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Estudio genético molecular de la apoptosis en lesiones pre-malignas y malignas del cérvix uterino

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Academic year: 2023

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ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR

TITULO

ESTUDIO GENETICO-MOLECULAR DE LA APOPTOSIS EN LESIONES PRE-MALIGNAS Y MALIGNAS DEL CERVIX

UTERINO.

TESIS QUE PRESENTA:

M. en C. HORACIO ASTUDILLO DE LA VEGA para obtener el grado de DOCTOR EN CIENCIAS en la

especialidad de BIOMEDICINA MOLECULAR

DIRECTOR: Dr. Patricio Gariglio Vidal

DIRECTOR: Dr. Luis Benítez Bribiesca

ASESORES: Dra. Laurence Marchat

Dr. Juan Salas Benito

Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara

M éxico, D. F., Octubre del 2007

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INDICE:

RESUMEN………. 12

ABSTRACT……… 13

INTRODUCCION……….. 14

ANTECEDENTES………. 21

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………... 24

HIPOTESIS……… 25

OBJETIVO GENERAL………. 25

OBJETIVOS ESPECIFICOS………... 26

MATERIALES Y METODOS………... 26

RESULTADOS……….. 34

DISCUSION……… 47

CONCLUSIONES………. 55

AGRADECIMIENTOS……….. 58

BIBLIOGRAFIA………. 59

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El presente trabajo fue financiado por el FOFOI-IMSS (Fondo para el Fomento a la Investigación) del Instituto Mexicano del Seguro Social y el CONACYT

(Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología).

Agradezco a la Dirección de Estudios de Posgrado e Investigación del I.P.N.

por el apoyo en la realización de este trabajo de tesis doctoral.

Agradezco al Instituto Mexicano del Seguro Social ( IMSS) por el apoyo en la realización de este trabajo de tesis doctoral.

Agradezco a la Fundación TELMEX por el apoyo otorgado durante una parte de mi trabajo doctoral al recibir la beca académica de posgrado.

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S i para recobrar lo recobrado Tuve que haber perdido lo perdido,

Si para conseguir lo conseguido Tuve que soportar lo soportado.

S i para estar ahora enamorado Fue menester haber estado herido, Tengo por bien sufrido lo sufrido, Tengo por bien llorado lo llorado.

P or que después de todo he comprendido Que no se goza bien de lo gozado, Sino después de haberlo padecido.

P or que después de todo he comprobado Que lo que tiene el árbol de florido,

Vive de lo que tiene sepultado.

Teresa de Ávila

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DEDICATORIA

Porque todo aquel que pide, recibe;

y el que busca halla; y al que llama, se le abrirá.

(Mateo 7:7,8)

A mis Padres Rolanda y Esteban Horacio por su infinito amor y apoyo a mi formación personal y académica.

A mis Hermanos Dulce María, Esteban y Rolando por estar siempre conmigo y ofrecerme lo mejor de la vida: su compañía, su cariño, su ejemplo y su comprensión.

A mis Abuelos: María Cristina, Carmen, Pedro y Jaime por ser los pilares de nuestra familia, por su inmenso amor y por estar siempre cerca de mí, todos ahora reunidos en algún sitio que desconozco pero que está muy cerca de mi corazón.

A mis Tíos especialmente Rosa María y Román por haber sido más que eso en mi vida y a quienes les debo también mucho de lo que soy, ahora juntos también en ese extraño lugar que solo sé que esta muy cerca de mi corazón.

A mi Sobrina Dulcita por todas las alegrías y bellos momentos que me ha compartido, y por mostrarme que la vida es algo más que eso.

A mi Iris Angélica por su cariño, su apoyo y su amor durante los 6 años que compartimos nuestras vidas y por todos los bellos momentos que endulzaron mi existencia.

A mis Padrinos Austreberta y Napoleón por ser mucho más que eso, por darme su apoyo, su comprensión y el ejemplo para vivir y ser mejor cada día.

A mis Primos especialmente Soledad, Julieta, Napoleón, Jaime, Gerardo y Román, y a mis demás familiares por su apoyo y por todas las alegrías y vivencias que me han hecho la vida más alegre, interesante y más fácil de lo que podría haber sido.

A la memoria del gran Maestro y Amigo Dr. Antonio Oriol y Anguera, a quien le debo mucho de mi pasión y gusto por el quehacer científico, a quien me hubiera gustado compartirle mi logro académico y a quien lo hubiera disfrutado tanto como yo.

Donde quiera que este Gracias Doctor Oriol.

.

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AGRADECIMIENTOS

Levá ntate y trabaja con un corazón valiente;

Y todavía persiguiendo logros Aprende a trabajar y a esperar.

(Little Book of Comfort, 1978)

El presente trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Oncología Molecular de la Unidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas del Hospital de Oncología del Centro Médico Nacional Siglo XXI, del IMSS, agradezco a todo el personal, investigadores, trabajadores y alumnos que han estado ligados directa o indirectamente a este proyecto.

“La memoria del corazón es el agradecimiento…”

Agradezco a mis tutores, Dr. Luis Benítez Bribiesca y Dr. Patricio Gariglio Vidal su invaluable apoyo no solo para la realización de este trabajo, sino también por las muestras de aprecio y comprensión en este largo tiempo de formación académica, y por su infinita paciencia para la culminación del presente trabajo, mi agradecimiento por siempre.

Agradezco al Dr. Hector Mayani Viveros, su amistad, su apoyo y también su paciencia para esperar este momento de mi vida, mi agradecimiento por siempre.

Agradezco a mis asesores: Dra. Laurence Marchat, Dr. Juan Salas Benito y Dr. David Guillermo Pérez Ishiwara por su apoyo incondicional para la obtención de mi grado.

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ABREVIATURAS

HPV Papilomavirus Humano

p53 Antioncogén humano

Bcl-2 (B cell leukaemia/lymphoma- 2)

PCNA Antígeno Nuclear de Proliferación Celular

TUNEL Transferencia de un deoxirribonucleótido conjugado digoxigenina- dUTP

NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical

CCE Carcinoma de Células Escamosas

CIS Cáncer in situ

E6/E7 Oncogenes virales del HPV E6 y E7

Rb Retinoblastoma

Ras Oncogén humano

c-Myc Oncogén humano

DNA Acido Dexosirribonucleico

H&E Hematoxilina y Eosina

PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

FASTA Alineación comparativa de dos secuencias genéticas vía GenBank

VPD Valor Promedio Estimado (Average Weighted Score)

CaCU Cáncer Cervico-Uterino

CICE Cáncer Invasor de Células Escamosas

MEE Media del Error Estándar

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1.- Análisis de imagen con el sistema de video captura digital realizado con el software PC Image V2.1 en un campo obtenido de una biopsia de CICE.

