Trabajo Fin de Grado

Trabajo Fin de Grado

Desarrollo y validación de métodos selectivos de extracción en fase sólida para la cuantificación por

HPLC de aditivos alimentarios

Autor/es

Gemma Pacheco Marín

Director/es

Vicente Ferreira González

Facultad de Ciencias

Departamento de Química Analítica

Laboratorio de Análisis del Aroma y Enología (LAAE) Curso 2020/2021

2 ÍNDICE

Resumen/abstract 3

1. Introducción/antecedentes 4

2. Objetivos y planteamiento del trabajo 8

3. Parte experimental 8

3.1. Reactivos 8

3.2. Muestras, fases móviles y disoluciones preparadas 8

3.3. Instrumentación 10

3.4. Metodología 10

3.4.1. Optimización de la resolución de los picos de ácido benzoico y ácido sórbico 10 3.4.2. Estudio de la repetibilidad del sistema HPLC 10 3.4.3. Estudio de linealidad del sistema HPLC: obtención de la curva de calibrado 11 3.4.4. Cálculo del límite de detección del sistema HPLC 11 3.4.5. Cálculo del volumen de ruptura del sistema SPE 11

3.4.6. Optimización de la elución del sistema SPE 11

3.4.7. Optimización de la fase de lavado del sistema SPE 12

3.4.8. Validación del método 12

3.4.9. Ensayo de recuperación 13

4. Resultados y discusión 13

4.1. Optimización de la resolución de los picos de ácido benzoico y ácido sórbico 13

4.2. Estudio de la repetibilidad 16

4.3. Estudio de la linealidad: obtención de la curva de calibrado 16

4.4. Cálculo del límite de detección del sistema hplc 18

4.5. Construcción de la curva de ruptura del sistema spe 18

4.6. Optimización de la elución del sistema spe 20

4.7. Optimización de la fase de lavado 21

4.8. Validación del método 22

5. Conclusiones 24

6. Bibliografía 25 Anexos 27

3 RESUMEN/ABSTRACT

Uno de los principales problemas del consumo de alimentos procesados radica en la presencia de aditivos que pueden llegar a ser potencialmente peligrosos para la salud. Por ello, todos ellos están sujetos a una regulación de las cantidades contenidas, en función de su toxicidad y de su valor máximo de ingesta diaria permitido. El objetivo de este trabajo es desarrollar un método analítico para determinar dos aditivos, el ácido benzoico y el ácido sórbico en bebidas refrescantes comerciales.

Para ello se elige un método consistente en una determinación HPLC-uv con una preconcentración selectiva previa basada en extracción en fase sólida (SPE). En primer lugar, se optimiza el proceso HPLC-uv, estudiando la fase móvil adecuada y sus proporciones, pH, tiempo de análisis, repetibilidad y linealidad. En segundo lugar, se optimiza el proceso de preconcentración SPE, estudiando los volúmenes de ruptura, fases de lavado y elución y, en tercer lugar, se realiza la validación del método aplicándolo a muestras reales.

Se concluyó que la proporción adecuada de acetonitrilo en la fase móvil era del 16 %, siendo el resto un buffer de acetato de sodio trihidratado a pH 4,6 (ajustado con ácido acético). Así la resolución de los picos era suficiente, con un valor de 1,4, y un tiempo de análisis de 9,0 minutos.

Además, el sistema HPLC mostraba una buena repetibilidad (2,03% DER en ácido benzoico, y 1,90%

DER en ácido sórbico). Los límites de detección fueron 0,94 ppm y 0,038 ppm para los ácidos benzoico y sórbico, respectivamente. El método SPE optimizado resultó muy cuantitativo, robusto y seguro, permitiendo eliminar numerosas interferencias y alcanzar un factor de concentración adecuado. La validación en muestras reales mostró que puede ser aplicado al análisis de muestras de Coca Cola. En el caso de muestras de Monster, sin embargo, se observó una elevada imprecisión que sugiere que el procedimiento SPE debe ser mejorado.

One of the main problems with the consumption of processed foods is the presence of additives that can be potentially dangerous to health. For this reason, all of them are subject to regulation of the amounts contained, depending on their toxicity and their maximum permitted daily intake value. The aim of this work is to develop an analytical method to determine two additives, benzoic acid and sorbic acid, in commercial soft drinks.

For this purpose, a method consisting of an HPLC-uv determination with a previous selective pre-concentration based on solid phase extraction (SPE) is chosen. Firstly, the HPLC-uv process is optimised by studying the appropriate mobile phase and its proportions, pH, analysis time, repeatability and linearity. Secondly, the SPE preconcentration process was optimised by studying the breakthrough volumes, washing and elution phases and, thirdly, the method was validated by applying it to real samples.

It was concluded that the appropriate proportion of acetonitrile in the mobile phase was 16 %, the rest being sodium acetate trihydrate buffer at pH 4.6 (adjusted with acetic acid). Thus the resolution of the peaks was sufficient, with a value of 1.4, and an analysis time of 9.0 minutes. Furthermore, the HPLC system showed good repeatability (2.03% ROD for benzoic acid, and 1.90% ROD for sorbic acid).

The detection limits were 0.94 ppm and 0.038 ppm for benzoic and sorbic acids, respectively. The optimised SPE method proved to be very quantitative, robust and safe, allowing elimination of

4 numerous interferences and achieving an adequate concentration factor. Validation on real samples showed that it can be applied to the analysis of Coca Cola samples. In the case of Monster samples, however, a high inaccuracy was observed, suggesting that the SPE procedure needs to be improved.

1. INTRODUCCIÓN/ANTECEDENTES

La adición de sustancias a los alimentos podría tener sus orígenes en el Paleolítico, debido a la experiencia de que la exposición al humo prolongaba su conservación. En el Neolítico se desarrollaron ciertas manipulaciones en los alimentos para hacerlos más apetecibles, como la adición de azafrán o cochinilla para alterar su sabor y color, o para aumentar el tiempo de conservación con otros componentes como la sal o el vinagre. No fue hasta finales del siglo XIX cuando se incluyó la palabra

“aditivo” para hacer referencia al uso de distintas sustancias para estos fines ¹.

En la actualidad los aditivos alimentarios se definen, según la AECOSAN (Agencia española de consumo), como “sustancias que se añaden a los alimentos con un propósito tecnológico (para mejorar su aspecto, textura, resistencia a los microorganismos, etc.) en distintas etapas de su fabricación, transporte o almacenamiento”. Los productos que los contienen deben estar correctamente etiquetados, indicando su aplicación en el apartado de ingredientes, y su uso está regulado y condicionado, permitiéndose únicamente si las características aportadas por ellos no se pueden conseguir de otra forma, no suponen un riesgo para la salud del consumidor en las cantidades presentes y no inducen a error al consumidor ².

Se clasifican mediante la letra “E”, que garantiza que el aditivo ha superado las pruebas de seguridad y ha sido aprobado para su uso en la Unión Europea, seguida de un número de tres o cuatro dígitos. El primero indica la categoría del aditivo (colorante, conservante…), el segundo se refiere a la familia del aditivo y el resto a la especie en concreto, facilitando así la identificación de la sustancia.

Por ejemplo, el carbonato potásico (E-501), es un aditivo de la familia de los acidulantes, indicado por su primer dígito; el 5, y actúa modificando la acidez o reforzando el sabor de los alimentos a los que se le añade ³.

Actualmente, los conservantes desempeñan un papel esencial en la industria alimentaria. Su composición puede ser de naturaleza orgánica u inorgánica y presentar distintos grupos funcionales.

