llenado vesical (Maggi y cols. 1989).
El nervio pudendo (Pd) se origina de los segmentos espinales L6-S1 (Núñez y cols. 1986; McKenna y Nadelhaft 1986; Dail y cols. 1989; Pacheco y cols. 1989; Pacheco y cols. 1997; Cruz y cols. 2004; Martínez-Gómez 1991; Figura 3). El 65 % de sus axones son amielínicos, indicando una contribución autonómica en el control de las vísceras urogenitales (Hulsebosch y Coggesshal 1982). A pesar de ello, varios autores han considerado al Pd como un nervio exclusivamente somático, con un importante papel en la regulación de las funciones sexuales y excretoras (McKenna y Nadelhaft 1986; Pacheco y cols. 1989; Schrøder 1980; Reitz y cols. 2003).
Estudios anatómicos muestran que del Pd emergen varias ramas; la rama al músculo coccígeo, la rama distal del escroto y la rama que contribuye a la formación del plexo sacro (Pacheco y cols. 1997; Figura 5). De este plexo surge la rama motora que inerva a los músculos estriados perineales; el esfínter externo de la uretra (EEU), el esfínter externo del ano (EEA), el isquiocavernoso y el bulboesponjoso (Pacheco y cols. 1997).
cuerpo del pene (Ambadkar y Vyas 1981; McKenna y Nadelhaft 1986; Pacheco y cols. 1997) y posiblemente también a las glándulas prepuciales (Ambadkar y Vyas 1981; Pastelín y cols. 2008).
La función de este nervio es regular la actividad sexual y su sección bilateral disminuye severamente las erecciones reflejas y la capacidad de realizar intromisiones durante la conducta sexual (Sachs y Liu 1991).
L3 L4 L5 L6 S1
2 7 9 11 12 16 10 15 5 4 3 1 6 14 13 8
1 Tronco lumbosacro 2 Tronco L6-S1
3 Rama del músculo del glúteo 4 Nervio ciático
5 Rama del músculo semitendinoso
6 Rama anastomótica
7 Nervio pélvico
8 Nervio pudendo
9 Rama del músculo coccígeo
10 Rama distal del escroto
11 Rama sensorial
12 Rama del músculo obturador interno
13 Rama anastomótica
14 Plexo sacro
15 Rama proximal del escroto
16 Rama motora
Figura 5. Organización del plexo sacro y del nervio pudendo en la rata macho (Tomado de Pacheco y cols.1997).
Origen y organización de la Rsnp
La Rsnp emerge del nervio pudendo, viaja en dirección caudal, lateral a la vena ilíaca interna, y después de 5 a 6 mm llega a la fosa isquiorectal (Figura 6). De esa zona discurre hasta la región dorsal del pene y se distribuye en el cuerpo del pene y en el glande (McKenna y Nadelhaft 1986; Pacheco y cols. 1997; Pastelín y cols. 2008).
Dos ramas provenientes del GPM se anastomosan a la Rsnp para formar un pequeño plexo que se localiza cerca de la base del pene. De esta estructura emergen tres ramas, dos de ellas corren adyacente a la pared lateral del EEU para unirse al GPM. La otra rama corre caudal al cuerpo esponjo del pene (Pastelín y cols. 2008; Figura 6). Otras ramificaciones se distribuyen en el cuerpo cavernoso, en la pared del divertículo uretral, en el músculo estriado uretralis, en el cuerpo del pene, en el glande, en el prepucio y en la glándula prepucial (Pastelín y cols. 2008; Figura 6).
Ic U
Axones somáticos de la Rsnp
Aferentes
Estudios de marcaje con un trazador retrogrado inyectado en el nervio dorsal del pene, sugirieron que el NDP está formado exclusivamente de fibras sensoriales (Núñez y cols. 1986). Congruentemente con esa información, mediante estudios electrofisiológicos se mostró que la Rsnp presenta potenciales de acción durante la estimulación mecánica de la piel que cubre al pene (campo receptivo =12.6 mm²), el prepucio, el glande y el cuerpo del pene, confirmando que acarrea axones somáticos sensoriales. En la figura siete se muestran los registros representativos de la actividad neuronal registrada durante la estimulación. La aplicación de un estímulo de igual o mayor magnitud en la piel perineal escrotal o inguinal no provocó respuesta en la Rsnp, indicando la especificidad de la respuesta.
Figura 7. Registro de la actividad eléctrica de la Rsnp. Durante la estimulación mecánica del prepucio y del glande. La duración del estímulo está representada con una línea punteada. (Modificado de Pastelín y cols. 2008.
Eferentes
A
B
*
Ic
Ic U U
1mm
+ +
U U
VDP
C
20
m
V
2 ms
ANTECEDENTES
Componentes autonómicos de la Rsnp
Estudios anatómicos de la organización y distribución de la Rsnp en la rata macho muestran que la Rsnp emerge del nervio pudendo. De ahí viaja en dirección caudal, lateral junto con la vena ilíaca interna y después de 5 a 6 mm llega a la fosa isquiorectal. No se observó ramificación a esté nivel. En una vista ventral, se muestra que debajo de la pelvis la Rsnp corre junto a la vena iliaca interna y caudal a la base del pene. Debajo del arco púbico, 8 a 9 mm antes de llegar a la base del pene, la Rsnp emite cuatro nervios. Dos ramas provenientes del GPM se anastomosan a la Rsnp para formar un pequeño plexo que se localiza cerca de la base del pene. De esta estructura emergen tres ramas, dos de ellas corren adyacente a la pared lateral al EEU para unirse al GPM. La otra rama corre caudal al cuerpo esponjo del pene. Otras ramificaciones se distribuyen en el cuerpo cavernoso del pene, en la pared del divertículo uretral, en el músculo uretralis, en el cuerpo del pene, en el glande, en el prepucio y en la glándula prepucial (Pastelín y cols. 2008; Figura 9).