Figura 2.- Electroforésis del DNA purificado a partir de la muestras embebidas en parafina.

Figura 3.- Electroforésis de los productos de PCR para la amplificación del gen L1 de los HPVs.

Figura 4.- Gráfica linear de los promedios de expresión (AWS) para las proteínas p53, Bcl- 2 y PCNA en epitelio normal, NIC I, II, III y Cáncer Cervical Invasor.

Figura 5.- Histograma de los promedios obtenidos para Células TUNEL positivas en los diferentes grupos analizados.

Figura 6.- (A)Micrografía de biopsias de un Adenocarcinoma Mamario que sobre- expresa la proteína p53; (B) Micrografía de una biopsia de ganglio linfático humano que expresa la proteína Bcl- 2.

Figura 7.- Fotomicrografías de secciones tomadas de diferentes casos representativos para la expresión de las proteínas p53, Bcl- 2, PCNA y marcaje TUNEL en los diferentes grupos histológicos estudiados.

Figura 8.- Micrografías de una sección estudiada para la expresión de la localización sub- celular de la proteína p53 por microscopía confocal

Figura 9.- Análisis de la co- determinación de la expresión de la proteína PCNA y el marcaje TUNEL en el mismo corte histológico.

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1.- Resultados obtenidos de las biopsias para expresión de las proteínas p53, Bcl- 2 y PCNA (método AWS), tipo viral (VPH), y número de células TUNEL positivo.

Tabla 2.- Muestras seleccionadas para el estudio de apoptosis en el cérvix.

Tabla 3.- Correlación de la Expresión de las Proteínas p53, Bcl-2 y PCNA en los diferentes grados Histológicos durante el desarrollo del Cáncer Cervical.

Tabla 4.- Prevalencia, Correlación y Tipo de Distribución en todos los Grados Histológicos Durante el Desarrollo del Cáncer Cervical

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RESUMEN

El cáncer de cérvix es una de las neoplasias más frecuentes en México. Se reconocen diversos factores involucrados en su etiología, uno de ellos es el virus del papiloma humano (HPV), el cual infecta las células del epitelio cervical y produce proteínas que alteran la regulación del ciclo celular. Durante los últimos 20 años se ha estudiado la ganancia celular como un mecanismo alterado en todos los cánceres, sin embargo en los últimos años ha sido de particular interés e importancia el estudiar la pérdida celular (apoptosis) como un mecanismo alterado en la homeostasis tisular. Existen reportes previos que revelan alteraciones en los mecanismos finos de regulación de tal proceso, donde participan secuencias oncogénicas y anti-oncogénicas, anteriormente caracterizadas en el estudio de la proliferación celular en el cáncer, tales como p53 y bcl- 2. Es importante estudiar el estado de la ganancia celular (proliferación) versus la pérdida celular (apoptosis) en las lesiones pre- malignas y malignas del cérvix-uterino. Por lo anterior para estimar el índice apoptótico durante el desarrollo del cáncer cervical determinamos el número de células TUNEL positivas así como las células con morfología apoptótica, además de determinar la expresión de proteínas clave reguladoras de este proceso, tales como p53, Bcl-2 y PCNA.

La expresión de las proteínas p53, Bcl-2 y PCNA fue estudiada por inmunohistoquímica en 31 epitelios cervicales sanos, 10 lesiones escamosas de bajo grado (NIC I), 28 lesiones escamosas de alto grado (NIC II/III) y 36 carcinomas de células escamosas (CCE) del cuello uterino.

El análisis estadístico mostró una débil correlación positiva entre la expresión de p53 y PCNA en NIC I (r=0.378, P=0.016). Una correlación similar se encontró entre la expresión de p53 y Bcl-2 en NIC II/III (r=0.385, P=0.023). La expresión de la proteína PCNA fue significativamente elevada en relación directa con el grado de la lesión cervical. La presencia del HPV de acuerdo al grado histológico fue la siguiente: Epitelio cervical normal 45% (14/31), NIC I 50% (5/10), NIC II/III 85% (24/28) y Cáncer cervical invasor 91% (33/36), siendo en todos los casos el tipo 16 el más frecuente tipo. Nuestros resultados sugieren que la sobre-expresión de la proteína p53 durante la tumorigénesis cervical podría estar jugando un papel importante en la progresión de este tipo tumoral. La sobre-expresión de la proteína Bcl-2 en el cáncer cervical podría sugerir que la inhibición de la apoptosis es importante para el mantenimiento de la neoplasia. La sobre-expresión de la proteína PCNA podría ser un marcador útil para el diagnóstico de varios grados de displasia y cáncer cervical.

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ABSTRACT

Cervical cancer is one of the most frequent neoplasias in Mexico. Diverse factors participate in its etiology, one of them is the human papilomavirus (HPV), which infects the cells of the cervical epithelium and express proteins that alter the regulation of the cellular cycle. During the last 20 years the cellular gain has been studied as a oncogenic and anti-oncogenic process, previously characterized in the study of cellular proliferation in cancer such as p53 and bcl-2. It is important to study the state of the cellular proliferation versus the cellular apoptosis in the pre-malignant and malignant lesions of the uterine-cervix. To estimate the apoptotic index during the development of the cervical cancer the number of positive TUNNEL cells as well as the cells with apoptotic morphology, and the expression of regulator/proteins key of this process, such as p53, Bcl-2 and PCNA were studied.

The statistical analysis showed a weak positive correlation between the p53 expression and PCNA in NIC I (r=0.378, P=0.016). A similar correlation was found between the p53 expression and Bcl-2 in NIC II/III (r=0.385, P=0.023). The expression of the protein PCNA was significantly high in direct relationship with the grade of the cervical lesion. The presence of HPV in various histological grades were the following: Normal cervical epithelium 45% (14/31), Cervical Intraephitelial Neoplasia (CIN) I 50% (5/10), CIN II/III 85% (24/28) and Invasive Cervical Cancer 91% (33/36), being in all the cases type 16 the most frequent. Our results suggest that the over-expression of protein p53 during the cervical tumorigenesis could be playing an important role in the progression of this tumor. Over-expression of the protein Bcl-2 in cervical cancer could suggest that the inhibition of the apoptosis is important for the maintenance of the neoplasia. The on-expression of the protein PCNA could be an useful marker for the diagnosis of several dysplasia grades and cervical cancer.