Es muy importante que todas las sustancias empleadas como conservantes estén libres de todo tipo de toxicidad, sean fácilmente solubles, no modifiquen los sabores característicos de los alimentos, tengan capacidad antimicrobiana y sean económicas ⁴.

Alguno de los conservantes más usados son el ácido benzoico (E-210) y el ácido sórbico (E- 200), que serán objeto del presente trabajo.

5 Figura 1. Ácido benzoico (izquierda) y ácido sórbico (derecha)

El ácido benzoico (C7H6O2) se caracteriza por ser un sólido cristalino blanco parcialmente soluble en agua (figura 1, izquierda). Se usa, entre otros, en alimentos ácidos, como algunas bebidas refrescantes, encurtidos o jugos de frutas, como conservante antimicrobiano de código E-210.

Hay que tener especial cuidado respecto a su liberación al medio ambiente, ya que es potencialmente peligroso para éste. En humanos puede interferir en diversas rutas metabólicas, ya que inhibe enzimas como la triacilglicerol lipasa o la araquidonato 15-lipogenasa. En altas dosis, el uso de ácido benzoico puede volverse contraproducente, acumulándose en el organismo y causando acidosis metabólica, convulsiones e hiperpnea, y reacciones alérgicas. La ingesta diaria admisible (IDA) es de 5 mg/kg de peso corporal.

El ácido sórbico (C6H8O2) se presenta como polvo o cristales blancos (figura 1, derecha). No manifiesta cambios de color después de calentarlo unos 90 minutos a 105 ºC y presenta una solubilidad similar en agua a la del ácido benzoico ^5–7.

Como ya se ha citado previamente, se emplea como conservante de código E-202, tiene un gusto ligeramente ácido y un olor sutil. Se utiliza principalmente en algunas bebidas refrescantes, queso, pan, productos cárnicos secos ³… Es un compuesto de baja toxicidad, debido a que puede metabolizarse por la misma vía que otros ácidos grasos, pero en altas cantidades puede producir urticaria y dermatitis de contacto. Al ser menos tóxico que el ácido benzoico, la ingesta diaria admisible es de 25 mg/kg de cuerpo ⁷.

Figura 2. Estructuras en 3D y 2D del ácido benzoico (izquierda) y del ácido sórbico (derecha)

Una de las técnicas analíticas más comunes para la determinación de estos conservantes es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un detector Ultravioleta visible, aprovechando que

6 la presencia de dobles enlaces conjugados en la estructura de los compuestos analizados garantiza absorción de luz en zonas del espectro ultravioleta adecuadas, superiores a los 220 nm.

En esta técnica la muestra debe estar en forma de disolución, inyectándose un pequeño volumen de la misma en la fase móvil líquida que compone el sistema cromatográfico. Una vez comenzado el análisis, la fase móvil transporta la muestra a través de la precolumna, encargada de proteger a la columna de posibles contaminaciones, y de la columna analítica en la que se conseguirá separar los distintos analitos que contiene la muestra en función de sus respectivas distribuciones entre la fase móvil y la fase estacionaria ⁸.

La disposición de fase estacionaria/fase móvil de la columna determina el tipo de interacciones que puede formar el analito y el principio que regula la retención cromatográfica, originándose así los distintos modos cromatográficos existentes en HPLC: cromatografía en fase normal, en fase reversa, de intercambio iónico, y de exclusión molecular. En la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es un sólido adsorbente polar, la más usada consiste en silicagel cruda o derivatizada, y la fase móvil es un medio orgánico apolar o poco polar, siendo la adsorción la responsable de la retención. La cromatografía de intercambio iónico se centra en la separación de iones, la fase estacionaria es un intercambiador iónico (aniónico o catiónico), y la fase móvil suele ser de naturaleza acuosa. En este caso la retención se controla mediante la fuerza iónica. En cuanto a la exclusión molecular, cabe destacar que es una separación física, ya que la elución está regida por el tamaño molecular, siendo los analitos más pequeños los que eluyen más tarde. El modo cromatográfico utilizado en este trabajo es el de fase reversa, cuya fase estacionaria es no polar. La columna más típica es la C18, que consiste en moléculas de un hidrocarburo de 18 átomos de carbono enlazado químicamente a un soporte (sílica normalmente). La fase móvil es polar, típicamente combinaciones de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano y agua tamponada al pH más adecuado para la separación de las moléculas de interés. En fase reversa existen muchos factores que afectan a la retención. Unos están ligados a la columna, como la superficie específica y porosidad del sólido particulado, la densidad de fase introducida o el grado de entrecruzamiento de la misma, y otros a la fase móvil, como es el tipo y proporción de disolvente orgánico y el pH ⁹.

Para impulsar la fase móvil a través de la columna empaquetada se necesita una bomba capaz de proporcionar altas presiones, y de mantener un caudal constante ⁸. Finalmente, los analitos llegan al detector UV en este caso, configurado para detectar a un valor de longitud de onda de 254 nm (el rango adecuado en este análisis oscila entre los 210 y los 260 nm), gracias a éste se obtienen los datos, y se procesan en el ordenador.

Uno de los múltiples estudios para la determinación de los ácidos benzoico y sórbico fue realizado por Ferreira y colaboradores ¹⁰, que emplearon un HPLC equipado con un detector UV para la determinación de estos en mermelada de membrillo.

En ocasiones, la sensibilidad y selectividad proporcionada por la técnica HPLC puede no ser suficiente para resolver el problema analítico, por lo que puede ser preciso preconcentrar y aislar el analito. Para ello puede usarse la extracción en fase sólida (SPE), que es una técnica de preparación de muestras líquidas muy utilizada para aislar y concentrar analitos, limpiar muestras o adecuar el disolvente. En SPE la muestra líquida se percola a través de un lecho de sorbente (fase sólida), en el cual quedan retenidos los analitos; se aplica una fase de lavado para eliminar interferencias si es

7 necesario y, finalmente, se recuperan los analitos por elución usando una disolución líquida, previamente optimizada, para recuperar los analitos en su totalidad en el menor volumen posible.

En cuanto a la instrumentación utilizada en SPE, se usan unos dispositivos de cartucho típicos, generalmente desechables, que consisten en columnas cortas (de aspecto de una jeringa abierta), conteniendo un sorbente con un tamaño de partícula entre los 50 y 60 µm, empaquetado entre dos frits de plástico poroso. Una de las mayores ventajas de estos cartuchos es su facilidad de preparación en el laboratorio, lo que a la par conlleva un menor coste, siendo más económicos que los dispositivos de disco, que también se usan en este tipo de extracciones, aunque en este estudio no sean relevantes

11. Por ejemplo, Lozada y colaboradores ¹², desarrollaron un método analítico de preparación de muestras de alimentos para determinar óxidos de colesterol mediante cromatografía, utilizando como proceso de extracción y limpieza un procedimiento SPE ¹¹.

Los beneficios más destacados de la extracción SPE respecto a otros tipos de extracciones, como puede ser la extracción líquido-líquido (LLE) son el tiempo de análisis, coste y mano de obra reducidos, la reducción del consumo y eliminación de disolventes orgánicos, y el potencial de automatización de la técnica, que permite aumentar la productividad y realizar simultáneamente varias extracciones. Además de todo lo citado, permite un mayor factor de concentración y una selectividad elevada en el proceso de aislamiento.

También cabe destacar algún inconveniente de la SPE, como posibles taponamientos o pérdidas de analito por asociación con material coloidal ¹³.

