Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Agropecuarias
3-2-2010
Elaboración de un anticuerpo monoclonal contra Leptospira
Elaboración de un anticuerpo monoclonal contra Leptospira
interrogans serovar pomona
interrogans serovar pomona
Yuly Andrea Guerrero QuirogaUniversidad de La Salle, Bogotá Juan Carlos Villarraga Micolta Universidad de La Salle, Bogotá
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Guerrero Quiroga, Y. A., & Villarraga Micolta, J. C. (2010). Elaboración de un anticuerpo monoclonal contra Leptospira interrogans serovar pomona. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/
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ELABORACIÓN DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONTRA Leptospira interrogans serovar pomona
Autores:
GUERRERO QUIROGA YULY ANDREA VILLARRAGA MICOLTA JUAN CARLOS
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD CIENCIAS AGROPECUARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA
ELABORACIÓN DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONTRA Leptospira interrogans serovar pomona
Autores:
GUERRERO QUIROGA YULY ANDREA COD. 14041047 VILLARRAGA MICOLTA JUAN CARLOS COD. 14041043
Trabajo de Grado como requisito para optar por el título de Médico Veterinario
Director:
CÉSAR AUGUSTO DÍAZ ROJAS, Docente Facultad de Medicina Veterinaria
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD CIENCIAS AGROPECUARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
RECTOR HNO CARLOS GABRIEL GÓMEZ
RESTREPO
VICERRECTOR ACADÉMICO HNO FABIO HUMBERTO CORONADO
PADILLA
VICERRECTOR PROMOCIÓN Y DESARROLLO HUMANO
HNO CARLOS PABÓN MENESES
VICERRECTOR INVESTIGACIÓN Y TRANSFERENCIA
HNO MANUEL CANCELADO JIMÉNEZ
VICERRECTOR ADMINISTRATIVO DR. EDUARDO ANGEL REYES
DECANO FACULTAD CIENCIAS AGROPECUARIAS
DR. LUIS CARLOS VILLAMIL JIMÉNEZ
DIRECTOR PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA
DR. PEDRO PABLO MARTÍNEZ MÉNDEZ
NOTA ACEPTACIÓN
_________________________________ CESAR AUGUSTO DIAZ ROJAS Director Tesis
_________________________________ GERMAN RODRIGUEZ MARTINEZ Jurado 1
________________________________ ARLEN PATRICIA GOMEZ RODRIGUEZ Jurado 2
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a nuestro director de tesis Cesar Augusto Díaz, por darnos la oportunidad de realizar este proyecto y sobre todo por incentivar nuestro espíritu investigador. A la Universidad Nacional De Colombia, por brindarnos el espacio para realizar una parte de los experimentos para el proceso de la tesis. A la Universidad De La Salle, por permitirnos realizar este proyecto y por ser nuestro hogar durante la carrera que nos brindo mucha satisfacción y nuevos conocimientos.
Agradecimiento muy especial a Aquilino Rincón Sanchez auxiliar de laboratorio, Lesly Johana Moreno coordinadora laboratorio pequeños y Ernesto Dalmau docente medicina veterinaria. Quienes nos brindaron su apoyo en el proceso de laboratorio, siempre dispuestos a ayudar sin esperar nada a cambio y sobretodo de transmitir conocimientos y oportunidades para culminar con éxitos este proyecto.
“La ayuda al prójimo es la mano de Dios que se alarga en tu Brazo”
DEDICATORIA
JUAN CARLOS:
Este trabajo de grado lo dedico a mis padres que me apoyaron en todo momento y me permitieron con su esfuerzo y dedicación culminarlo satisfactoriamente, también a mi Compañero miguel que me hizo reír y disfrutar en los momentos más tensos. Pero también a mis profesores sin cuya guía y conocimiento no hubiera podido llevarlo a cabo.
YULY ANDREA:
Dedico este proyecto a mi abuelita Anita y a mi tio, por ser la base y los cimientos de lo que soy ahora; a mi mama y mi hermana por ser mi familia que es lo más importante para una persona; a Juan José por el apoyo y amor que me ha brindado en este proceso de transición entre estudiante y profesional; a esas personas que hacen posible que yo este acá en este momento; y a Juan Carlos por acompañarme en este camino universitario, que hoy terminamos; gracias por todas las cosas buenas que me han brindado.
“uno puede devolver un préstamo de oro, pero está en deuda de por vida con
INDICE GENERAL Pág. RESUMEN 1 ABSTRACT 3 INTRODUCCIÓN 4 MARCO TEÓRICO 7 LEPTOSPIRA 7
Generalidades del género Leptospira 7
Clasificación 7 Problemática en humanos 9 Patogenia de Leptospira spp 10 Sintomatología 11 Transmisión 12 Tratamiento 12
Pruebas diagnosticas para Leptospira spp 13
ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAbs) 16
Generalidades 16
Fusión celular 16
Clasificación anticuerpos monoclonales 17
Recientes aplicaciones 17
MATERIALES Y MÉTODOS 19
PROCEDIMIENTOS GENERALES 19
PROCEDIMIENTOS 19
Población estudio 19
Manejo y cuidado de animales de experimentación 20
Indicaciones de estrés y enfermedad que ocasionarían el
sacrifico del animal 21
Monitoreo de la respuesta del anticuerpo 21
ELISA-DOT 21 ELISA indirecto 22 MAT 23 Antígeno 23 Cepas 23 Preparación inoculo 24
Extracción por sonicado 24
Inmunización 25
Fusión celular 25
Células mieloma 26
Descongelación células 26
Prueba viabilidad células mieloma 26
Fusión 26
Contaminación 28
Hibridomas 28
RESULTADOS 29 Inoculo 29 Inoculación 29 Fusión 30 Esplenocitos 30 Células mieloma 30 Post-fusión 31 Ratón P1 32 Densidad hibridomas 32 Viabilidad Hibridomas 32 Contaminación 33 Detección Anticuerpos 33 DISCUSION 34 Preparación de antígeno 34
Selección del adyuvante 35
Protocolo de inoculación 35
Fusión 36
Post-fusión 37
Prueba de detección de los Anticuerpos 38
CONCLUSIONES 40
REFERENCIAS 43
INDICE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Clasificación de las leptospiras 8
Tabla 2. Número total esplenocitos 30
Tabla 3. Resultados células mieloma 31
INDICE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Leptospira spp vista en campo oscuro 9
Figura 2. Comportamiento serológico de la Leptospira spp 13
Figura 3. Lugar mantenimiento animales 20
Figura 4. Ratón sacrificado 27
Figura 5.Evaluacion macroscópica post fusión 28
Figura 6. Resultados prueba ELISA-DOT 30
Figura 7. ELISA-DOT 31
Figura 8. Viabilidad hibridomas 32
Figura 9. Contaminación 33
INDICE ANEXOS
pág.
ANEXO 1: MEDIOS Y SOLUCIONES
PREPARACION MEDIO EMJH (100ml) 52
PREPARACION MEDIO RPMI – 0 52
SOLUCION AMORTIGUADORA DE FOSFATOS (SSAF) (500ml) 53
PEROXIDASA 53
SUSTANCIA BLOQUEADORA 53
SOLUCION LAVADO 54
SOLUCION REVELADORA 54
RESUMEN
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial, más común en áreas tropicales donde las condiciones para su transmisión son favorables. Su incidencia a nivel mundial depende del clima, los reservorios, y su vigilancia; pero en Colombia estos índices no son bien valorados por la falta de investigaciones certeras en el tema.
Es considerada una enfermedad ocupacional que afecta a personas que se dedican a la agricultura, limpieza de desagües, minería y aquellos que tienen contacto con animales como los trabajadores de famas y los veterinarios (Céspedes M, et.al, 2003; Slak A, et.al, 2007), sin contar que puede ser trasmitida por gran variedad de vectores como el agua y los roedores, aumentando de esta manera el riesgo de infección y propagación de la Leptospira spp.