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INTRODUCCION

“El conocimiento de lo real es una luz que siempre proyecta alguna sombra. Jamás es inmediata y plena.

Las revelaciones de lo real son siempre recurrentes. Lo real no es jamás “lo que podría creerse”, sino siempre lo que debiera haberse pensado. El pensamiento empírico es claro, inmediato, cuando ha sido bien montado el aparejo de las razones. Al volver sobre un pasado de errores, se encuentra la verdad en un verdadero estado de

arrepentimiento intelectual. En efecto, se conoce en contra de un conocimiento anterior, destruyendo conocimientos mal adquiridos o superando aquello que, en el espíritu mismo, obstaculiza a la espiritualización.”

“La formation de l‘esprit scientifique”

Gaston Bachelard (1948)

Las neoplasias malignas se consideran como enfermedades del crecimiento y la diferenciación celular. Quizás el denominador común de todos l os cánceres es su crecimiento incontrolado, el que puede ser observado tanto clínica como experimentalmente. El estudio de la cinética de la proliferación celular en las neoplasias ha rendido información importante, particularmente en alteraciones de la regulación del ciclo celular. Lo anterior ha permitido el desarrollo de tratamientos anti-neoplásicos que inciden precisamente en la supresión de la proliferación celular. Hasta hace pocos años, el índice mitótico y el proceso de transformación celular eran los dos factores principales que se esgrimían para explicar el crecimiento acelerado de las neoplasias. En la última década sin embargo, se ha descubierto que la alteración en la regulación de la muerte celular genéticamente programada o apoptosis desempeña un papel importante en el desarrollo del cáncer. Se ha planteado, y se ha intentado demostrar, que en la mayoría de los tumores malignos, la apoptosis se encuentra inhibida y el aumento del número de células no sólo se debe al aumento de la actividad mitótica, sino también a la inhibición de la pérdida celular, lo cual altera la homeostasis tisular [Barr, 1994; Canman, 1995;

Katsikis, 1995].

El gran interés que ha despertado el estudio de la apoptosis, se debe fundamentalmente a que, la eliminación fisiológica de las células depende de un programa genético finamente regulado, en el cual participan oncogenes y anti-oncogenes celulares. Muchas de estas secuencias promotoras y

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supresoras desempeñan un papel central en el proceso de la carcinogénesis y fueron descubiertas independientemente de su participación en el proceso de la muerte celular programada. Ha resultado necesario comprender los procesos genéticos y moleculares que controlan la apoptosis, para así entender mejor el proceso de la carcinogénesis [Cotman, 1995; Isner, 1995].

La carcinogénesis de múltiples pasos

La naturaleza de múltiples pasos de la carcinogénesis es aceptada universalmente y se ha propuesto que consta de tres grandes etapas: la transformación, la promoción y la progresión. Las s ecuencias de las alteraciones genéticas se pueden estudiar mejor en órganos en los cuales, un fenotipo histo-morfológico está definido para cada estado de la progresión tumoral, como se puede observar en el cáncer de colon [Fearon, 1990; Kinzler, 1993] y de igual manera en el cáncer del cérvix-uterino. En estudios recientes, ha sido posible descubrir que este esquema simple es, en verdad, mucho más complicado y requiere de la acumulación de numerosos cambios moleculares.

Los estudios moleculares llevados a cabo en el cáncer hereditario de colon han demostrado una serie de anomalías cromosómicas y genéticas, acumuladas progresivamente en la mucosa de las células del colon de individuos susceptibles, antes de generar un adenocarcinoma invasor clínicamente detectable. Es muy probable que la mayoría de los cánceres se desarrollen de acuerdo a este proceso de múltiples etapas, pues los rearreglos genómicos son una característica de la inestabilidad del DNA, típica de todas las neoplasias malignas. Se ha estimado, que se requieren entre tres y siete eventos genéticos independientes para transformar una célula normal en una célula cancerosa y probablemente otros tantos para conferirle el fenotipo invasor y metastásico [Fearon, 1990]. Estos desarreglos genéticos se expresan generalmente como incremento de la actividad de algunos oncogenes o como deleciones y mutaciones de algunos genes supresores, lo que finalmente produce aumento del índice de proliferación e inhibición de la apoptosis. Todas estas anormalidades genéticas influyen en el control de la apoptosis, por lo que

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puede afirmarse que este proceso es de importancia fundamental en el desarrollo de la carcinogénesis.

Algunos tipos de papilomavirus humanos (HPV) son considerados como factores de riesgo en cáncer genital, pero la infección con estos virus no es suficiente para inducir neoplasias. Se necesita la alteración o desregulación de la expresión de oncogenes celulares, de antioncogenes y de otros genes celulares para que se desarrolle un cáncer cervical fran camente invasor. Los largos períodos de latencia (varias décadas) entre la infección y el desarrollo de un carcinoma, el bajo porcentaje del total de individuos infectados que desarrolla cáncer, así como diversos datos experimentales, sugieren que se necesitan otros factores para que se origine un tumor maligno después de la infección viral.

Aún cuando sabemos que la infección por papilomavirus en el hombre no determina directamente el desarrollo de displasias o carcinomas, debido al largo período de latencia entre la transición de una displasia leve a un carcinoma invasor, lo anterior podría sugerir fuertemente la existencia de otros factores necesarios para la transformación maligna de la célula epitelial. El carcinoma del cérvix uterino, no ha sido estudi ado con la profundidad y amplitud con que se ha estudiado el cáncer hereditario del colon, pero debido a su accesibilidad y al conocimiento preciso de las etapas pre -neoplásicas que ocurren en ese epitelio, podría ser el modelo ideal para estudiar in vivo los eventos moleculares que influyen en la regulación de la apoptosis durante el proceso de transformación maligna. Se acepta por lo general, que existe una progresión temporal y horizontal desde las lesiones epiteliales cervicales más leves como la displasia, hasta el carcinoma invasor, tanto así que la nomenclatura más en boga de estas lesiones es la de “neoplasia intra-epitelial cervical” (NIC) que incluye todos los grados de displasia y el carcinoma in situ (National Cancer Institute Workshop: "The 1998 Bethesda system for reporting cervical/vaginal cytologic diagnoses"). Este concepto, se fundamenta principalmente en estudios de correlación morfo-epidemiológica, pero como es fácil comprender no es factible probarlo; por ello existen todavía muchas duda s

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acerca de la transformación progresiva que alcanzan las células displásicas del cérvix. Se sabe también, que dentro del grupo de las displasias leves y moderadas, un gran porcentaje involuciona espontáneamente o después de tratamientos anti-inflamatorios, lo cual demuestra que esas células no habían sufrido el cambio irreversible de la transformación maligna, o aún teniéndolo pudieron ser eliminadas por apoptosis. Sólo una pequeña proporción de esas alteraciones del epitelio cervical, progresa hasta el cá ncer invasor. El reconocimiento de un virus, el virus del papiloma humano (HPV), parece desempeñar un papel importante en su etiología [Bosch, 1995; zur Hausen, 1983]. De los más de 100 tipos de HPV, sólo algunos se consideran de alto riesgo y por ello capaces de transformar a las células epiteliales [Park, 1995].