Ganglio pélvico mayor Rama del divertículo uretral Rama del músculo uretralis
Rama de los cuerpos cevernosos
Ramas al glande del pene Rama de la
mucosa del prepucio
Ramas esponjoso Rama de la
glándula prepucial Rama sensorial del nervio pudendo Tronco L6-S1 Nervio pudendo Rama anastomótica Rama escrotal distal Nervio pélvico Rama coccigea A B Ramas anastomóticas Plexo pélvico
Rama de la piel externa del prepucio + * & Ganglio pélvico mayor Rama del divertículo uretral Rama del músculo uretralis
Rama de los cuerpos cevernosos
Ramas al glande del pene Rama de la
mucosa del prepucio
Ramas al cuerpo esponjo Rama de la
glándula prepucial Rama sensorial del nervio pudendo Tronco L6-S1 Nervio pudendo Rama anastomótica Rama escrotal distal Nervio pélvico Rama coccigea A B Ramas anastomóticas
Plexo pélvico menor
Rama de la piel externa del prepucio
+
*
&
Lo antes descrito, sugiere que la Rsnp no solamente está constituida por axones somáticos sensoriales y somáticos motores sino que también por axones autonómicos. Estudios histoquímicos e imnunohistoquímicos que apoyan esta propuesta muestran que la Rsnp está conformada mayoritariamente (67%) por axones amielínicos (Moore y White 1996). Estudios inmunohistoquímicos donde han mostrado que las neuronas posganglionares del pene se encuentran en la cadena ganglionar simpática (Galindo y cols. 1997). Cuando se denervó la Rsnp hubo una reducción drástica de la inervación adrenérgica del pene y ausencia de marcaje en las neuronas de la cadena simpática ganglionar, lo que ha sugerido que la Rsnp contiene elementos simpáticos, siendo la principal ruta de inervación adrenérgica del pene de la rata (Galindo y cols. 1997). Esta propuesta también se apoya por el hecho de que el inyectar peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés, horseradish peroxidase) en la Rsnp se encontró el marcaje en la cadena simpática ganglionar (Mckenna y Nadelhaft 1989). Se ha sugerido que esta inervación es importante en el control de la función eréctil o glandular del aparato urogenital.
HIPÓTESIS
1. En las porciones engrosadas del plexo pélvico menor existen neuronas posganglionares cuyos axones inervan al tejido eréctil (cuerpos cavernosos y cuerpo esponjoso) y a la uretra peneana.
2. La rama sensorial del nervio pudendo contiene axones autonómicos parasimpáticos que inervan al tejido eréctil y a la uretra peneana.
OBJETIVO GENERAL
DISEÑO EXPERIMENTAL
Animales
Se utilizaron 22 ratas macho adultos de la cepa Wistar, de tres a cuatro de meses de edad (250 a 300g). Los animales fueron mantenidos en condiciones estándar de bioterio a una temperatura de 24 ± 2 ºC y con ciclo controlado de luz-oscuridad 12:12 h. Los animales fueron colocados en cajas de acrílico colectivas 47 x 33 x 20 cm, con camas de aserrín y se les proporcionó agua y alimento (Nutrícubos Purina) ad
libitum. El protocolo experimental fue aprobado por el comité de la Universidad
Autónoma de Tlaxcala para el manejo de los animales de laboratorio, según las reglas del Consejo Mexicano sobre el cuidado y uso de los animales experimentales (NOM-062-ZOO 1999).
Se realizaron dos experimentos. El primero, para mostrar que los cuerpos eréctiles peneanos y la uretra peneana presenta inervación parasimpática cuyas neuronas están localizadas en el plexo pélvico menor.
EXPERIMETO 1. NEURONAS AUTONÓMICAS POSGANGLIONARES QUE
INERVAN EL PENE
OBJETIVO
Determinar si el plexo pélvico menor contiene neuronas posganglionares que inervan a estructuras peneanas.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar las características anatómicas e histológicas del plexo pélvico menor.
Determinar mediante estudios histoquímicos si el plexo pélvico menor contiene neuronas posganglionares que inervan a los cuerpos cavernosos, al cuerpo esponjoso y a la uretra peneana.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las características, distribución y topografía del plexo pélvico menor fueron determinadas por anatomía gruesa (n=4) y estudios histológicos (n=14). Las neuronas posganglionares que inervan el tejido eréctil del pene fueron marcadas con peroxidada de rábano (n=4).
Anatomía gruesa
y se tomaron fotografías digitales de la Rsnp, las cuales se trabajaron en Corel Photo-Paint, versión 13.0 (Corel, Mountain View, CA).
Estudio histológico
Colecta del tejido
De las veintidós ratas macho, catorce fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (60 mg/kg, IP; Anestesal, Smith Kline, México DF, México). El hueso pélvico fue removido. Usando un microscopio estereoscópico, el plexo pélvico menor izquierdo fue localizado (Pastelín y cols. 2008). En ocho ratas se colectaron bloques de aproximadamente 5-7 mm² del tejido localizado en la base del pene. Esté incluyó el plexo pélvico menor y una pequeña fracción de musculatura estriada del EEU y de la vena pudenda. El tejido de cuatro animales fue teñido con tricrómica de Masson y otros cuatro se tiñeron con la técnica de Nissl. En seis ratas adicionales el plexo pélvico menor fue removido por separado de los tejido circundantes y ambos tejidos fueron teñidos con la técnica de Nissl.
Procedimiento
Marcaje de neuronas posganglionares
tetrametilbenzidina para visualizar el tejido que rodea a las neuronas.
Mediciones, procesamiento de imágenes y análisis estadístico
RESULTADOS
Anatomía gruesa
Características histológicas
En los cortes longitudinales del tejido teñido con tricrómica de Masson se encontró, entre los axones y rodeado por tejido conectivo, una estructura elongada (717 µm²) con un cúmulos de alrededor de 150 ± 20 células con núcleo grande (Figura 11 A). El colágeno estaba unido al esfínter externo de la uretra (Figura 11 A). Junto al músculo estriado, también pudo observarse tejido epitelial similar al revestimiento de la uretra. En el tejido procesado con Nissl se encontró alrededor de 140 células marcadas con violeta de cresilo (Figura 2B), confirmando que las células son neuronas. Las neuronas se agrupan en posición similar a las observadas en el tejido teñidas con tricrómica de Masson.