La técnica diagnóstica más utilizada para leptospirosis es la “Técnica de Aglutinación Microscópica” (MAT), esta prueba serológica detecta anticuerpos IgM, describe brotes recientes y puede distinguir animales infectados de animales vacunados sí se realizan muestreos pareados. Se encuentra otra serie de pruebas en el mercado, pero de especificidad y sensibilidad variables, por lo cual es necesaria la creación de nuevas técnicas que propendan por un mejor diagnóstico, eficaz, rápido y certero.
El presente estudio llevó a cabo los procedimientos para intentar desarrollar un anticuerpo monoclonal específicos para Leptospira pomona. Para esto se prepararon antígenos de tipo sonicado y crudo, estos fueron
inoculados a ratones Balb/c con seguimiento serológico para ver los títulos de anticuerpos producidos. Posteriormente los ratones fueron sacrificados y se extrajo el bazo para tomar los esplenocitos que se fusionaron con células de Mieloma, obteniendo de esta manera una gran cantidad de hibridomas, los cuales resultaron no reactivos a Leptospira pomona.
ABSTRACT
Leptospirosis is a worldwide zoonosis, more common on tropical areas where transmission conditions are favorable. Its worldwide incidence depends on the climate, vigilance and reservoirs, but in Colombia this indices are not well value due to the lack on specific investigation.
It is consider an occupational sickness that affects people who works on agriculture, minery and cleaning waters, and those who have contact with animals as veterinarians and butchers. Its huge variety of vectors as water and rats increase the risk of infection and make leptospirosis an easy propagation sickness.
The more frequently diagnostic test is Microscopic Agglutination Test (MAT), because is easy to perform and it has a low price. There are other tests on the market but its low specificity and multiple problems, establish the need of new techniques with better speed, and more accurate results.
The present study gave up the procedures to develop monoclonal antibodies specific for Leptospira pomona. The antigens were prepare by sonicate and crude antigen and were inoculate to Balb/c mice’s. These mice’s were sampled for antibody titles and were slaughtered to extract the spleen. The splenocytes were fused with myeloma cells obtaining a large quantity of hibridomas, that were not reactive to Leptospira pomona.
INTRODUCCIÓN
Es de vital importancia para ciencias como la medicina veterinaria, tener métodos por los cuales se diagnostique eficaz y tempranamente problemáticas que ponen en peligro la salud de los seres humanos y animales.
La Leptospira spp es un agente microbiológico que causa grandes pérdidas económicas y afecta la salud tanto de personas como de animales; llegando a ser reconocida como la zoonosis de mayor difusión mundial (Cacchione R, 2004) aún sin tener claro su desempeño y desconociendo el alcance de la misma; ya que se caracteriza por tener sintomatología inespecífica que la indiferencia de patologías reproductivas tales como la Diarrea Viral Bovina (DVB) y la Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR) (Caicedo C, 2006; Ahumada C y Huerta J, 2006) y se desconoce su impacto económico por los numerosos casos que han sido mal diagnosticados y la subestimación de la problemática(Delgado J y Vargas M, 2006).
De acuerdo con la casuística del centro de investigaciones en salud y producción animal CEISA, y a los resultados serológicos examinados en 1993, la presencia de la Leptospira spp en el país muestra resultados significativos al obtener cifras superiores a las encontradas para la brucelosis y otras enfermedades de origen bacteriano, (Gallego M,1994) lo cual indica que la leptospirosis es una enfermedad sobre la cual deben orientarse y ejecutarse campañas de control y divulgación apropiadas que salvaguarde un valor primario que es la vida misma.
En razón a que esto suceda es esencial que el médico además de identificar los síntomas y asociarlos a la patología, tenga una herramienta para comprobar el diagnóstico y de esta manera poder ofrecer un tratamiento efectivo. Con la leptospirosis esto no ocurre ya que no se practica una vigilancia epidemiológica adecuada, dificultando la obtención de información real del panorama actual de la enfermedad y sus aspectos en la salud pública (Guzmán A y Pachón R, 2005).
En la actualidad, se pueden encontrar varias pruebas para diagnosticar leptospirosis; entre ellas sobresalen la prueba de la aglutinación macroscópica que tiene poca especificidad y sensibilidad por lo cual se utiliza como prueba tamiz (Caicedo C, 2006; Ahumada C y Huerta J, 2006) y la aglutinación microscópica, que es la prueba serológica más común para diagnóstico en bovinos, detecta anticuerpos IgM.
Pero según algunas referencias, se necesita de la búsqueda de nuevas técnicas más certeras ya que con este método, es necesaria más de una muestra para comprobar el diagnóstico debido a que los anticuerpos se mantienen por largo tiempo en el organismo por lo cual no se puede diferenciar una infección reciente de una antigua (Caicedo C, 2006) y presenta el gran inconveniente de manejar serovares vivos de la Leptospira y su sensibilidad depende de la capacidad de respuesta inmune del hospedador, de la patogenesidad del agente y de la fase de infección (Ahumada C y Huerta J, 2006). Es necesario un método rápido e inicial en el diagnóstico de leptospirosis (Céspedes M, et al, 2002).
Con este trabajo se busca colaborar con el avance de nuevos métodos de diagnóstico precoz de la enfermedad; aportando pautas importantes en el desarrollo de anticuerpos monoclonales, los cuales pueden emplearse para identificar o aislar cantidades mínimas de antígenos específicos (Smith C & Wood E, 1998, Tungtrakanpoung et al, 2006); el anticuerpo elegido puede
producirse en las cantidades necesarias para las futuras investigaciones y pruebas evitando la importación y disminuyendo de esta manera los costos de realización de la prueba diagnóstica, por lo cual servirán no solo para la técnica, sino para otros medios de diagnóstico posteriores (Guerrero D y Henao L, 2005).
MARCO TEÓRICO
LEPTOSPIRA.
Generalidades del género Leptospira: La Leptospira spp es una
espiroqueta Gram negativa con forma de hélice flexible; pertenece al orden spirochaetales, especie Leptospira y se caracteriza por ser oxidasa, catalasa y peroxidasa positivo (Slak A, et.al, 2007; Vadillo M, 2002); tiene una longitud de 6 a 20 micras y un diámetro de 0,1 micra, es sensible a la desecación, a los ácidos, al fenol, a los detergentes y a los desinfectantes, además de ser resistente a los tratamientos térmicos de 50-55 grados durante 30-60 minutos (Vadillo M, 2002).
Clasificación: La Leptospira se puede categorizar en 17 especies,
estas a su vez pueden ser divididas en patógenas y saprofitas; las leptospiras patógenas incluyen los géneros interrogans, kirschneri,
santarosai, weilii, alexanderi, borgpetersenii, genomospecies1 y noguchii;
adicionalmente un sistema taxonómico las clasifica por serovares de los cuales más de 200 han sido descritos (Slack A, et al, 2007).
El serogrupo pomona está dividido en pomona, mozdok, tsaratsovo,
Tabla 1. Clasificación Leptospiras.
spp Serogrupos Serovariedades Especie
Interrogans Bovina Porcina Canina Equina Ovina Roedora Australis australis x bangkok x bratislava x x x wewak x Autummalis autummalis X Bataviae bataviae x X Canicola canicola x x x X Icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae x x x x X copenhageni x x X Pomona pomona x x x x cornelli x kennewicki x Sejroe medanensis x saxkoebing x Borgpetersenii Ballum ballum X Javanica 52-73 x Sejroe balcanica x hardjo x sejroe x X Tarassovi tarassovi x tunis x yunxian x Santarosai Hebdomadis goiano x Sanmartini x Mini szwajizak x Pomona dania x Sejroe guaricura x Shermani babudieri x Tarassovi aguatica x Kirschneri Autumnalis bim x Canicola galtoni x Grippotyphosa Grppotyphosa x x x X
Problemática en humanos: La leptospirosis es una zoonosis de
distribución mundial, más común en áreas tropicales donde las condiciones para su transmisión son favorables. Su incidencia a nivel mundial depende del clima, los reservorios, y la vigilancia, en países como Barbados, Brasil y Nueva Caicedonia se tienen títulos altos mientras Australia y la mayoría de países desarrollados manejan títulos bajos.