Los tipos 16 y 18 del HPV, son los más comúnmente encontrados en asociación con el cáncer de cerviz [de Villiers, 1992]. Estos virus codifican para dos oncoproteínas: E6 y E7, las cuales son capaces de antagonizar a dos proteínas anti-oncogénicas fundamentales para la regulación del ciclo celular y la diferenciación: p53 y Rb [Chellappan, 1992; Kim, 1995; Scheffner, 1991]. Aunque este mecanismo parecería suficiente para explicar la transformación maligna, todavía no es posible saber por qué las lesiones pre -malignas tienen grandes periodos de latencia, y por qué muchas involucionan espontáneamente. Se ha sugerido que la integración del genoma viral al de la célula epitelial pudiera ser un factor i mportante; sin embargo, deben existir otros factores que influyan en la transformación maligna de la célula epitelial;

por ejemplo, la alteración en la regulación directa o indirecta de los mecanismos de control de la muerte celular programada o quizá también los mecanismos de reconocimiento inmune. A diferencia de los estudios de carcinogénesis del colon, existen pocos estudios sobre las aberraciones cromosómicas que tienen lugar durante el proceso de transformación desde lesiones pre-malignas hasta cánceres invasores del cérvix. Sin embargo, algunos estudios citogenéticos recientes revelan algunas alteraciones cromosómicas poco constantes, como son algunas del cromosoma 1 y las ganancias y pérdidas en los cromosomas 4, 5, 6, 11, 13, 17, 18 y 21 [Atkin,

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1979]. Se sabe además, que casi el 95% de los cánceres invasores tiene alguna alteración cromosómica [Sreekantaiah, 1988] y en un estudio reciente se encontró que en el 90% de los casos hay una ganancia del cromosoma 3q, lo que parece sugerir la relación de esta alteración cromosómica con el fenotipo invasor [Heselmeyer, 1996]. Sin embargo, hasta la fecha no se ha podido relacionar estas alteraciones con la acción oncogénica del HPV ni mucho menos con la alteración de los mecanismos de apoptosis. Existe sin embargo, un buen número de estudios genético-moleculares que permiten suponer que hay una relación estrecha entre estas alteraciones y la regulación de la apoptosis.

La Genética de la regulación de la apoptosis

Los genes que regulan la apoptosis se pueden agrupar en dos grandes categorías: 1. Los represores, cuya expresión previene o retarda la muerte celular, y 2. Los inductores, en los que su expresión puede directamente inducir la muerte celular o aumentar la susceptibilidad de las células a los estímulos inductores de muerte. Muchas células malignas muestran mutaciones, deleciones o cambios en la expresión de oncogenes y anti - oncogenes, tales como bcl-2, p53, c-myc y ras, lo que altera el programa genético de eliminación celular. Un gen que desempeña un papel central en el control de este proceso y que está alterado frecuentemente, tanto por mutaciones o deleciones de novo como por las oncoproteínas virales, es el gen supresor p53. Se sabe que las mutaciones o deleciones de p53 tienen lugar en más del 50% de todos los cánceres humanos, y su papel central en la carcinogénesis ha sido firmemente establecido [Hollstein, 1991; Levine, 1991].

En ratones transgénicos con el gen p53 mutado desarrollan una gran variedad de neoplasias en unos cuantos meses y en los homocigotos con deleción de p53, todos los animales experimentales mueren por cáncer a los diez meses.

La proteína p53 produce una detención en la etapa G1 del ciclo celular, lo cual permite la reparación de DNA dañado por mutágenos externos o internos. De

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apoptosis, ya que cuando el daño mutacional del DNA rebasa los límites de una reparación adecuada, p53 activa los mecanismos de muerte celular programada para prevenir la propagación del daño genético. Así se explica, que las mutaciones o deleciones de p53 que se encuentran en la mayoría de los cánceres producen clonas celulares incapaces de entrar en apoptosis. En el caso del carcinoma de cérvix, se sabe que p53 es inactivado y degradado por la proteína E6 del HPV, pero también se ha demostrado que existen algunas mutaciones puntuales y deleciones de novo en este cáncer.

El gen inhibidor de la apoptosis más conocido es el gen bcl-2 que se sobre- expresa principalmente en el linfoma folicular humano cuando se transloca al locus de la inmunoglobulina (t14;18). La sobre-expresión de este gen aumenta la sobrevivencia celular ante una gran variedad de agentes lesivos como son las drogas genotóxicas, la radiación ionizante y los glucocorticoides [reed JC, 1994]. En los últimos años se ha podido determinar que un gran número de neoplasias malignas sobre-expresan este gen anti-apoptótico y el ejemplo más aparente es el que ocurre en el carcinoma de próstata resistente a la terapéutica hormonal convencional [Henriksen R, 1995]. En el cáncer de cérvix, existen pocos estudios sobre bcl-2; sin embargo, algunos revelan que la expresión de este gen parece estar elevado en cánceres con infección de HPV y que puede desempeñar un papel importante en las lesi ones pre-malignas del cervix [Saegusa, 1995]. No se ha definido si su sobre-expresión pudiera ser un marcador específico de la transformación maligna de este epitelio. Aun cuando existen numerosos genes como el c-myc, los de APO-Fas, y otros más que regulan el proceso de apoptosis en numerosas células normales y cancerosas, los que parecen desempeñar el papel central en este proceso en tejido cervical son precisamente p53 y bcl-2.

