Complementación de baculovirus que no forman
cuerpos de oclusión mediante líneas celulares
establemente transformadas con el gen poliedrina
López, María Gabriela
2010
Tesis Doctoral
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
www.digital.bl.fcen.uba.ar
Contacto: [email protected]
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Fuente / source:
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
“Complementación de baculovirus que no
forman cuerpos de oclusión mediante líneas
celulares establemente transformadas con el
gen poliedrina”
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de
Buenos Aires en el área: Ciencias Biológicas
Lic. María Gabriela López
Director: Dr. Oscar Taboga
Consejero de estudio: Dr. Esteban Hopp
Laboratorio de Virus Animales Instituto de Biotecnología
CNIA, INTA-Castelar
establemente transformadas con el gen poliedrina
Resumen
Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos. AcMNPV presenta un ciclo de vida bifásico, con dos fenotipos virales: los virus brotantes y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV). Los ODV, responsables de la infección primaria, se embeben en una matriz de poliedrina, proteína que no es esencial para la propagación de los virus en cultivos celulares. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo desarrollar una línea transformada de insecto empaquetadora de baculovirus defectivos en poliedrina, bajo la hipótesis de que es posible complementar esta deficiencia en trans desde el genoma celular. Para ello, en primer lugar, se evaluaron diferentes secuencias regulatorias del promotor del gen poliedrina controlando el gen reportero CAT, en ensayos de transfección transitoria. Luego de la infección con un baculovirus occ-, los mayores niveles de actividad reportera se obtuvieron con una región regulatoria de 2.735 pb que incluye el promotor mínimo de poliedrina y secuencias con funciones de enhancer de la transcripción en baculovirus (hr1, AcSp). Esta región fue seleccionada para regular la transcripción de poliedrina en las líneas establemente transformadas. La infección de una de estas líneas, Sf9POL, demostró que la morfogénesis de poliedros ocurre de manera similar a la de la infección natural y los baculovirus resultantes mostraron además una infectividad similar a los salvajes, en larvas de Rachiplusia nu. Las larvas infectadas oralmente mostraron sólo una progenie viral de genotipo pol- y fenotipo occ-, incapaz de propagar la infección por vías naturales. Colateralmente, se describe una mutación en la posición 130 del gen poliedrina, responsable de alteraciones en tamaño, morfología y capacidad de oclusión de poliedros. En conjunto, los resultados y conclusiones de este trabajo contribuyen al conocimiento de los mecanismos de morfogénesis de los cuerpos de oclusión en el baculovirus AcMNPV, con importantes implicancias en el diseño de baculovirus recombinantes para el control de plagas y la producción de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
“Complementation of baculovirus that do not
form occlusion bodies by stably transformed
insect cell lines with polyhedrin gene”
Thesis presented to obtain the PhD degree
Lic. María Gabriela López
Director: Dr. Oscar Taboga
Advisor: Dr. Esteban Hopp
Laboratorio de Virus Animales Instituto de Biotecnología
CNIA, INTA-Castelar
lines with polyhedrin gene
Abstract
Baculovirus is a diverse family of virus infecting arthropoda. AcMNPV has a bifasic life cycle, with two viral phenotypes: budded virus and occlusion-derived virus (ODV). ODVs are responsible of primary infection and occlude into a polyhedrin matrix to form polyhedra. Polyhedrin is a non-essential protein for multiplication in cell cultures. The main goal of this work was to develop a transformed insect cell line for packaging polyhedrin defective virus, hypothesizing that it is possible to complement this deletion in trans from the cellular genome. In this way, different polh gene regulatory sequences driving CAT were evaluated by reporter gene assays. After infection of transiently transformed insect cells with pol- baculovirus, the highest CAT levels were obteined when a 2,735 bp regulatory region containing the minimum polyhedrin promoter preceded by hr1 and AcSp sequences with known enhancer activities, was positioned upstream CAT gene. This region was selected to regulate the transcription of polyhedrin in stably transformed cell lines. The infection of one line named Sf9POL demonstrated that morphogenesis of polyhedra occurred in a similar way to the natural infection and that rendered baculovirus also showed similar infectivity for Rachiplusia nu larvae. Oral infection of larvae with polyhedra from infection of Sf9POL line, generated a viral progeny genotypically pol- and phenotypically occ-, unable to propagate the infection by natural means. Colaterally, a mutation in the polyhedrin gene mapped in the position 130 and responsible for alterations in size, shape and capacity for virion occlusion, is described. Together, results and conclusions presented here contribute to the knowledge of the morphogenesis of occlusion bodies in AcMNPV, with important implicances in the design of recombinant baculovirus for plague control and production of heterologous proteins in lepidoptera larvae.
“Cuando el hombre, inducido a una viva observación, comienza a mantener una lucha con la naturaleza, siente ante todo el impulso irrefrenable de someter a sí mismo los objetos. Sin embargo, muy pronto éstos se le imponen con tal fuerza que siente cuán razonable sea reconocer su poder y respetar su acción. Apenas se convenza de ese influjo recíproco, caerá en la cuenta de un doble infinito: por parte de los objetos, la multiplicidad del ser, del devenir y de las relaciones que se entrecruzan de un modo viviente; por parte de él mismo, la posibilidad de un perfeccionamiento ilimitado en la medida en que sea capaz de adaptar, tanto su sensibilidad como su juicio, a formas siempre nuevas de recepción y de reacción. Esto le proporciona un goce elevado, y decidiría la fortuna de su vida si obstáculos internos y externos no se opusiesen al bello transcurso de ella hasta su culminación”.
Mi reconocimiento a la Universidad de Buenos Aires por la completa formación que me otorgó, al Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) por abrirme las puertas de su Institución y brindarme el espacio para continuar mis estudios de postgrado y al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por haber hecho posible la realización de este trabajo.
Agradecimientos
En primer lugar quiero agradecer a mi director, Oscar Taboga, por confiar en mí desde un primer momento. Por orientarme hacia la buena ciencia, por enseñarme tantas cosas no sólo de biotecnología sino de “la vida” y de la manera más divertida. Oski, gracias por todo lo que desinteresadamente me diste, por la buena onda de todos los días… realmente me siento muy orgullosa de ser parte de tu grupo de trabajo, gracias por ayudarme a llegar hasta acá!!
A la directora del Instituto, Elisa Carrillo, por todo lo que me brindó siempre, desde su confianza hasta su preocupación porque nunca me falte nada y que logre mis metas de la mejor manera. Sinceramente sentir tu apoyo me hizo mucho más fuerte para recorrer este camino… Gracias por todo, Lela!
A mis compañeras de laboratorio. A Victoria, mi “coequiper”, gracias por tus consejos y tus siempre acertadas sugerencias (sobre todo por el tiempo que invertiste en las últimas correcciones, tu ayuda fue invaluable!). Gracias además, Vic, por tu preocupación constante por mis cosas, tu seguridad, empeño y ese espíritu crítico del que aprendí mucho. A Pauli, por todo lo que vivimos juntas dentro de este lab, por tus consejos y tu fuerza! A Marie, la más nuevita de este grupo, por su buenísima disposición para colaborar en lo que sea, por el interés, dedicación y cariño que ponés en todo lo que hacés. Y a Andre, que me conoce desde el comienzo y fuimos mutuas testigos de un hermoso crecimiento personal! A las cuatro, mil gracias por estar siempre dispuestas a ayudarme en lo que necesitara, por aportar tanto a esta etapa de mi formación, por nuestras charlas de virología y de lo demás (aprendí mucho de maternidad, ahora sólo me falta experimentarla!), por todo lo que compartimos día a día… Es un placer realmente trabajar con uds. También quiero agradecer a Paola Chabay, una invitada de lujo! Por los días de trabajo compartidos, nuestras charlas de viajes y de cosas de mujeres, tus buenos consejos, tus riquísimos mates! Me encantó haberte conocido, Pao! Gracias a las 5, las quiero mucho, chicas!