Es considerada una enfermedad ocupacional que afecta a personas que se dedican a la agricultura, limpieza de desagües, minería y aquellos que tienen contacto con animales como personal de manejo en fincas, frigorificos y veterinarios (Céspedes M, et al, 2003; Slak A, et al, 2007).
En el ámbito médico se ha visto un escaso interés, debido que en la mayoría de los casos se presenta con escasa sintomatología, e incluso pasa como una enfermedad inaparente. Sin contar con que además existe la receta indiscriminada de antibióticos por parte de los clínicos al identificar en el paciente la elevada fiebre inicial presentada en los casos de leptospirosis, con lo que queda enmascarado el imprescindible diagnóstico de laboratorio (Saiz L, 1976; Sirimanote P, et al, 2008), además la falta de pruebas de diagnóstico adecuadas hacen que se confunda con enfermedades como la
Salmonelosis, Dengue y Rikettsias que presentan manifestaciones clínicas
indiferenciables (Sirimanote P, et al, 2008).
Patogenia de Leptospira spp: El período de incubación de la Leptospira spp es de 7 a 26 días, con un promedio de 12 días. El
microorganismo penetra a través de la piel reblandecida y alcanza rápidamente el torrente sanguíneo, diseminándose a todos los órganos, incluyendo líquido cefalorraquídeo (LCR) y humor acuoso (Céspedes M, 2005).
Los órganos más frecuentemente afectados incluyen el hígado, el riñón, el cerebro y los músculos. En el hígado se presenta una disfunción hepática que se manifiesta por la disminución de la excreción de la bilirrubina como alteración más frecuente, disminución de los niveles de albúmina sérica, incremento de los niveles de inmunoglobulinas y disminución en la producción de los factores dependientes de la vitamina K (Céspedes M, 2005).
A nivel renal se presenta una necrosis tubular aguda, causada por efecto directo de la Leptospira spp sobre el tejido renal, la hipoxia o el depósito de complejos antígeno-anticuerpo-complemento en los glomérulos (García J, 1997).
En los músculos, las alteraciones varían desde inclusiones vacuolares en las miofibrillas e infiltrado discreto de polimorfonucleares en el tejido muscular (García J, 1997).
Después de la primera semana, aparecen los anticuerpos en sangre y coinciden con el desarrollo de meningitis, caracterizado por diversos grados de edema con manguitos inflamatorios mononucleares perivasculares y pequeños trombos capilares, atribuible a la meningitis aséptica producida en la enfermedad de los porqueros por la Leptospira pomona (Céspedes M, 2005; García J, 1997).
Sintomatología: En el bovino la infección se caracteriza por la
aparición repentina de fiebre alta, hemoglobinuria y disnea por congestión pulmonar. (Sandow y Ramírez W, 2005).
La fase aguda afecta los terneros con signos clínicos como anorexia, laxitud, fiebre, 40,5-41,50C seguido de hemoglobinuria, ictericia, hemorragias petequiales en todas las membranas mucosas y septicemia que lleva a la muerte, sin embargo la forma de presentación más frecuente es la forma reproductiva en la que aparecen signos clínicos como abortos, retención de placenta, mortinatos, nacimientos de animales débiles y síndrome de la caída de la leche (Sandow K y Ramírez W, 2005).
En los equinos la leptospirosis evoluciona a la forma clínica ictérica en un importante porcentaje de mortalidad, siendo frecuentes las iridociclitis recidivantes. Las encuestas de Cabedela y Pumarola dan una prevalencia en esta especie de 27,1% de la cual un 15,6 es a L. pomona, (Saiz L, 1976).
Los signos clínicos en porcinos incluyen: pobre eficiencia reproductiva; abortos y nacidos débiles, también se puede presentar en forma aguda con estados febriles graves, ictericia, hemorragia y posible muerte, además de una causa frecuente de nefritis; siendo L. pomona tarasovi la causa más reportada. (Sandow K y Ramírez L, 2005; Miller D, et al, 1990).
El serovar L. pomona presenta signos clínicos que lo diferencian de otros serovares dentro de estos está la anemia hemolítica, atribuida a la presencia de hemoaglutininas frías bajo un fenómeno de autoinmunidad. Además de los lipopolisacáridos de su pared que median a los neutrófilos a unirse con las plaquetas desarrollándose una trombocitopenia. (Songer J, et al, 2004; Ernst L y Zee C, 1994).
Transmisión: La fuente del microorganismo es la orina de los
animales infectados o de animales portadores siedo posible la infección de fómites como el agua, el estiércol, y los piensos. La infección puede presentarse de manera directa o indirecta y puede tener lugar por vía nasal, oral, por la mucosa conjuntival y a través de la piel erosionada; (Carter G, 1989; León G, et al, 2002) otras rutas de infección son la vía transplacentaria y ruta venérea, heridas por mordedura, ó ingesta de carne infectada (McDonough P, 2001).
En un estudio realizado por Merchant acerca del serotipo L. pomona, se halló que persistía en los cursos de agua utilizada como suministro para los bovinos infectados 19 días después de la epizootia, el mismo serotipo sobrevivió 183 días en suelos sobresaturados, cinco días en suelos húmedos, dos horas en suelos secos, de 7 a 10 días en agua con contaminación fecal. (Merchant J & Parker R, 1980) otros estudios realizados en jabalís en Rusia han demostrado la alta prevalencia de
Leptospira pomona implicando al jabalí como un hospedador intermediario y
el riesgo que corren las personas por la corrientes de agua que atraviesan lugares con alta afluencia de jabalís (Jansen A, et al, 2007).
Tratamiento: La Leptospira spp es muy sensible In Vitro a las
penicilinas, la estreptomicina, y a las tetraciclinas. La antibioterapia promete buenos resultados sobre todo en la fase precoz de la infección, evitando de esta manera la eliminación y el paso al estado crónico, sin embargo la estreptomicina es el antibiótico mas acreditado para lograr la curación bacteriológica. (Nicolet J, 1986).
Figura 2. Comportamiento serológico de la Leptospira (Céspedes M, 2005).
Pruebas diagnósticas para Leptospira: En la actualidad se
encuentran en el mercado varias pruebas diagnósticas, que varían según costo, especificidad, sensibilidad entre otras.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Es la técnica
diagnóstica de elección en los países desarrollados, se utiliza un “primer” o cebador para amplificar los segmentos de un genoma, y ha sido utilizado para clasificación taxonómica, identificación rápida de Leptospira y evaluar la variabilidad genética entre serovares. Sin embargo sus altos costos hacen de ella una técnica poco aplicable. (Ciceroni L, et al, 2002).
Cultivo microbiológico: Es el método más antiguo que se conoce; en
él, las leptospiras se aíslan de la orina adicionando 0,1 ml de orina en 0.9 ml de buffer salino Sorensen, resultando en unas dilución de 10 1; a partir de esta dilución se deben hacer otras dos diluciones (102 y 103). Cada dilución se trasfiere a 5 ml de medio Fletcher suplementado con suero de conejo e
incubado en atmosfera aerobia a 28 °C. Los cultivos y los subcultivos son observados a las 12 semanas a través de microscopia de campo oscuro para observar si hay crecimiento. (Soto F, et al, 2006) sin embargo son métodos lentos intensivos y muchas veces infructuosos con errores en la interpretación (Quaresma M y Koury C, 2006).
Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA): La prueba de ELISA permite medir la concentración de anticuerpos en un suero problema, estas pruebas dependen de anticuerpos específicos unidos a un ligando sólido, los cuales interaccionan con el suero problema, esta actividad es identificada por la adición de anticuerpos específicos anticlase ligados a una enzima. La cantidad de anticuerpo marcado a la enzima puede compararse con una solución estándar, cuantificándose de este modo la cantidad de suero problema.
Por su rapidez, la prueba ELISA permite una confirmación diagnóstica rápida y segura, útil también en situaciones epidémicas o brotes, posibilitando dirigir medidas de vigilancia y control epidemiológico. (Céspedes M, et al, 2003; Halliwell R & Gorman N 1992).
Prueba Aglutinación microscópica (MAT): La prueba de MAT se
realiza usando un panel con diferentes serovares de Leptospira spp como antígenos vivos y cultivados en medio líquido Ellinghausen- McCullough-Johnson-Harris (Difco).
La prueba se realiza en microplacas de 96 pozos agregando 50 μl de cada antígeno a 50 μl del suero previamente diluido 1:50 con SAF. Las placas se cubren y se incuban por 1 hora a 37ºC. La prueba se interpreta como positiva cuando se observa por microscopía de campo oscuro con objetivo de 10X una aglutinación igual o mayor al 50% de las leptospiras con cualquiera de los serovares, en una dilución del suero de 1:100. (Rodríguez A, et al, 2004; León G, et al, 2002).
Observación en microscopio de campo oscuro: Este método se
realiza para la observación de leptospiras en los fluidos orgánicos, pero presenta la dificultad del gran número de artefactos que, por su parecido con las Leptospiras, pueden crear confusión; además precisa que haya un gran número de microorganismos en las muestras (Sandow K y Ramírez W, 2005).
Fijación del complemento (FC): Es una prueba género-específica que
se considera tan fiable como el MAT para la detección de animales con leptospiruria, es útil en la investigación de grandes cantidades de sueros ya que puede semiautomatizarse, detecta infección reciente.
Es una herramienta epidemiológica para diagnóstico rápido, menos laboriosa que el MAT. Las desventajas son las sustancias anticomplementarias del suero, la corta vida e inestabilidad del antígeno, no permite la diferenciación de serovares y no detecta niveles bajos de anticuerpos. (Sandow K y Ramírez W, 2005).
Prueba de aglutinación en látex: El antisuero reacciona con el
antígeno y provoca una aglutinación. El antígeno viene colocado en las laminas de látex (Mahajans & Chhabra D. 2008).
Análisis de enzimas de restricción de ADN: Se toman enzimas de
restricción sobre el antígeno y se corre una electroforesis para generar unas huellas específicas. (Mahajans & Chhabra D. 2008).
Ribo tipificación: Recientemente los patrones de restricción genética
de los ribosomas han sido utilizados para la identificación de especies para comparación filogenética. (Mahajans & Chhabra D. 2008).
ANTICUERPOS MONOCLONALES (MAbs).
Generalidades: Los anticuerpos, también denominados inmunoglobulinas, son glicoproteínas especializadas que hacen parte de la inmunidad humoral; son producidas por las células B, que tienen la capacidad de reconocer otras moléculas específicas llamadas antígenos. Ejercen su función uniéndose a los antígenos con el fin de eliminarlos mediante los mecanismos de neutralización, aglutinación y activación del complemento. (Campbell N, 1996). Esta capacidad ha llevado a que los anticuerpos monoclonales sean usados en varios procedimientos como: medición de proteína y niveles de medicamento en el suero, tipificación de tejidos y la sangre, identificación de agentes infecciosos, diferenciación para clasificación de leucemias y linfomas, identificación de antígenos tumorales, células específicas (Hart L, 1996), evaluación de fármacos y vacunas, detección de antígenos (Obregón, et al, 2007) entre muchas otras actividades.
Ya que los anticuerpos tienen la propiedad de unirse con alta especificidad y afinidad a una molécula blanco, se han hecho diversos procedimientos con el fin de utilizarlos en la investigación biomédica y clínica. Lo cual se ha logrado a través de la técnica de fusión celular (Dwight,
et al, 2004).
Fusión celular: Esta técnica empieza con el trabajo realizado en las
Universidades de Oxford y Cambridge, donde se encontró que las membranas plasmáticas de las células podrían fundirse utilizando virus o polietilenglicol PEG y que durante esta fusión, también se fusionaban los núcleos de las células; algunas células que fusionaban los núcleos conti-nuaban creciendo con el doble del número de cromosomas y se observó que era posible producir híbridos celulares del hombre y ratón. A partir de este descubrimiento la técnica de la fusión celular fue también utilizada por Kóhler
y Milstein en 1975, quienes idearon la fusión de células formadoras de anticuerpos del bazo de ratón con células de mieloma murino. Esta idea se transformó en realidad práctica cuando demostraron que las células de bazo de ratón productoras de anticuerpos podían fusionarse con células de mielo-ma para producir anticuerpos monoclonales mediante la formielo-mación previa de clones de células híbridas o «hibridomas» (Outteridge P, 1989). Sin embargo el requisito final es la producción de anticuerpos, para esto se requiere seleccionar el hibridoma adecuado a través de diluciones simples de la población, seguido de sembrado en alícuotas, a una dilución apropiada permitiendo seleccionar solo un hibridoma y multiplicarlo indefinidamente (Walker J & Gingold E, 1997).
Clasificación anticuerpos monoclonales: Los anticuerpos monoclonales se clasifican según su producción, en escala baja para proyectos de investigación donde se requiere menos de 0,1 gramos, escala media 0,1-1g para kits diagnósticos y larga escala más de 1 gramo para diagnósticos de rutina o para terapéutica (Committee on methods of producing monoclonal antibodies, 1999).
Recientes aplicaciones: En los últimos años las aplicaciones de los
anticuerpos monoclonales han sido variadas y han probado ser invaluables en la detección y cuantificación de niveles de expresión de genes al igual que en el diagnóstico de muchas enfermedades infecciosas y en la detección de tumores mediante técnicas inmunológicas de diagnóstico (Manchado N, et
al, 2006).
En los últimos años la elaboración de anticuerpos monoclonales contra
Leptospira spp no está enfocada en la detección de la enfermedad o el
agente sino en el desarrollo de nuevas técnicas para identificación de serogrupos, y sus posibles usos como agentes terapéuticos (Branger C, et al, 2005). Dobrina y colaboradores desarrollaron un anticuerpo monoclonal
contra Leptospira Interrogans y lo probaron en macrófagos In Vitro para observar el desarrollo del sistema inmune, observando que los macrófagos tenían un mayor índice de fagocitosis (Dobrina A, et al, 1995) mostrando de esta manera que los anticuerpos monoclonales no se limitan a la detección sino también al tratamiento de la enfermedad.
En Colombia el campo de los monoclonales ha sido poco trabajado, actualmente se cuenta con un trabajo de la Universidad De la Salle en donde se desarrollaron anticuerpos monoclonales contra Leptospira
interrogans serovar canicola y Leptospira borgpetersenii serovar hardjobovis
MATERIALES Y MÉTODOS
PROCEDIMIENTOS GENERALES:
El primer procedimiento fue conseguir una fracción antigénica de
Leptospira Pomona y poder elaborar un anticuerpo específico, para lo cual se
utilizó el método de sonicación de Leptospira y prueba de Lowry para evaluar la concentración de antígeno presente.