Figura 11. Plexo pélvico menor en la rata macho. Microfotografía de una sección longitudinal del tejido colectado de la base del pene, donde se encontró el plexo pélvico menor, teñido con tricrómica de Masson (A) o Nissl (B). Note que en el panel A, cerca del músculo estriado (MS), se encuentra una estructura como ganglio nervioso rodeado por tejido conectivo, que contiene células con núcleos grandes. En B note algunas células nerviosas teñidas con Nissl que se distribuyen en una estructura similar a un ganglio (*).
nervio, en 80-90 laminillas de las 270-290 colectadas. En el tejido recolectado por debajo de la Rsnp, cerca de la rama anastomótica, se encontraron células teñidas asociadas a los axones que corren cerca del EEU. Acorde a su ubicación, se identificaron 5 grupos de células, 4 ganglios en el plexo pélvico menor (ganglio1-4; Figura 12) y uno más en el tejido adyacente (ganglio 5, Figura 12). Los ganglio 1, 2 y 5 tenían más células (40 a 50 cada uno) que el ganglio 3 y 4 (15 a 25 cada uno). Como se muestra en las imágenes digitales representativas del tejido teñido con Nissl, las células de los ganglios fueron similares en su tamaño, en su forma y núcleo. Alrededor de estas células se pueden observar otras células pequeñas similares a las células gliales.
NDP
Neuronas posganglionares
En las laminillas del tejido colectado en el plexo pélvico menor de las ratas inyectadas con HRP-WGA se encontraron de 80 a 100 neuronas posganglionares marcadas (el número se ajusto con el factor de corrección Abercrobie’s). En los cortes contrateñidos con eosina, después de la reacción enzimática, se observaron los axones rodeando a los soma (Figura 13 A). Las células tienen forma triangular (Figura 13 B). El promedio del área del soma fue 86 ± 4 µm². Las neuronas marcadas fueron detectadas en los 5 ganglios descritos anteriormente.
También se encontraron neuronas marcadas con HRP-WGA en el GPM (300 ± 38) y en el ganglios de la raíz dorsal (28 ± 8), indicando que la técnica histoquímica fue correctamente ejecutada. La especificidad de la reacción enzimática también fue probada en estudios preliminares al inyectar HRP-WGA en el músculo cavernoso de la rata macho. En estos animales se encontraron neuronas marcadas en los núcleos dorsolaterales de los segmentos L6-S1 de la médula espinal, pero no en plexo pélvico menor.
DISCUSIÓN
El presente estudio reporta que hay neuronas posganglionares en un pequeño plexo localizado en la base del pene de la rata macho, cuyos axones posganglionares están inervando estructuras peneanas. En previos estudios, se ha reportado que las neuronas posganglionares del pene se encuentran en el GPM y pueden también localizarse en el nervio cavernoso (Keast 2006 y Dail y cols. 1989).
El presente estudio ha confirmado la inervación de las estructuras peneanas por el GPM y ha añadido que alrededor de 25% de las neuronas del pene se encuentran en otro plexo pequeño ubicado en la base del pene. Nuestros hallazgos sugieren que las funciones del pene no solo están reguladas por las neuronas localizadas en el GPM, sino también por las neuronas del plexo pélvico menor aquí descrito. Debido a que el plexo pélvico menor se localiza cerca de los órganos blanco existe la posibilidad que las neuronas posganglionares sean parasimpáticas. Los axones preganglionares que viajan por las ramas anastomáticas y los axones posganglionares podrían llegar a los órganos blanco a través de la Rsnp, la rama al plexo venoso y la rama del divertículo uretral. De esta manera, además de la vía autonómica descrita para el nervio cavernoso (Quinlan y cols. 1989 y Quinlan y cols. 1991), la Rsnp podría ser una vía importante autonómica y no solamente vía somática sensorial, que puede contribuir a la regulación de las funciones peneanas tales como la erección, eyaculación y la micción. Nuestra propuesta es sustentada por los hallazgos de que el nervio cavernoso no es la única vía vasodilatadora del plexo pélvico al pene de la rata macho (Dail y cols. 1999). Otros axones que convergen en la Rsnp proceden de las neuronas simpáticas (Galindo y cols. 1997). Por lo tanto, la Rsnp parece ser un nervio mixto con axones que viajan de la médula espinal por lo menos a través de dos vías, la Rsnp y el plexo pélvico menor. Estas dos vías estarían convergiendo en el nervio dorsal del pene, lo que aclara el efecto diferencial de la ablación del nervio dorsal del pene versus la neurectomía de la Rsnp
menor (pueden ser axones preganglionares del GPM así como posganglionares) son relevantes o complementarios a los axones que viajan en el pudendo para regular la erección y la eyaculación. Al igual que en las ratas, se ha mostrado que en cadáveres existe una conexión de fibras de el nervio cavernoso y el nervio dorsal del pene (Benoit y cols. 1999), sugiriendo que el nervio dorsal del pene del hombre también tiene componentes autonómicos, además de los axones somatosensoriales. En contraste con nuestro estudio, no se encontraron neuronas posganglionares en los cadáveres en el área anastomótica. Este resultado podría estar relacionado a la diferencia del sistema nervioso en las especies o a los procedimientos metodológicos. En humanos, gatos y perros, el plexo pélvico está formado por una compleja red de nervios y un gran número de ganglios (Benoit y cols. 1999; Langley y Anderson 1896; Wozniak y Skowronska 1967; Li y Masuko 2001; Juenemann y cols. 1988). En estos ganglios pudiera estar regulada la función peneana y no necesariamente en el área anastomótica. También, es posible que haya neuronas en el área anastomótica pero no se encontraron. Los investigadores no reportan en su investigación si analizaron todo el tejido nervioso. En nuestro estudio, las neuronas están restringidas a regiones específicas ya que en más de la mitad del tejido no hubo neuronas.
urinaria) y el ganglio pélvico menor, situado cerca de la base del pene. Todos estos componentes deber ser considerados cuando se estudia la regulación neural del aparato urogenital en la rata macho.