Existen varios estudios donde se han combinado los dos métodos ya descritos, HPLC y SPE, para la determinación de los ácidos benzoico y sórbico, por separado o incluso junto algunos ácidos más.

Mikami y colaboradores ¹⁴, realizaron un análisis simultáneo de ácido benzoico, ácido sórbico, ácido deshidroacético y ácido salicílico en productos cosméticos mediante SPE y HPLC. Sin embargo, ellos emplearon un sistema HPLC Shimadzu, con un detector UV, y cartuchos Bond-Elut SI de 3 mL de capacidad y 500 mg de sorbente para la preparación de muestras, llevada a cabo por SPE.

Ittipon Techakriengkrai y Ranee Surakarnkul analizaron los ácidos benzoico y sórbico en vinos y destilados de arroz tailandeses combinando HPLC y SPE ¹⁵.

En el presente trabajo se desarrolla una etapa de limpieza y preconcentración de las muestras aprovechando las ventajas de la técnica SPE para estudiar la presencia de dos conservantes, el ácido benzoico (E-210) y el ácido sórbico (E-200), en bebidas refrescantes por HPLC-uv. Concretamente, se han analizado Coca Cola y Monster Energy, dos bebidas ácidas muy consumidas y en las que pueden estar presentes ambos aditivos. Ambos se obtienen mediante síntesis química, por lo que son considerados aditivos no naturales o sintéticos, de ahí que sea importante su control. Los ácidos conservadores, en su mayoría, son de este tipo ^4,16.

8 2. OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO DEL TRABAJO

El objetivo general es el desarrollo, optimización y validación de un método de extracción en fase sólida (SPE) para el aislamiento selectivo de ácido benzoico (E-210) y ácido sórbico (E-200) presentes en bebidas comerciales para su análisis cuantitativo posterior mediante HPLC.

Para lograr este objetivo se han abordado los siguientes objetivos específicos:

1. Desarrollo de un método HPLC que permita detectar y cuantificar los dos analitos de interés: ácido benzoico y ácido sórbico. Ello incluye la optimización de la composición de la fase móvil (proporción de disolventes y pH) con disoluciones patrón para conseguir una resolución adecuada entre los dos picos.

2. Desarrollo de un método basado en extracción en fase sólida (SPE) para aislar y concentrar las especies en muestras reales, llevándolas a fases analizables por HPLC.

3. Validación del método y aplicación a muestras reales.

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. REACTIVOS

En la tabla 1 se recogen algunos de los reactivos utilizados en los análisis. El metanol se usó con la finalidad de limpiar el sistema HPLC entre cada inyección, en forma de dilución 1:10. El ácido fórmico se usó para fijar el pH tanto en muestras como en el agua. Se usó agua ácida durante el acondicionamiento de los cartuchos SPE y para hacer análisis de blancos en HPLC. El potasio fosfato bipotásico, y el fosfato monopotásico se usaron en las proporciones adecuadas para preparar el tampón necesario para eluir en SPE. El pH 7 deseado en dicho tampón se consiguió mediante la adición de NaOH 1 M y NaOH 0,1 M ya preparados en el laboratorio.

Tabla 1. Especificaciones de los reactivos comerciales.

Fórmula molecular

Peso molecular

(g/mol) Pureza (%)

Densidad (g/cm³)

Casa comercial

Metanol CH3OH 32,04 99,9 0,792 Scharlau

Ácido fórmico CH2O2 46,03 98-100 1,22 Emsure

Potasio fosfato

bipotásico PO4HK2

174,2 100 - Probus

Fosfato monopotásico PO4H2K 136,09 100 - Probus

3.2. MUESTRAS, FASES MÓVILES Y DISOLUCIONES PREPARADAS

Reactivos: En la tabla 2 se encuentran los dos ácidos comerciales, que son objeto de estudio.

Sirvieron de referencia durante toda la optimización del método de HPLC, y también para el desarrollo de las condiciones adecuadas de la extracción en fase sólida (SPE).

9 Tabla 2. Especificaciones y características de los dos ácidos comerciales.

Fórmula molecular

Peso molecular

(g/mol)

Log P pKa

Pureza (%)

Casa comercial Ácido

benzoico C7H6O2 122,12 1,89

(hidrofóbico) 4,19

99,5 Aldrich Ácido

sórbico C6H8O2 112,13 1,35

(hidrofóbico) 4,76

≥ 99 Sigma

Los reactivos utilizados para la preparación de las fases móviles están agrupados en la tabla 3.

El sodio acetato 3-hidrato, de naturaleza sólida, se utilizó para preparar el buffer, junto con ácido acético, con el cual se ajustaba la disolución hasta llegar al pH deseado. El acetonitrilo proporcionaba la fuerza de elución necesaria para el análisis, además de servir también para proporcionar una fuerza de elución adecuada al eluir los analitos en la SPE. Y el agua Milli Q, además de usarse como agente de limpieza del sistema, también fue indispensable para la preparación de disoluciones, como agente diluyente, etc.

Tabla 3. Especificaciones de los reactivos implicados en la preparación de las fases móviles.

Fórmula molecular

Peso molecular

(g/mol) Pureza (%)

Densidad (g/cm³)

Casa comercial Sodio Acetato 3-

hidrato

CH3COONa·3

H2O 136,08 99-101 - Panreac

Ácido acético glacial CH3COOH 60,05 99,7 1,05 Panreac

Acetonitrilo CH3CN 41,05 99,9 0,786 Scharlau

Agua Milli Q H2O 18,02 ≥ 99 1 Millipore

Muestras: Las muestras reales analizadas fueron Coca Cola y Monster Energy, comprados en un supermercado.

Disoluciones: Se emplearon varias disoluciones para las diferentes etapas del desarrollo del método. Su preparación se indica a continuación.

Disolución A: 200 ppm de ácido benzoico y 6 ppm de ácido sórbico. Tanto la disolución madre como la disolución A fueron disueltas en fase móvil A (buffer de acetato de sodio con 16 % de acetonitrilo), no en agua, como es el caso de las demás.

Disolución B: 96,062 y 3,891ppm de ácido benzoico y sórbico, respectivamente, en agua.

Disolución C: 93,086 y 3,8203 ppm de ácido benzoico y sórbico, respectivamente, en agua.

10 3.3. INSTRUMENTACIÓN

Equipo: Se empleó un cromatógrafo de líquidos (HPLC) de Varian ProStar (figura 3), modelo 230, con número de serie 01260, equipado con una columna LiquidPurple ODS (3 µm 100 x 3 mm). El sistema estaba acoplado a un detector UV visible con número de serie 01288.

Condiciones cromatográficas: La separación cromatográfica se realizó en isocrático, con un flujo constante de 0,4 mL/min. Las fases móviles consistían en un buffer de acetato de sodio trihidratado como fase A durante la optimización, y una mezcla de este buffer con acetonitrilo una vez optimizado el sistema (premezclado). Como fase B se tenía acetonitrilo de alta pureza, y como fase C agua Milli Q. El detector UV fue configurado para detectar a un valor de longitud de onda de 254 nm (el rango adecuado para este tipo de análisis oscila entre los 210 y los 260 nm). El volumen de inyección (loop) era de 10 µL. Después de cada inyección, el inyector se lavó con una disolución 1:10 (metanol:agua), eliminando posibles restos del análisis anterior.

Figura 3. Instrumento HPLC.