La Apoptosis y el Cáncer

Aunque se acepta generalmente que en las neoplasias malignas ocurre un aumento cuantitativo de las mitosis, existen muchos ejemplos en los cuales es

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duplicación y longitud del ciclo celular en tumores malignos ha permitido constatar que el número de células en replicación puede ser inclusive menor que aquel del tejido de origen, con un tiempo de duración del ciclo generalmente más largo. Resulta por lo tanto claro que el aumento de replicación celular no es la única explicac ión de la ganancia continua de células malignas. El otro aspecto de la homeostasis, que es la inhibición del ritmo de pérdida celular o apoptosis, parece ser un factor fundamental en este proceso. Por esto, la estimación del índice apoptótico sería de gran importancia tanto para entender el proceso de transformación maligna, como para dar seguimiento clínico al crecimiento de una neoplasia, aun más, se sabe que la monitorización de este fenómeno puede desempeñar un papel fundamental en la estimación de la químio y radio-sensibilidad de las neoplasias durante el tratamiento [Kondo, 1995]. En el cáncer cérvico -uterino y lesiones pre-malignas, existen pocos estudios encaminados a conocer las alteraciones del mecanismo apoptótico. Sin embargo, en algunos estudio s recientes se ha podido constatar que hay inhibición parcial de la apoptosis en lesiones pre-malignas y en neoplasias con HPV 16 y 18 [Furuya, 1996] .

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ANTECEDENTES

Apoptosis, Papilomavirus humano y Cáncer Cervico-Uterino

El papilomavirus es un virus de DNA circular de doble cadena que induce una gran variedad de lesiones epiteliales en mucosas de mamíferos, incluido entre ellos a los humanos. Los papilomavirus son ubicuos entre los vertebrados superiores. Existen más de 100 tipos de papilomavirus humanos (HPVs) de los cuales cerca de 25 son trópicos para el tracto genital. Los subtipos de HPVs se clasifican por su asociación a las lesiones epiteliales del cérvix -uterino en bajo- , intermedio- y alto-riesgo. El subgrupo de alto riesgo lo integran los tipos 16, 18, 31, 33 y 51, frecuentemente asociados con los cánceres ano -genitales en humanos [van der Brule, 1991]. La replicación viral ocurre en lesiones de bajo- grado las cuales están ligeramente alteradas en su patrón de diferenciación. La producción de partículas virales, la amplificación del genoma viral, la síntesis de las proteínas de la cápside y el ensamblaje de los viriones son procesos dependientes de la diferenciación celular y se r estringen a las células para- basales. En los carcinomas, el DNA viral es usualmente encontrado de manera integrada dentro del genoma del hospedero y no se observa producción viral [Howley PM, 1990]. A nivel molecular se ha ganado terreno en el conocimiento de mecanismos moleculares por los cuales los HPVs promueven la malignidad, siendo evidente la participación de las oncoproteínas virales E6 y E7. La evidencia sugiere que las oncoproteínas E6 y E7 funcionan inactivando a los reguladores del ciclo celular p53 y retinoblastoma (Rb), con lo que se promueve de manera inicial el evento de la carcinogénesis de múltiples pasos.

La inactivación de la proteína p53 por la oncoproteína viral E6 es obviamente un mecanismo que altera la apoptosis. Aunque se reconoce la ausencia del HPV en menos del 5% de los carcinomas del cervix-uterino, estos casos son los que presentan un factor pronóstico mas pobre [Higgins GD, 1991] .

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Progresión Tumoral y Apoptosis en el Cáncer

Aun cuando se han reportado defectos en la señalización de vías apoptóticas en algunas células tumorales [Evan and Vousden, 2001; Zornig, 2001], se ha acumulado evidencia clínica y experimental, para apoyar la hipótesis que define a la apoptosis como un “acelerador de la progresión tumoral” [Gurova K, and Gudkov A, 2003].

Importancia de la Apoptosis en la Clínica del Cáncer

Se sabe que uno de los genes que controlan el ciclo celular y algunos mecanismos de reparación del DNA es p53 [Levine AJ, 1997; Baker SJ, 1990]. De igual manera se ha demostrado que la introducción de la proteína p53 a células tumorales con p53 mutada desencadena la apoptosis, lo cual ha sentado las bases para tratar de utilizarla con fines terapéuticos [Baselga J, 1997]. Otro efecto demostrado en contra de las complicaciones relacionadas con la apoptosis durante la quimioterapia in vivo, se ha atribuido a una familia de compuestos químicos inhibidores de la expresión del gen p53 [Komarov PG, 1999]. La acción de muchos genes relacionados con el cáncer, específicamente algunos oncogenes como Ras y Myc, han sido re -valorados con respecto a su papel anti-apoptótico en el cáncer, convirtiéndose así en potenciales blancos terapéuticos [Evan G, and Littewood T, 1998] . Los factores anti-angiogénicos son ahora re-planteados como agentes preventivos de los mecanismos evasores de la apoptosis inducida por la vía extracelular, proponiendo que el mecanismos es por disminución del flujo sanguíneo en condiciones de stress celular y la consecuente hipoxia [Gee MS, 1999;

Browder T, 2000]. Una visión retrospectiva de las bases patogénicas de muchas enfermedades humanas, casi siempre revela un componente apoptótico que de alguna manera contribuye a la progresión de la enfermedad o forma parte de esta, tal es el caso del SIDA, la psoriasis, las enfermedades neurodegenerativas, etc [Nicholson DW, 2000]. Lo anterior es el reflejo de una

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gran cantidad de reportes de la literatura que señalan a la apoptosis como uno de los procesos celulares más importantes para el estudio del cáncer en los últimos años.

Genes involucrados en la Apoptosis familia de genes Bcl-2

El bcl-2 (B cell leukemia/lymphoma 2 genes) fue el primer proto-oncogen detectado y asociado a procesos malignos de las células B. Durante la maduración de las células B puede ocurrir una traslocación cromos omal 14,18 en el gen bcl-2; lo cual provoca un aumento en la expresión de la proteína citoplasmática Bcl-2, que origina una inhibición de la apoptosis en las células B dando por resultado la supervivencia de la célula transformada [Reap EA, 1995]. Está demostrado que la sobre-expresión del gen bcl-2 en linformas inducidos experimentalmente, se asocia con la proliferación neoplásica por los efectos inhibitorios de Bcl-2 sobre las vías apoptóticas [Munn DH, 1995].Este gen facilita el aumento de la supervivencia de la célula transformada y de este modo aumenta la posibilidad de futuras aberraciones genéticas que pueden conducir a la progresión maligna [Binder C, 1995; Oltvai ZN, 1994]. La expresión de este gen en algunos tipos de cáncer es un marcador de mal pronóstico [Osborne BA, 1994]. El gen bcl-2 forma parte de una familia de genes que intervienen en la regulación de la supervivencia de la célula. Los miembros de la familia Bcl-2 están integrados por: Bcl-2, Bax, Bad, Bcl-X1, Bcl- Xs, Mcl-1. El destino de una célula de morir o sobrevivir está determinado por las diferencias en la expresión de estas proteínas, actuando algunas como promotoras y otras como inhibidoras de las señales de apoptosis [Boise LH,1993; Yang E, 1995; Boise LH, 1995]. Se ha demostrado que la formación del heterodímero Bcl-2/Bax y la variante Bcl-X1 tienen un efecto inhibitorio de la muerte celular, al impedir la acción de las cisteín-proteasas que median señales de apoptosis. Sin embargo, la formación de homodímeros Bax-Bax, así como elevados niveles de Bax o Bcl-Xs, pueden favorecer la muerte programada de la célula [Boise LH, 1995].