A todo el grupo Virus Animales: a mis antiguas compañeritas del lab, Silvi, Eva y Sole, extraño nuestro día a día pero se que sigo contando con uds siempre, gracias!! A Analía, Gaby, Flavia, Guido, Paula, Flor, Rubén, Bernardo, Sebastián y Juan, por el lindo grupo que formamos, por la buenísima energía que siempre siento de parte de uds, porque la pasamos bien, porque así vale la pena todo! Me siento orgullosa, además, de estar rodeada por profesionales de tal calidad académica y humana. Gracias por su apoyo, sepan que es recíproco!! A todo el Instituto de Biotecnología del INTA, porque me hacen sentir en casa! Por las buenas intensiones, los buenos deseos, la buena onda que percibo de uds. Porque además de trabajar mucho, nos divertimos! Me alegro de haberlos conocido. Gracias a todos!!
A la gente que nos ayuda día a día con el material: Isa, Vilma, Majo, Roxana, Fabián, Jorge y Haydee. Sin su ayuda todo sería más difícil, gracias por todo lo que hicieron y hacen por nosotros!
A la gente del IMyZA. A María y Débora de Cría de Insectos por el mantenimiento de las larvas, fue importante contar con ellas! A Alicia Sciocco por compartir sus conocimientos conmigo y por su gestión en temas entomológicos. A Ricardo Salvador, otro tesista baculovirólogo, por tu buena onda! Y en especial agradezco a Marcelo Berretta, por invertir parte de su tiempo en explicarme la regulación génica de baculovirus, por su excelente predisposición y el aporte desinteresado a la discusión de estos temas y por generar en mí el beneficio de la duda!
A las chicas del Laboratorio de Entomología del INTA Sáenz Peña, Chaco. A Marita Simonella, Mariela Fogar y Elisa por enviarme larvas y por su recibimiento tan cálido cuando viajé para allá a buscarlas.
A Luis por mandarme en el día los papers que le pedía y a Ma. José Gravisaco por su colaboración con el citómetro y por venir y aportar a los seminarios, gracias!!
A Blanca y Julián por su ayuda con las muestras y el microscopio electrónico.
A los chicos de la cátedra de Biotecnología de la facu de Farmacia y Bioquímica. A Victoria, Lucía, Gustavo y Alexandra, compañeros del curso de baculovirus que nos ha traido tantas penas como alegrías… por la buena onda con la que siempre me trataron. Gracias!
A Paola Talia del Instituto y a los doc Sergio Rodríguez Gil y Pablo Rebagliati de Exactas por la mano que me dieron en la incursión de la técnica PRINS (que a pesar de no haberla empleado, la aprendí por ellos). Gracias por el valioso tiempo que me dedicaron!!
A la gente de la cátedra de Farmacología de la Facultad de Odontología. En particular a los doc Carlos Mendez y Lucila Busch por confiar en mí, por todo lo que me enseñaron de fármaco y de docencia. Realmente es un placer trabajar con uds. Y a todos mis compañeros que son buenísimos conmigo: Betina, Silvia, Sabrina, Gabriel, Florencia, Ale, Andrea, Dani, Fabi y especialmente a Alejandra Delgado y Gabriel Fiszman por las clases compartidas y por su buenísima onda, me encantó haberlos conocido!
A mis amigos biólogos, Romi Petrigh, Caro Poncini, Caro Pontillo, Marce Cucher, Diego Urteaga y Diego Kormes porque siempre están presentes como colegas y amigos, adoro nuestras charlas de biología y de la vida, es esencial saber que cuento con uds en los momentos más importantes de mi vida, los quiero mucho amigos!!
A Irene y Diego, por sus buenísimos viajes al INTA (me encantó ver crecer a Cata y conocer a Mateo!), porque son excelentes personas y aprendí mucho de uds, gracias por su generosidad y cariño, amigos!! También agradezco a Goyo, que nos conocemos desde la facu. Gracias por tus viajes y tu buena onda!
A mis amigos de la vida: Male, Mechi, Luján, Pia, Mei, María José y Martín, Conrado,Vero, Majo, gracias por estar siempre! Comparto esto con uds!
A toda mi familia. Principalmente a mi mamá y a mi papá porque entre tantas cosas, de ellos aprendí que la felicidad llega de hacer lo que a uno le apasiona y los logros, del esfuerzo diario. A mis hermanos Juan Pablo y María Martha. A los 4 por todo el amor que me brindaron siempre, la comprensión y el apoyo incondicional que me hacen sentir en todo momento, no alcanza un gracias! Les dedico lo que soy. A mis tíos y primos también les agradezco el interés y los buenos deseos que siempre me dedican, es tan importante saber que están, los quiero mucho!! Y a los Scovenna y Gallardo de Suipacha, les agradezco el inmenso cariño que me dieron siempre y por hacerme parte de su hermosa familia. Los adoro!!
Y a mi amor Alexis, por TODO. Por ser mi compañero, mi inspiración. Por todo lo que compartimos! Gracias por tu paciencia, por tu contención, por tus consejos (aprendo tanto de vos!), por aguantarme… y por hacerme feliz cada día de mi vida!! Nada sería lo mismo sin vos…
En fin, a toda la gente que de una u otra manera me acompañó desinteresada y amablemente en esta etapa de mi historia, tanto en lo laboral como en lo personal… Muchas gracias a todos!!
Gaby
Parte de los resultados de este trabajo de tesis han sido publicados en el siguiente artículo:
López, M.G., Alfonso, V., Carrillo, E., Taboga, O. (2010) “Trans-complementation of polyhedrin by a stably transformed Sf9 insect cell line allows occ- baculovirus occlusion and larval per os infectivity”. Journal of Biotechnology 145:199-205.
ÍNDICE
Abreviaturas ... II
Introducción... 3
1. Los baculovirus: generalidades... 3
2. La oclusión, última etapa de la infección viral... 14
3. Aplicaciones de los baculovirus... 22
Objetivos... 35
Materiales y Métodos ... 36
1. Virus... 36
2. Células ... 36
3. Cepas bacterianas... 36
4. Metodología del ADN recombinante... 37
5. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida... 39
6. Identificación de proteínas mediante Western blot... 40
7. Obtención de los baculovirus recombinantes ... 41
8. Amplificación de los baculovirus recombinantes... 45
9. Titulación viral ... 46
10. Construcción de los plásmidos utilizados en transfecciones transitorias ... 46
11. Expresión transitoria por las distintas regiones regulatorias de poliedrina ... 51
12. Obtención de los vectores para transfecciones estables... 54
13. Transfecciones ... 56
14. Metodologías utilizadas con la línea estable que expresa poliedrina... 58
15. Bioensayos... 61
Resultados... 64
1. Construcción de los baculovirus recombinantes utilizados en este trabajo... 65
2. Determinación de los elementos regulatorios mínimos necesarios río arriba de poliedrina: estudio de la expresión transitoria de un gen reportero ... 70
3. Obtención de una línea celular Sf9 establemente transformada con el gen poliedrina... 78
4. Caracterización de los poliedros obtenidos de la línea Sf9POL infectada con baculovirus pol- ... 87
5. Estudio de la infectividad de los poliedros resultantes de la línea Sf9POL infectada con baculovirus pol-92 CAPÍTULO II... 97
1. Antecedentes... 97
2. Construcción de un baculovirus con poliedrina mutante en el aminoácido 44: ... 99
3. Caracterización de los poliedros anormales... 100
4. Infectividad de los poliedros mutantes... 103
Discusión ... 106
Desarrollo de una línea celular empaquetadora de baculovirus pol-... 106
Caracterización de una mutanción puntual en el gen poliedrina ... 113
Potenciales aplicaciones de la línea Sf9POL... 117
Conclusiones ... 120
Anexo... 121
Bibliografía ... 124
Abreviaturas
°C: grados centígrados (Celsius) aa: aminoácido/s
AcMNPV: Autographa californica multiple nucleopoliedrovirus ADN: ácido desoxiribonucleico
ADNc: ADN copia ARN: ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero
BEVS: del inglés Baculovirus Expression Vector System, sistema de expresión por baculovirus BmMNPV: Bombyx mori multiple nucleopoliedrovirus