3.4. METODOLOGÍA

3.4.1. Optimización de la resolución de los picos de ácido benzoico y ácido sórbico

Disoluciones para la optimización: Sus concentraciones son de unos 100 ppm de ácido benzoico y 3 ppm de ácido sórbico, concentraciones suficientes para dar una señal apreciable que permita la obtención de los parámetros nombrados. Son concentraciones aproximadas, ya que su propósito es el estudio de los tiempos de retención y factores de retención (k’), cuyos valores dependen de la concentración.

Se comenzó realizando un análisis con la fase A (buffer con acetato de sodio 0,05 M) a distintos pH (4,4, 3,4 y 4,6), y para cada pH se varió la fuerza de elución. Ésta se optimizó mediante la modificación del porcentaje de fase B (acetonitrilo).

La elección de los pH de trabajo, para lograr una buena separación, se realizó de manera que fuera un pH intermedio entre los valores de los pKa de los ácidos (pKa ácido benzoico = 4,19 y pKa ácido sórbico

= 4,76), estando así el ácido benzoico mayormente en su forma desprotonada, y el sórbico en su mayoría en la protonada.

Estudio de la repetibilidad del sistema HPLC

Este estudio se realizó mediante la inyección repetida de la disolución A, llegando a analizar un total de 4 inyecciones.

11 3.4.2. Estudio de la linealidad del sistema HPLC: obtención de la curva de calibrado

Disoluciones de calibrado: Se prepararon seis disoluciones de calibrado que contenían ambos analitos en distintas concentraciones, todas ellas conocidas con exactitud. Estas disoluciones se prepararon con disolución de fase móvil como disolvente y se inyectaron por duplicado. Se comenzó haciendo la más concentrada (disolución 6), y a partir de ésta se prepararon las demás, en las proporciones indicadas en la tabla 4.

Disolución 6 (249,096 ppm ácido benzoico y 12 ppm ácido sórbico): disolución de partida; 6 mL de ácido benzoico 1037,90 ppm y 6 mL de ácido sórbico de 50 ppm.

Tabla 4. Volúmenes necesarios para la preparación de las disoluciones, y concentraciones exactas de estas

Volumen disolución 6 (mL)

Volumen final (mL)

Concentración ácido benzoico

Concentración ácido sórbico

Disolución 1 1 20 12,45 0,6

Disolución 2 1 10 24,91 1,2

Disolución 3 2 10 49,82 2,4

Disolución 4 4 10 99,64 4,8

Disolución 5 3 5 149,46 7,2

3.4.3. Cálculo del límite de detección del sistema HPLC

Se calculó con ayuda de la disolución 6 del calibrado, midiendo la altura máxima y mínima del ruido o variación de la línea base en su cromatograma. Con ayuda de estos valores y el dato exacto de la concentración de la disolución 6 se pudo hallar el límite de detección mediante la ecuación 1.

𝐿𝐷 = 3 · 𝐶𝑝𝑖𝑐𝑜

𝛥(𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑟𝑢𝑖𝑑𝑜)

𝛥(𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑝𝑖𝑐𝑜) (1)

3.4.4. Cálculo del volumen de ruptura del sistema SPE

Para aplicar la extracción en fase sólida (SPE) se dispuso de cartuchos SPE Sep-Pack C18, que contenían 200 mg de fase. Estos cartuchos fueron acondicionados sucesivamente con 4 mL de metanol y 4 mL de agua Milli Q, a pH 2,6. Una vez realizado el acondicionamiento, se percoló a su través la disolución preparada (disolución B), y se recogieron pequeñas fracciones de volumen conocido (0,6, 1,2 ó 2,4 mL), siendo analizadas seguidamente por HPLC hasta que se obtuvo una elución completa de los dos ácidos.

3.4.5. Optimización de la elución del sistema SPE

Se empleó un tampón fosfato a pH 7 para realizar la elución de las muestras.

12 Tampón fosfato: Se empleó fosfato dipotásico K2HPO4 (A^-) y fosfato monopotásico KH2PO4 para elaborar el tampón hidrogenofosfato (A^-)/dihidrogenofosfato (AH) 0,01 M. Se preparó adicionando 0,65 g/L de A y 0,8048 g/L de B en agua Milli Q

Optimización etapa de elución: Los cartuchos de C18 se acondicionaron sucesivamente con 4 mL de metanol y 4 mL de agua Milli Q a pH 2,6. Acto seguido se cargaron 2 mL de una disolución de una concentración de 100 veces el límite de detección de los analitos (93,888 ppm ácido benzoico y 3,834 ppm ácido sórbico). Las concentraciones de las disoluciones percoladas no fueron exactamente las mismas en los 4 análisis (aproximadamente fueron las concentraciones de la disolución C).

Finalmente, se eluyó con agua tamponada a pH 7, realizando un total de 4 análisis. Cada uno estaba compuesto de tampón y distintos porcentajes de acetonitrilo, que fueron de 0, 5, 10 y 15 %, así se consiguieron estudiar distintas fuerzas de elución.

3.4.6. Optimización de la fase de lavado del sistema SPE

Inicialmente se hizo con una muestra sintética de características similares a las habituales (disolución C) para comprobar en qué fracción del lavado comenzaban a perderse los analitos.

A tal efecto se acondicionó la columna sucesivamente con 4 mL de metanol y 4 mL de agua Milli Q a pH 2,6, y posteriormente se cargó un volumen de muestra acidificada equivalente al 50 % del volumen de ruptura, a pH 2,6 con ácido fórmico. Como el volumen de ruptura era de 18 mL, se cargaron volúmenes de 9 mL. Estos se prepararon diluyendo 2 mL de la muestra sintética con 7 mL de agua ácida a pH 2,6, comprobando pH exacto.

Se comprobó la efectividad de dos fases de lavado; agua ácida a pH 2,6 con 15 y 10 % de acetonitrilo, recogiendo para cada una cinco fracciones de 0,6 mL.

3.4.7. Validación del método

Tras las diferentes etapas de optimización, se llevó a cabo la validación del método con muestras reales.

El método optimizado es como sigue. Se acondicionó el cartucho SPE sucesivamente con 4 mL de metanol y 4 mL de agua Milli Q a pH 2,6. A continuación se cargó la muestra diluida, que consistía en una disolución de 2 mL de Monster o Coca Cola (en su caso fortificada con analitos) diluidas con 7 mL de agua Milli Q a pH 2,6 y con 20 µL de ácido fórmico comercial (pureza 98-100 %) en el caso del Monster. Una vez percolada toda esta disolución, se lavó con 1,8 mL con una mezcla de agua Milli Q a pH 2,6 con el 10 % de acetonitrilo. Después del lavado se procedió a eluir con 1,8 mL de agua tamponada a pH 7 conteniendo el 10% de acetonitrilo.

Finalmente, se analizó la disolución obtenida, que contenía los dos analitos. Tuvieron que hacerse ciertas adaptaciones para que el ácido sórbico entrase dentro de la recta de calibrado, ya que su relación señal/concentración era muy alta. Para ello se cogieron 80 µL de la disolución obtenida, con una micropipeta, y se diluyeron con 1,92 mL de agua Milli Q a pH 2,6. Se inyectó esta disolución diluida por duplicado para el análisis del ácido sórbico, y la disolución directamente obtenida del cartucho, sin dilución, para el análisis del ácido benzoico, también por duplicado.