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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los estudios citológicos e histológicos de las diferentes etapas de transformación maligna del epitelio cervical se conocen con bastante precisión y han sido motivo de numerosos estudios, tanto morfológicos, como genéticos- moleculares y más recientemente genómicos. Sin embargo, todavía no es posible determinar en que momento de este proceso aparecen células o clonas que expresen ya un genotipo de inmortalización y por ello de transformación irreversible hacia una neoplasia invasora. Los estudios de los mecanismos genéticos involucrados en la infección por HPV, no son suficientes para esclarecer este punto y todavía no es posible conocer en que momento este virus produce alteraciones irreversibles características de la transformación maligna. No existe una explicación adecuada de los grandes períodos de latencia que existen entre las diferentes lesiones pre -malignas y el cáncer invasor (que en muchos casos se supone que puede ser hasta de 20 año s).

Tampoco es posible saber en que momento las alteraciones de los genes p53, Rb, c-myc y otros influyen en este proceso. Por último, aunque existen numerosos estudios del índice de replicación celular en el cáncer de cérvix, muy poco se ha estudiado en relación con la alteración del mecanismo de la apoptosis en la progresión de los cambios celulares desde la displasia leve hasta el cáncer invasor. Por lo tanto, no se sabe si la alteración de este fenómeno podría marcar con precisión el momento de la transformación de una célula pre-maligna a una célula maligna, lo cual sería de gran interés tanto desde el punto de vista de la biología celular del cáncer como desde el punto de vista clínico aplicado para definir mejor temporal y espacialmente, las lesiones del epitelio cervical de alto riesgo. Aun más, no se conoce el índice apoptótico de los cánceres invasores y su relación con el comportamiento clínico, con la capacidad de invasión y de metástasis ni con su sensibilidad al tratamiento. Esta es un área de investigacón prometedora para el estudio de todas las neoplasias malignas, ya que se sabe que en general la presencia de

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clonas resistentes a la apoptosis se asocia a resistencia al tratamiento y a una evolución clínica muy acelerada.

Lo anterior nos permite plantear la siguiente pregunta:

¿Existe un cambio en el patrón de expresión de los genes p53, bcl -2, y PCNA que marque el inicio de la carcinogénesis del cérvix -uterino y que pueda en presencia o ausencia del HPV producir la transición de las lesiones pre- malignas a malignas en el epitelio del cérvix-uterino?

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HIPOTESIS

La alteración en la regulación de los mecanismos de muerte celular programada (apoptosis) es un requisito para la transformación maligna. Por ello la investigación de algunos de lo s marcadores moleculares de la apoptosis (p53/bcl-2) en lesiones pre-malignas y malignas del cérvix permitirá identificar la etapa crítica de transformación irreversible.

OBJETIVO GENERAL

Investigar la alteración de los mecanismos de muerte celular progra mada en lesiones pre-malignas y malignas del cérvix uterino.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1) Determinar la expresión de los genes p53 bcl-2 en muestras de tejido de pacientes en estadios pre-malignos y malignos (CaCU epidermoide invasor).

2) Determinar el índice apoptótico por análisis histomorfológico y de marcaje terminal (TUNEL).

3) Determinar el índice proliferativo por análisis inmunohistoquímico para la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular).

4) Determinar la presencia y tipo de papilomavirus humanos en las muestras antes mencionadas.

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MATERIALES Y METODOS

Estrategia Experimental

OBTENCION DE MUESTRAS

(Cérvix sano, Cervicitis, NIC I,II,III y CaCU epidermoide invasor)

CORTES DE 5m PURIFICACION DNA (12 cortes) (Cortes de 10 m en laminillas)

INMUNOHISTOQUIMICA TIPIFICACION HPVs p53 , Bcl-2, PCNA (Proteína) (Análisis por PCR y secuenciación) (Análisis por microscopía óptica)

INMUNOFLUORESCENCIA p53, Bcl-2, PCNA (Proteína)

(Análisis por microscopía óptica y análisis de imagen)

Estudio histomorfológico del índice APOPTOTICO y MITOTICO con Hematoxilina y Eosina (H&E)

(Análisis por microscopía óptica y análisis de imagen)

Técnica in situ de TUNEL para determinar índice APOPTOTICO

(Análisis por microscopía óptica y análisis de imagen) ANALISIS DE RESULTADOS

TABLA 2.- Muestras seleccionadas para el estudio de apoptosis en el cérvix.

E

Eppiitteelliioo CCeerrvviiccaall

( ( nn== ))

N

Noorrmmaall

3 311

N

NIICC II 1010

N

NIICC IIII 55

N

NIICC IIIIII 2233

C

CIICCEE 3366

N NIICC::

N

Neeooppllaassiiaa IInnttrraaeeppiitteelliiaall CCeerrvviiccaall C

CIICCEE:: Cánncceerr IInnvvaassoorr ddee Célluullaass EEppiitteelliiaalleess

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Diseño del Estudio

Se presenta un diseño del tipo de análisis multivariado, tratándose de un estudio de tipo exploratorio, observacional, no experimental y longitudinal (aún cuando se realizó una sola medición de cada variable , se estudió en todas las etapas de la carcinogénesis del cáncer cérvico-uterino, en muestras obtenidas de distintos individuos) [Dawson B., 2001].

El estudio se realizó en cortes de tejido incluidos en parafina de materiales del archivo del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital General de Zona No. 4 del IMSS.

El número de casos para cada grupo de lesiones que se estudió ( NIC I, II, III, y Carcinoma Epidermoide invasor) fue de 30 para cada uno. Como controles se utilizaron cortes de cérvix normal, obtenidos de histerectomías por fibromiomas.

En cada biopsia de cérvix sano, de estadios pre-neoplásicos y neoplásicos, se estudiaron 3 variables dependientes:

HPV

Variable nominal dicotómica (presencia, ausencia y tipo viral de alto o bajo riesgo).

p53, Bcl-2

Variables cuantitativas continuas determinadas por captura y análisis de imagen digital.