BV: baculovirus brotado
CAT: cloranfenicol acetil transferasa
CIP: del inglés calf intestinal phosphatase, fosfatasa alcalina intestinal CPV: cipovirus
cpm: cuentas por minuto DL50: dosis letal media dpi: días post infección dpt: días post transfección
DTT: ditiotreitol, inhibidor de proteasas
EDTA: ácido etileno diamino tetracético, quelante de iones bivalentes GFP: del inglés green fluorescent protein, proteína verde fluorescente GV: granulovirus
h: horas
hpi: horas post infección
hrs: del inglés homologous regions, secuencias de repetición homólogas
ies: del inglés immediate early factors, factores de expresión inmediata temprana kDa: kilodaltons
kpb: kilo pares de bases
lefs: del inglés, late expression factors, factores de expresión tardía min: minutos
moi: multiplicidad de infección NC: nucleocápside
nm: nanómetros
NPV: nucleopoliedrovirus
OB: del inglés occlusion bodies, cuerpos de oclusión occ-/+: oclusión negativo o positivo
ODV: del inglés, occlusion derived virus, baculovirus derivado de oclusión ORF: del inglés open reading frame, marco abierto de lectura
pb: pares de bases
PCR: del inglés polimerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa pif: del inglés per os infection factors, factores de infectividad por vía oral PMSF: phenyl methyl sulfonyl fluoride, inhibidor de serin-proteasas POL: poliedrina
pol+/-: poliedrina positivo o negativo pol/polh: gen poliedrina
POV: del inglés pre-occluded virus, baculovirus preocluido
PPBP: del inglés polyhedrin promoter binding protein, proteína de unión al promotor de poliedrina pu: del inglés polyhedrin upstream, secuencia río arriba de poliedrina
rpm: revoluciones por minuto s: segundos
SAP: del inglés shrimp alcaline phosphatase, fosfatasa alcalina Sf9 o Sf21: Líneas celulares derivadas de Spodoptera frugiperda SFB: suero fetal bovino
SNPV: simple nucleopoliedrovirus TBP: del inglés TATA binding protein U/μl: Unidades por microlitro UV: ultravioleta
vlf-1: del inglés, very late factor, factor de transcripción de genes muy tardíos VLP: del inglés virus like particles, partículas semejantes a virus
wt: del inglés wild type, tipo salvaje μm: micrómetros
Introducción
1. Los baculovirus: generalidades
1.1 Descripción y clasificación
Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos, aislados de más de 600 especies de insectos del orden Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Orthoptera, Coleoptera, Neuroptera, Thysanera y Trichoptera (Adams y McClintock, 1991; Herniou et al., 2003; Martignoni e Iwai, 1986; Murphy et al., 1995; Tinsley y Kelly, 1985). Los baculovirus que infectan lepidópteros son los más ampliamente descriptos. Presentan un genoma circular de ADN de doble cadena, contenido en una nucleocápside (NC) de forma de bastón. El nombre baculovirus hace referencia a la morfología de las partículas virales cuyo tamaño oscila entre los 30-60 nm de ancho por 250-360 nm de largo, dependiendo del tamaño del genoma.
La familia Baculoviridae comprende este grupo de virus y a su vez se divide en dos subfamilias: Eubaculovirinae (baculovirus ocluidos) y Nudibaculovirinae (baculovirus no ocluidos). La primera subfamilia es capaz de producir estructuras cristalinas llamadas “cuerpos de oclusión” (OB, del inglés Occlusion Bodies) y a su vez se puede subclasificar en dos géneros: virus de la granulosis (GV por Granulovirus) y virus de la poliedrosis nuclear (NPV por Nucleopoliedrovirus), que se distinguen según la proteína mayoritaria que conforma los cuerpos de oclusión. Los NPV presentan OB de un tamaño aproximado entre 0,15 y 3 μm cuya proteína mayoritaria es la poliedrina y los del género GV se caracterizan por producir OB más pequeños, de geometría ovoide de entre 0,13 y 0,5 μm que normalmente contienen un solo virión y cuya proteína mayoritaria es la granulina. Recientemente se ha propuesto una nueva división para estos virus específicos de lepidópteros: Alphabaculovirus (NPV) y Betabaculovirus (GV). Esta reclasificación se asocia con el aumento de evidencia molecular a partir de la cual se infiere que estos virus pertenecen a grupos filogenéticamente distintos.
Los NPV se subdividen según el número de nucleocápsides que contienen: MNPV (del inglés Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) para aquellos que contienen múltiples nucleocápsides empaquetadas dentro de una membrana común y SNPV (del inglés Single Nuclear Polyhedrosis Virus) si contienen una sola.
1.2 Estructura
La capacidad de los baculovirus de replicarse eficientemente dentro del hospedante y diseminar la infección dentro de una población de insectos se debe principalmente a la existencia de dos fenotipos de partículas infectivas dentro del ciclo de vida del virus: virus ocluidos (ODV del inglés Oclusion-Derived Virus) y virus brotantes (BV, del inglés Budded Virus) (Figura I1). Los ODV son embebidos por una matriz cuasicristalina de poliedrina y son responsables de la transmisión horizontal de la enfermedad entre los individuos susceptibles de una población así como de iniciar la infección primaria en las células epiteliales del mesenterón (Granados y Williams, 1986). Los BV son los responsables de la transmisión de la infección de una célula a la otra y de un tejido a otro dentro del insecto.
Viriones
brotantes (BV) Viriones derivados de cuerpos de oclusión (ODV)
Estructura apical Glicoproteina de fusión de la envoltura,gp64 cápside Estructura basal Componentes comunes de los viriones
ADN viral (circular superenrollado) Proteína básica de unión al ADN (p6.9) Proteínas principales de la cápside (vp39, p80, p24) Proteína Terminal de la cápside (ORF 1629) Cuerpo de oclusión (OB) Matriz de poliedrina Viriones
brotantes (BV) Viriones derivados de cuerpos de oclusión (ODV)
Estructura apical Glicoproteina de fusión de la envoltura,gp64 cápside Estructura basal Componentes comunes de los viriones
ADN viral (circular superenrollado) Proteína básica de unión al ADN (p6.9) Proteínas principales de la cápside (vp39, p80, p24) Proteína Terminal de la cápside (ORF 1629) Cuerpo de oclusión (OB) Matriz de poliedrina
Figura I1. Comparación entre las estructuras de los dos fenotipos virales de MNPV.
A la izquierda se presenta la estructura de los viriones brotantes (BV) con su característica envoltura, en cuya parte apical se encuentra la glicoproteína mayoritaria, GP64. La parte central del esquema correlaciona los componentes estructurales de las nucleocápsides con los viriones derivados de cuerpos de oclusión (ODV). Dentro de la envoltura, de distinto origen que la envoltura de los BV y por lo tanto, de distinta composición proteica y lipídica, los ODV pueden coexistir de a grupos. Estos “paquetes” de virus son los que, embebidos en una matriz de poliedrina, conforman el cuerpo de oclusión (OB).
Los miembros de la familia Baculoviridae se caracterizan por poseer un genoma circular cerrado de doble cadena de ADN con tamaños que varían entre los 80 y 180 kpb, empaquetado dentro de una cápside proteica (Theilmann et al., 2005). El ADN genómico se encuentra condensado unas 100 veces por unión a la proteína del core p6.9 que neutraliza sus residuos ácidos y permite su compactación.
La nucleocápside de los nucleopoliedrovirus presenta una típica forma de bastón asimétrica con una base en un extremo y un ápice en el otro (Federici, 1986; Fraser, 1986) y está compuesta mayoritariamente de la proteína VP39 (Figura I1). Asociada a la cápside también se encuentra una proteína con actividad de quinasa que cataliza la fosforilación de la proteína básica p6.9 produciendo el desempaquetamiento del ADN y su liberación en el núcleo de la célula hospedante para iniciar la replicación (Oppenheimer y Volkman, 1995).