CONCLUSION
EXPERIMENTO 2. INERVACIÓN DE ESTRUCTURAS PENEANAS A TRAVÉS DE
LA RAMA SENSORIAL DEL NEVIO PUDENDO
En el experimento uno se mostró que las neuronas posganglionares que inervan a los cuerpos eréctiles peneanos y a la uretra peneana se encuentran en el ganglio pélvico menor y en el ganglio pélvico mayor. Para conocer si los axones de estas neuronas viajan por la Rsnp, se utilizaron 8 ratas machos que se distribuyeron en dos grupos: intacto y denervado. En el grupo intacto (Int=4) se inyectó HRP-WGA unilateralmente en la uretra peneana, los cuerpos cavernosos y el cuerpo esponjoso y se contó el número de neuronas marcadas en el ganglio pélvico menor, en el ganglio pélvico mayor y en los ganglios accesorios. En el grupo denervado (Nx=4) se cortó bilateralmente la Rsnp previo a la inyección del trazador en las estructuras mencionadas. Se contó el número de neuronas marcadas en el ganglio pélvico menor, en el ganglio pélvico mayor y en los ganglios accesorios.
OBJETIVO
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
El peso, la edad y el alojamiento de los animales fueron similares a los descritos en el experimento uno.
Inyección del trazador
Se inyectó 5 µl de HRP-WGA en la uretra peneana, en el cuerpo esponjoso y en el cuerpo cavernoso izquierdo. Los animales fueron perfundidos, se colectaron y analizaron el ganglio pélvico menor, el ganglio pélvico mayor y los ganglios accesorios, todos del lado izquierdo. La reacción histoquímica y el conteo de las células marcadas se realizaron acorde a los métodos descritos en la sección de marcaje de neuronas posganglionares y en la sección de mediciones, procesamiento y análisis estadístico del experimento uno.
RESULTADOS
Tabla 1. Números de neuronas positivas a HRP-WGA en machos intactos y
denervados de la rama sensorial del nervio pudendo.
Ganglios
pélvicos
Grupo
Intacto
n=4
Grupo
Denervado
n=4
Ganglios
accesorios 140 ± 2.3 120 ± 4.1
Ganglio pélvico
menor 60 ± 5.6 20 ± 0.8
Ganglio pélvico
Intactos
40X
Denervados
40X
Ganglio pélvico menor Ganglio pélvico mayor Ganglios accesorios
DISCUSIÓN
Los resultados histoquímicos del presente trabajo muestran que la Rsnp contiene axones posganglionares de neuronas localizadas en el ganglio pélvico menor, en el ganglio pélvico mayor y en los ganglios accesorios que inervan a la uretra peneana, a los cuerpos cavernosos y al cuerpo esponjoso. Así, confirmamos que la Rsnp tiene componentes autonómicos, por lo que, se debe considerar a la Rsnp como un nervio mixto, con componentes somáticos y autonómicos. No es sorprendente encontrar axones autonómicos en la Rsnp si consideramos que los axones provenientes de las neuronas posganglionares del ganglio pélvico mayor se anastomosan con los axones de la Rsnp para formar el ganglio pélvico menor (Pastelín y cols. 2008).
El hecho de encontrar neuronas positivas a HRP en varios ganglios pélvicos (ganglio pélvico menor, ganglio pélvico mayor y ganglios accesorios) y la disminución en número de cuerpos neuronales con la denervación de la Rsnp nos indica que el aparato urogenital de la rata macho recibe inervación eferente parasimpática de diferentes poblaciones neuronales cuyos axones convergen en la Rsnp, aunque no es la única vía. Esta complejidad se explica en términos de las funciones realizadas, ya que la Rsnp controla funciones reproductivas y de micción. El hecho de que la denervación de la Rsnp disminuyera la proporción de neuronas posganglionares en los ganglios pélvicos pero no las eliminara, confirma que la Rsnp no es la única vía de centros nervioso a las estructuras peneanas. Existe otra vía, la del nervio cavernoso (Quinlan y cols. 1986; Quinlan y cols. 1991). Este nervio quedó íntegro en nuestros animales neurectomizados. De acuerdo a estudios anatómicos la Rsnp y el nervio cavernoso son los dos únicos nervios que llegan a inervar a los cuerpos eréctiles peneanos y a la uretra peneana de la rata macho.
CONCLUSIÓN
DISCUSIÓN GENERAL
La Rsnp lleva aferentes de la piel prepucial, del cuerpo del pene y del glande (Pastelín y cols. 2008). Esta información sensorial juega un papel primordial en la regulación de las funciones reproductivas como la intromisión y la eyaculación (Meisel y Sachs 1994; Andersson y Wagner 1995). Con respecto a sus componentes motores, esta rama podría participar en la compresión de la vena dorsal del pene mediante la contracción del uretralis (Dail y Sanchs 1991). Este mecanismo puede mantener la vena obstruida para acumular sangre e irrigarla a las trabéculas de los cuerpos cavernosos, producir tumescencia y rigidez de los cuerpos peneanos. Los axones posganglionares autonómicos pueden contribuir a la regulación de tales funciones peneanas. Los hallazgos de las fibras parasimpáticas de la Rsnp en nuestro estudio son relevantes. En la figura quince proponemos la organización de axones que conforman a la Rsnp en la rata macho. La Rsnp emerge del nervio pudendo, el cual a su vez se origina del tronco L6-S1. La inervación aferente de las estructuras peneanas corren por la Rsnp pasando por el nervio pudendo y el tronco L6-S1 hasta llegar a los ganglios de la raíz dorsal de la región lumbosacra. La inervación eferente somática está sustentada por neuronas cuyos somas se localizan en la región ventral lumbosacra (L6-S1). Estos axones eferentes corren por el tronco L6-S1 pasando por el nervio pudendo y de ahí a la Rsnp cuyas fibras inervan al músculo uretralis (Pastelín y cols. 2008).
viajan a través del nervio hipogástrico pasando por el GPM y por las ramas laterales y ventral llegando a la Rsnp y de ahí a los órganos blanco.