13 Para la fortificación, se añadieron en un matraz de 25 mL en el caso de la Coca Cola dopada, se aplicó un tratamiento similar al de una muestra normal, cogiendo 2 mL de ésta, ya dopada, y llevándola a un volumen final de 9 mL con pH 2,6 con ácido fórmico. Su preparación consistió en la adición de 1,820 mL de ácido sórbico (controlados por pesada de una disolución calibrada m/m) de ácido sórbico 51,761 ppm y 2,330 mL (controlados por pesada de una disolución calibrada m/m) de ácido benzoico 998,216 ppm, llevando la disolución combinada a un volumen final de 25 mL en un matraz aforado, con Coca Cola.

3.4.8. Ensayo de recuperación

Su finalidad es estudiar la capacidad del método analítico desarrollado, para determinar de manera cuantitativa las cantidades de los dos analitos adicionados a las muestras. Sus resultados se expresan generalmente en forma de porcentajes, y son muy útiles para evaluar la exactitud de dicho método.

Ambas muestras comerciales, de Coca Cola y Monster, se doparon con 93,888 ppm ácido benzoico y 3,834 ppm ácido sórbico. La diferencia fue que, en el caso del Monster, ya estaban presentes los analitos, pero en la Coca Cola no.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se partió de las condiciones experimentales de un estudio realizado por García y colaboradores

17. A partir de éste se fueron modificando según las necesidades del análisis.

4.1. OPTIMIZACIÓN DE LA RESOLUCIÓN DE LOS PICOS DE ÁCIDO BENZOICO Y ÁCIDO SÓRBICO Durante esta etapa se busca optimizar la separación, para obtener dos picos totalmente resueltos en el menor tiempo de análisis posible. Para ello se estudia el poder de elución de fases conteniendo acetonitrilo:agua en proporciones crecientes de acetonitrilo. El acetonitrilo es el disolvente activo y proporciona una gran fuerza de elución, siendo capaz de eluir casi todos los compuestos retenidos en una fase reversa. Se espera que un mayor porcentaje de acetonitrilo implique menor retención y análisis más cortos.

Sin embargo, como se ha comentado anteriormente, para lograr una buena separación de estos ácidos, es necesario también una optimización del pH. Es importante trabajar en un pH intermedio entre los valores de los pKa de los ácidos ya que en este intervalo de pH se obtienen las mayores variaciones en la proporción de formas protonadas/deprotonadas de ambos ácidos. Ya que las formas ácidas neutras son las únicas retenidas en fase reversa, cabe esperar que en estos intervalos de pH se consiga la máxima diferencia de retención relativa entre ambos ácidos. Por lo tanto, se comenzó a trabajar a un pH de 4,4; justo entre los dos valores de pKa. Se comprobó si era efectivo este pH con distintas proporciones de fase A y B y se estudió la variación de los tiempos de retención de los picos y su resolución. Un parámetro esencial es el denominado factor de retención (k’), que expresa la relación existente entre el número de moléculas de analito en la fase estacionaria y en la fase móvil

14 durante el proceso cromatográfico. Es decir, cuanto mayor factor de retención, más retenido es el analito y mayor tiempo de retención. En la figura 1 de los anexos se puede ver la variación de la retención en función de la proporción de acetonitrilo de la fase móvil.

En la tabla 5 se observan los tiempos de retención de los analitos a pH 4,4 con diferentes porcentajes de acetonitrilo (20, 30 y 40 %). En todos los análisis el analito menos retenido (menor tiempo de retención), es el ácido benzoico. Se comprobó experimentalmente inyectando por separado disoluciones patrón de cada analito por separado. En cuanto a las resoluciones, se obtienen mediante la diferencia de los tiempos de retención, dividida entre la anchura de pico promedio.

Tabla 5. Resultados al inyectar una de las disoluciones para la optimización (100 ppm ácido benzoico y 3 ppm de ácido sórbico a pH 4,4 con ácido acético glacial.

Ácido benzoico Ácido sórbico

%

acetonitrilo tr (min) k' Anchura

(min) tr (min) k'

Anchura (min)

Resolución picos

t0

(min)

40 2,452 0,3877 - 2,647 0,4981 - Superpuestos 1,767

30 2,967 0,6793 0,5142 3,405 0,9268 1,046 0,56

20 4,587 1,596 1,265 5,89 2,334 1,733 0,87

En la tabla 6 se reflejan los resultados a pH 3,4, con los mismos porcentajes de acetonitrilo que en el experimento anterior (tabla 4), pero ajustando el pH con ácido fórmico. En este caso la resolución fue nula, tanto así que solo se observaba un pico más intenso, resultante del solapamiento de los picos de los dos ácidos. Por ejemplo, para el 20 % de acetonitrilo el pico del ácido benzoico sale al minuto 4,5874, y el del ácido sórbico al minuto 5,8904, siendo esta diferencia de tiempos insuficiente para realizar un análisis cuantitativo. Esto se ve claramente en el cromatograma obtenido, correspondiente a la figura 2 de los anexos, y en las resoluciones, que en este caso no tienen lugar, ya que los picos se solapan totalmente en todos los experimentos.

Tabla 6. Tiempos de retención de una disolución 100 ppm ácido benzoico y 3 ppm ácido sórbico en disolución conjunta y por separado, a pH 3,4 con ácido fórmico al 98 %.

Ácido benzoico Ácido sórbico

% acetonitril

o

tr (min) k'

Anchura tr (min) k' Anchura

Resolución

picos t0 (min) 40 3,073 0,7388

- 3,022 0,7104 -

Superpuesto

s 1,767

30 4,123 1,333

- 4,147 1,347

-

Superpuesto s

20 7,72 3,369

- 7,781 3,404

-

Superpuesto s

Los resultados anteriores reflejan que el pH idóneo está más cercano a pH 4,4 que a pH 3,4 y que los mejores resultados se obtienen a porcentajes de acetonitrilo alrededor del 20%. Por esta razón se estudió un pH de 4,6 y un rango de porcentajes de acetonitrilo de 20 y 15 %, para observar si la separación era mejor. En la tabla 7 se exponen los datos obtenidos para un análisis a pH 4,6, que se

15 encuentra entre los dos valores de pKa de los dos analitos, estando el ácido benzoico en su mayor parte desprotonado, y el ácido sórbico mayormente protonado, y facilitando de esta manera la separación.

En la realización de este análisis se observó una gran inestabilidad de la línea base. Una de sus posibles causas pudo ser el sistema de mezclado del cromatógrafo, pudiéndose evitar realizando la mezcla de fases móviles de manera externa. Es decir, mezclando el porcentaje de acetonitrilo deseado con buffer de acetato de sodio trihidratado directamente en la botella de la fase A.

Tabla 7. Resultados al inyectar disolución 100 ppm ácido benzoico y 3 ppm ácido sórbico, a pH 4,6 ajustado con ácido acético glacial.

Ácido benzoico Ácido sórbico

% acetonitril

o

tr (min) k'

Anchura tr (min) k' Anchura

Resolución

picos t0 (min)

20 3,946 1,233 1,031 5,261 1,978 1,098 1,24 1,767

15 5,097 1,885 0,9686 7,482 3,234 1,552 1,89

Sin tener en cuenta este problema de inestabilidad de la línea base, se determinó que la resolución mejoraba considerablemente al trabajar con el 15 % de acetonitrilo y pH 4,6, siendo incluso superior a la requerida. Por este motivo se repitió el análisis con el mismo pH y porcentajes algo más altos de acetonitrilo, con el fin de acortar el análisis, e inyectando también mayores concentraciones de los analitos para reducir la proporción de ruido.

Se estudiaron distintas proporciones de acetonitrilo (16, 18 y 20 %) para este mismo valor de pH, y se recogen en la tabla 8.