En un momento dado de la replicación, las NC adquieren una envoltura lipoproteica cuyo origen y composición de proteínas, lípidos y ácidos grasos difiere entre los fenotipos baculovirales (BV u ODV) (Braunagel et al., 2003) y les confiere selectividad de infección. Los BV adquieren la envoltura por brotación de la membrana plasmática de la célula infectada y presentan en la misma dos proteínas mayoritarias: la glicoproteína GP64 y la proteína de fusión F (Monsma, 1996; Westenberg, 2002; Westenberg, 2004; Pearson, 2001; Lung, 2002), las cuales se ubican en un extremo del virón que se denomina peplómero, que coincide con el ápice de la nucleocápside. Estas proteínas poseen N-glicosilaciones que son adquiridas en el tránsito por el retículo endoplasmático y están involucradas en la entrada del virus a una nueva célula a través de un mecanismo de endocitosis mediada por receptor (Hefferon, 1999; Blissard, 1992) (Figura I2). Los NPV se clasifican en grupo I si poseen GP64 y grupo II si carecen de un homólogo de GP64, como se observa en los GV. En ese caso, la fusión de la membrana dependiente de bajo pH durante la entrada de viral ocurre mediada por la proteína F. Mientras que la proteína GP64 es exclusiva del grupo I de NPV, existen homólogos de la proteína F de envoltura no sólo en los virus de insectos, sino también en algunos virus de vertebrados (Westenberg et al., 2004).
En etapas más tardías de la infección, las nuevas NC permanecen en el núcleo celular y adquieren una membrana lipoproteica, dando lugar a los ODV. El origen de la membrana que recubre este fenotipo viral no ha sido aún bien dilucidado. Algunos autores sugieren que es sintetizada de novo (Blissard, 1996b), mientras que otros sostienen que el origen de la envoltura está asociado a la formación de microvesículas a partir de invaginaciones de la membrana nuclear interna (Slack y Arif, 2007). Se conoce que en este fenotipo baculoviral existen cinco o
más proteínas de envoltura, entre las que se destaca P74 y otras que son probables componentes de las mismas como los factores de infectividad por vía oral o factores pif (del inglés, per os infection factors).
Más tarde en el ciclo de infección, grupos discretos de viriones dentro de una membrana común se embeben en una matriz constituida principalmente por la proteína poliedrina para dar lugar a los cuerpos de oclusión (comúnmente denominados poliedros), liberados al ambiente una vez que ocurre la lisis de la célula infectada. Los OB resultan una forma de resistencia del virus, ya que constituyen una protección mecánica de los viriones a las agresiones ambientales, que les permite sobrevivir fuera de una célula hospedadora por períodos largos hasta ser ingeridos por un insecto susceptible.
1.3 Ciclo viral
Como se hizo mención anteriormente, los baculovirus presentan dos fenotipos distintivos durante su ciclo viral, los virus brotantes (BV) y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV) (Blissard y Rohrmann, 1990), por lo tanto poseen un ciclo replicativo “bifásico”.
El ciclo de la infección comienza en los insectos cuando en la naturaleza las larvas ingieren los poliedros presentes en las hojas que constituyen su dieta (Figura I2). Los mismos alcanzan el intestino medio de la larva que posee un pH superior a 9.5 y la matriz de poliedrina se disuelve en este ambiente alcalino liberando los ODV. Hay trabajos que sugieren que la disolución de la matriz de los OB en el intestino podría verse facilitada por una proteasa alcalina viral denominada "enhancina" (Lepore et al., 1996) cuya acción aumenta la susceptibilidad de las larvas a las infecciones por baculovirus y disminuye su tiempo de supervivencia (Derksen y Granados, 1988).
Los ODV atraviesan la membrana peritrófica, una red de proteínas y quitina secretada por las células intestinales con el fin de proteger el intestino del contacto directo con los alimentos, para luego entrar en las células epiteliales por fusión de la envoltura del virión con la membrana celular (Granados, 1978; Horton y Burand, 1993). Los ODV son capaces de infectar con mucha mayor eficiencia las células epiteliales del intestino de la larva que las de cualquier otro tipo celular del insecto. Una vez dentro de la célula, las NC son transportadas hacia el núcleo, el ADN se desnuda y se da comienzo a la transcripción y replicación. Esta se denomina infección primaria.
Figura I2.Ciclo infectivo de MNPV. A) Esquema que ilustra la infección primaria de los ODV en el intestino de las larvas hospedadoras. B) Esquema que ilustra los principales eventos del ciclo de los nucleopoliedrovirus en células de insecto tanto en la etapa de infección primaria, como en la etapa de infección secundaria.
Tomado de Kalmakoff y Ward, 2003.
A
B
Membrana plasmáticaMembrana nuclear Poro nuclear Ingesta por el hospedador Solubilización de los poliedros en el intestino Virus Brotante (BV) Infección primaria Fusión con las células intestinales Desnuda miento Envoltura Oclusión Endocitosis Infección secundaria Estroma virogénico Virus Derivados de Cuerpos de Oclusión (ODV)
brotación
Los poliedros se liberan al ambiente por lisis celular y muerte del hospedador
Membrana plasmática Membrana nuclear Poro nuclear Ingesta por el hospedador Solubilización de los poliedros en el intestino Virus Brotante (BV) Infección primaria Fusión con las céluas intestinales Desnuda miento Envoltura Oclusiónón Endocitosis Infección secundaria Virus Derivados de Cuerpos de Oclusión (ODV) brotación Los poliedros se liberan al ambiente por lisis celular y muerte del insecto
Estroma
Virogénico Membrana plasmática
Membrana nuclear Poro nuclear Ingesta por el hospedador Solubilización de los poliedros en el intestino Virus Brotante (BV) Infección primaria Fusión con las células intestinales Desnuda miento Envoltura Oclusión Endocitosis Infección secundaria Estroma virogénico Virus Derivados de Cuerpos de Oclusión (ODV)
brotación
Los poliedros se liberan al ambiente por lisis celular y muerte del hospedador
Membrana plasmática Membrana nuclear Poro nuclear Ingesta por el hospedador Solubilización de los poliedros en el intestino Virus Brotante (BV) Infección primaria Fusión con las céluas intestinales Desnuda miento Envoltura Oclusiónón Endocitosis Infección secundaria Virus Derivados de Cuerpos de Oclusión (ODV) brotación Los poliedros se liberan al ambiente por lisis celular y muerte del insecto
Estroma Virogénico
Tomado de Lars Keld Nielsen, Universidad de Queensland, Australia.
Posteriormente se producen viriones de fenotipo brotante que salen de la célula para infectar nuevas células e iniciar lo que se denomina infección secundaria. Estos BV entran a la célula hospedadora mayoritariamente por endocitosis, probablemente mediada por interacción de GP64 con un receptor aún no identificado (Volkman y Goldsmith, 1985; Wickham et al., 1990; Wickham et al., 1992). En el citoplasma, el endosoma se acidifica provocando la liberación de las nucleocápsides por fusión de membranas. Las NC migran entonces al núcleo donde ocurre la transcripción y el ADN es replicado y ensamblado en nuevas NC. En una etapa más tardía de la infección, las NC salen del núcleo y se dirigen a la membrana plasmática de la cual brotan al igual que en la infección primaria. En una etapa muy tardía de la infección, las NC adquieren su envoltura en el núcleo y se convierten en ODV. Los ODV se ocluyen en una matriz paracristalina de poliedrina para formar los OB maduros, que son liberados por lisis celular quedando disponibles para iniciar un nuevo ciclo de infección. En la figura I3 se ilustran las distintas etapas que sufren las células del insecto luego de la de la infección por NPV.
1.4 Regulación de la transcripción
Los baculovirus han sido extensamente estudiados a nivel molecular, en particular el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV). El mismo ha sido tomado como modelo Figura I3. Evolución de la infección por NPV en células de insecto. Las NC son inicialmente traslocadas a la membrana celular para la producción de BV y en una etapa más tardía de la infección son retenidas en la zona nuclear en anillo (nuclear ring zone) para la producción de ODV. MNI significa membrana nuclear interna, la que provee de envoltura a los ODV.
para el estudio de la transcripción, ya que su genoma de 134 kpb con sus aproximadamente 150 genes ha sido totalmente mapeado y secuenciado (Ayres, 1994).
La expresión de los genes baculovirales ocurre de manera secuencial. Sus genes son expresados en forma de cascada en la que se distinguen tres fases principales: fase temprana (early) que es anterior a la replicación del ADN viral, fase tardía (late) y fase muy tardía (very late) (Lu y Miller, 1995) (Tabla I1). Cada fase requiere de la transcripción de genes de las fases anteriores (Hasnain et al., 1997). A continuación se describen brevemente las tres fases a fin de distinguir los procesos que transcurren en cada una.