Con respecto a la inervación eferente parasimpática los cuerpos neuronales se encuentran en la región mediolateral L6-S1 de la médula espinal. Los axones preganglionares confluyen en el tronco L6-S1 pasando por los nervios pudendo y pélvico, en donde algunos axones preganglionares hacen relevo en las neuronas del ganglio pélvico mayor y cuyos axones posganglionares viajan por las ramas que se anastomosan con la Rsnp, a través de estas inervan las estructuras peneanas. Los axones posganglionares también pueden tomar otra ruta, pasando por el GPM y haciendo relevo en los cuerpos neuronales del ganglio pélvico menor para inervar los órganos blanco mencionados. La otra vía de las eferentes posganglionares puede ser a través del nervio pélvico en donde algunos axones hacen relevo con las neuronas del los ganglios accesorios cuyos axones posganglionares corren a través del GPM hasta Rsnp. Esta rama es la vía final de estas fibras posganglionares que estarían inervando a los cuerpos eréctiles peneanos y uretra peneana. Así, la Rsnp de la rata macho es un nervio mixto con componentes sensoriales, motores somáticos y autonómicos. En revisiones a la composición de la Rsnp en otras especies hemos notamos algunas similitudes con respecto a su composición. En el hombre la Rsnp posee componentes somáticos sensoriales que inervan a la piel prepucial, al cuerpo del pene y al glande. Componentes autonómicos que inervan a la uretra distal y componentes somatomotores que inervan al esfínter externo de la uretra (Narayan y cols. 1995; Benoit y cols. 1999). En el conejo la Rsnp tiene componentes sensoriales de la piel prepucial y de el pene y somatomotores del músculo bulboesponjoso (Wu y cols. 2007; Cruz y cols. 2002). En el gato tiene
CONCLUSION GENERAL
PERSPECTIVAS
Determinar mediante anatomía gruesa e histología las características morfológicas de la glándula prepucial de la rata macho y mediante estudios de marcaje retrogrado corroborar si la glándula prepucial esta inervada por la rama sensorial del nervio pudendo.
Describir con técnicas de inmunohistoquímica, los neurotranmisores y neuropéptidos presentes en las neuronas posganglionares que se localizan en el plexo pélvico menor.
Corroborar la proporción de neuronas posganglionares en los ganglios pélvicos con la denervación de la Rsnp versus nervio cavernoso, para determinar cual de los
REFERENCIAS
Abercrombie. The annotated Abercrombie. Anat Rec. 99: 239-24, 1946.
Ambadkar PM y Vyas DM. Innervation of the rat preputial gland. Acta Anat. 110:
98-102, 1981.
Ambadkar PM y Vyas DM. In vitro characterization of adrenergic receptor mediating of preformed sebum from preputial gland of rat. Depart Zool. 307-308,
1979.
Andersson KE y Wagner G. Physiology of penile Erection. Physiol Rev. 75: 191-236,
1995.
Benoit G, Droupy S, Quillard J, Paradis V y Giuliano F. Supra and infralevator neurovascular pathways to the penile corpora cavernosa. J Anat. 195:
605-15, 1999.
Berkley KJ, Robbins A y Sato Y. Functional differences between afferent fibers in the hypogastric and pelvic nerves innervating female reproductive organs in the rat. J Neurophysiol. 69: 533-44, 1993.
Berkley KJ. Autonomic nervous system and reproduction. En Encyclopedia of reproduction. Knobil E y Neill JD. (eds.) Academic Press. United States of
America. Pp. 320-325, 1999.
Canguven O y Burnett A. Cavernous nerve injury using rodent animal models. J Sex.
Cruz Y, Hudson R, Pacheco P, Lucio RA, Hudson R y Martínez-Gómez M. Anatomical and physiological characteristic of perineal muscles in female rabbit. Phyisiol Behav. 75: 33-40, 2002.
Cruz Y, Pastelín C, Cerezo H, Pacheco P, Juarez M. Branches of the major pelvic ganglion in male rat. Annual meeting of Neuroscience 2009. Chicago, Illinois, 2009.
Cruz Y, Zempoalteca R, Lucio RA, Pacheco P, Hudson R y Martínez-Gómez M. Pattern of sensory innervation of the perineal skin in the female rat. Brain
Res. 1024: 97-103, 2004.
Dail WG, Harji F, Gonzales J y Galindo R: Multiple vasodilator pathways from the pelvic plexus to the penis of the rat. Int J Impot Res. 11: 277-85, 1999.
Dail WG y Sachs BD. The ischiouretralis muscle of the rat: anatomy, innervation, and function. Anat Rec. 229: 203-208, 1991.
Dail WG, Trujillo D, Diana de la Rosa, Walton G. Autonomic innervation of reproductive organs: Analysis of the neurons whose axons project in the main penile nerve in the pelvic plexus of the rat. Anat Rec. 224: 94-101,
1989.
de Groat WC y Steers WD. Neural control of the urinary bladder and sexual organs. Experimental studies in animals. Oxford Press, 1988.
Gabella G. Autonomic nervous sytem. The rat nervous sytem. Paxinos G (eds.)
Galindo R, Barba V y Dail WG. The sensory branch of the pudendal nerve is the major route for adrenergic innervation of the penis in the rat. Anat Rec.
247: 479-85, 1997.
Harji F, Gonzales J, Galindo R y Dail WG. Preganglionic fibers in the rat hypogastric nerve project bilaterally to pelvic ganglia. Anat Rec. 252: 229-234. 1998.
Hebel R y Stromberg WA. Anatomy and embryology of the laboratory rat. Bio Med
Verlag. Germany, 1986.
Holstege G, Blok FM, Horst G. Brain stem systems for blinking, feeding y micturition. En: The rat nervous system. Paxinos G (eds.) Academic Press. Australia.
Pp. 257-275, 1995.
Hulsebosch CE y Coggeshall RE. An analysis of the axon population in the nerves to the pelvic viscera in the rat. J Comp Neurol. 211: 1-10, 1982.
Juenemann KP, Lue TF, Schmidt RA y Tanagho EA. Clinical significance of sacral and pudendal nerve anatomy. J Urol. 139: 74-80, 1988.
Keas J. Plasticity of the pelvic autonomic ganglia and urogenital innervation. Int Rev
Cytol. 248: 141-208, 2006.