Tabla 8. Resultados al inyectar disolución 200 ppm ácido benzoico y 6 ppm ácido sórbico a pH 4,6 con ácido acético glacial.

Ácido benzoico Ácido sórbico

% acetonitril

o

tr (min) k'

Anchura tr (min) k' Anchura

Resolución

picos t0 (min)

20 4,147 1,347 1,324 5,482 2,102 1,395 0,982 1,767

18 4,699 1,659 1,151 6,386 2,614 1,411 1,32

16 5,286 1,991 1,116 7,368 3,17 1,893 1,38

En vista de los resultados obtenidos, el porcentaje de acetonitrilo escogido para el análisis fue del 16%. Se llegó a esta conclusión de manera cualitativa, observando el cromatograma obtenido.

También se evaluó mediante los tiempos de retención recogidos en la tabla 8, donde se observó el primer pico (ácido benzoico) a los 5,286 minutos, y el segundo (ácido sórbico) a los 7,368 minutos.

Finalmente, se comprobó que la resolución era la suficiente (1,384), tal como se refleja en la tabla.

Para evitar la inestabilidad de la línea base, en lo sucesivo, se decidió mezclar el 16 % de acetonitrilo con buffer de acetato de sodio trihidratado y se puso esta mezcla en el lugar de la fase A.

16 4.2. ESTUDIO DE LA REPETIBILIDAD

Para estudiar la repetibilidad, se inyectó por cuadruplicado una misma disolución (disolución A), con el fin de examinar la variación de los tiempos de retención de los analitos y de sus formas.

En la tabla 9 se recogen todos los resultados procedentes del análisis de repetibilidad, donde se expresan los datos cuantitativos de las áreas de los dos analitos, sus medias y desviaciones estándar relativas (DER), estas últimas en porcentaje. Estos valores de la desviación (DER), son bajos, lo que indica que los resultados fueron bastante repetibles.

Tabla 9. Resultados obtenidos en el estudio de repetibilidad.

Área réplica 1

Área réplica 2

Área réplica 3

Área réplica 4

Desviación

estándar (s) Promedio % DER Ácido benzoico

(tr = 4,8598 min) 10561640 10511029 10749124 10887880 173710 8576676,67 2,03 Ácido sórbico

(tr = 6,7676 min) 9697966 9671293 9876143 9987070 150006 7876495,68 1,90

4.3. ESTUDIO DE LA LINEALIDAD: OBTENCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRADO

Para estudiar la linealidad del análisis, se realizó una recta de calibrado para cada analito. Cada disolución fue inyectada por duplicado.

En la tabla 10 se encuentran las áreas absolutas de cada réplica y de cada disolución.

Tabla 10. Resultados de la doble inyección para la construcción de la curva de calibrado.

Disolución 1

Disolución 2

Disolución 3

Disolución 4

Disolución 5

Disolución 6

Ác.benzoico

Concentración

(ppm) 12,45 24,91 49,82 99,64 149,5 249,1

Réplica 1 600624 1266510 2588516 4395746 7963805 13694487 Réplica 2 614484 1276747 2794156 4629179 8185034 13735919 Promedio 607554 1271628,5 2691336 4512462,5 8074419,5 13715203

Ác.sórbico

Concentración

(ppm) 0,6 1,2 2,4 4,8 7,2 12

Réplica 1 987246 1877964 3946203 6657867 12045944 20775960 Réplica 2 1007571 1883226 4170609 7001048 12350064 20696390 Promedio 997408,5 1880595 4058406 6829457,5 12198004 20736175

A partir de los valores medios de las áreas de las dos inyecciones se construyeron las rectas de calibrado, que relacionan la señal obtenida experimentalmente, en forma de áreas de los picos, con la concentración de cada analito. Las rectas de calibrado se encuentran en la figura 4, para el ácido benzoico, y la figura 5, para el ácido sórbico.

17 Figura 4. Recta de calibrado del ácido benzoico.

Figura 5. Recta de calibrado del ácido sórbico.

Puede apreciarse que la linealidad es satisfactoria, con un coeficiente de determinación (R²) de 0,9945 en ambas rectas de calibrado. El coeficiente de determinación expresa el % de la varianza Y explicada en la regresión.

Con ayuda de las ecuaciones de ambas rectas, obtenidas a partir de los gráficos representados en las figuras 4 y 5, se cuantificaron las cantidades de ambos ácidos contenidas en muestras reales, mediante interpolación.

y = 55216x - 241624 R² = 0,9945

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000

0 50 100 150 200 250 300

SEÑAL

CONCENTRACIÓN

ÁCIDO BENZOICO

y = 1731056x - 352626 R² = 0,9945

0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000

0 2 4 6 8 10 12 14

SEÑAL

CONCENTRACIÓN

ÁCIDO SÓRBICO

18 4.4. CÁLCULO DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DEL SISTEMA HPLC

“El límite de detección (LD) se define habitualmente como la cantidad o concentración mínima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un método analítico determinado” ¹⁸. De esta manera, las concentraciones más bajas que es capaz de detectar el equipo HPLC corresponden a los límites de detección expresados. El cálculo del límite de detección viene dado por la ecuación 1, que ya había sido expuesta en el punto 3.4.4:

𝐿𝐷 = 3 · 𝐶𝑝𝑖𝑐𝑜

𝛥(𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑟𝑢𝑖𝑑𝑜)

𝛥(𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑝𝑖𝑐𝑜) (1) Fue calculado con ayuda del cromatograma de la disolución número 6 del calibrado, de concentración conocida:

𝐿𝐷 á𝑐. 𝑏𝑒𝑛𝑧𝑜𝑖𝑐𝑜 = 3 · 249,096𝑚𝑔 𝐿 ·

(88,5 − 1,76 µ𝐴𝑈) · 1 𝑚𝐴𝑈 1000 µ𝐴𝑈

69,1 − 0,0609 𝑚𝐴𝑈 = 0,93888𝑚𝑔 𝐿

𝐿𝐷 á𝑐. 𝑠ó𝑟𝑏𝑖𝑐𝑜 = 3 · 12𝑚𝑔 𝐿 ·

(88,5 − 1,76 µ𝐴𝑈) · 1 𝑚𝐴𝑈 1000 µ𝐴𝑈

81,5 − 0,0609 𝑚𝐴𝑈 = 0,03834𝑚𝑔 𝐿

La diferencia entre los límites de detección de los dos ácidos es elevada, pudiéndose detectar concentraciones mucho más bajas de ácido sórbico que de ácido benzoico, ya que el primero absorbe mucha mayor intensidad de luz.

4.5. CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE RUPTURA DEL SISTEMA SPE

La determinación del volumen de ruptura del cartucho C18 de 200 mg, (cuyo volumen de lecho aproximado es de 0,3 mL; volumen muerto equivalente al 50 % del volumen de la columna, es decir, 0,15 mL) se hizo a partir de una disolución combinada conteniendo concentraciones 100 veces el límite de detección de cada analito (disolución B), siendo cargada ésta de manera continua. El volumen de ruptura es, por definición, “el máximo volumen de muestra que se puede pasar por el cartucho sin que la masa no retenida alcance una cierta cantidad de la masa total cargada (1, 5 o 10%)”. En la tabla 11 se recogen los valores de áreas absolutas de los analitos.

Tabla 11. Datos para la construcción de la curva de ruptura.