Fase temprana
El ADN viral entra en el núcleo de la célula hospedadora y comienza la transcripción de los genes reconocidos por la ARN polimerasa II de la célula hospedadora. La expresión de los genes virales tempranos ocurre en un periodo que abarca desde las 0 a las 6 horas post infección (hpi). Dos tipos de genes son transcriptos en forma temprana: los denominados genes inmediatamente tempranos (ie, de inglés immediate early), que no requieren de la síntesis de novo de otros factores virales para su transcripción (como ie-0, ie-1, ie-2, pe38) ni utilizan elementos enhancers de la transcripción y los genes llamados tempranos retrasados (delayed-early), que están involucrados en la replicación del virus y la manipulación de funciones celulares del hospedador y requieren la síntesis de factores virales como el IE-1, que unidos a enhancers llevan la transcripción al nivel requerido para el progreso de la infección (Guarino y Smith, 1992; Guarino y Dong, 1991; Pullen y Friesen, 1995). Estudios llevados a cabo por Guarino y Summers (1986) demostraron la inducción mediada por IE-1 en ensayos de expresión transitoria del gen 39K.
La proteína IE-1 sintetizada inicialmente forma dímeros en el citosol y es transportada al núcleo, donde se une a palíndromes de 28 pb presentes en regiones específicas del genoma, denominadas secuencias homólogas (hrs, del inglés homologous regions) (Olson et al., 2002). La interacción del dímero de IE-1 con las hrs recluta factores de transcripción celulares, actuando así como un enhancer transcripcional de genes tempranos en cis. Por lo tanto, IE-1 se ve involucrada tanto en la replicación viral (es un componente necesario en el complejo de replicación del ADN) (Kool et al., 1994a), como en la regulación de la transcripción de genes tempranos. Otros productos de la fase temprana como IE-0, IE-2 y PE38/PE34 también regulan la transcripción por transactivación.
Fases Temprana (early) Tardía (late) Muy tardía (very late)
Tiempo 0 h a 6-8h 6-8 h a 18-24 h 18-24 h a 76 h
Transcripción mediada
por: ARN polimerasa II celular ARN polimerasa viral
Promotores utilizados TATA (A/G/T)TAAG (A/G/T)TAAG
Secuencia de inicio de la transcripción CA(C/G/T)T Primera A de la secuencia TAAG Primera A de la secuencia TAAG Motivos de unión a proteínas involucradas en la transcripción (T/A)GATA(A/G)CACGTG
Replicación del ADN
Genes transcriptos
ie-0, ie-1, ie-2, pe38, me53, dna-pol, dna-hel, etl (pcna)p47, lef-1, lef-3, lef-5, lef-6, lef-7, lef-8, 1,
iap-2, p35, gp64, egt, etc.
ie-0, ie-1, eap-1, iap-2, me53, dna-pol, dna-hel, 10, 1 (primasa), lef-2, lef-3, lef-4, lef-8, lef-9, p47, vlf-1, p6.9, vp39, gp64, 39K, p74, ubi, pp78/83, etc. p10, polh, vp39, v-chi, ubi, p74, gp41, odv-e66, odv-ec27, odv-e56, etc. Producción de BV Producción de OB
La mayoría de los promotores de genes tempranos poseen una caja TATA seguida de un motivo CABT [CA(C/G/T)T] a 20-40 nt río abajo que corresponde al inicio de la transcripción. La proteína TBP (del inglés TATA Binding Protein) se une a la secuencia TATA y se reclutan factores transcripcionales; se cree que la secuencia CABT influye en la afinidad por el factor de transcripción TFIID (Blissard, 1996).
En cuanto a los cambios sufridos por la célula como consecuencia de la infección, se puede considerar la acción de los factores de síntesis temprana que al bloquear la continuidad del ciclo Tabla I1. Etapas en la infección con NPV. La expresión de genes baculovirales se divide en tres etapas: temprana, tardía y muy tardía. La transcripción de genes tempranos depende de la ARN polimerasa celular. La replicación del ADN es un prerrequisito para la expresión de genes tardíos y muy tardíos, los cuales se transcriben utilizando la ARN polimerasa viral.
celular dejan las células infectadas detenidas en fase S y G2/M (Braunagel et al., 1998; Ikeda y Kobayashi, 1999). La estructura del citoesqueleto se reacomoda drásticamente como consecuencia de la expresión de otros genes tempranos. Los filamentos de actina y los microtúbulos son redistribuidos ocasionando la hipertrofia del núcleo y el cambio de morfología celular (Charlton y Volkman, 1991). Por otro lado, la inhibición de la apoptosis es requerida para una eficiente replicación y expresión génica, para lo cual el virus cuenta con el producto del gen p53 que es un inhibidor de caspasas.
Fase tardía
Replicación
La etapa tardía de la infección transcurre entre las horas 6 y 12 post infección hasta la hora 18 aproximadamente. Comienza con la replicación del ADN viral, que resulta esencial para la transcripción de genes tardíos. Para este proceso, el virus cuenta con los productos de los genes tempranos.
La evidencia actual sugiere que la replicación del genoma de AcMNPV requiere de elementos que actúan en cis y en trans. La existencia de orígenes de replicación (oris) requeridos en cis ha sido comprobada por análisis de genomas defectivos obtenidos luego de varios pasajes virales en cultivo de células de insecto (Kool et al., 1994b; Lee y Krell, 1994). La actividad ori se encontró asociada con las regiones homólogas (hrs) (Cochran y Faulkner, 1983). AcMNPV contiene ocho hrs: hr1, hr1a, hr2, hr3, hr4a, hr4b, hr4c y hr5 (Figura I4). Estas regiones contienen secuencias palindrómicas interespaciadas con repeticiones directas cortas y se encuentran dispersas a lo largo del genoma de baculovirus cumpliendo el rol de enhancers transcripcionales (Friesen, 1997). Además de los oris del tipo hr se han identificado otros orígenes de replicación no-hr mediante ensayos de replicación transitoria en AcMNPV (Kool et al., 1994b). Estos ori no-hr consisten en secuencias que carecen de las estructuras palindrómicas y repeticiones propias de los hrs, aunque poseen estructuras básicas que se encuentran en el contexto de los orígenes de replicación eucariotas, tales como múltiples repeticiones invertidas y directas, palíndromes y estructuras ricas en AT. La estructura secundaria de éstos es quizás más importante que la secuencia en sí misma para la función de origen de replicación.
En ensayos previos fue posible lograr la replicación de un plásmido de origen bacteriano sin inserciones genómicas baculovirales en células de insecto al ser cotransfectado con ADN viral (Guarino y Summers, 1988; Wu et al., 1999). Estos grupos demostraron que la replicación del
plásmido era independiente de la existencia de elementos en cis, pero que se iniciaba por la maquinaria de replicación viral como concatémeros o integrados al genoma viral. Estos datos sugieren un mecanismo de replicación del ADN del tipo círculo rodante.
Aún se desconoce el rol individual de los ocho orígenes identificados en AcMNPV en la replicación y si son activos simultáneamente.
Los elementos requeridos en trans para la replicación incluyen algunos lefs (del inglés late expression factors), la ADN polimerasa viral (dnapol) y la helicasa p143. En AcMNPV se han identificado cinco genes esenciales (p143, ie-1, lef-1, lef-2, lef-3) y cinco genes estimulantes de la replicación (dnapol, p35, ie-2, lef-7 y pe38) (Crouch y Passarelli, 2002).
Transcripción
La expresión de genes tardíos, la producción de proteínas estructurales y la formación de BV ocurre ente las 8 y 24 hpi.
Los factores esenciales para la transcripción de genes tardíos son diecinueve (Rapp et al., 1998) e incluyen los llamados lefs, cuatro de los cuales (lef-4, lef-8, lef-9 y p47) codifican para una ARN polimerasa resistente a α-amanitina (Grula et al., 1981; Guarino et al., 1998). Esta enzima es esencial para la transcripción de genes tardíos y muy tardíos y reconoce secuencias promotoras con el consenso (A/T/G)TAAG. La fuerza de la expresión a partir de los promotores tardíos depende del contexto de esta secuencia TAAG. Generalmente, en estos casos la transcripción se inicia en la primera A de la secuencia consenso.