Keast JR, Booth AM y de Groat WC. Distribution of neurons in the major pelvic ganglion of the rat which supply the bladder, colon or penis. Cell Tissue
Res. 256: 105-12, 1989.
Langworthy OR. Innervation of the pelvic organs of the rat. Invest Urol. 2: 491-511,
1965.
Larsson K y Sodersten P. Mating in male rats after sections of the dorsal penile nerve. Physiol Behav. 10: 567-71, 1973.
Li MZ y Masuko S. Target specific organization and neuron types of the dog pelvic ganglia: a retrograde-tracing and immunohistochemical study. Arch Histol
Cytol. 64: 267-80, 2001.
Loranca MA. Participación del nervio hipogástrico en la conducta copulatoría de la rata macho. Tesis licenciatura. Universidad Autónoma de Puebla, 1994.
Lucio RA. Participación del nervio pélvico en la conducta copulatoría de la rata macho. Tesis de Maestría. UAT- CINVESTAV, 1992.
Lucio RA, Manzo J, Martínez- Gómez M, Sachs BD y Pacheco P. Participation of pelvic nerve branches in male rat copulatory behavior. Physiol Behav. 55:
241-246, 1994.
Lucio RA, Manzo J y Pacheco P. Pelvic and hypogastric nerve co-participation in the mediation of the male rat sexual behavior. Soc Neurosci Abstract. 17:
1059, 1991.
Maggi CA, Conte B, Furio M, Santicioli P, Guliani S y Meli A. Further studies on mechanisms regulating the voiding cycle of the rat urinary bladder. Gen
Pharmacol. 20: 833-838, 1989.
Mariano TY, Boger AS y Gustafson KJ. The feline dorsal nerve of the penis arises from the deep perineal nerve and not the sensory afferent Branch. Anat
Histol Embryol. 1-3. 2007.
Martínez-Gómez M, Chirino R, Beber C, Komisaruk BR y Pacheco P. Visceral and postural reflexes evoked by genital stimulation in urethane-anasthetizad female rats. Brain Res. 572: 279-284, 1992.
Martínez-Gómez M. Estudio anatómico y fisiológico de reflejos involucrados en la actividad reproductiva pélvica de la rata hembra. Tesis de Maestría.
UAT-CINVESTAV, 1991.
McKenna KE y Nadelhaft I. The organization of the pudendal nerve in the male and female rat. J Comp Neurol. 248: 532-549, 1986.
McKenna KE y Nadelhaft I. The pudendo-pudendal reflex in male and female rats. J
Autom Nerv Syst. 27: 67-77, 1989.
Meisel RL y Sachs BD. The physiology of male sexual behavior. Physiol Reprod. 35:
3-105, 1994.
Mensulam MM. Tetramethybenzidine for hoseradish peroxidase neurohistochemistry: A non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents, J Histochem Cytochem. 26:
106-117, 1978.
Moore CL y White RH. Sex difference in sensory and motor branches of the pudendal nerve of the rat. Horm Beh. 30: 590-599, 1996.
Nadelhaft I y Vera PL. Neurons labelled after the application of tracer to the distal stump of the transected hypogastric nerve in the rat. J Auton Nerv Syst. 36:
87-96, 1991.
Narayan P, Konety B, Aslam K, Aboseif S, Blumenfeld W y Tanagho E. Neuroanatomy of the external urethral sphincter: implications for urinary continence preservation during radical prostate surgery. J Urol. 153:
337-341. 1995.
Nuñez H, Gross GH y Sachs BD. Origin and central projections of rat dorsal penile nerve. Possible direct projection to autonomic and somatic neurons by primary afferents of nonmuscle origin. J Comp Neurol. 247: 417-429, 1986.
Pacheco P, Camacho MA, García LI, Hernández ME, Carrillo P y Manzo J. Electrophysiological evidence for the nomenclature of the pudental nerve and sacral plexus in the male rat. Brain Res. 763: 202-208, 1997.
Pacheco P, Martínez-Gómez M, Whipple M, Beber C y Komisaruk BR. Somato-motor components of the pelvis and pudendal nerve of the female rat. Brain Res.
490: 85-94, 1989.
Pastelín CF, Zempoalteca R, Pacheco P, Downie JW y Cruz Y. Sensory and somatomotor components of the "sensory branch" of the pudendal nerve in the male rat. Brain Res. 1222: 149-55, 2008.
Poortmans A y Wyndaele JJ. M. levator ani in the rat: does it really lift the anus? Anat Rec. 25: 20-7, 1998.
Quinlan DM, Nelson RJ, Partin AW, Mostwin JL y Walsh PC. The rat as a model for the study of penile erection. J Urol. 141: 656-61, 1989.
Quinlan DM, Nelson RJ y Walsh PC. Cavernous nerve grafts restore erectile function in denervated rats. J Urol. 145: 380-3, 1991.
Reitz A, Shamid DM, Curt A, Knapp PA y Shurch B. Afferent fibers of the pudendal nerve modulate sympathetic neurons controlling the bladder neck.
Neurourol Urodyn. 22: 597-60I, 2003.
Sachs BD y Liu YC. Copulatory behavior and reflexive penile erection in rats after section of the pudendal and genitofemoral nerves. Physiol Behav. 51:
673-80, 1992.
Sachs BD y Liu YC. Maintenance of erection of penile glans, but not penile body, after transection of rat cavernous nerve. Am Urol. 146: 900-905, 1991.
Schrǿder HE. Organization of the motoneurons innervating the pelvic muscles of the male rat. J Comp Neurol. 192: 567-587, 1980.
Soto S, Hayashi RH y Garfield RE. Mechanical responses of the rat uterus, cervix, and bladder to stimulation of hypogastric and pelvic nerves in vivo. Biol
Reprod. 40: 209-219, 1989.
Steinman JL, Carlton SM y Willis WD. 1992. The segmental distribution of afferent fibers from the vaginal cervix and hypogastric nerve in rast. Brain Res. 575:
Steers WD, Mallory B y de Groat WC. Electrophysiological study of neural activity in penile nerve of the rat. Am J Physiol. 254: R989-1000, 1988.