PCNA

Variable ordinal a clasificarse de acuerdo a la intensidad de la señal del cromógeno: disminuida (1), media (2) e incrementada (3) y se convertirán en discontínuas al multiplicar el número asignado a cada una, por el % de células tumorales positivas.

Indice: APOPTOTICO

Variables cuantitativas continuas determinadas por fórmulas, descritas en la parte correspondiente del protocolo.

El análisis de los resultados obtenidos se realizó por medio de la prueba del coeficiente de correlación de Pearson [J.C. Fry, 1993] simbolizado como r, la cual se calcula de la siguiente manera:

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r = (X-X) (Y-Y)

 (X-X)

2

(Y-Y)

2

El cálculo del tamaño de la muestra se realizó con el programa Epi-Info Versión 6, a un nivel de confianza del 95% y un poder de la prueba del 80%.

Aunque el tamaño mínimo que se determinó fue de 16 casos, tomando en consideración el teorema del límite central, se decidió aument ar a 30 casos para justificar de una manera mejor el análisis de los resultados que se puedan obtener. Partiendo de este teorema justificamos cualquier análisis experimental definido en la hipótesis [Bernard Rosner, 1982]. Los controles se obtuvieron igualmente en número de 30, de cérvix normal proveniente de histerectomías por leiomiomas.

Criterios de Inclusión

En vista de que no se buscó una correlación clínica, los criterios de inclusión se refirieron únicamente a la disponibilidad en la siguiente forma :

1.-Pacientes de cualquier edad sin antecedentes de neoplasias previas o concomitantes y sin tratamiento al momento de la obtención de la biopsia.

2.-Que existan bloques de parafina de cada paciente seleccionada y que el diagnóstico histopatológico corresponda al diagnóstico histopatológico establecido por los responsables del proyecto con la especialidad médica en Patología quirúrgica.

3.-Que el tejido se encuentre en condiciones óptimas para el estudio histopatológico y en cantidad suficiente para obte ner los cortes necesarios.

Cortes de tejido

De todos los bloques de parafina se obtuvieron cortes de 5 a 10 m de espesor los cuales fueron divididos en 2 grupos, uno para las técnicas inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia, y otro para la extracció n de DNA. En todos los casos uno de los cortes se tiñó con hematoxilina y eosina para comprobación del diagnóstico histopatológico y para la estimación morfológica del índice apoptótico.

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Extracción de DNA Genómico

El DNA genómico fue extraído de los pacientes a partir de muestras de tejido embebidas en parafina, utilizando el sistema de columnas de QIAGEN para extracción de DNA (www.qiagen.com).

En el particular caso de las muestras que serán analizadas en este estudio se utilizaron bloques de parafina, de los cuales se purificó el DNA a partir de secciones de 10 um. La calidad del DNA se evaluó por electroforésis y espectrofotometría (Figura 1).

Figura 1.- Electroforésis del DNA purificado a partir de la muestras embebidas en parafina. En el carril C se aprecia la calidad de un DNA íntegro a una concentración conocida.

Detección y tipificación del HPV

Para la detección de el genoma de HPV, se practicó una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) en el equipo GeneAmp PCR System 9700 amplificando la región L1/MY con los oligonucleótidos universales MY09/MY11 [Manos, 1989] y la tipificación por medio de la secuenciación del producto de amplificación por el método de PCR con nucleótidos fluorescentes (BigDye terminator Ready Reacción Kit, Perkin-Elmer) (Figura 3).

M

M CC 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111

C

C == DDNNAA ggeenómmiiccoo ((550000nngg))

(31)

Figura 2.- Electroforésis de los productos de PCR para la amplificación del gen L1 de los HPVs. Se aprecia en el carril (C+) un control positivo correspondiente a la amplificación de un vector plasmídico que contiene el genoma del HPV tipo 16.

Análisis de las secuencia de DNA:

Se realizó en un secuenciador automático de DNA (Automatic Genetic Analyzer ABI PRISM 310, Perkin-Elmer) y el análisis de la secuencia se ejecutó a través del programa FASTA de alineamiento de secuencias con la base de datos del GeneBank para papilomavirus humanos.

Figura 3.- Análisis de secuencias por alineamientos .

M

M 11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 CC +

+ CC((--))

F

Frraaggmmeennttoo

d dee 115500 ppbb

Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi|688182|gb|S71514.1| L1 [human papillomavirus type 16 HPV... 115 6e-24 gi|27752860|gb|AY177679.1| Human papillomavirus type 16 L1 ... 115 6e-24 gi|25272113|gb|AF548835.1| Human papillomavirus type 16 iso... 115 6e-24 gi|21667875|gb|AF512011.1| Human papillomavirus type 16 L1 ... 115 6e-24

gi|688182|gb|S71514.1| L1 [human papillomavirus type 16 HPV16, Genomic, 452 nt] Length = 452 Score = 115 bits (58), Expect = 6e-24 Identities = 58/58 (100%) Strand = Plus / Plus

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Técnica de Inmunohistoquímica para las proteínas p53, Bcl-2 y PCNA Se utilizó el sistema peroxidasa anti-peroxidasa. Previa desparafinización de las laminillas en xileno, seguida por hidratación en etanoles (100 -30%), bloqueo con suero de cerdo (1:100) e incubación del anticuerpo primario (anti- PCNA) por 2 hr a T° ambiente en cámara húmeda. Posteriormente se adicionó el Ab linker y finalmente el complejo PAP, usando como cromógeno diaminobenzidina, para producir un precipitado café insoluble.

Análisis de Resultados: Se realizó con un sistema de análisis de imágen (sistema de video-captura microscopio Olympus AX-70) para determinar la inmunolocalización y expresión, utilizando un sistema de clasificación de la intensidad de la reacción del cromógeno por el siguiente sistem a: nula (0), disminuida (1), media (2) e incrementada (3) multiplicando el número asignado a cada una por el % de células tumorales positivas (Figura 1) [Sinicrope, 1995].

Figura 2.- Ejemplo del Análisis de imagen con el sistema de video captura digital realizado con el software PC Image V2.1 en un campo obtenido de una biopsia de CICE. En esta imagen se calificó con una Intensidad=3, un Store=4 (>75%), resultando en un AWS=12. Los círculos verdes marcan cada núcleo celular del campo (detección de la proteína PCNA).