El siguiente paso fue la elaboración del anticuerpo monoclonal, para ello se inocularon ratones Balb/c con las fracciones antigénicas previamente seleccionadas, los títulos de los ratones inoculados fueron probados mediante una técnica ELISA-DOT y MAT para saber el momento del sacrificio.
Finalmente los esplenocitos fueron extraídos de los ratones después de su sacrificio y fusionados con células de mieloma; llegando así a la etapa de hibridoma; después de su cultivo se determinó la especificidad de los anticuerpos producidos por los hibridomas a través de la técnica ELISA-DOT y ELISA Indirecto.
PROCEDIMIENTOS: Población Estudio:
Los animales de laboratorio empleados en este proyecto fueron ratones Balb/c (Mus Musculus) procedentes del Bioterio de la Universidad Nacional de Colombia.
Manejo y cuidado de animales de experimentación: los animales se
mantuvieron en jaulas en aislamiento, donde se les ofrecía agua y comida a voluntad, (ver Figura 3) junto con una inspección diaria de su estado de salud según lo estipulado por el Capítulo II de la Ley 84 del 27 de diciembre de 1989 que rige las normas bioéticas para los animales de experimentación. La población tenía una edad aproximada de tres meses de edad al iniciar el proceso de inoculación, no se hizo diferencia por sexo y se mantuvieron en ambiente controlado con una temperatura de 21°C y el aseo se realizó cada 8 días haciendo cambio de camas y limpieza general.
Figura 3. Jaulas independientes. Fuente autores
Los tres primeros ratones fueron nombrados como A, B y P; de acuerdo al antígeno que les fue inoculado; el viernes 25 de septiembre se encuentra muerto el ratón P; se le realiza una necropsia y posteriormente se adquiere el cuarto ratón P1, al cual se le realiza la inmunización que se estaba realizando para el ratón P.
La técnica de sujeción empleada es la técnica a dos manos descrita por Arce (Arce A, et al, 2007) y el sacrificio se realizó por sobredosis de ketamina.
Indicaciones de estrés y enfermedad que ocasionarían el sacrifico del animal: Inapetencia, altos o bajos niveles de actividad, se
ponen en las esquinas, agresiones entre ellos, patrones repetitivos, anormalidades sexuales y automutilación, anorexia, pérdida de pelaje, pérdida de peso, taquipnea, disnea, si se presentan cualquiera de estos síntomas se debe examinar y si es necesario proceder con el sacrificio del animal.
Monitoreo de la respuesta del anticuerpo:
Las respuestas durante la etapa de inoculación fueron monitoreadas
mediante la prueba de ELISA-DOT, se eligió esta en comparación del MAT, ya que presenta una mayor sensibilidad y especificidad (Vanasco N, et al, 2001), esta prueba se realizó hasta la sexta inoculación, en la que se obtuvieron resultados no específicos, por lo cual se procedió a usar la prueba MAT; con la cual se obtuvo el resultado esperado; en la inoculación seis del ratón A y la quinta inoculación del ratón B, se obtuvo el resultado óptimo para sacrificar los ratones; por lo cual no se realizaron más pruebas de monitoreo hasta el sacrificio.
Para la evaluación de la producción de los anticuerpos en la etapa de hibridomas se realizó la prueba ELISA-DOT a los 14 días de la fusión (10 diciembre) arrojando resultados negativos, también el control positivo dió negativo; así que se decide realizar un ELISA-Indirecto el lunes 14 de diciembre.
ELISA-DOT: Para esta prueba se usó una pequeña muestra de sangre;
esta muestra no debía superar el 10% del volumen de sangre circulante, sin embargo en términos prácticos se manejó un 1% del peso vivo del ratón, pero sin excederse de 0,3ml; esta muestra fue extraída haciendo uso de las venas de la cola.
Se cortó la membrana de nitrocelulosa al tamaño deseado teniendo precaución de usar guantes, se marcaron las áreas a usar para la prueba; se colocó el antígeno conocido (1 µl) que en este caso fue Leptospira
pomona fresca tomada del cultivo sin aglutinación. Después del secado de la
membrana se procedío a bloquear los espacios no utilizados con solución a base de leche descremada por 15 minutos, posteriormente se realizaron 3 lavados con solución de lavado de 1 minuto de duración cada una; en una caja de 96 pozuelos se colocaron las muestras problema; en el caso de la etapa de inoculaciones se colocó suero extraído de los ratones en diferentes diluciones y en la etapa de hibridomas se colocó el sobrenadante extraído de los pozos en estudio. Se enfrenta la membrana con la caja de pozuelos para que el antígeno entre en contacto con la muestra a probar, se incubó por 1 hora a 37°C en cámara húmeda.
Al terminar el tiempo de incubación, se realizaron 3 lavados con sustancia de lavado y se procedío a colocar la membrana en peroxidasa y se incubó por 1 hora a 37°C protegiendo de la luz; se realizaron 3 nuevos lavados con sustancia de lavado y se introdujo la membrana en sustancia reveladora por 15 minutos protegido de la luz; esta reacción se detuvo con agua y se dejó secar para observar los resultados obtenidos.
El control positivo fue suero antipomona utilizado a concentración de 1:500; el control negativo fue Solución Salina Amortiguadora de Fosfatos (SSAF). Se observó la positividad por presencia de manchas de color rojizo parduzco; se evaluó además la presencia y diferencia de los resultados obtenidos de las muestras con el control positivo y negativo.
ELISA Indirecto: Para realizar esta prueba se tomó el cultivo de Leptospira pomona y se mantuvo en Buffer Acetato por 12 horas;
posteriormente se siguen los lineamientos usados en la prueba de ELISA-DOT.
MAT: Este procedimiento se realizó en cajas de 96 pozos de fondo en U,
y se evaluaron diferentes diluciones.
Para una dilución inicial de suero, se tomaron 2µl de suero mas 510 µl de SSAF, obteniendo una concentración de 1:256; se colocaron 100 µl de ésta concentración en el primer pozo, se agitó y se tomaron 50 µl de este pozo y se adicionaron en el siguiente pozo que contenía 50 µl de SSAF. Se realizó el mismo procedimiento de dilución hasta llegar a una concentración deseada.
Se agregaron 50 µl de Leptospira pomona tomada de cultivo fresco sin aglutinación a cada pozo, se incubó en cámara húmeda a 37°C por una hora; posteriormente se tomaron microgotas de cada pozo y se observó la presencia de aglutinación en el microscopio de campo oscuro.
Antígeno:
Cepas: Las cepas, que fueron donadas por el Banco de Germoplasma
del Instituto Colombiano Agropecuario - ICA, administrado por la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria – CORPOICA; se mantuvieron en Medio líquido EMJH (Difco™) suplementado al 10% con Leptospira enrichment EMJH (Difco™) a 28°C y protegidos de la luz.
Para el crecimiento de la Leptospira pomona, se tuvo un volumen inicial de 5ml de cultivo, y se realizaron pases cada 4-8 días aumentando el volumen del cultivo (10ml, 20ml, 40ml…) hasta obtener un volumen final de 1000ml, el cual fue utilizado para la extracción por sonicado; paralelamente se sembró cultivo para el inóculo de antígeno crudo, el cual se uso en volumen final de 5ml semanalmente. El punto de crecimiento óptimo para realizar el pase es encontrar aproximadamente 100 leptospiras móviles por campo evaluado, visto en 400X.
Preparación Inóculo: Se prepararon dos tipos de inóculos, el primer
inóculo fue antígeno extraído por sonicado y el segundo inóculo fue el antígeno crudo; en ambos casos se utilizó coadyuvante incompleto de Freund para aumentar la respuesta inmunitaria de la población en estudio; el coadyuvante utilizado fue un agente que aumentó la respuesta a un antígeno ya que secuestró el antígeno y lo liberó durante el tiempo, se administra con los mismos volúmenes que el antígeno, el uso del Mycobacterium spp (mas usado M. butirycum) se debe a que produce agregación de macrófagos en el sitio de inyección. (Jackson L & Fox J, 1995; Jennings V, 1995).