Wail CY, Liehr P, Boreham MK, Schaffer JI y Word RA. Effect of periurethral denervation on smooth muscle of the lower urinary tract. Am J Obstet
Gynecol. 191: 1950-60. 2004.
Wozniak W y Skowronska U. Comparative anatomy of the pelvic plexus in cat, dog, rabbit, macaque and man. Anat Anz. 120:457-73, 1967.
Wu BJ, Jiang H, Li WP, Zhang YF y Che G. Location of somatic sensory neurons of the skin and dorsal neve of the penis in rabbit. Zhonghua Nan Ke Xue. 13:
17-20. 2007.
Yoo PB, Woock JP y Grill WM. Somatic innervation of the feline lower urinary tract.
APÉNDICE I
APÉNDICE II
Basic and Translational Science
Another Component of the Pelvic
Plexus That Innervates the Penis in the Rat
C. F. Pastelín, P. Pacheco, M. Camacho, and Y. Cruz
OBJECTIVES To determine whether the small plexus located at the base of the penis, consisting of nerves arising from the major pelvic ganglion, connecting with the sensory branch of the pudendal nerve, contains postganglionic neurons innervating the erectile tissue and urethra of the penis. METHODS A total of 22 adult male Wistar rats 3-4 months of age (weight 250-350 g) were used. The features, distribution, and topography of the small plexus were determined by gross anatomy and histologic studies (Masson’s trichrome and Nissl stain). Postganglionic neurons were traced with horseradish perox-idase-wheat germ agglutinin injected in the cavernosum, spongiosum corpora, and penile urethra. RESULTS The small plexus located at the base of the penis has ganglia containing cells with large nuclei.
The cells were stained with the Nissl technique confirming they are neurons. The neurons were positively labeled with horseradish peroxidase-wheat germ agglutinin after the tracer was in-jected in the penile structures.
CONCLUSIONS In the male rat, the small plexus located at the base of the penis contains postganglionic neurons innervating the penile structures. These neurons can contribute to the regulation of the sexual and urinary function of the genitourinary tract. Because the rat is the main laboratory animal used in urologic studies, it is important to consider, when designing experiments or discussing results, that in addition to the major pelvic ganglion, other postganglionic neurons of the penis are provided by the small plexus. The small plexus could be named the minor pelvic ganglia and considered a component of the pelvic plexus. UROLOGY78: 232.e7–232.e13, 2011. © 2011 Elsevier Inc.
I
n male mammals, the genitourinary tract has sexual and urinary function. The urethra expels urine during voiding and semen during ejaculation. These func-tions are regulated by somatic and autonomic innerva-tion and damage to this neural circuitry could cause erectile, ejaculatory, and urinary dysfunction.Most of the autonomic regulation of the genitourinary tract is provided by the pelvic ganglia, which contain a mixture of sympathetic and parasympathetic neurons. The structure of the pelvic ganglia is commonly referred to as a pelvic plexus.1
The pelvic plexus of the male rat has a single major ganglion (MPG) with 2 incoming nerves, the hypogastric and pelvic nerves.2-4In addition, a cluster of 2-4 micro-ganglia (also known as accessory pelvic micro-ganglia) are lo-cated in the lateral ligament, distal and cranial to the MPG, between the urethra and ductus deferens.2
From the MPG emerges several efferent nerves that supply the bladder, rectum, bulbourethral gland, prostate, rostral urethra, and penis.1-6 Three sets of nerves that emerge from the MPG run to the penis: the main branch, lateral branch, and ventral branch.2 The main branch, also called the main penile nerve or cavernous nerve, has been extensively studied and found to carry afferent and efferent axons with hundreds of scattered neurons pro-jecting to the corpora penile crus, corpus spongiosus, and bulbourethral gland.3,5,6 The other 2, the lateral and ventral nerves, have been considered as accessory vaso-dilator pathways from the MPG to the penis.7
In a previous study, it was found that the lateral and ventral nerves are connected to the sensory branch of the pudendal nerve (SBPdn) to form a small plexus at the base of the penis.8
The aim of the present study was to determine whether the small plexus located at the base of the penis, consist-ing of nerves arisconsist-ing from the major pelvic ganglion connecting with the SBPdn, contains postganglionic neurons innervating penile structures.
MATERIAL AND METHODS
Animals and Experimental Design
A total of 22 adult male Wistar rats aged 3-4 months (weight 250-350 g) were used. The rats were maintained on a
12/12-This study was supported by the Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (grant 61352).
From the Doctorado en Neuroetología, Instituto de Neuroetología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, Mexico; Instituto de Neuroetología, Universidad Veracruzana, Xalapa, Veracruz, Mexico; Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, México City, Mexico; and Centro Tlaxcala de Biología de la Conducta, Universidad Autónoma de Tlaxcala, Tlaxcala, México
The Tlaxcala University Committee on Laboratory Animals approved the experiment protocol, according to the guidelines of the Mexican Council on Laboratory Animals Care (NOM-062-Z00-1999).
The features, distribution, and topography of the small plexus were determined by gross anatomy (n ⫽ 4) and histologic studies (n⫽14). Postganglionic neurons innervating erectile tissue of the penis were traced with horseradish peroxidase (HRP) (n⫽4).
Gross Anatomy
In rats anesthetized with urethane (1.2 g/kg administered in-traperitoneally), a longitudinal skin incision was made at the midline of the abdominal and pelvic region. The penis was freed by cutting the suspensory ligaments. Next, the pubic and the ischial pelvic bones, as well as the striated muscles attached to them, were withdrawn. The SBPdn was dissected, and the small pelvic plexus was located according to a previous study.8
Draw-ings were made using a Leica MZ6 stereoscopic microscope. The digital photographs were taken and managed in Corel Photo-Paint, version 13.0 (Corel, Mountain View, CA).