PCNA

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Técnica de doble Inmunofluorescencia

Las laminillas con las muestras embebidas en parafina fueron desparafinadas usando Xileno al 100%, estas se hidrataron en baños de etanol de concentraciones descendentes (100-30%), se enjuagaron finalmente en PBS 1x y se incubaron en cámara húmeda a temperatura ambiente con suero de caballo al 10% por 1 hora. El exceso de suero fue decantado y los tejidos se incubaron con el primer anticuerpo a concentraciones 1:100 para cada proteína blanco (Ab monoclonal de ratón para la proteína p53 y Ab policlonal de conejo para la proteína Bcl-2), posteriormente se lavaron en PBS 1x Tween 20 al 0.2% en agitación por 20 minutos y se adicionó el segundo anticuerpo marcado con fluoresceína (1:100) contra la fracción Fc del Ab policlonal de conejo y el anticuerpo marcado con rojo Texas contra la fracción Fc del Ab monoclonal de ratón, nuevamente se sometió a lavado con PBS 1x Twin 20 al 0.2% por 20 minutos, se protegieron con protector de fluorescencia y el cubreobjeto.

Análisis de resultados: Se sometió al análisis por microscopía confocal para determinar la inmunolocalización y captura de la imagen, el procesamiento de imagen se realizará con el programa PC Image (Synoptics V. 3.11 England) para análisis cuantitativo de la señal fluorescente.

Cuantificación de la Muerte Celular Programada por la Técnica de Transferencia Terminal (TUNEL)

Los cortes de parafina de lo casos a estudiar, fueron desparafinados en xileno dos veces durante 5 minutos, para ser re-hidratados con etanol al 100%, 95%, 75% y 50% por 3 min en cada uno; después se lavaron en PBS 1X, se inactivó la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno el 0.5%, y se incubaron con Proteinasa K a una concentración de 20 g/ml. El procedimiento para el marcaje se realizó a través de la enzima deoxinucleotidil transferasa (TdT), la cual cataliza la adición de un deoxirribonucleótido marcado (conjugado digoxigenina-dUTP) a los extremos 3'-OH de los fragmentos de DNA. La señal de marca de los extremos por el conjugado TdT-dUTP (TUNEL), fue entonces

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detectada por un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con fluoresceína.

Para el segundo caso se utilizó un cromógeno como la diamonobenzidina.

Finalmente las laminillas se lavaron, secaron y montaron en gl icerol. El índice apoptótico fue calculado como porcentaje de células TUNEL-positivas usando la siguiente fórmula:

Indice apoptósico(IA)=(no. células TUNEL- positivas/número total de núcleos celulares) x100.

Controles Experimentales:

Se utilizó para la detección de la proteína p53: Células COS-1 (no. de catálogo de la ATCC: CRL-1650, originarias de riñon de mono) p53(+).

Para la detección de la proteína bcl-2: Cortes de ganglio linfático humano, los cuales son bcl-2(+).

Para la detección de HPV: Células HeLa (no. de catálogo de la ATCC: CCL2, originarias de adenocarcinoma de cérvix, HPV18 positivas) y células CaSki (no. de catálogo de la ATCC: CRL-1550, originarias de cáncer epidermoide de cérvix), las cuales son HPV16 (+), así como células C33A (no. de catálogo de la ATCC: HTB-31, originarias de carcinoma de cérvix), las cuales son HPV ( -).

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Equipo e Infraestructura utilizados para el proyecto:

La infraestructura disponible para el desarrollo del proyecto fue la siguiente:

Equipo para técnica de PCR:

GeneAmp PCR System 9700 Perkin Elmer Applied Biosystems. (UIMEO- Hosp.Onc. CMN SXXI IMSS).

Microscopía óptica y confocal:

 Microscopio Olympus AX-70 con sistema de captura de video y análisis de imagen.(UIMEO-Hosp.Onc. CMN SXXI IMSS).

 Microscopio confocal modelo: Bio-Rad MRC 1024 confocal imaging system. (Centro de Instrumentos, Hospital de Especialidades, CMN SXXI, IMSS).

Cultivos y líneas celulares (controles) :

 Disponibles en la Unidad de cultivos celulares del Laboratorio del Dr.

Patricio Gariglio en el Departamento de Genética y Biología Molecular del CINVESTAV-IPN

Insumos y equipo menor disponibles en ambos laboratorios (Lab -24, 25 del Departamento de Genética y Biología Molecular CINVESTAV-IPN y Lab de Oncología Molecular de la Unidad de Investigaci ón Médica en Enfermedades Oncológicas del Hosp. de Oncología CMN SXXI IMSS) así como personal técnico y de apoyo.

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RESULTADOS

Expresión de las proteínas p53, Bcl-2 y PCNA en tejido cervical humano Una vez colectadas las muestras de estudio (Tabla 2) se procedió a realizar la determinación de la expresión de las proteínas p53, Bcl -2 y PCNA en cada muestra. Los resultados para la proteína p53 mostrarón que la inmunorreactividad fue tanto nuclear como citoplasmática, pero fue encontrada predominantemente en las muestras malignas. El análisis de la expresión de p53 fue basado en los resultados de ambas señales de localización (nuclear y citoplasmática). El método de análisis de expresión semicuantitativo utilizado para la inmunoreactividad de p53 fue el valor promedio determinado (VPD). En el epitelio cervical normal y los diferentes tipos de lesiones cervicales la inmunorreacción positiva tanto nuclear como citoplasmática para la proteína p53 se incrementó en el siguiente orden: Normal < NIC I < NIC II/III < CaCU (Figura 2a-d; ver también Tabla 1). De manera diferencial la tinción nuclear de p53 decreció en casi todas las muestras en el mismo orden, mientras la tinción citoplasmática se incrementó en las mismas muestras (Figura 2a y 2d). Un alto nivel de p53 fue observado en el citoplasma de los casos de CaCU (Figura 2d).

Por otro lado, la expresión de Bcl-2 fue localizada en el citoplasma de las células parabasales del epitelio cervical normal (Figura 2e), con mayor inmunoreactividad observada en NIC I (Figura 2f) que en las biopsias de NIC II (Figura 2g), y una intensa inmunoreactividad citoplasmática con una discreta señal nuclear en las biopsias de CaCU (Figura 2h). Como se indica en la Tabla 1, el promedio obtenido del VPD para la expresión de la proteína Bcl-2 se incrementó de epitelio cervical sano (0.92+0.19) a NIC I (3.20+0.48), decreció en NIC II/III (2.94+0.48) y fue más alta en los casos de CaCU (3.7+0.67). La expresión de PCNA fue nuclear y se incrementó progresivamente de NIC I a NIC III, alcanzando su máximo valor en las lesiones de CaCU (Figuras 2i a 2l) en donde todas las células fueron intensamente positivas.

Referencias

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