Para mezclar el inóculo con el coadyuvante, se colocaron 500 µl de Ag sonicado en un vial y se adicionan 500 µl coadyuvante incompleto de Freund, se repite por el número requerido de viales, los cuales se tapan correctamente y se colocan en agitación en un vortex por 8 ciclos que consisten en: 15 minutos en agitación por 10 minutos de descanso.
Extracción por sonicado: Para conseguir la fracción antigénica
especifica se realizó el sonicado de la Leptospira pomona que estaba siendo cultivado; se tomó el volumen final de 1Lt al comprobar un crecimiento óptimo en una curva estándar de Lowry. Se inactivó la cepa en baño maría por 1 hora, se centrifugó a 5000 Rev./min a 4ºC por 15 minutos, se descartó el sobrenadante, y el precipitado se resuspendió en 5 ml de SSAF estéril.
La solución se colocó en hielo para mantener las Leptospiras en bajas temperaturas y se sonicó por ciclos de 30 segundos de ultrasonido a 20 Hz y un minuto de reposo; los ciclos se realizaron elevando la secuencia de la siguiente manera: primero se mantuvo la Potencia 20 por 10 segundos, luego Potencia 40 por 10 segundos, Potencia 50 por 10 segundos y se dejaba en reposo para su reposo en hielo.
Inmunización: El esquema de inmunización manejó inyecciones
Antígeno A y Antígeno B: estos antígenos fueron extraídos por medio de sonicación; pero difieren por el cultivo del que provenía la Leptospira utilizada.
Antígeno P: este antígeno crudo es Leptospira pura, inactivada por calor.
Para la inmunización se realizaron secuencias de inoculaciones; una primera inoculación se llevó a cabo para el ratón A: el día 06 de Agosto; para el ratón B: el día 13 de agosto; para el ratón P: 20 de agosto y para el ratón P1: el día 01 de octubre. Se esperó 10 días y se hizo la inoculación número dos, luego se continuó con las inoculaciones periódicas cada 8 días. Posterior a la sexta inoculación, ya se tienen los niveles de anticuerpos requeridos para la fusión (1:25000); pero por problemas técnicos en la incubadora, no se pudo realizar la fusión hasta alcanzar la inoculación número 16 en el ratón A, la inoculación número 15 del ratón B y la octava inoculación en el ratón P1.
Tres días después de la ultima inoculación los ratones fueron sacrificados por medio de sobredosis de ketamina, la cual fue inoculada intramuscularmente; los bazos fueron extraídos y usados para la fusión.
Fusión celular:
La fusión se realizó en dos etapas: Ratones A y B el día 26 de Noviembre
y fusión del ratón P1 la cual se llevó a cabo el día 03 de diciembre.
El tipo de fusión celular más conocido consiste en la fusión de linfocitos B de ratón BALb/c productores de anticuerpos obtenidos de un ratón inmunizado con una línea celular de mieloma; esta fusión permite producir un anticuerpo monoclonal de elección mediante una línea celular de hibridoma permanente.
Celulas Mieloma: las células de mieloma utilizadas fueron de la línea
X63AG9; Estas células fueron descongeladas y luego cultivadas en medio
RPMI al 15% de suero fetal bovino (SFB) a temperatura de 37°C con 5% CO2.
Descongelación Células: se extrajeron los viales de la crioconservación, y se descongelaron en baño maría (37°c); se colocaron en un tubos Falcon 15 y se centrifugaron a 2500rev/min por 15 minutos; se eliminó el sobrenadante para eliminar el DMSO que es tóxico para las células; se resuspendieron en medio RPMI-15% SFB y se colocaron en un frasco de cultivo; se incubaron a 37°C con un ambiente de 5%CO2 y se evaluó crecimiento
Prueba viabilidad de las células de mieloma: Se colocó la lámina cubreobjetos en la cámara de newbauer; en un microvial se colocaron 20µl del cultivo celular y se añaden 20µl de azul tripan. Con ayuda de una micropipeta se colocan 10 µl de la solución por las ranuras de la cámara y se deja reposar por 1 minuto, luego se realizó el conteo en las cuadrículas externas utilizando las siguientes fórmulas, a un aumento de 400X.
# Total Células: __ # células contadas____ X 25 # Cuadros X dilución
% viabilidad: #células viables___ X100 # Total células
Fusión: para la fusión se esperó a que las células de mieloma presentaran un crecimiento exponencial; se tomaron las células de los frascos de cultivo y se centrifugaron a 2500rev/min por 15 minutos, se resuspendieron en 10ml de RPMI-0 y se sacó la alícuota para conteo que se realizó por medio de cámara de newbauer.
Se sacrificó el ratón y se extrajo el bazo en cabina, se lavó en 20ml de RPMI-0, se eliminó el medio de lavado y se adicionó 10ml de RPMI-0 nuevo, se maceró el bazo para obtener los esplenocitos y se recogió el volumen obtenido en tubo Falcon 50, se dejó reposar unos minutos y se pasó el sobrenadante a otro Falcon, el cual se centrifugó a 2500rev/min por 15 minutos. El pellet se resuspendió en 1ml de RPMI-0 y se sacó la alícuota para conteo que se realizó adicionando acido acético al 2%; se realizaron los cálculos para tener 10 esplenocitos por cada célula de mieloma y se unieron los dos tipos de células en un nuevo tubo Falcon que se centrifugó a 2500rev/min por 15 minutos.
Grafica 4. Ratón sacrificado. Fuente autores
Se adicionó al pellet 1,6ml de Polietilenglicol al 50% de RPMI-0 en un minuto, se colocó en agitación por un minuto y se adicionó RPMI-0 hasta completar 10ml de volumen final durante 7 minutos en agitación. Se centrifugó a 2500rev/min por 15 minutos y se resuspendío el pellet en medio RPMI suplementado con HAT al 15% SFB. Finalmente se plaqueo colocando 70µl en cada pozo de las cajas de 96 pozos y se mantuvo en incubación en un ambiente de 37°c y 5% CO2. (Morgan S & Darling D, 1995); se revisó los
pozuelos cada dos días para evaluar viabilidad de la fusión y 10 días después se realizó la prueba de ELISA-DOT para comprobar la reactividad de los hibridomas contra la Leptospira pomona.
Contaminación: Los pozuelos se revisaron en busca de
contaminación día de por medio, macroscópicamente se buscaba cambios de color, presencia de cuerpos extraños o turbidez de los pozuelos (ver Figura 5); microscópicamente se buscaba presencia de bacterias u organismos diferentes a los hibridomas. Cuando se encontraba presencia de contaminación, se procedía a inocular 100µl de hipoclorito puro al pozuelo afectado y la caja era separada de las cajas sin contaminación de pozuelos; Cuando la contaminación superaba el 75% de la caja, esta era descartada.
Figura 5. Evaluación macroscópica post fusión. Fuente autores
Hibridomas: Después de la fusión, y sembrar los hibridomas en medio RPMI suplementado con HAT al 15% SFB, estas se incubaron a 37°C y 5%CO2, el día 01 de diciembre, el 07 de diciembre y el 11 de diciembre se hizo revisión del crecimiento celular evaluando la densidad celular presente en los pozuelos; se realizó un promedio primero entre los pozuelos de cada caja y posteriormente las cajas de cada ratón, obteniendo la viabilidad y densidad de los hibridomas obtenidos por la fusión realizada.