Histologic Studies
Tissue Collection.Of the 22 rats, 14 were anesthetized with sodium pentobarbital (60 mg/kg intraperitoneally; Anestesal, Smith Kline, Mexico City, Mexico). The pubic bone was with-drawn. Using a stereoscopic microscope, the left small plexus was located.8In 8 rats, we collected it in a block of 5-7 mm2of tissue located at the base of the penis, which included the small plexus and the surrounding striated muscle and pudendal ves-sels. The tissue of 4 rats was stained with Masson’s trichrome stain. The tissue of the others was stained using the Nissl technique. In another 6 rats, the small plexus was collected separately from the surrounding tissue for Nissl staining. Procedure. The fresh tissue was placed in Böuin Duboscq’s fixative solution (glacial acetic acid, formalin, and picric acid) for ⱖ16 hours. The fixed tissues were rinsed, dehydrated in graded ethanol, and embedded in paraffin. Paraffin sections of 7-m thickness were cut with a microtome. The sections were deparaffinized in xylene, rehydrated through graded ethanol, and stained with Masson’s trichrome stain or using the Nissl procedure. Masson’s trichrome is a staining protocol that pro-duces red keratin and muscle fibers, blue or green collagen and bone, light red or pink cytoplasm, and dark brown to black cell nuclei. Nissl’s method is used for the detection of Nissl bodies in the cytoplasm of neurons, which are stained purple-blue, giving the cytoplasm a mottled appearance.
Tracing Postganglionic Neurons
The rats were anesthetized with an intraperitoneal injection of ketamine (90 mg/kg) and xylazine (15 mg/kg intraperitoneally) and placed in the supine position. A longitudinal incision was made in the perineal skin, between the testicles and the bulbar urethra. The base of the penis and the crura were exposed, and the bulbospongiosus muscle was removed to avoid tracer being captured by the adjacent musculature. Under a stereoscopic
microscope, 25 g of HRP-wheat germ agglutinin
(HRP-WGA) diluted in 5 L of 1% dimethylsulfoxide (Sigma-Al-drich, St. Louis, MO) was injected into the cavernosum, spon-giosum corpora, and penile urethra. A single penetration of a
covering the bulbar urethra. The needle was moved to inject ⱖ2 points of the penile urethra and spongiosum corpus. An-other 5 L of the tracer solution was injected into the left corpus cavernosum. The needle was left in place for 1-2 minutes after tracer administration and then slowly withdrawn. The tissue was washed with saline solution and the skin sutured closed. The rats were kept in a warm chamber until their recovery from anesthesia and analgesia was provided (bu-prenophrine 0.03 mg/kg). Next, they were returned to the animal room. After 24-48 hours, the HRP-WGA-injected rats were anesthetized with sodium pentobarbital (60 mg/kg intra-peritonally) and immediately perfused transcardially with 400 mL of heparinized saline solution (0.09%), followed by 400 mL of fixative at room temperature (1% paraformaldehyde and 1.25% glutaraldehyde in 0.1-M phosphate buffer, pH 7.4) and 400 mL of cryoprotecting 10% sucrose in 0.1-M phosphate buffer (pH 7.4), maintained at 4°C. In the left side of the base of the penis, a block of⬃5-7 mm2of tissue, including the small pelvic plexus, was collected. In 2 rats, the major pelvic ganglion and L5-S1 dorsal root ganglia were also harvested as a positive control. The tissue was stored for 24-48 hours in sucrose buffer solution at 4°C, embedded in Tissue-Tek medium for frozen tissue specimens (Sakura Finetek, Torrence, CA) and cryostat sectioned (Leica CM1850, Leica Microsystems, Wetzlar, Ger-many) at 10m longitudinally (n⫽2) or transversally (n⫽2). The sections were mounted on poly-L-lysine-coated slides and
air-dried for 6-24 hours. The sections were processed for the tetramethylbenzidine procedure, then rinsed in 0.0025-M ace-tate buffer (pH 3.3), dehydrated in graded ethanol, cleared in xylene, and mounted in Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Hat-field, PA). Some sections were counterstained with eosin to visualize the tissue surrounding the neurons.
Measurements, Image
Processing, and Statistical Analysis
The sections were examined with an optical microscope (Axio Imager A1, Carl Zeiss, Thornwood, NY). Only those neurons whose body and nucleus were clearly visible were counted. The raw number of labeled neurons was adjusted using the formula for Abercrombie’s correction factor. The sections were photo-graphed with a digital camera (Cannon PowerShot S50, Canon USA, Lake Success, NY). Digital photomicrographs were saved as tiff files, and the images were analyzed in Corel Photo-Paint X3, version 13.0 (Corel) with automatic adjustment of contrast and brightness. The area of the soma of 20 neurons per rat was measured using AxioVision, version 4.6, software (Carl Zeiss) by tracing the outline of the labeled cell body and calculating the enclosed area.
RESULTS
Gross Anatomy
the SBPdn, the 3 nerves connect and continued cau-dally to reach a bridge-like structure (Fig. 1B). At least 2 clear swellings or protrusions were present in the bridge (Fig. 1B). From the small plexus 1 nerve emerges that divides into 2 branches (Fig. 1B). One branch runs to the vascular plexus located at the base of the penis and enters to the corpus cavernosum. The other one passes below the SBPdn and joined a branch emerging from it (Fig. 1B). From this juncture, a nerve emerges that runs caudally and enters the bulbar
ure-Histologic Features
In longitudinal sections of the tissue harvested en bloc and stained with Masson’s trichrome stain, an elongated structure (717m2) was observed containing 150⫾ 20
cells with a large nucleus surrounded by axons and con-nective tissue (Fig. 2A). The collagen was attached to the external urethral sphincter (Fig. 2A). Epithelial tis-sue similar to that lining the urethra was observed next to the external urethral sphincter (data not shown). In the Nissl-stained slices, we counted about 140 positively
Figure 1. Gross anatomy of innervation of urogenital viscera.(A)Drawing of lateral view of urogenital tract of male rat showing major pelvic ganglion and its afferent and efferent branches. Note, 2 lateral (Ln) and 1 ventral (Vn) nerve
anastomosed to SBPdN, forming a small plexus located near base of penis.(B)Expanded view of the small plexus. From
the small plexus originates 2 branches; 1 runs to venous plexus of penis and other to bulbar urethra.(C)Digital image of