Figura I4. Localización de los genes involucrados en la replicación y las regiones homólogas (hrs) en el genoma de AcMNPV. Los números indican la cantidad de repeticiones en cada hr. Las flechas grandes y pequeñas indican la orientación relativa de los genes y hrs, respectivamente.
En el transcurso de la fase tardía de la infección se forma en el núcleo una zona denominada estroma virogénico (Harrap, 1972) donde las nucleocápsides se ensamblan (Bassemir et al., 1983).
Fase muy tardía
La expresión de genes muy tardíos transcurre entre las 18 y 76 hpi aproximadamente y se caracteriza por un marcado incremento en la transcripción de los genes denominados muy tardíos: p6.9, pol y p10 (Lu y Miller, 1995). Estos genes son transcriptos por la ARN polimerasa viral a partir de promotores muy tardíos. En estos promotores, a diferencia de los tardíos, el nivel de expresión no depende del contexto inmediato en el que se encuentra la secuencia TAAG sino de una secuencia denominada burst sequence, una región rica en A+T de la secuencia 5´ no codificante de sus ARNm. Esta región se localiza entre el sitio de inicio de la transcripción y el codón de inicio de la traducción. Se ha observado que mutaciones en la burst sequence reducen la expresión durante la etapa muy tardía de la infección unas 10 a 20 veces y más, tanto los niveles basales de ARNm de poliedrina como la tasa de inicio de la transcripción a partir de su promotor (Ooi et al., 1989). En contraste, mutaciones en la secuencia río arriba del motivo TAAG del promotor de poliedrina tienen efectos menos drásticos en la regulación del gen pol (Weyer y Posse, 1989). Esta secuencia burst interactúa con proteínas celulares que resultan imprescindibles para alcanzar los altos niveles de expresión de genes como pol y p10 en NPV, y otros genes que codifican proteínas necesarias para la formación de los cuerpos de oclusión.
El gen vlf-1 (del inglés very late factor) de AcMNPV cumple un rol importante en la expresión muy tardía a partir de los promotores pol y p10. La presencia de vlf-1 en ensayos de expresión transitoria estimula la transcripción mediada por promotores muy tardíos, no así la mediada por promotores tardíos (Todd et al., 1996). Se observó posteriormente que el factor VLF-1 se une directamente a las regiones no codificantes de los promotores pol y p10, provocando de manera directa su transactivación (Yang y Miller, 1999).
Los OB se acumulan en el núcleo formando una zona en anillo (ring zone) entre el estroma virogénico y la membrana nuclear y eventualmente pueden llenar todo el núcleo. La lisis celular ocurre entre las 60 y 72 hpi. Como consecuencia de la infección, las células dejan de sintetizar proteínas y entran en apoptosis. La figura I5 es un esquema simplificado de las distintas etapas que sufre el ADN baculoviral dentro de la célula en el transcurso de la infección, en el modelo AcMNPV.
2. La oclusión, última etapa de la infección viral
En una etapa muy tardía de la infección, la mayoría de las nucleocápsides que se ensamblan son destinadas a permanecer en el núcleo para su posterior envoltura y oclusión. La producción de cuerpos de oclusión depende del tipo celular. Para algunos virus, las células intestinales no permiten la formación de poliedros. Sin embargo, para otros virus la oclusión ocurre en esas células, exclusivamente. La razón de esto no se conoce aún.
En las infecciones por nucleopoliedrovirus, los viriones que permanecen en el núcleo adquieren su membrana a partir de la membrana interna nuclear a la cual modifican ciertas proteínas específicas del fenotipo ODV, codificadas por el genoma viral (Braunagel y Summers, 2007).
Figura I5. Esquema simplificado de la cascada de transcripción de los genes de AcMNPV.
Dentro de la ilustración del ciclo del ADN baculoviral se detalla el proceso de replicación a partir de la enzima ADN polimerasa viral y factores de la célula hospedadora y la regulación transcripcional de poliedrina como modelo de gen muy tardío.
ARN polimerasa celular IE1 + enhancers Genoma viral Genes tempranos
Replicación del ADN
ARN polimerasa viral Genes tardíos viriones Genes muy tardíos RNA polimerasa viral + VLF-1 Viriones ocluidos ARN polimerasa celular IE1 + enhancers Genoma viral Genes tempranos
Replicación del ADN
ARN polimerasa viral Genes tardíos viriones Genes muy tardíos RNA polimerasa viral + VLF-1 Viriones ocluidos
Proteína de unión al ADNsc (LEF-3) Topoisomerasa (hospedador?) helicasa
ADN polmerasa ADN polimerasa
ADN ligasa (hospedador?) Cebador de ARN
ADN primasa (LEF-1/LEF-2)
Fragmento de Okazaki
Proteína de unión al ADNsc (LEF-3) Topoisomerasa (hospedador?) helicasa
ADN polmerasa ADN polimerasa
ADN ligasa (hospedador?) Cebador de ARN
ADN primasa (LEF-1/LEF-2)
Fragmento de Okazaki
Lefs virales
RNA pol viral
Factores celulares tipo Sp Promotor POL VLF-1 Otros factores celulares Proteína de unión a hr1 Lefs virales
RNA pol viral
Factores celulares tipo Sp Promotor POL VLF-1 Otros factores celulares Proteína de unión a hr1
Regulación transcripcional depoliedrina
Modificado de Rohrmann, 2008
Modificado de Rohrmann, 2008.
La última etapa de la replicación viral tiene lugar luego de que la mayor parte del ADN ha sido replicado y ocurre una hiperexpresión de los genes muy tardíos aumentando dramáticamente los niveles de las proteínas poliedrina y P10. Poliedrina se acumula en el núcleo y en un momento cristaliza en una estructura que envuelve los viriones. No queda claro si la oclusión viral resulta un evento dependiente de la concentración, es al azar, o si los viriones sirven para enuclear la formación de cuerpos de oclusión. Se demostró que al menos una proteína (Ac68) está involucrada en este proceso porque cuando se eliminó su ortólogo de BmMNPV (Bm56), los viriones producidos no se incorporaron dentro de los poliedros (Xu et al., 2008).
La proteína P10 forma estructuras tubulares que penetran tanto en el núcleo como en el citoplasma (Patmanidi et al., 2003; Carpentier et al., 2008). Cuando los cuerpos de oclusión maduran, las fibrillas de P10 se alinean en la superficie de los poliedros y se cree que están íntimamente asociados al ensamblado de la envoltura de los mismos, otorgándole una superficie de aspecto más plano y parejo.
2.1 Evolución de los cuerpos de oclusión
Ya se mencionó el origen de los poliedros como forma de resistencia de los baculovirus. Estas estructuras otorgan protección mecánica y físico-química a los viriones mientras éstos se encuentran en un ambiente desfavorable fuera del insecto. De hecho, las poblaciones de insectos no tienen una estructura constante en el tiempo sino que se expanden y colapsan durante los períodos cálidos y húmedos y los períodos fríos y secos, respectivamente. Esto se relaciona con la disponibilidad de fuentes de alimento, presencia de predadores y ciclos de temperaturas óptimas para la reproducción. Además de los cambios estacionales, bajo ciertas circunstancias en las que se produce una combinación óptima de condiciones, las poblaciones de insectos pueden expandirse dramáticamente. Estos períodos de expansión pueden estar separados por largos períodos, a veces muchos años. Una implicancia trascendente de esta naturaleza cíclica de las poblaciones de insectos es que los patógenos se quedan sin sus hospedadores de manera estacional o por períodos aún mayores. Para esto, distintos patógenos desarrollaron diferentes estrategias de supervivencia, como permanecer en pupas, huevos o en hospedadores alternativos. Aunque existe alguna evidencia de persistencia dentro de sus hospedadores, algunos virus han desarrollado los cuerpos de oclusión como una estrategia de sobrevida fuera
de su hospedador. Dentro de estas estructuras cristalinas proteicas, lo virus son protegidos de las adversidades del ambiente, principalmente del calor y la desecación, por muy largos períodos. Esta estrategia puede ser tan ventajosa que ha sido incorporada en los ciclos de vida de tres diferentes tipos de virus de insectos: en los reovirus (cipovirus, virus de ARN de doble hebra con genomas segmentados), en los poxvirus (entomopoxvirus, virus de ADN de doble hebra con replicación citoplasmática) y en los baculovirus. Se sugiere, por lo tanto, que la existencia de dos fases dentro del ciclo de vida de los baculovirus refiere a una coevolución con su hospedador.