Fracción

Volumen total

Volumen fracción

Área benzoico

Área sórbico

V x área benzoico

V x área sórbico

1 0,6 0,6 0 0 0 0

2 1,2 0,6 0 0 0 0

3 1,8 0,6 0 0 0 0

4 2,4 0,6 0 0 0 0

5 3,6 1,2 0 0 0 0

6 4,8 1,2 0 0 0 0

7 7,2 2,4 0 0 0 0

19

8 8,4 1,2 0 0 0 0

9 9,6 1,2 0 0 0 0

10 10,8 1,2 0 0 0 0

11 12 1,2 0 0 0 0

12 13,2 1,2 0 0 0 0

13 14,4 1,2 0 0 0 0

14 15,6 1,2 16815 8164 20178 9796,8

15 16,8 1,2 32910 15455 39492 18546

16 18 1,2 33122 38246 39746,4 45895,2

17 19,2 1,2 366483 303767 439779,6 364520,4

18 20,4 1,2 622217 669520 746660,4 803424

19 21,6 1,2 1067461 1137820 1280953 1365384

20 24 2,4 1680022 1895406 4032053 4548974

21 26,4 2,4 2331003 3210238 5594407 7704571

En las figuras 6 y 7 se pueden observar los volúmenes de ruptura correspondientes a ambos analitos. Los valores máximos de las áreas; pertenecientes a las máximas concentraciones, cuando ya se había perdido toda la retención, fueron de 2331003 para el ácido benzoico y 3210238 para el ácido sórbico. Una fracción adecuada para que la masa no retenida en ambos analitos estuviera entre el 1 y el 10 % fue la fracción 16, correspondiente a 18 mL de volumen de disolución percolada, donde se obtuvo un área de 33122 para el ácido benzoico (1,42 % del total) y 38246 para el ácido sórbico (1,19

% del total). Por estas razones se determinó que el volumen de ruptura para el estudio era de 18 mL.

Figura 6. Curva de ruptura del ácido benzoico.

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Volumen fracción · área pico

Fracción

CURVA ÁCIDO BENZOICO

20 Figura 7. Curva de ruptura del ácido sórbico.

4.6. OPTIMIZACIÓN DE LA ELUCIÓN DEL SISTEMA SPE

Para lograr una buena optimización de la elución del cartucho SPE se preparó un medio neutro/alcalino con el fin de eluir únicamente los ácidos estudiados y similares. Éste estaba constituido por agua tamponada a pH 7 con una cierta cantidad de acetonitrilo (0, 5, 10 y 15 %), siendo esto último el objeto de estudio. Todos los datos correspondientes a las eluciones se recogen en las tablas 1, 2, 3 y 4 de los anexos.

Al representar el área del pico de cada analito multiplicada por el volumen de la fracción recogida para cada fracción, se obtuvieron una serie de gráficos. Éstos se encuentran recogidos de forma conjunta en las figuras 8 y 9 para el ácido benzoico y el ácido sórbico, respectivamente.

Figura 8. Optimización de la elución para el ácido benzoico.

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Volumen fracción · área pico

Fracción

CURVA ÁCIDO SÓRBICO

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000

1 2 3 4 5 6

Área pico x volumen fracción

Fracción

ÁCIDO BENZOICO

solo tampon 5 % acn 10% acn 15% acn

21 Figura 9. Optimización de la elución para el ácido sórbico.

Como se observa en las figuras 8 y 9, ambos analitos tardaban más en eluir con el 100 % de tampón, viéndose restos de los analitos hasta la cuarta o quinta fracción. Sin embargo, al ir aumentando el porcentaje de acetonitrilo hasta el 15 %, los analitos eluían antes, necesitando así menos volumen de elución.

Analizando los resultados de las eluciones concluimos que para el 10 % y el 15 % de acetonitrilo la elución era efectiva ya en las tres primeras fracciones. Teniendo en cuenta que las eluciones de los análisis iban a ser de 1,8 mL, volumen para el cual se podían realizar inyecciones por duplicado sin inconveniente, se decidió coger el del 10 % de acetonitrilo.

Por esta razón, el disolvente de elución compuesto por agua tamponada a pH 7 con 10 % de acetonitrilo fue elegida como el mejor eluyente. Además de ser el más adecuado, era la misma proporción de éste que en la fase de lavado, explicada más detalladamente en el apartado número 7.

4.7. OPTIMIZACIÓN DE LA FASE DE LAVADO

La fase de lavado se realizó con la finalidad de eliminar, en la medida de lo posible, cualquier sustancia diferente a los analitos presente en la muestra a fin de garantizar máxima limpieza y niveles mínimos de interferencias. Para ello, se empleó una disolución ácida a pH 2,6 y se estudiaron diferentes porcentajes de acetonitrilo (10 y 15%).

En la tabla 12 se recogen los resultados pertenecientes al lavado con agua Milli Q a pH 2,6 y 15 % de acetonitrilo. Los resultados muestran que en la primera fracción (0,6 mL) no existe pérdida de los analitos, pero en la segunda (0,6 mL) se observa que una parte de los analitos se extrae en esta fase de lavado, aunque la pérdida sea inapreciable respecto las de las siguientes fracciones.

Tabla 12. Lavado con agua ácida a pH 2,6 y 15 % de acetonitrilo.

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000

1 2 3 4 5 6

Área pico x volumen fracción

Fracción

ÁCIDO SÓRBICO

solo tampon 5% acn 10% acn 15% acn

Fracción

Volumen fracción

Área

benzoico Área sórbico V x área benz

V x área sórbico

1 0,6 0 0 0 0

2 0,6 11750 31893 7050 19135,8

22 En cambio, sustituyendo el lavado por uno que contenía el 10 % de acetonitrilo y pH 2,6, (tabla 13), se conseguían obtener tres fracciones de 0,6 mL sin pérdida alguna de los analitos. Esto indica que el lavado con agua ácida a pH 2,6 y 10 % de acetonitrilo parece el óptimo, siendo viable así lavar con un volumen de 1,8 mL, equivalente a las tres primeras fracciones recogidas en este

experimento.

Tabla 13. Lavado con agua ácida a pH 2,6 y 10 % de acetonitrilo.

4.8. VALIDACIÓN DEL MÉTODO

Uno de los procedimientos finales consiste en la comprobación de la validez del método desarrollado para el aislamiento, concentración y posterior determinación de los analitos en muestras reales (como la bebida energética Monster Energy, o la Coca Cola) que contengan o puedan contener ácido benzoico y ácido sórbico.

Esta última carece de ellos, pero sirve como base de estudio aplicándole un dopaje con los dos ácidos, ya que contiene otros muchos compuestos que interferirían en el análisis si la técnica se hubiera desarrollado mal.

Con la validación se comprueba si se pierden los analitos en el lavado, si terminan o no de eluir con el eluyente y volumen elegidos, y si verdaderamente es eficaz dicho lavado para eliminar gran parte de los compuestos presentes en las bebidas.

En el primer análisis del Monster se recogió el eluato de la muestra y, con el fin de comprobar que el proceso de preconcentración había sido exitoso, se volvió a eluir en otro cartucho siguiendo todos los pasos anteriores. Asimismo, también se recogieron las fases de lavado y se analizaron para confirmar que los analitos no se estaban perdiendo. Los análisis de la fracción de lavado y del eluato confirmaron que ambos compuestos se retuvieron de manera cuantitativa en el lecho SPE.