La densidad fue evaluada por el espacio por pozo ocupado por los hibridomas; y la viabilidad de los hibridomas fue probada por las mismas formulas que se utilizaron en la prueba de viabilidad de células de mieloma, teniendo en cuenta que los hibridomas vivos son redondeados, transparentes y refringentes.
RESULTADOS
A continuación se presentan los resultados obtenidos en el proyecto, divididos según la etapa de estudio: elaboración del inóculo, esquemas de inoculación, fusión celular y post-fusión.
Elaboración del inóculo: el cultivo de Leptospira pomona tuvo un
crecimiento rápido y constante, pudiendo realizar los pases aproximadamente cada 3-5 días, las Leptospiras se encontraban móviles y de buen tamaño.
Al realizar la prueba de Lowry, se encontró una proteína antigénica de 3.30mg/ml en el antígeno A y 4.11mg/ml en el antígeno B, se obtuvo 21 viales de cada antígeno con contenidos de 1ml/vial, los cuales fueron mantenidos en refrigeración hasta su uso.
Inoculación: la inoculación se llevó a cabo sin inconvenientes, el ratón B
presento decaimiento por unas horas post-inoculación en todas las inoculaciones, las cuales se llevaron a cabo en las fechas establecidas; en la sexta inoculación del ratón A y quinta inoculación del ratón B, se obtuvieron los resultados esperados de anticuerpos para el sacrificio de los ratones; pero como ya se indicó se presentaron fallas técnicas con la incubadora de CO2. Ajenas a la voluntad de los autores del proyecto, que motivaron la
administración de más inoculaciones. El ratón P, presentó decaimiento progresivo 4 días después de la quinta inoculación con Antígeno crudo y muere al 5 día post inoculación.
En la Figura 6, se puede observar los resultados obtenidos en la última prueba ELISA-DOT realizada a los ratones A y B, donde se encuentra que presentaron títulos de 1:16384 en el ratón A y 1:32768 en el ratón B; la siguiente prueba arrojo resultados falsos; y el MAT arrojo resultados de 1:32768 en ambos casos.
Figura 6. Resultados prueba ELISA-DOT. Fuente autores
Fusión:
Esplenocitos: Al realizar el conteo de los esplenocitos obtenidos tras
el sacrificio y extracción del bazo, se encontraron los resultados que pueden ser observados en la tabla 2; donde se observa un mayor número de celularidad obtenida del ratón A y P1 con respecto al ratón B.
Tabla 2. Número total esplenocitos.
ESPLENOCITOS Células Ratón A 27´875.000 Ratón B 16´750.000 Ratón P1 23´125.000 Nota. Fuente Autores
Células mieloma: En la tabla 3 se puede observar la cantidad de
células de mieloma encontradas los dos días de la fusión; el día 26 de noviembre donde se realizaron las fusiones de los ratones A y B; y el día 03 de enero cuando se realizó la fusión del ratón P1.
Tabla 3. Resultados células mieloma.
CÉLULAS MIELOMA NÚMERO Células 26-nov 24´625.000 03-ene 20´975.000 VIABILIDAD % 26-nov 55 03-ene 75
Nota. Fuente Autores
La viabilidad de las células fue 75% para la fusión de los ratones A y B, mientras que la viabilidad para la fusión del ratón P1 fue del 55%.
Post-fusión:
En fusión celular se encuentra el porcentaje de fusión, evaluado por el número de hibridomas viables encontradas en la revisión y la densidad promedio encontrada, así como la contaminación presentada.
Al realizar el ELISA-DOT el día 10 de diciembre, se obtienen resultados negativos a todos los pozos además del control positivo (ver figura 7), así que el día 14 de diciembre se realiza la prueba de ELISA indirecto donde se encuentran 4 sospechosos pero no positivos; por lo cual todos los sobrenadantes de los hibridomas en las dos fusiones se toman como negativos, considerándose terminado el ensayo.
Figura 7. ELISA- DOT. Fuente autores
Ratón P1: La fusión realizada con los esplenocitos del Ratón P1 se
tomó como contaminada y se descartó todas las cajas, al encontrar más del 75% de contaminación de los pozuelos.
Densidad hibridomas: la densidad encontrada en el cultivo
post-fusión (ver tabla 4) fue alto en ambos ratones, siendo el promedio del ratón A más alto que el encontrado en el ratón B.
Tabla 4. Resultados Densidad Hibridomas
RESULTADOS OBTENIDOS RATON A % RATON B % Caja 1 85 Caja 1 55 Caja 2 75 Caja 2 65 Caja 3 75 Caja 3 85 Caja 4 85 Caja 4 95 Caja 5 85 Caja 5 75 Caja 6 95 Caja 6 75 Caja 7 85 Caja 7 75 Total 83,5714 Total 75 Nota. Fuente Autores
Viabilidad Hibridomas: la viabilidad de los hibridomas fue alta al igual
que la densidad en ambos ratones; siendo más alta en el ratón B. la viabilidad se mantuvo constante en todo el proceso de post-fusión teniendo un promedio en el ratón A de 70% y en el ratón B de 85% (ver Figura 8)
.
Figura 8. Viabilidad hibridomas. Fuente autores
Contaminación: como ya se indicó el ratón P1 se descartó por alto
porcentaje de contaminación (ver Figura 9). En el caso del ratón A, se encuentra contaminación en 2 pozos: pozo H8 de la caja A4 y el pozo A2 de la caja A5. Por su parte, el ratón B, presentó contaminación en tres pozos de la misma caja: pozos H3, G10 y G11 de la caja B6; después de inactivar los pozos por medio de adición de hipoclorito, no se presentaron más casos de contaminación.
Figura 9. Contaminación. Fuente autores
Detección Anticuerpos: Al realizar el ELISA-DOT el día 10 de
diciembre, se obtienen resultados negativos a todos los pozos además del control positivo, así que el día 14 de diciembre se realiza la prueba de ELISA
Indirecto y se encuentran 4 sospechosos a positivo: dos pozuelos en la misma caja del ratón A (caja A3: pozos D8 y H3) y dos pozuelos de diferentes cajas del ratón B: (caja B2: pozo C10 / caja B7: pozo A10); pero el resultado no es concluyente. Al no obtener resultados positivos a la prueba se da por terminada la investigación obteniendo como resultado final la producción de una alta cantidad de hibridomas no secretores de anticuerpos monoclonales específicos para Leptospira pomona y cuatro pozos con hibridomas con resultados no comprobados.
DISCUSIÓN
En este proyecto se obtuvieron excelentes resultados respecto a los antígenos producidos; el crecimiento de la Leptospira fue rápido y constante, la proteína encontrada fue adecuada en los antígenos fue de 3.3 y 4.11mg/ml, lo cual es mayor que el obtenido en estudios como el de Díaz y colaboradores (Díaz C, et al, 2009), en el cual obtuvieron 2mg/ml como máximo de sus experimentos y los anticuerpos en sangre a la quinta inoculación ya superaban los encontrados por el mismo estudio, en los cuales obtuvieron una titulación máxima de 1:250000.
Con respecto a la fusión, se obtuvieron resultados importantes, al obtener un alto nivel de fusión viable y de rápido crecimiento, baja mortalidad y alta densidad.
Con respecto al objetivo principal del presente estudio, no se cumplió a cabalidad ya que los resultados no fueron los esperados; los hibridomas obtenidos no fueron reactivos contra la Leptospira pomona y por ende no se obtuvo un anticuerpo monoclonal efectivo.
Se han descrito algunos pasos críticos en la producción de los Anticuerpos monoclonales; entre los cuales están: preparación del antígeno, selección del adyuvante, protocolo de inoculación (Leenaars M & Hendriksen C, 2005) así como la fusión, medio cultivo para los hibridomas, post-fusión y la prueba de detección del anticuerpo; a continuación se evalúan las posibles causas para llegar a los resultados obtenidos, basándonos en los pasos críticos del proceso.