2.2 Componentes de los cuerpos de oclusión
Además de los viriones que contienen, los cuerpos de oclusión se componen de una matriz y una estructura en su superficie. Otras proteínas también se asocian con los poliedros, detalladas en la tabla I2.
POLIEDRINA
Es la proteína mayoritaria de los cuerpos de oclusión de los NPV. En AcMNPV posee 246 aa y un peso molecular aproximado de 29 kDa. Es una de las proteínas más conservadas de los baculovirus. El ensamblaje de poliedrina resulta en la formación de estructuras supramoleculares cúbicas que empaquetan viriones en una etapa tardía de la infección. El gen pol no es esencial cuando los baculovirus se replican en cultivo celular, pero son de importancia
ORF/Proteína Distribución en NPV Efecto de la deleción
Ac8 Poliedrina Todos Viable
Ac131 Envoltura/Cálix Todos excepto CuniNPV Viable
Enhancina Algunos Viable
Ac137 p10 Todos Viable
Proteasas alcalinas Contaminantes, no baculovirales
Tabla I2. Proteínas asociadas a los cuerpos de oclusión de baculovirus. Las proteínas se listan con su número de marco abierto de lectura, su distribución y los efectos observados de su deleción.
vital en infecciones naturales a campo. La cubierta de poliedrina asegura la persistencia del material genético, protegiendo al virión de la desecación y de los rayos UV.
CÁLIX
El OB está rodeado por una cubierta externa llamada Cálix o envoltura del poliedro (PE, del inglés polyhedron envelope) formada principalmente por carbohidratos asociados a una proteína de 34 kDa producto del ORF 131. Esta proteína le confiere a la matriz de poliedrina cobertura y rigidez, otorgando al poliedro una mayor estabilidad.
En el laboratorio, cuando los poliedros se someten a tratamiento alcalino, la estructura cristalina se disuelve, pero la envoltura persiste como una bolsa en la cual los viriones quedan atrapados.
La proteína PE se asocia con las estructuras fibrilares formadas por P10.
P10
La proteína P10 no es la proteína mayoritaria de los cuerpos de oclusión, pero se sabe que se requiere para el correcto ensamblado de la envoltura del poliedro. Los poliedros de virus que no poseen el gen PE poseen una apariencia similar a los poliedros de virus que no poseen el gen p10: ambos presentan una superficie rugosa o interrumpida y la envoltura del poliedro parece estar fragmentada o no existir (Williams et al., 1989).
ENHANCINAS
Las enhancinas son una clase de metaloproteinasas codificadas por ciertos NPV de lepidópteros, como LdNPV, CfNPV, MacoNPV y algunos GVs como AgGV, AsGV, etc. En un estudio sobre el virus LdMNPV se encontró asociación de las enhancinas con las envolturas de ODV. Se cree que estas proteínas facilitan la infección al degradar la mucina de la membrana peritrófica permitiendo así el acceso de los viriones a las células intestinales (Wang y Granados, 1997).
PROTEASAS
Se hallaron proteasas asociadas a los OB, pero que poseían propiedades similares a las del intestino medio de las larvas. Por otro lado, los poliedros aislados de cultivos celulares carecían de estas proteasas asociadas (McCarthy et al., 1979). A pesar de que muchos baculovirus codifican para una proteasa de la familia de las catepsinas (Ac127), ésta es más activa bajo
condiciones ácidas (pH 5) (Slack et al., 1995). Por lo tanto, las proteasas asociadas a OB probablemente son una combinación de enzimas derivadas de bacterias, intestinos de insectos y el virus.
2.3 Morfogénesis de poliedros en AcMNPV
Sobre la estructura de poliedrina y el ensamblaje en poliedros
Como ya se mencionó, dos familias de virus no emparentadas producen poliedros en su ciclo de multiplicación. Los cipovirus (CPV), cuyos poliedros a menudo presentan miles de viriones icosaédricos en su interior (Yu et al., 2008) y los baculovirus. Estos últimos producen poliedros que contienen menos cantidad de partículas virales y que se envuelven en una capa de proteoglicanos (cálix), ausente en los poliedros de cipovirus. A pesar de las diferencias en tamaño y forma de los OB y de los diferentes tipos de virión que contienen, se ha observado que la simetría de los cristales formados por ambos grupos es muy similar.
Las proteínas poliedrina de baculovirus contienen entre 243 y 249 aa y están conservadas en alrededor de un 50 % entre α- y β-baculovirus, mientras que las proteínas poliedrina de cipovirus contienen entre 247 y 252 aa y existe una identidad de alrededor de un 20 % entre clados. No se han hallado altos grados de similitud entre las secuencias aminoacídicas de las proteínas de los cuerpos de oclusión de estos dos grupos de virus. Sin embargo, cuando se analizó la estructura de los poliedros de cipovirus y de AcMNPV por difracción de rayos X, éstos presentaron parámetros tan similares que sugieren una evolución conjunta de ambas proteínas (Anduleit et al., 2005).
El advenimiento de nuevas técnicas cristalográficas, como la cristalografía de proteínas por microdifracción (Riekel et al., 2005), permitió la resolución de la estructura cristalográfica de los poliedros del cipovirus del gusano de seda, dando los primeros detalles de la organización de esos cristales. La estructura reveló un intrincado arreglo de trímeros de poliedrina entrelazados con α-hélices N-terminales. Esta estructura explicaría la notable estabilidad de los poliedros (Coulibaly et al., 2007). Posteriormente, se utilizaron métodos similares para determinar la estructura cristalográfica de los poliedros producidos por AcMNPV (Coulibaly et al., 2009). A pesar de que no se ha podido brindar evidencia concluyente sobre las relaciones evolutivas entre los poliedros de CPV y NPV, la estructura de la poliedrina de AcMNPV explica varios aspectos
funcionales, incluyendo el desensamblado dependiente del pH y la adaptación de los baculovirus a sobrevivir dentro de un poliedro.
Las últimas investigaciones describen que las moléculas individuales de poliedrina se pliegan en un dominio β-sandwich con una proyección de 52 aa hacia el extremo N-terminal y una proyección más corta de 10 aa hacia el extremo C-terminal. El dominio interno fue descrito como un dominio “jelly-roll” clásico. Los residuos N-terminales 10 a 52 forman una horquilla β seguida de una larga hélice curva (H1/2) que se extiende hacia el exterior del cuerpo principal de la molécula y perpendicular al sandwich central (Figura I6).
Figura I6. Estructura de la poliedrina de NPV. A) y B) Estructura terciaria de la molécula de poliedrina. La cadena polipeptídica está coloreada en un gradiente de azul a rojo desde su extremo N-terminal a extremo C-N-terminal. C) y D) Trímeros de poliedrina. Vistas ortogonales.
En los poliedros, cuatro trímeros idénticos se asocian íntimamente en un grupo de geometría tetraédrica. En la periferia este ensamblaje se mantiene por dos loops que se extienden del sandwich central. El área de contacto es pequeña pero involucra uniones fuertes, como puentes disulfuro (Cys131-Cys131). En el centro del grupo tetraédrico, las proyecciones de los extremos
N-terminales fortalecen el ensamblaje en un dominio de intercambio en el que las hélices H1/2 de los trímeros interacciona entre sí. La figura I7 muestra un esquema de ese ensamblaje que conforma la unidad con la que se construyen los poliedros.