3 0,6 924566 2450310 554739,6 1470186

4 0,6 2924724 6749060 1754834,4 4049436

5 0,6 1985234 3922118 1191140,4 2353270,8

Fracción

Volumen fracción

Área

benzoico Área sórbico V x área benz

V x área sórbico

1 0,6 0 0 0 0

2 0,6 0 0 0 0

3 0,6 0 0 0 0

4 0,6 26798 94772 16078,8 56863,2

5 0,6 224409 765458 134645,4 459274,8

23 Tabla 14. Resultados del análisis del Monster Energy.

1º inyección

(área)

2º inyección

(área)

Promedio áreas

Concentración calculada

(incluye

dilución) Incertidumbre Ácido benzoico

Muestra 1 5157260 4818765 4988012,5 75,77 7,27 Muestra 2 4633640 4376788 4505214 68,77 7,28 Muestra 3 3262066 3007742 3134904 55,04 7,37 Ácido sórbico

(diluido)

Muestra 1 14144236 13963657 14053946,5 187,3 9,3 Muestra 2 14668686 14523663 14596174,5 194,3 9,4 Muestra 3 14842792 14741154 14791973 196,8 9,4

En la tabla 14 se recogen los resultados numéricos derivados del estudio del Monster. Se preparó una disolución de 2 mL de muestra en un total de 9 mL, la concentración e incertidumbre obtenidas en la plantilla fueron corregidas aplicando un factor de 1,6/2, ya que, por cada 2 mL de muestra percolada, se acababa obteniendo 1,6 mL de muestra eluida. Además, en el caso del ácido sórbico, al haber sufrido una dilución mayor para que así los resultados entrasen dentro de la recta de calibrado, se aplicó este factor y también 2000/90, ya que se diluyeron 90 µL en un volumen final de 2,0 mL (2000 µL) para su análisis.

Puede apreciarse que los resultados obtenidos en el caso del ácido benzoico son muy imprecisos, y que dicha imprecisión parece ser atribuida a un problema en la retención o elución de este componente en el proceso SPE, ya que la imprecisión afecta a los promedios de muestras diferentes. Esto sugiere que, a pesar de los aparentemente buenos resultados de los experimentos anteriores, hay un problema en el proceso SPE con este tipo de muestras.

En el caso de la Coca Cola, los resultados obtenidos se agrupan en las tablas 15 y 16, donde se expresan las concentraciones pertenecientes a ambos ácidos, junto a sus incertidumbres (tabla 15), y los errores relativos en base a las concentraciones teóricas presentes (tabla 16).

Tabla 15. Resultados del análisis de la Coca Cola dopada con 92,846 ppm de ácido benzoico y 3,763 ppm de ácido sórbico.

1º inyección

(área)

2º inyección

(área)

Promedio áreas

Concentración calculada (dilución ya

aplicada) Incertidumbre Ácido benzoico

Muestra 1 6341948 6280172 6311060 94,93 7,3 Muestra 2 5993395 6038134 6015764,5 90,67 7,3 Muestra 3 5944538 5905740 5925139 89,33 7,3 Ácido sórbico

(diluido)

Muestra 1 8911042 8905356 8908199 3,793 0,352 Muestra 2 8719836 8793310 8756573 3,742 0,352 Muestra 3 8646162 8430948 8538555 3,652 0,352

24 Tabla 16. Concentraciones teóricas de los analitos en la Coca Cola, y errores en relación a ellas.

Concentración

teórica Error (ppm) % error Ácido benzoico

Muestra 1

92,846

2,08 2,2

Muestra 2 2,18 2,3

Muestra 3 3,51 3,8

Ácido sórbico (diluido)

Muestra 1

3,763

0,03 0,80

Muestra 2 0,021 0,56

Muestra 3 0,111 2,9

En este caso, los resultados fueron muy satisfactorios desde el punto de vista cuantitativo.

Ya que en este caso se trata de concentraciones dopadas (estos analitos no se encuentraron en la coca cola analizada), los errores obtenidos nos dan una estimación directa de la exactitud del procedimiento, permitiendo establecer que para este tipo de muestras (coca cola) el procedimiento desarrollado está libre de sesgos.

5. CONCLUSIONES

En las condiciones HPLC empleadas, la mejor fase móvil fue la que contenía un 16% de acetonitrilo, disuelto en un buffer de acetato de sodio trihidratado, a un pH de 4,6 alcanzado con ayuda de ácido acético glacial.

Para un sistema SPE, formado por un cartucho desechable que contiene un sorbente adecuado empaquetado, se pueden extraer cuantita y selectivamente los analitos y llevar a cabo el proceso de lavado y concentración de las muestras.

La aplicación del método a muestras reales de Coca Cola ha permitido comprobar que el método desarrollado es cuantitativo y que proporciona resultados libres de sesgo.

En el caso de las muestras de Monster, sin embargo, se han encontrado problemas de reproducibilidad que sugieren que, para este tipo de muestras, la extracción SPE debe ser mejorada.

25 6. BIBLIOGRAFÍA

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(18) Boqué, R. EL LÍMITE DE DETECCIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO. 9.

27 ANEXOS

Figura 1 anexo. Cromatograma a pH 4,4 con ácido acético para el 20, 30 y 40 % de acetonitrilo.

Figura 2 anexo. Cromatograma a pH 3,4 con ácido fórmico para el 20 % de acetonitrilo.

28 Figura 3 anexo. Cromatograma a pH 4,6 con ácido acético para el 15 y 20 % de acetonitrilo.

Figura 3 anexo. Cromatograma a pH 4,6 con ácido acético para el 15 y 20 % de acetonitrilo.

29 Figura 4 anexo. Cromatograma obtenido en el estudio de repetibilidad.

Figura 5 anexo. Cromatograma resultante de superponer todos los del calibrado.

30 Tabla 1 anexo. Elución SPE con solo tampón (disolución 93,086 ppm ácido benzoico y 3,8203 ppm

ácido sórbico).

Fracción

Volumen

fracción Área benzoico Área sórbico

V x área benzoico

V x área sórbico

1 0,6 157669 0 94601,4 0

2 0,6 13687534 20023562 8212520 12014137

3 0,6 78737 793690 47242,2 476214

4 0,6 20204 45683 12122,4 27409,8

5 1,2 14081 30638 16897,2 36765,6

6 1,2 11159 20963 13390,8 25155,6

Tabla 2 anexo. Elución SPE con tampón y 5 % acetonitrilo (disolución 92,902 ppm ácido benzoico y 3,8033 ppm ácido sórbico.

Tabla 3 anexo. Elución con tampón y 10 % acetonitrilo (92,008 ppm ácido benzoico y 3,8148 ppm ácido sórbico).

Fracción

Volumen

fracción Área benzoico Área sórbico V x área benz

V x área sórbico

1 0,6 1611688 296990 967012,8 178194

2 0,6 12178965 21216652 7307379 12729991

3 0,6 17467 105630 10480,2 63378

4 0,6 0 0 0 0

Tabla 4 anexo. Elución con tampón y 15 % acetonitrilo (disolución con 93,086 ppm ácido benzoico y 3,8203 ppm ácido sórbico).

Fracción

Volumen

fracción Área benzoico Área sórbico

V x área benzoico

V x área sórbico

1 0,6 157669 0 94601,4 0

2 0,6 13687534 20023562 8212520 12014137

3 0,6 78737 793690 47242,2 476214

4 0,6 20204 45683 12122,4 27409,8

5 1,2 14081 30638 16897,2 36765,6

6 1,2 11159 20963 13390,8 25155,6

Fracción

Volumen

fracción Área benzoico Área sórbico

V x área benzoico

V x área sórbico

1 0,6 2575463 2344301 1545278 1406581

2 0,6 6630719 17969726 3978431 10781836

3 0,6 0 52302 0 31381,2

4 0,6 0 0 0 0