Preparación de antígeno: La especificidad de la respuesta inmune obtenida
depende de la calidad del antígeno aplicado (Leenaars M & Hendriksen C, 2005); teniendo en cuenta esto, se manejo en todos los procesos un nivel alto de asepsia, todos los materiales utilizados fueron nuevos o correctamente esterilizados; el cultivo de Leptospira no presentaba contaminación, y cada inoculación se realizó con agujas y jeringas diferentes, los viales de las inoculaciones se manejaban unidad/inoculación y se mantenían correctamente refrigerados y aislados del medio ambiente por medio de papel parafilm.
Selección del adyuvante: Los adyuvantes más utilizados en este tipo de
estudios son el adyuvante completo e incompleto de Freund; se ha confirmado que el adyuvante completo de Freund induce una respuesta inmune mucho más alta que el adyuvante incompleto de Freund (Hong T, et
al, 1989); pero también induce con más frecuencia enfermedades y
formación de tumoraciones, por lo cual se optó por la utilización del adyuvante incompleto.
Protocolo de inoculación: En el proceso de inoculación, se deben tener en
cuenta lugar de inoculación y número de refuerzos utilizados; estos aspectos pueden alterar los resultados obtenidos.
Las inoculaciones y los refuerzos fueron aplicados en su totalidad Intraperitonealmente; este procedimiento no se ajusta a los resultados obtenidos en el estudio de Hong; en él se sugiere que la respuesta inmune primaria por la inmunización intraesplenica tiene una respuesta superior que la obtenida por el método convencional de inmunización subcutánea (Hong T, et al, 1989).
Una de las posibles causas para no alcanzar el objetivo principal de este proyecto, es el número de inoculaciones y refuerzos utilizados. Estudios como el realizado por Micheel y Sharte plantean que múltiples inyecciones
disminuyen la cantidad de anticuerpos producidos. ( Micheel B & Sharte G, 1993) Neron y Lemieux obtuvieron los mismos resultados mostrando reducciones de una tercera parte de los anticuerpos producidos y sugirieron la inducción de un estado de tolerancia/supresión causante de la disminución de los anticuerpos (Neron S & Lemieux R, 1992). Esta disminución en la producción de anticuerpos puede ser causada a su vez por un aumento en la afinidad de los anticuerpos y una respuesta inmune más sensible y específica al tener un alto número de inoculaciones y de esta manera disminuir la producción de los linfocitos B específicos para Leptospira (Vass M, et al, 2005).
En el presente estudio se aplicaron de 15 a 16 inoculaciones, lo cual quintuplica el número de inoculaciones que en promedio se recomienda sean 2 a 3 inoculaciones para obtener óptimos resultados, aunque dependiendo de la naturaleza antigénica del antígeno mismo (Chaicumpa W, 2008; Ludtke C, et al, 2003; Micheel B & Sharte G, 1993); este alto número de inoculaciones pudo inducir un fenómeno de depleción en la producción de Anticuerpos; ya que al tener una carga frecuente de Antígeno se puede presentar una “parálisis inmunológica” ( Roitt I, et al, 2001;Rojas W, 2007) la cual es específica y en la cual se ha demostrado no hay producción de Anticuerpos y es más fácil de lograr con Antígenos que posean relativa resistencia a la degradación. (Wesley J & Good R, 1984) como la resistencia otorgada por el coadyuvante incompleto de Freund, con lo que se logra un estímulo persistente (Lañez E, 1999). Este hecho no pudo preveerse en la realización del experimento dado un daño inesperado de la incubadora de CO2, que solo se logró solucionar con la consecución de otro laboratorio seis
semanas después. Sin embargo el ratón P1 presentó cinco inoculaciones, las adecuadas pero los altos índices de contaminación tampoco permitieron obtener los resultados deseados.
Fusión: En esta parte del proceso se utilizó una relación de 10 esplenocitos
por cada célula de mieloma; que es la relación más segura para obtención de anticuerpos monoclonales (Belve A, 1983). El fusógeno utilizado fue el polietilenglicol que presenta un índice de desarrollo de hibridomas positivos alto (Bellve A, 1983); el tiempo de adición del mismo fue 1 minuto, que en promedio es el tiempo más usado para tener un mayor desempeño en la producción de Anticuerpos; un tiempo mayor a este resulta en un detrimento de la eficiencia de la fusión, además de desarrollar efectos citotoxicos (Lane R, 1985).
Medio de cultivo para los hibridomas: Estudios como el realizado por Zeng, sugieren que la producción de los MAbs es limitada por la disponibilidad de nutrientes que tenga el medio (Zeng A, 1996). El medio utilizado es el RPMI suplementado con HAT; este es el medio utilizado para los hibridomas; pero en el presente estudio se sugiere que la disponibilidad de los nutrientes se pudo ver afectada por la densidad celular. El medio fue suplementado con glutamina, este aminoácido estimula no solo el crecimiento celular y la viabilidad de las células, sino también la tasa de producción de los anticuerpos monoclonales (Jeon Y & Wang S, 1995).
Post-fusión: Las condiciones seleccionadas por el investigador para el
mantenimiento de estas células post-fusión pueden ser también críticas en los resultados de los clones celulares que logren crecer y desarrollarse (Varcarcel P, et al, 1997); los cambios de temperatura afectan la viabilidad de los hibridomas (Reuveny S, et al, 1986); las células fueron mantenidas en un ambiente de 5%CO2 y una temperatura de 37°C.
Otra de las variables que pudieron afectar los resultados obtenidos, es el crecimiento de los hibridomas y la densidad de los mismos; por lo cual en algunos estudios se sugiere realizar subclonación de los hibridomas rápidamente debido a que las clonas no productoras se reproducen más fácil
y veloz que las clonas productoras de anticuerpos (Bellve A, 1983). Al hacer uso de los linfocitos provenientes del bazo la mayoría de investigadores obtienen alrededor de 1000 colonias de hibridomas con un proceso de fusión única de las cuales menos de 50 colonias son productoras de anticuerpos estables (Ozturk S & Pallson B, 1990).
Con respecto al efecto de la densidad celular post-fusión, que en este estudio fue alta en todo el proceso post-fusión, los resultados obtenidos por los diversos estudios realizados por otros autores son muy controversiales (Zeng A, 1996). Por un lado, varios estudios indican que la secreción de anticuerpos se ve directamente afectada por la densidad de las células, teniendo que la alta densidad celular conlleva a un bajo rendimiento en la producción de anticuerpos en los pozuelos (Hadas E & Theilen G, 1987) mientras en otros indican que al aumentar la densidad de células, se aumenta la cantidad de Anticuerpos producidos (Banik G & Heath C, 1995).
Se sugiere que una posible causa para la disminución en la secreción de anticuerpos presentada en este estudio por la alta densidad puede ser atribuido al rápido uso de los nutrientes del medio; los cuales afectan la producción de anticuerpos (Zeng A, 1996).
Prueba de detección de los Anticuerpos: Uno de los pasos más críticos en
la elaboración de MAbs, es la técnica utilizada para la detección de los Anticuerpos, ya que problemas como la densidad del cultivo, la contaminación, o la falta de sensibilidad puede dar falsos negativos. (Hadas E & Theilen G, 1987; Leenaars M & Hendriksen C, 2005).
Dentro de las técnicas más utilizadas en la detección de MAbs está el Elisa, el cual es muy usado por su fácil proceso y su alta especificidad (Bianchi A, et al, 1995; Carvalho F, et al, 2008). Se utilizo la técnica de Elisa indirecta debido a su mayor sensibilidad (Cervino C, et al, 2008).