Importancia de la secuencia aminoacídica de poliedrina en la morfogénesis de los poliedros No existe en la bibliografía información suficiente y completa acerca de los eventos que desencadenan la morfogénesis de poliedros en una etapa tardía de la infección con baculovirus. Se conoce que la formación de poliedros depende de la interacción entre poliedrina y otras
Figura I7. Grupos tetraédricos que conforman los poliedros de NPV. A) Con diferentes colores se representan los cuatro trímeros que conforman el grupo tetraédrico. B) Vista detallada del área de contacto entre los trímeros de poliedrina, donde se destacan las uniones entre residuos (recuadrado). C) Detalle de las interacciones entre los cuatro trímeros, mediadas por el dominio de intercambio de los extremos N-terminales de tres trímeros (rojo, amarillo y verde) con los dominios centrales tipo “jelly-roll” del cuarto trímero (azul).
proteínas presentes en la envoltura del virión (Woo et al., 1998). Sin embargo, la morfología de los poliedros depende no sólo de las interacciones entre poliedrina y otras proteínas virales o de la célula hospedadora, sino de su propia secuencia aminoacídica (Carstens et al., 1992; Cheng et al., 1998; Hu et al., 1998).
El grupo de Ji en el año 2010 explicó, a partir de esquemas basados en la estructura cristalográfica de poliedrina, cómo ocurre el ensamblaje de las unidades que conforman los poliedros de AcMNPV (Ji et al., 2010). Ellos postularon que los cambios puntuales en la secuencia aminoacídica de poliedrina pueden dar origen a virus mutantes que generan poliedros de morfología distinta de los baculovirus salvajes. Se propuso un dominio requerido para el ensamblaje supramolecular de los poliedros para poliedrina de AcMNPV (Jarvis et al., 1991) que corresponde a la región entre los aminoácidos 19 y 110. Se han estudiado mutaciones dentro de esa región que provocaban cambios en la morfogénesis de poliedros así como también efectos en la oclusión de los baculovirus.
Se han hallado y caracterizado mutantes de AcMNPV, la mayoría de las cuales contienen mutaciones puntuales en el gen poliedrina que provoca un fenotipo de poliedros alterado (Carstens et al., 1992; Lin et al., 2000; Ribeiro et al., 2008). La tabla I3 muestra la posición de distintos cambios aminoacídicos en la proteína poliedrina, en mutantes tanto de baculovirus AcMNPV como de BmMNPV (Ribeiro et al., 2008).
Las diferentes mutantes puntuales en el gen poliedrina dan por resultado dos fenotipos definidos en la bibliografía como: occ- cuando se observa una masa proteica dispersa que no ocluye baculovirus en lugar de la formación de poliedros u occ+ cuando se observa la formación de grandes estructuras cristalinas de forma cúbica que ocluyen deficientemente. Hasta el año 2008 en el modelo de AcMNPV se han caracterizado 5 mutaciones puntuales en el gen poliedrina. El fenotipo occ- fue la consecuencia de mutaciones en la región carboxi terminal. Cambios aminoacídicos en la posición 85 (Carstens et al., 1987), 118 (Ribeiro et al., 2008) y 183 (Carstens et al., 1992) producen la acumulación de abundantes cantidades de partículas conformadas por poliedrina en el interior del núcleo de la célula infectada y ausencia de formación de estructuras poliédricas. Sin embargo, las dos mutaciones puntuales halladas hacia el extremo amino terminal correspondientes a cambios aminoacídicos en las posiciones 25 (Lin et al., 2000) y 59 (Carstens et al., 1986) mostraron un fenotipo mutante caracterizado por la presencia de poliedros anormalmente grandes, conformados por poliedrina que se ha ensamblado de manera anormal. El hallazgo de estas mutantes y su descripción permitieron
inferir que la estructura molecular de poliedrina juega un rol esencial en la correcta morfogénesis de poliedros y la oclusión de baculovirus infectivos.
Nombre del mutante/ virus parental
Posición aminoacídica
(wt/mut)
Oclusión Morfología de poliedros Referencia
AcMNPV-Tkmt513/AcNPV 25 (Gly/Asp) Occ+
Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral. Lin et al. (2000) M5/AcNPV 59 (Pro/Leu) Occ+ Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral. Carstens et al. (1986) # 220/BmNPV 58 (Asp/Asn),
222 (Ile/Thr) Occ+
Grandes y cúbicos con poca
o nula oclusión viral. Katsuma et al. (1999) M29/AcNPV 85 (Leu/Pro) Occ- Masa proteica dispersa Carstens et al. (1987) vSynlitx1B12P/AcNPV 118 (Val/Phe) Occ- Masa proteica dispersa Ribeiro et al. (2008) # 136/BmNPV 141 (Leu/Phe) Occ- Masa proteica dispersa Katsuma et al. (1999) # 211/BmNPV 144 (Glu/Leu) Occ+ Formas irregulares o
pequeños Katsuma et al. (1999) # 128/BmNPV 171 (Leu/Pro) Occ+ Similar a wt con poca o nula
oclusión viral Katsuma et al. (1999) # 126/BmNPV 178 (Cys/Tyr) Occ- Masa proteica dispersa Katsuma et al. (1999) M934/AcNPV 183 (Leu/Phe) Occ- Masa proteica dispersa Carstens et al. (1992)
3. Aplicaciones de los baculovirus
Tanto las propiedades físicas como la biología molecular de los baculovirus han permitido su utilización en múltiples aplicaciones.
En los últimos veinte años, el sistema de expresión por baculvirus se convirtió en uno de los sistemas más utilizados en la producción de proteínas recombinantes (Possee, 1997). Numerosas innovaciones tecnológicas se llevaron a cabo para mejorar el sistema y hoy en día resulta el de elección por su practicidad y rapidez, así como por su bioseguridad y posibilidad de un fácil escalado de la proteína de interés (Kost et al., 2005). Sin embargo, las aplicaciones biotecnológicas del sistema baculovirus-células de insecto van más allá de la producción de proteínas heterólogas funcionales de distintos orígenes en células de insecto en cultivo. Se trata
Tabla I3. Lista de los baculovirus mutantes en poliedrina descriptos hasta el momento. Las mutaciones en la secuencia aminoacídica de poliedrina de AcMNPV y BmMNPV se listan detallando el cambio de aminoácido y su sitio, así como también los cambios fenotípicos que generan.
de un sistema muy versátil cuyas múltiples funciones están siendo a su vez optimizadas. Hoy en día este sistema se utiliza con éxito en la generación de partículas semejantes a virus (VLP del inglés virus like particles) para el estudio de los procesos de ensamblado viral en ausencia de virus infectivo o para la producción de inmunógenos y proteínas diagnósticas, e incluso para transferencia de genes (Maranga et al., 2002; Petry et al., 2003). Por otro lado se desarrollaron estrategias para la inclusión de péptidos heterólogos y proteínas en la envoltura de los baculovirus, mediante fusión a la glicoproteína de superficie GP64 (Boublik et al., 1995; Oker-Blom et al., 2003; Peralta et al., 2007). Por lo general, el vector se diseña de tal manera de poseer tanto la copia salvaje de gp64 como la fusionada a la proteína heteróloga. Estos baculovirus resultan muy efectivos como inmunógenos.
Como ya se mencionó, los baculovirus no son capaces de infectar células de mamífero pero sí logran transducirlas (Hofmann et al., 1995) y esta propiedad fue aprovechada en el desarrollo de tecnologías como el delivery de genes mediado por baculovirus (Kost y Condrey, 2002). El uso de baculovirus recombinantes que contienen cassettes de expresión en células de mamífero fue primero ensayado en células hepáticas. El sistema se denominó BacMam® y se encuentra actualmente en auge ya que la innovación permitió avances en los campos de la genómica, desarrollo de nuevos fármacos y terapia génica.
En los últimos años se ha demostrado que los baculovirus poseen propiedades adyuvantes en el sistema inmune de los mamíferos, mediadas por la activación de la respuesta innata (Abe et al., 2005). Este descubrimiento contribuye al empleo de los baculovirus como una excelente plataforma para el desarrollo de vacunas.
3.1 El uso de los baculovirus como sistema de expresión
3.1.1 El sistema baculovirus-célula de insecto
Probablemente la expresión de proteínas a partir de baculovirus recombinantes sea la aplicación más conocida y más utilizada de los baculovirus. Las características de los genes muy tardíos tales como sus altos niveles de expresión y su carácter no esencial han permitido el desarrollo de vectores de expresión de proteínas en sistemas eucariotas. El sistema de expresión de proteínas más utilizado en células de insecto infectadas con baculovirus está basado en el reemplazo del gen poliedrina en el genoma de baculovirus por un gen heterólogo mediante recombinación
